FØDEVAREKEMI Parmaskinker nitritfrie charcuterivarer med optimal farvedannelse De legendariske Parmaskinker»Prosciutto di Parma«er kendt for deres gode smag og unikke farve. De er resultat af en speciel tørsaltningsproces med havsalt fra Middelhavet. Men hvordan fremkommer den specielle farve, og hvilken kemisk struktur ligger bag? Af Christina E. Adamsen, Jens K. S. Møller og Leif H. Skibsted, Fødevarekemi, Institut for Fødevarevidenskab, KVL Emilia-Romagna provinsen, kendt som livsnydernes provins, ligger i Norditalien på den frugtbare Po-slette, der danner grundlag for områdets rigdom og storhed. I provinsen ligger hertugbyen Parma, og i omegnen produceres de verdensberømte Parmaskinker. Parmaskinkerne er bl.a. kendt for en frisk og appetitlig farve. En af de vigtigste faktorer, når forbrugerne bedømmer kvaliteten af et levnedsmiddel. Farven på kød og kødprodukter er afhængig af en lang række faktorer. Brugen af tilsætningsstoffet nitrit er særlig interessant, da det sammen med myoglobin (Mb) danner det holdbare røde pigment nitrosylmyoglobin (MbFe(II)NO), der ved varmebehandling omdannes til det lyserøde pigment, nitrosylmyochrom (dmbfe(ii)no), hvor globindelen er denatureret. Disse pigmenter giver kødprodukter som tørsaltet skinke, bacon, spegepølse og kogt skinke deres karakteristiske farve. Nitritsaltning har ud over den farvegivende effekt også en positiv indvirkning på den oxidative stabilitet og forhindrer fremvækst af pølseforgiftningsbakterien Clostridium botulinum. Nitrit kan virke cancerogent, og brugen som tilsætningsstof til levnedsmidler har derfor været omdiskuteret siden 70 erne. Uden tilsætning af nitrit får kødprodukterne en mat brungrå kogt kødfarve og dermed et mindre appetitligt udseende. Smagen ændrer sig pga. oxidationsprocesser, og det samme gør forbrugernes bedømmelse af produktet. I et ph.d.-studium ved KVL, Institut for Fødevarevidenskab, Fødevarekemi, hentes inspiration til udvikling af nye nitritfrie kødprodukter fra middelhavslandenes tørsaltede produkter. Der tages udgangspunkt i Parmaskinker, der opnår en ensartet stabil rød farve med havsalt som eneste tilsætningsstof [1]. Denne farvedannelse er klart af interesse for andre og nye nitritfrie charcuterivarer. Projektet er delvis finansieret af Institut for Fødevarevidenskab, Forskerskolen for økologisk jordbrug og fødevareproduktion (SOAR) og Norma og Frode S. Jacobsens fond. Produktion af Parmaskinke Tørsaltningsprocessen fra middelhavslandene består af til- smøring med salt af skinkernes skæreflade. Derefter følger udligningsperioder og en længere modningsperiode, hvor temperaturen samt den relative luftfugtighed (RH %) styres i større klimakamre (figur 1). Gennem den lange fremstillingsproces på op til 18 måneder er der et vandtab og en diffusion af salt gennem skinken. Det medfører en gradvis stabilisering af produktet forårsaget af en sænkning af vandaktiviteten. Samtidig foregår der komplicerede kemiske processer, herunder proteolytiske og lipolytiske modifikationer, der resulterer i Parmaskinkens legendariske kvalitet. Fremstillingen af Parmaskinke er under streng kontrol af»consorzio del Prosciutto di Parma«(http://www.prosciuttodiparma.com/eng/index.php) samt italiensk lovgivning. Udvælgelse og trimning Skinkerne, der anvendes til fremstilling af Parmaskinker, stammer alle fra grise af racen Italiensk Landrace, Large White, Duroc eller krydsninger mellem disse. Grisene skal på slagtetidspunktet være 9 måneder gamle, veje ca. 150 kg og være født og opdrættet på italiensk fastland for at opfylde de fastsatte krav. Saltning Saltningen består af to trin, hvor skinkernes kødoverflade i første saltning gnubbes med salt tilsat 20% vand, hvorefter der drysset et tyndt lag tørt salt over. Efterfølgende lagres de ved 75-90 RH% og en temperatur på 1-4 C. Den anden saltning består af en gentagelse efter 5 6 dage, men denne gang lagres skinkerne i 21 dage ved 70-80 RH% og fortsat en temperatur på 1-4 C for at opnå en mild dehydrering. Udligningsperiode og vask I den efterfølgende udligningsperiode hænger skinkerne ved 1-4 C i 2-3 måneder. Målet er at udligne saltgradienten og sænke vandaktiviteten. Udligningsperioden inddeles i to faser; i første fase (14 dage) hænger skinkerne ved en 50-60 RH% for at AAS ICP/MS UV-VIS LC/MS GC/MS FT-IR/NIR Ny FT-IR? - Så er det også os! 48 16 62 00 Gydevang 17-19 3450 Allerød dansk kemi, 86, nr. 11, 2005 24
