QIAamp DSP-viruskit Håndbog

Transkript

1 _DA :33 Uhr Seite 1 November 2007 QIAamp DSP-viruskit Håndbog Version 1 Σ 50 IVD QIAamp DSP-viruskit er et generisk system, der anvender QIAamp-teknologi til isolering og oprensning af virale nukleinsyrer fra humant plasma eller serumprøver til in vitro-diagnostiske formål. Til in vitro-diagnosticering REF H B DA 11/2007 QIAGEN GmbH, D Hilden, Tel: R1 MAT DA Sample & Assay Technologies

2 _DA :33 Uhr Seite 2 Varemærker: QIAGEN, QIAamp, QIAvac, MinElute (QIAGEN Group); AMPLICOR HBV MONITOR, AMPLICOR HCV MONITOR, AMPLICOR HIV-1 MONITOR, COBAS, TaqMan (Roche Group); artus, RealArt (artus GmbH); Eppendorf (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH). Registrerede navne, varemærker osv. anvendt i dette dokument, selv når de ikke specifikt er markeret som sådan, skal ikke betragtes som værende juridisk ubeskyttede. PCR-processen er dækket af amerikanskepatenter 4,683,195 og 4,683,202 og udenlandske ekvivalenter tilhørende Hoffmann-La Roche AG QIAGEN. Alle rettigheder forbeholdes.

3 _DA :33 Uhr Seite 3 Indholdsfortegnelse Kittet indeholder 4 Symboler 5 Opbevaring 6 Kvalitetskontrol 6 Formål 6 Begrænsninger af produktets anvendelse 7 Sikkerhedsoplysninger 7 Indledning 9 Princip og procedure 10 Udstyr og reagenser, der skal leveres af bruger 14 Vigtige Bemærkninger 15 Vigtige punkter før start 15 Forberedelse af RNA 15 Opbevaring af prøver 16 Forberedelse af reagenser og buffere 16 Eluering af virale nukleinsyrer 19 Virale nukleinsyrers udbytte og kvalitet 19 Opsætning af QlAvac 24 Plus vakuumsystem 19 Protokol Isolering og oprensning af viral nukleinsyrer fra plasma og serum 22 QIAGEN-forhandlere 27 QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/2007 3

4 _DA :33 Uhr Seite 4 Kittet indeholder QIAamp DSP-viruskit Katalognr Antal præparater 50 QIAamp MinElute QIAamp MinElute Kolonner COL 50 med vaskeglas (WT) (2 ml) EXT Kolonneforlængere (3 ml) COL EXT 50 ET Elueringsglas (1,5 ml) ELU TUBE 50 VC VacConnectors VAC CON 50 LT Lysisglas (2 ml) LYS TUBE 50 WT Vaskeglas (2 ml) WASH TUBE 50 AL Lysisbuffer* LYS BUF 33 ml AW1 Vaskebuffer 1* (koncentrat) WASH BUF 1 CON 19 ml AW2 Vaskebuffer 2 (koncentrat) WASH BUF 2 CON 13 ml AVE Elueringsbuffer (lilla hætter) ELU BUF 4 x 2 ml PS Proteasesolvent QPROT SOLV 4,4 ml Carrier Carrier RNA (røde låg) CAR RNA 310 µg QP QIAGEN Protease QPROT 1 hætteglas CD H B 1 Håndbog H B 1 * Indeholder guanidinhydrochlorid. Ikke kompatibel med desinfektionsmidler, der indeholder blegemiddel. For at få yderligere oplysninger, se side 7. Indeholder natriumazid som konserveringsmiddel. Genopslæmningsmængde 4,4 ml. 4 QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/2007

5 _DA :34 Uhr Seite 5 2 C 8 C Symboler Σ 50 i IVD REF LOT MAT COMP VOL i Kit indeholder reagenser til 50 prøvepræparater Se informationen i håndbogen Skal anvendes inden Medicinsk udstyr til in vitro-diagnosticering Katalognummer Lotnummer Materialenummer Komponenter Volumen Temperaturbegrænsninger Juridisk fabrikant Ved ankomst Vigtig bemærkning Skift handsker efter protokoltrin med dette mærke Åbnes ved levering; opbevar QIAamp MinElute-kolonner ved 2 8 C? EtOH ADD CONT LYOPH RCNS EtOH GuHCI SUBT Skriv den aktuelle dato ned efter tilsættelse af ethanol til flasken Tilsætter Indeholder Frysetørret Rekonstituér i Ethanol Guanidinhydrochlorid Subtilisin Fører til QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/2007 5