2 1 Rå Trimning uafhængig HPLC service -et reelt alternativ 3 Saltning 4 Udligningsperiode 5 Vask 15-18 o C 6 Tørring 7020 6688 www.labservice.dk hple@labservice.dk LAB service Palle Schultz & Morten Therbo. HPLC service i samarbejde med førende serviceorganisationer i Europa når det drejer sig om reservedele, træning og viden! 7 Modning 8 Parmaskinke Figur 1. Fremstillingsproces for Parmaskinke inddelt i seks overordnede procestrin: Trimning, saltning, udligningsperiode, vask, tørring samt modning. opnå udtørring. Det efterfølges af en periode (10 uger) ved 70-90 RH% (figur 2). Afslutningsvis vaskes der med lunkent vand for at fjerne overskydende saltkorn samt bakterielt dannet slim, hvilket efterfølges af tørring ved 20 C i 12 timer, hvorefter temperaturen gradvis sænkes til 15 C over 6 dage. Modning og kontrol Modning af skinkerne er det sidste og mest tidskrævende procestrin, og det er samtidig her de største ændringer i skinken finder sted. Modningen foregår ved 15 C og 75 RH %. Efter 5-7 måneder påsmøres en blanding af rismel, peber og svinefedt på skinkernes kødoverflade for at undgå en overdreven og uønsket udtørring. Længden af modningsperioden afhænger af skinkernes vægt, men ligger oftest mellem 6-11 måneder. Slutteligt udføres der organoleptisk bedømmelse af skinkerne mht. farve og smag. Skinkernes aroma kontrolleres med en heste-fibula (en nål fremstillet af en Figur 2. De saltede Parmaskinker hænger til udligning i klimarum under streng kontrol af temperatur og relativ luftfugtighed. 25 dansk kemi, 86, nr. 11, 2005
hesteknogle), der indføres i området omkring lårbenet, hvor der er størst risiko for bakteriel vækst. Aromaen sætter sig i den porøse hesteknogle, og aromaen og mikrobiel vækst bedømmes ved at lugte til fibulaen. Skinkerne skal på dette tidspunkt have mistet 23% af deres oprindelige vægt. Kontrollen udføres af en af»konsortiet«godkendt person. Ved godkendelse påbrændes den karakteristiske Parma-krone, der er forbrugernes garanti for ægthed og kvalitet (figur 3). Ændringer i Parmaskinkerne, vandindhold og a w Under den lange fremstillingsproces sker der en række fysisk-kemiske forandringer, der afhænger af samspillet mellem flere faktorer som skinkens ph-værdi, mængden af intramuskulært fedt, temperaturen og luftfugtighed under fremstillingen (tabel 1). Figur 3.»Parma-kongekronen«det officielle logo, der påbrændes skinkerne, hvis de er fremstillet efter de fastsatte retningslinjer og lever op til kvalitetskravene. Forløbet af de kemiske, enzymatiske og mikrobielle reaktioner afhænger af skinkernes vandindhold og vandaktivitet. Under fremstillingsprocessen opstår der en gradient i vandindholdet og i a w mellem skinkens forskellige muskler. Den udlignes under modningen, der er det sidste trin i fremstillingen. Den største diffusion af vand forekommer også under modningsprocessen. Diffusionen af vand ud af skinken er en langsom proces og kan tilnærmelsesvis beskrives med Ficks lov: (X-X 0 ) er afstanden i meter, (C-C 0 ) er forskellen i vandindhold i kg/m 3, og D er diffusionskoefficienten (m 2 /s). Problemet er, at diffusionskoefficienten pga. kødets heterogene sammensætning ikke kan betragtes som konstant, hvorfor der oftest arbejdes med en eksperimentel fundet eller en effektiv diffusionskoefficient (D e ). Også mange andre faktorer påvirker diffusionen. Lav ph medfører dårlig vandbindingsevne i kød, Skinkens indre Skinkens ydre FØDEVAREKEMI ( X- X ) = D C- ) 0 ( C0 ph -værdi Mængden af intramuskulært fedt Totalvægt Vandindholdet Forholdet mellem overflade af skind og kød Mængden af skimmel på overfladen Omgivelserne Temperatur RH % Flowhastigheden af luft Tabel 1. Fysisk-kemiske ændringer i Parmaskinker under den lange fremstillingsproces. intramuskulært fedt virker som en barriere for diffusionen af vand, mens størrelsen af skinken og det initiale vandindhold også har betydning. Den vigtigste faktor er forholdet mellem skind- og kødoverfladen, da fordampningen af vand kun forekommer gennem kødoverfladen. Derfor er det også vigtigt, at kødoverfladen holdes fri for skimmelvækst, der kan nedsætte fordampningen. Saltdiffusion Saltdiffusionen ind i skinken er en langsom proces. Som for vandindholdet opstår der en gradient mellem de ydre og de indre muskler, der kan beskrives med Ficks lov. De eksperimentelt fundne effektive diffusionskoefficienter, D e, for saltdiffusionen er 20 gange højere end for vand. Saltdiffusionen påvirkes ligeledes af forskellen mellem de indre og ydre muskler. 4-5 måneder inde i fremstillingsprocessen er saltgradienten mellem de ydre og indre muskler udlignet. Enzymatiske reaktioner og lipidoxidation De største forandringer i Parmaskinkens kemiske sammensætning skyldes ændringerne i vand- og saltindhold, men også phændringen fra ca. 5,6 til 6,1 har betydning for det færdige produkt. Andre ændringer er dog lige så vigtige for kvaliteten. De er et resultat af lipidoxidation og af enzymatisk aktivitet af proteaser og lipaser (figur 4 og 5). De proteolytiske og lipolytiske enzymer er generelt stabile. Flere bevarer deres aktivitet gennem hele fremstillingsproceduren, og deres nedbrydningsprodukter ophobes sammen med lipidoxidationsprodukterne. Enzymernes aktivitet afhænger af temperaturen, og deres aktivitet topper i denne modningsperiode pga. den høje temperatur. Den protolytiske aktivitet har en direkte effekt på teksturen, idet proteolytiske enzymer nedbryder det karakteristiske muskelnetværk. Enzymerne har også en altafgørende effekt på Parmaskinkens samlede flavor, idet der dannes peptider og frie aminosyrer, der direkte påvirker smagen eller virker som forstadier for flygtige aromaforbindelser. Især de frie aminosyrer er af betydning for aromaen. Via decarboxylering og transaminering danner de Strecker-aldehyder med lav lugttærskel. Frie fedtsyrer og flygtige produkter fra den oxidative nedbrydning af umættede fedtsyrer påvirker flavoren eller er forstadier i flavordannelsen. Den lipolytiske aktivitet og den oxidative nedbrydning påvirker også de umættede fedtsyrers tekstur i det underliggende fedtvæv og er årsagen til dets harske aroma og gule farve. De lipolytiske reaktioner i Parmaskinke kan beskrives som en hydrolyse af triglyceriderne og phospholipiderne til monoog diglycerider samt frie fedtsyrer. Den lipolytiske aktivitet Sarkoplasmiske og myofibrillære proteiner Oligo-peptider Di- og tri-peptider Frie aminosyrer Cathepsin Calpain Tripeptidylpeptidase Dipeptidylpeptidase Dipeptidase Aminopeptidase Carboxylpeptidase Figur 4. Proteolytiske ændringer under fremstillingen af Parmaskinke dansk kemi, 86, nr. 11, 2005 26
foregår under hele fremstillingsprocessen, men aktiviteten er mest intens under saltningen og i den efterfølgende udligningsperiode. Frie fedtsyrer dannes dog fortsat helt frem til den sidste del af modningsprocessen. Det efterfølges af et fald i koncentrationen, der skyldes oxidativ nedbrydning. Måling af primære (peroxid-tal) og sekundære (TBAtal) oxidationsprodukter viser dynamikken mellem disse parametre, hvor der for begge størrelser sker en stigning efterfulgt af et fald senere i processen. Slutprodukterne ved lipidoxidation er flygtige forbindelser eller fluorescerende tertiære oxidationsprodukter. Måling af overfladefluorescens igennem fremstillingen af Parmaskinke viser, at mængden af fluorophorer stiger sidst i processen. Triglycerider Muskelfedt Phospholipider Di - og monoglycerider