6 _DA :34 Uhr Seite 6 Opbevaring QIAamp MinElute-kolonner bør opbevares ved 2 8 C ved ankomst. Alle buffere kan opbevares ved stuetemperatur (15 25 C). Frysetørret Carrier RNA kan opbevares ved stuetemperatur (15 25 C) indtil udløbsdatoen. Carrier RNA kan kun opløses i elueringsbuffer (AVE); opløst Carrier RNA bør straks tilsættes lysisbuffer (AL) som beskrevet på side 16. Denne opløsning bør tilberedes frisk og er stabil ved 2 8 C i op til 48 timer. Ubrugte portioner Carrier RNA opløst i elueringsbuffer (AVE) bør nedfryses i alikvoter ved 20 C. Frysetørret QIAGEN Protease (QP) (15 25 C) kan opbevares ved stuetemperatur (15 25 C) indtil udløbsdatoen uden forringelse af ydeevne. Rekonstitueret QIAGEN Protease (QP) er stabilt i op til 1 år, når det opbevares ved 2 8 C, men kun indtil udløbsdatoen. Rekonstitueret vaskebuffer 1 (AW1) og rekonstitueret vaskebuffer 2 (AW2) er stabileiop til 1 år, når de opbevares ved stuetemperatur (15 25 C), men kun indtiludløbsdatoen. Kvalitetskontrol I henhold til QIAGEN's certificerede totale kvalitetshåndteringssystem testes hvert lot QIAamp DSP-viruskit mod forudbestemte specifikationer for at sikre konstant produktkvalitet. Formål QIAamp DSP-viruskit er et generisk system, der anvender QIAamp-teknologi til isolering og oprensning af virale nukleinsyrer fra humant plasma eller serumprøver til in vitro-diagnostiske formål. Alle diagnostiske resultater, der genereres vha. prøvepræparatproceduren sammen med efterfølgende diagnostisk NAT-analyse, bør tolkes under hensyntagen til andre kliniske eller laboratorieresultater. Produktet er beregnet til brug af professionelle brugere, såsom laboratoriepersonale og læger, der er uddannet i molekylærbiologiske teknikker. Det er beregnet til anvendelse sammen med enhver efterfølgende applikation, der anvender enzymatisk amplifikation eller anden enzymatisk modifikation af DNA eller RNA efterfulgt af signaldetektion eller amplifikation. De isolerede og oprensede virale nukleinsyrer kan anvendes i kvalitative (feks. blodscreening) så vel som kvantitative (feks. viral belastningsmonitorering), diagnostiske NAT-analyser. For at minimere uregelmæssigheder i diagnostiske resultater, er produktet beregnet til at blive anvendt sammen med en intern kontrol så vel som positive og negative kontroller i løbet af prøveforberedelsesprocessen og prøveamplifikation og detektion i henhold til den efterfølgende analyse, der anvendes. Produktet er designet til brug sammen med QIAvac 24 Plus-vakuumsystem eller et tilsvarende vakuumsystem. 6 QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/2007