Frie fedtsyrer Frie fedtsyrer Lysosomale lipaser Neutrale lipaser Lysosomale lipaser FØDEVAREKEMI Phospholipaser Farvedannelse i Parmaskinke Hvordan dannes Parmaskinkes stabile ensartede røde farve? Indholdet af nitrit og nitrat i det tilladte havsalt har været diskuteret som kilde til mulig dannelse af det røde MbFe(II)NO, men analyser af saltet har vist, at nitrit og nitrat forekommer i utilstrækkeligt mængder. Bakteriel farvedannelse Det er vist, at pigment ekstraheret med 75 vol/vol % acetone/ Figur 5. Lipolytiske ændringer under fremstillingen af Parmaskinke. vand fra Parmaskinke og pigment dannet i kødmodelsystemer indeholdende Stafylokokker har identiske absorptionsspektre. Der var tydelig spektral forskel mellem pigmentet ekstraheret fra kødprodukter tilsat nitrit og Parmaskinke. Det blev derfor konkluderet, at Parmapigmentet blev dannet ved bakteriel aktivitet, og at der var tale om en hidtil ukendt form af myoglobin [2]. Det blev efterfølgende verificeret i et spegepølsemodelsystem, hvor 27 dansk kemi, 86, nr. 11, 2005
FØDEVAREKEMI Stafylokok-arter tilsyneladende dannede den samme ukendte farve som i Parmaskinke. Det blev senere foreslået, at det ukendte myoglobinderivat fra Parmaskinke, dannet af Staphylococcus xylosus i modelsystemer, var et hexakoordineret kompleks mellem NO og ferromyoglobin (deoxymyoglobin, MbFe(II)) (på baggrund af ESR-spektre). Et stabilt pigment Parmapigmentet er mere stabilt end forventet for denne type NO-komplekser. Ekstraheret med vand er det stabilt i ph-intervallet 6-10, og ved lave ph-værdier omdannes det ikke til det gråbrune metmyoglobin (MbFe(III)), der normalt dannes ved oxidation af de rødfarvede myoglobinformer. Parmapigmentet reagerer heller ikke med oxiderende stoffer som ferricyanid [3]. Et andet interessant, men ubesvaret spørgsmål er: Hvordan kan bakterier give en ensartet rød farve gennem hele skinken? To pigmenter giver farven I år 2003 introducerede Parolari et al. [4] en ny tretrins ekstraktionsmetode til spektrale undersøgelser af Parmaskinkepigmentet. Han viste, at Parmapigmentet består af et polært og et apolært pigment, og at andelen af apolært pigment stiger med stigende procestid (figur 6). ESR-spektroskopi viste (figur 7), at Parmapigmentet på intet tidspunkt i den lange fremstillingsproces var et nitrosyleret myoglobinkompleks [5]. Begge forskningsgrupper [4;5] konkluderede, at spektre af det apolære og det polære Parmapigment adskilte sig fra spektre af alle kendte myoglobinderivater fundet i kød- og kødprodukter (MbFe(II)O 2, MbFe(II)NO og MbFe(III)). Det blev diskuteret om den 6. ligand i Parmaskinkens myoglobinderivat kunne være svolvholdige eller basiske aminosyrer dannet under den ekstensive proteolyse [5]. Det polære og det apolære pigment virker begge antioxidativt, dog ikke i samme grad som MbFe(II)NO. Derimod er det apolære Parmapigment mere holdbart end MbFe(II)NO mht. lys og varme. Selv 70 C forårsager ikke nedbrydning i opløsningen. Parmapigment er zink-protoporphyrin I 2004 viste en japansk forskningsgruppe, at pigmentet var et zinkkompleks af protoporphyrin IX [6]. Under Parmaskinkens lange saltnings- og modningsperiode udskiftes jern i hæmgruppen med zink (figur 8). Teorien understøttes af modelforsøg, hvor homogeniseret svinekød tilsat ekstra myoglobin (pakket anaerobt og lagret) danner Zn-protoporphyrin. Den nye teori har rejst spørgsmålet: Hvor kommer al den zink fra? Men rent faktisk er der mere zink end jern i en velafblødt muskel. Skinkemusklen Semimembranosus indeholder 3,6 mg zink/100 g kød og 0,66 mg jern/100 g kød. Det er ca. fem gange så meget zink som jern. Alt i alt virker teorien fremsat af den japanske forskningsgruppe plausibel. Mekanismen for udbytningen af jern med zink er endnu ukendt, men bakteriel, enzymatisk eller en rent kemisk udbytning synes mulig. Analyser af forskellige kødprodukter fremstillet med varierende saltningsprocedure viste, at Zn-protoporphyrin