7 _DA :34 Uhr Seite 7 Begrænsninger af produktets anvendelse Kittet må ikke anvendes til blod, væv, knoglemarv eller dyrkede celler. Kittet er heller ikke beregnet til isolering og oprensning af nukleinsyrer fra bakterier, svampe eller parasitter. Kittets ydeevne til isolering og oprensning af virale nukleinsyrer fra andre cellefri kropsvæsker, såsom urin og cerebrospinalvæske, er ikke blevet evalueret. Sikkerhedsoplysninger Når der arbejdes med kemikalier skal der altid bæres egnet laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller. For at få yderligere oplysninger konsulteres det behørige sikkerhedsdatablad (MSDS). Dette fås online i praktisk og kompakt PDFformat hos hvor du kan finde, se og udskrive sikkerhedsdatabladet for hvert QIAGEN-kit og kit-komponent. FORSIGTIG: Der må IKKE tilsættes blegemiddel eller syreholdige opløsninger direkte i prøvepræparataffaldet. Lysisbuffer (AL) og vaskebuffer 1 (AW1) indeholder guanidinhydrochlorid, som kan danne højt reaktive forbindelser, når de kombineres med blegemiddel. Hvis væske, der indeholder disse buffere, deles, rengøres med egnet laboratoriedetergent og vand. Hvis den delte væske indeholder potentielt infektiøse midler, rengøres det påvirkede område først med laboratoriedetergent og vand og dernæst med 1% (v/v) natriumhypochlorit. Hvis bufferflaskerne er beskadigede eller lækker, bæres der handsker og beskyttelsesbriller, når flaskerne bortskaffes for at undgå personlig skade eller skade på andre. QIAGEN har ikke testet det flydende affald, der genereres af QIAamp DSPvirusproceduren mht. resterende infektiøse materialer. Kontaminering af det flydende affald med resterende infektiøse materialer er meget usandsynligt, men kan ikke helt udelukkes. Derfor skal flydende affald betragtes som infektiøst og håndteres og bortskaffes i henhold til lokale sikkerhedsbestemmelser. QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/2007 7

8 _DA :34 Uhr Seite 8 De følgende risiko- og sikkerhedssætninger gælder komponenter af QIAamp DSP viruskit: Lysisbuffer (AL) og vaskebuffer I (AW1) Indeholder guanidinhydrochlorid: skadelig, irritament. Risiko- og sikkerhedssætninger:*r22-36/38, S QIAGEN Protease (QP) Indeholder subtilisin (frabacillus subtilis): sensibilisator, irritament. Risiko- og sikkerhedsfraser:*r37/ , S /37/ timers nødoplysninger Medicinske oplysninger vedrørende nødstilfælde kan fås på engelsk, fransk og tysk 24 timer i døgnet fra: Giftinformationscentralen, Mainz, Tyskland Tlf.: * R22: Farlig ved indtagelse; R36/38: Irriterer øjnene og huden; R37/38: Irriterer åndedrætsorganerne og huden; R41: Risiko for alvorlig øjenskade; R42: Kan give overfølsomhed ved indånding; S13: Må ikke opbevares sammen med nærings- og nydelsesmidler samt foderstoffer; S22: Undgå indånding af støv; S24: Undgå kontakt med huden; S26: Kommer stoffet i øjnene, skylles straks grundigt med vand og læge kontaktes; S36: Brug særligt arbejdstøj; S36/37/39: Brug særligt arbejdstøj, egnede beskyttelseshandsker og briller/ansigtsskærm; S46: Ved indtagelse, kontakt omgående læge og vis denne beholder eller etiket. 8 QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/2007

9 _DA :34 Uhr Seite 9 Indledning QIAamp DSP viruskittet anvender veletableret teknologi til samtidig isolering og oprensning af viralt DNA og RNA. QIAamp DSP-virusproceduren kombinerer de selektive bindingsegenskaber for en silicabaseret membran med minimale elueringsmængder på 20 μl eller 60 μl. Det lineære værdiområde for QIAamp DSP-virusproceduren er blevet bestemt ved HIV RNA og HBV DNA i adskillige efterfølgende diagnostiske analyser (Tabel 1, Figur 1 og 2). Tabel 1. Efterfølgende diagnostiske analyser i hvilke det lineære værdiområde for QIAamp DSP-virusproceduren er blevet testet Analyse Real-time RT-PCR af HIV RNA Real-tids-PCR af HBV DNA Kit TaqMan analyser og COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR test TaqMan-analyse og COBAS AMPLICOR HBV MONITOR test Lineært værdiområde for QIAamp DSP-virusprocedure vha. TaqMan-analyser A logresult IU/ml y = 1,0042x + 0, R 2 = 0, loginput IU/m l B logresult IU/ml y = 0,9725x + 0,0982 R 2 = 0, loginput IU/ml Figur 1 Det lineære værdiområde for QIAamp DSP-virusproceduren ved 60 μl elueringsmængde blev bestemt vha. TaqMan-analyser for A HIV RNA og B HBV DNA. QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/2007 9

10 _DA :34 Uhr Seite 10 Lineært værdiområde for QIAamp DSP-virusprocedure vha. COBAS AMPLICOR MONITOR-tests A logresult IU/ml y = 1,0098x + 0,1234 R 2 = 0, loginput IU/ml B logresult IU/ml y = 0,8839x + 0,1718 R 2 = 0, loginput IU/ml Figur 2 Det lineære værdiområde for QIAamp DSP-virusproceduren ved 60 μl elueringsmængde blev bestemt vha. COBAS AMPLICOR MONITOR-tests for A HIV RNA og B HBV DNA. Proceduren er egnet til anvendelse sammen med plasma eller serum; begge kan indeholde citrat eller EDTA. Prøver kan være enten friske, frysetørrede eller frosne, hvis de ikke har været frosne og optøede mere end én gang. Proceduren kan anvendes til isolering af viralt RNA og DNA fra en bred række RNA- og DNA-vira. Proceduren er designet til at undgå prøve-til-prøve krydskontaminering og muliggør sikker håndtering af potentielt infektiøse prøver. Proceduren er meget velegnet til samtidig behandling af multiple prøver. Virale nukleinsyrer elueres i elueringsbuffer (AVE), klar til anvendelse i amplifikationsreaktioner eller opbevaring ved 20 C. Princip og procedure QIAamp DSP-virusproceduren består af 4 trin: Lysering af viruspartikler i prøven Binding af de virale nukleinsyrer i lysatet til membranen af en QIAamp MinElute Column Vask af membranen Eluering af de virale nukleinsyrer fra membranen Proceduren udføres vha. QIAamp MinElute Columns på et vakuummanifold. 10 QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/2007

11 _DA :34 Uhr Seite 11 Prøvevolumen Detektionsgrænsen (DL) og kvantificeringsgrænsen (QL) er blevet fastsat i henhold til ICH-retningslinjerne 2QA og 2QB, for QIAamp DSP-virusproceduren (med en startprøvemængde på 500 μl og elueringsmængder på 20 μl og 60 μl) vha. forskellige efterfølgende diagnostiske analyser (Tabel 2 og 3). Tabel 2. Detektionsgrænse for QIAamp DSP-virusproceduren Analyse Elutionsmængde 95% grænseværdi artus RealArt HBV DNA. 20 μl 2,31 IU/ml (n=240) artus RealArt HCV RNA 20 μl 24,31 IU/ml (n=192) AMPLICOR manuel HIV RNA 60 μl 90,92 IU/ml (n=209) TaqMan HBV DNA 60 μl 4,73 IU/ml (n=192) Tabel 3. Kvantifikationsgrænse for QIAamp DSP-virusproceduren Analyse QL CV TaqMan HBV DNA 5,7 IU/ml < 70% (n=88) TaqMan HIV RNA 52 IU/ml < 60% (n=88) COBAS AMPLICOR HIV RNA 100 IU/ml < 60% (n=88) COBAS AMPLICOR HBV DNA 30 IU/ml < 60% (n=88) COBAS AMPLICOR HCV RNA 700 IU/ml < 60% (n=66) Lysering af viruspartikler Prøver bliver lyseret under denatureringsforhold ved forhøjede temperaturer. Lyse blev udført ved tilstedeværelsen af QIAGEN Protease (QP) og lysisbuffer (AL), som sammen sikrer inaktivering af RNaser. QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/

12 _DA :34 Uhr Seite 12 Binding af nukleinsyrer til QIAamp MinElute-kolonnemembranen For at kunne optimere bindingen af viralt DNA og RNA til QIAamp MinElute kolonnemembranen, tilsættes der først ethanol til lysaterne. Hvert lysat bliver dernæst tilsat en QIAamp MinElute Column og virale nukleinsyrer adsorberes på silicagelmembranen samtidig med, at lysatet trækkes igennem via vakuumtryk. Fjernelse af restkontaminanter Mens de virale nukleinsyrer forbliver bundne til QIAamp MinElute-kolonnemembranen, bliver kontaminanter effektivt vasket bort vha. den første vaskebuffer 1 (AW1), dernæst vaskebuffer 2 (AW2) og dernæst ethanol. Eluering af rene nukleinsyrer Virale nukleinsyrer elueres fra QIAamp MinElute-kolonnemembranen vha. elueringsbuffer (AVE). QIAamp MinElute-kolonner muliggør elueringsmængder på 20 μl eller 60 μl. Afhængig af den efterfølgende analyse, der anvendes, kan nukleinsyre-eluatet bestå af op til 50% af reaktionsmængden uden nogen hæmningseffekter. 12 QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/2007