fandtes i alle undersøgte produkter, dog i mindre mængder end i Parmaskinke [7]. Figur 6. Ændringer i koncentration af det polære (... ) og det apolære ( ) Parmapigment gennem fremstillingsprocessen [5]. I et kødmodelsystem blev det også vist, at nitrit tilsat ved saltning fuldstændigt inhiberer dannelse af Zn-protophyrin [7]. Inspiration til produktudvikling Parmapigmentet er identificeret. Tilbage er imidlertid en række uløste kemiske problemer. Hvad driver udbytningsprocessen, og hvad bliver der af myoglobins jern? Frit jern er stærkt g 1 = 2.0207 g 2 = 2.0115 320 325 330 335 340 345 Magnetfelt [Gauss] g 3 = 2.0009 Figur 7. ESR-spektre ved 150K af a) rent nitrosylmyoglobin (0,20 mm); b) Serranoskinke (tilsat nitrit under fremstillingen); c) kogt og lagesaltet skinke (saltlagen er tilsat nitrit) og d) Parmaskinke (kun tilsat NaCl under fremstillingen) [5]. a) b) c) d) AAS ICP/MS UV-VIS LC/MS GC/MS FT-IR/NIR Ny ICP-MS? - Så er det også os! 48 16 62 00 Gydevang 17-19 3450 Allerød dansk kemi, 86, nr. 11, 2005 28
FØDEVAREKEMI Figur 8. Udbytningen af jern med zink i porphyrin. prooxidativt. Det kendes fra varmebehandlet kød, hvor jern ved opvarmning eller genopvarmning katalyserer lipidoxidationen meget kraftigt. Men Parmaskinker er ikke udsat for lipidoxidation, og de bliver ikke harske. Detaljerede svar på disse spørgsmål kan medføre produktion af en helt ny type charcuterivarer, hvor nitritsaltning kan erstattes af en styret sænkning af vandaktivitet og farvedannelse ved dannelse af zink-porphyrin og oxidationsbeskyttelse ved jernbinding. Et forslag er, at jern bindes af de mange lavmolekylære forbindelser, der dannes ved proteolyse og lipolyse i kød. I Parmaskinke kan man forstille sig, at jern inaktiveres gennem kompleksdannelse, måske med frie fedtsyreanioner. Det er næppe hele sandheden. Den lave vandaktivitet og den høje chloridkoncentration kan også fremme udfældning af blandede jernoxider, måske i kombination med sulfider, hvor sulfid dannes ved nedbrydning af aminosyrer. Der forestår et større udviklingsarbejde for at kunne kontrollere og øge hastigheden af disse omdannelser i produkterne. Det virker sandsynligt, at der kan udvikles teknologier, der vil kunne resultere i kødprodukter fremstillet med en kortere produktionstid, men med kvalitetsegenskaber som Parmaskinker. Det kræver forskning og udvikling at følge den komplicerede kinetik, hvor jern deaktiveres, mens lipiderne beskyttes og zink bindes i hæmproteinerne for at omdanne disse til zink-prophyrin. 2. Morita, H., Niu, J, Sakata, R. & Nagata, Y. (1996). Red pigment of Parma ham and bacterial influence on its formation. Journal of Food Science, 61(5):1021-1023. 3. Sakata, R. (2000). Studies on physicochemical characteristics of red pigments in meat products. Animal Science Japanese. 71(1):1-16. 4. Parolari, G., Gabba, L. & Saccani, G. (2003). Extraction properties and absorption spectra of dry cured hams made with and without nitrate. Meat Science. 64:483-490. 5. Møller, J. K. S., Adamsen, C. E. & Skibsted, L. H. (2003). Spectral characterisation of red pigment in Italian-type dry-curd ham. Increasing lipophilicty during processing and maturation. European Food Research and Technology. 216:290-296. 6. Wakamatsu, J., Nishimura, T. & Hattori, A. (2004a). A Zn-porphyrin complex contributes to bright red color in Parma ham. Meat Science. 67:95-100. 7. Adamsen, C. E., Møller, J. K. S., Laursen, K., Olsen, K. & Skibsted, L. H. (2005). Zn-porphyrin formation in cured meat product. Effect of added salt and nitrite. Accepted for publication in Meat Science den 21/ 8-2005 E-mail-adresser Christina Elslund Adamsen: cep@kvl.dk Jens K. S. Møller: jemo@kvl.dk Leif H. Skibsted: ls@kvl.dk Referencer: 1. Parolari, G. (1996) Review: Achievements, needs and perspectives in dry-cured ham technology: the example of Parma ham. Food Science and Technology International. 2(2):69-78. 29 dansk kemi, 86, nr. 11, 2005