13 _DA :34 Uhr Seite 13 QIAamp DSP Virus-metod Prøve Lysér Læs protokollen (side 22) nøje før der startes Tilsæt 75 μl QP, 500 μl prøve og 500 μl AL til LT Vortex 15 sek. Inkubér 15 min (±1 min) ved 56 C (±1 C) Tilsæt 600 μl ethanol Vortex 15 sek. Inkubér 5 min. (±1 min.) ved stuetemperatur (15 25 C) Bind Overfør lysat til QIAamp MinElute-kolonne med tilknyttet EXT Vakuum Vask (AW1) Fjern EXT inden vakuum anvendes Tilsæt 600 μl rekonstitueret AW1 Fjern EXT Vakuum Vakuum Vakuum Vask (AW2) Vask (etanol) Tilsæt 750 μl rekonstitueret AW2 Tilsæt 750 μl ethanol Eluér Rene virale nukleinsyrer Tørcentrifugér Anbring QIAamp MinElute-kolonne i WT Centrifugér 1 min. ved o/min Anbring QIAamp MinElute-kolonne i WT Inkubér 3 min. ved 56 C Anbring QIAmp MinElute-kolonne i ET Tilsæt 20 μl eller 60 μl AVE Inkubér 3 min. ved stuetemperatur (15 25 C) Centrifugér 1 min. ved o/mi QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/

14 _DA :34 Uhr Seite 14 Udstyr og reagenser, der skal leveres af bruger Når der arbejdes med kemikalier skal der altid bæres egnet laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller. For at få yderligere oplysninger konsulteres det behørige sikkerhedsdatablad (MSDS), der fås fra produktets leverandør. Ethanol (96 100%) Pipetter* og pipettespidser (for at forhindre krydskontaminering anbefaler vi stærkt at anvende pipettespidser med aerosolskærme) Engangshandsker Varmeblok* til lysering af prøver ved 56 C (vi anbefaler Eppendorf Thermomixer comfort med thermoblok til 2,0 ml mikroprøveglas ) Mikrocentrifuge* Målecylinder (50 ml) Vortexer QIAvac 24 Plus-vakuumsystem (QIAvac 24 Plus, kat.nr , QIAvac forbindelsessystem, kat.nr og vakuumpumpe, kat.nr.84020) eller et tilsvarende generelt laboratorievakuumsystem * For at sikre, at prøver bliver behandlet korrekt i QIAamp DSP-virusproceduren, anbefaler vi på det kraftigste, at instrumenter (feks. pipetter og varmeblokke) kalibreres i henhold til fabrikantens anbefalinger. Dette er ikke en fuldstændig liste over forhandlere og omfatter ikke mange vigtige leverandører af biologiske forsyninger. Tilgængelig fra i midten af 2004; tjek venligst 14 QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/2007

15 _DA :34 Uhr Seite 15 Vigtige Bemærkninger Vigtige punkter før start Når du har modtaget kittet tjekkes kittets komponenter for beskadigelse. Hvis blisterpakningerne eller bufferflaskerne er beskadigede, kontaktes QIAGEN's tekniske service eller den lokale forhandler. Hvis der spildes væske, se "Sikkerhedsoplysninger" (side 7). Der må ikke anvendes beskadigede kitkomponenter, eftersom deres anvendelse kan føre til ringe ydeevne af kittet. Brug altid Rnase-frit udstyr. Opbevar ethanol (96-100%) på is under proceduren. Udskift altid pipettespidser mellem væskeoverførsler. For at undgå krydskontaminering anbefaler vi anvendelse af pipettespidser med aerosolskærme. Alle centrifugeringstrin udføres ved stuetemperatur (15 25 C). Anvend altid engangshandsker og tjek regelmæssigt, at de ikke er kontamineret med prøvemateriale. Bortskaf handsker, hvis de bliver kontamineret og i det mindste ved alle trin, der er markeret med handskesymbolet. For at undgå krydskontaminering åbnes der kun ét glas ad gangen. Anvend ikke kitkomponenter fra andre kits sammen med det kit, som du i øjeblikket anvender, medmindre lotnumrene er identiske. Undgå, at kitreagenserne udsættes for bakteriekontaminering. For at sikre sikkerhed mod potentielt infektiøst materiale, anbefaler vi at arbejde under laminare luftstrømsforhold, indtil prøverne er lyserede. Dette kit bør kun anvendes af personale, der er uddannet i in vitro diagnostisk laboratoriepraksis. Proceduren giver anvisninger på behandlingen af en enkelt plasma- eller serumprøve. Op til 24 prøver kan imidlertid behandles samtidig på QIAvac 24 Plus-vakuumsystemet. Forberedelse af RNA Forberedelse af RNA Når viralt RNA forberedes, skal der arbejdes hurtigt under de manuelle trin af proceduren. Elueringsbuffer (AVE) indeholder natriumazid*, et antimikrobielt middel, der forhindrer vækst af RNase-dannende organismer. Da denne buffer imidlertid ikke indeholder nogen Rnase-nedbrydende kemikalier, vil den ikke aktivt hæmme Rnaser, der introduceres pga. ukorrekt håndtering. Der skal udvises yderste forsigtighed for at undgå kontaminering med Rnaser, når elueringsbuffer (AVE) håndteres. * Når der arbejdes med kemikalier skal der altid bæres egnet laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller. QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/

16 _DA :34 Uhr Seite 16 Opbevaring af prøver Efter prøvetagning og centrifugering, kan plasma eller serum opbevares ved 2 8 C i op til 6 timer. Ved langtidsopbevaring anbefales det at fryse dem ned ved 20 C eller 80 C i alikvoter. Frosne plasma- eller serumprøver må ikke optøes mere end én gang. Gentagen fryse-optøning resulterer i denaturering og udfældning af proteiner, der resulterer i reducerede virale titre og derfor reduceret udbytte af virale nukleinsyrer. Cryopræcipitater, der er dannet under fryse-optøningen vil endvidere tilstoppe QIAamp MinElute kolonnemembranen. Hvis cryopræcipitater er synlige, bør de pelleteres via centrifugering ved ca xg i 3 minutter. Den rensede supernatant bør aspireres og behandles straks uden at forstyrre pelleten. Forberedelse af reagenser og buffere Forberedelse af QIAGEN Protease Tilsæt hele indholdet af hætteglasset med 4,4 ml Protease Solvent (PS) til hætteglasset med frysetørret QIAGEN Protease (QP) og bland grundigt. For at undgå, at det skummer, blandes det ved at vende hætteglasset på hovedet adskillige gange. Sørg for, at QIAGEN Protease (QP) er fuldstændigt opløst. i Tilsæt ikke QIAGEN Protease (QP) direkte til lysisbuffer (AL). Tilsæt Carrier RNA og intern kontrol til lysisbuffer Carrier RNA tjener to formål. Først forbedrer det bindingen af virale nukleinsyrer til QIAamp MinElute-kolonnemembranen, specielt hvis der er meget få målmolekyler i prøven. For det andet reducerer tilføjelsen af store mængder Carrier RNA chancen for viral RNA-nedbrydning i de sjældne tilfælde, hvor Rnase-molekyler ikke denatureres via de kaotropiske salte og detergenter i lysisbuffer (AL). Hvis Carrier RNA ikke bliver tilsat til lysisbuffer (AL), kan dette føre til reduceret viral RNA eller DNA-gendannelse. Carrier RNA kan også inkluderes i visse interne kontrolreagenser af kommercielle efterfølgende analyser. I disse tilfælde se de relevante brugsanvisninger fra fabrikanten af den efterfølgende analyse. Anvendelse af en intern kontrol anbefales på det kraftigste, når QIAamp DSP-viruskit anvendes sammen med diagnostiske amplifikationssystemer. Intern kontrol-rna eller DNA og rekonstitueret Carrier RNA bør tilsættes lysisbuffer (AL) og blandes grundigt ved at vende glasset på hovedet 10 gange. For at undgå skumning, må der ikke bruges vortex. Se fabrikantens anvisninger mht. at bestemme den optimale koncentration af intern kontrol. Anvendes der en anden koncentration end den anbefalede, kan det resultere i fejlagtige resultater. Når den korrekte mængde intern kontrol, der skal anvendes, beregnes, skal der tages højde for startmængden af prøven og elueringsmængden. Husk, at QIAamp DSP-viruskittet anvender en startprøvemængde på 500 μl. 16 QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/2007

17 _DA :34 Uhr Seite 17 For at kunne forberede Carrier RNA-opløsningen, tilsættes 310 μl elueringsbuffer (AVE) til glasset med 310 μg frysetørret Carrier RNA for at opnå en opløsning på 1 μg/μl. Opløs Carrier RNA grundigt, afmål den i alikvoter af praktisk størrelse og opbevar den ved 20 C. Alikvoter af Carrier RNA må ikke fryses-optøs mere end 2 gange. Bemærk, at Carrier RNA ikke opløses i lysisbuffer (AL). Det skal først opløses i elueringsbuffer (AVE) og dernæst tilsættes lysisbuffer (AL). Sørg for, at Carrier RNA er helt opløst i den korrekte mængde elueringsbuffer (AVE) før det blandes med lysisbuffer (AL). i Anvend altid den korrekte interne kontrol til efterfølgende analyse. Se fabrikantens anvisninger for yderligere oplysninger. Beregn mængden af lysisbuffer (AL)/Carrier RNA-blanding, der er nødvendig pr. portion prøver ved at vælge antallet af prøver, der skal behandles samtidigt fra Tabel 4 (side 18). Mængder beregnes vha. følgende prøveberegning: n x 0,55 ml = y ml y ml x 11,2 μl/ml = z μl hvor: n = antallet af prøver, der skal behandles samtidigt y = beregnet mængde lysisbuffer (AL) z = mængde Carrier RNA/elueringsbuffer (AVE) der skal tilføjes lysisbuffer (AL) QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/

18 _DA :34 Uhr Seite 18 Tabel 4. Mængde lysisbuffer (AL) og Carrier RNA/elueringsbuffer (AVE), der er nødvendig til QIAamp DSP-virusproceduren Antal Vol. AL Vol. Carrier Antal Vol. AL Vol. Carrier prøver (ml) RNA/AVE (μl) prøver (ml) RNA/AVE (μl) 1 0,55 6,2 13 7,15 80,0 2 1,10 12,3 14 7,70 86,0 3 1,65 18,5 15 8,25 92,4 4 2,20 24,6 16 8,80 98,6 5 2,75 30,8 17 9,35 104,7 6 3,30 37,0 18 9,90 110,9 7 3,85 43, ,45 117,0 8 4,40 49, ,00 123,2 9 4,95 55, ,55 129,4 10 5,50 61, ,10 135,5 11 6,05 67, ,65 141,7 12 6,60 73, ,20 147,8 Forberedelse af vaskebuffer 1 Vha. en målecylinder tilsættes 25 ml ethanol (96-100%) til flasken med 19 ml Wash Buffer 1-koncentratet (AW1). Opbevar det rekonstituerede vaskebuffer 1 (AW1) ved stuetemperatur (15 25 C). i Bland altid det rekonstituerede vaskebuffer 1 (AW1) ved at vende flasken på hovedet adskillige gangen før proceduren startes. Forberedelse af vaskebuffer 2 Vha. en målecylinder tilsættes 30 ml ethanol (96-100%) til flasken med 13 ml vaskebuffer 2-koncentratet (AW2). Opbevar det rekonstituerede vaskebuffer 2 (AW2) ved stuetemperatur (15 25 C). i Bland altid det rekonstituerede vaskebuffer 2 (AW2) ved at vende flasken på hovedet adskillige gangen før proceduren startes. Forberedelse af elueringsbuffer Fire glas elueringsbuffer (AVE) er vedlagt kittet. Pas på ikke at kontaminere bufferen med RNaser. Hvis der foretages 4 oprensningsprocedurer eller mindre vha. et enkelt kit, anbefaler vi at bortskaffe glasset med elueringsbuffer (AVE) efter færdiggørelse af hver procedure. 18 QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/2007

19 _DA :34 Uhr Seite 19 Eluering af virale nukleinsyrer For efterfølgende anvendelser, der kræver små startmængder (feks. visse PCR og RT- PCR-analyser), kan anvendelse af virale nukleinsyrer elueret i 20 μl elueringsbuffer (AVE) forøge analysesensibiliteten. Mængden af virale nukleinsyrer elueret fra en QIAamp MinElute Column kan være op til 5 μl mindre end mængden af elueringsbuffer (AVE), der blev brugt til kolonnen. Elueres virale nukleinsyrer for eksempel med 60 μl elueringsbuffer (AVE) resulterer det i et eluat på ca. 55 μl, mens eluering med 20 μl resulterer i ca. 15 μl eluat. Mængden af gendannet eluat afhænger af prøvens beskaffenhed. Hvis mængden af gendannet eluat er for lav til den efterfølgende analyse, forøges mængden ved at tilføje mere elueringsbuffer (AVE). Eluerede virale nukleinsyrer indsamles i Elution Tubes (ET). Hvis virale nukleinsyrer skal opbevares i op til 24 timer, anbefaler vi opbevaring ved 2 8 C. Virale nukleinsyrers udbytte og kvalitet Udbyttet og kvaliteten af de isolerede virale nukleinsyrer er egnet til alle typer efterfølgende detektionsprocedurer i molekulære diagnostikker. Diagnostiske analyser bør udføres i henhold til fabrikantens anvisninger. Opsætning af QlAvac 24 Plus vakuumsystem Sørg for, at du opsætter Column Extender (kolonneforlænger) (EXT), QIAamp MinElutekolonne, VacConnector (VC) og VacValve korrekt (se figur 3) Figur 3 Samling af komponenterne til QIAamp DSP-viruskit til vakuumbehandling af prøver: 1: VacValve (vedlagt vakuumsystemet) 3: QIAamp MinElute Column 2: VacConnector (VC) 4: Column Extender (EXT) QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/

20 _DA :34 Uhr Seite 20 Vi anbefaler at etikettere lysisglas (LT), elueringsglas (ET) og QIAamp MinElutekolonner til anvendelse sammen med QIAvac 24 Plus-vakuumsystemet i henhold til oversigten på figur 4 for at undgå forveksling af prøver. Denne figur kan fotokopieres og mærkes med navnene på prøverne QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/2007

21 _DA :34 Uhr Seite 21 Dato: Bruger: Kørsels-ID: Figur 4 Etiketteringsoversigt over lysisglas (LT), elueringsglas (ET) og QIAamp MinElute-kolonner til anvendelse på QIAvac 24 Plus-vakuumsystemet. QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/

22 _DA :34 Uhr Seite 22 Protokol Protokol: Isolering og oprensning af viral nukleinsyrer fra plasma og serum Til isolering og oprensning af virale nukleinsyrer fra 500 μl EDTA- eller citratbehandlet plasma og serum. Ting, der skal gøres før start Ekvilibrér prøver til stuetemperatur (15 25 C) og sørg for, at de er blandet godt. Tilsæt Carrier RNA rekonstitueret i elueringsbuffer (AVE) eller intern kontrol til lysisbuffer (AL) i henhold til anvisningerne på side 16. Sørg for, at vaskebuffer 1 (AW1), vaskebuffer 2 (AW2) og QIAGEN Protease (QP) er blevet forberedt i henhold til anvisninger i "Vigtige bemærkninger" på side 15. Ekvilibrér elueringsbuffer (AE) til stuetemperatur (15 25 C) til anvendelse på trin 18. Om muligt anvendes frisk elueringsbuffer (AVE) for hver procedure (4 glas er vedlagt). Indstil en varmeblok til 56 C til anvendelse på trin 4 og 17. For at undgå krydskontaminering isættes en VacConnector (VC) på hver lueradapter på vakuumsystemet. Sørg for, at affaldsflasken på vakuumsystemet er tom og at alle koblinger er forbundet korrekt. For at få yderligere oplysninger om vakuumsystemets drift, specielt vedligeholdelse, se den vedlagte håndbog. Procedure 1. Pipettér 75 μl QIAGEN Protease (QP) i en Lysis Tube (LT). Tjek udløbsdatoen på den rekonstituerede protease før anvendelse. 2. Tilsæt 500 μl plasma eller serum til Lysis Tube (LT). 3. Tilsæt 500 μl lysisbuffer (AL) (der indeholder 11,2 μg/ml Carrier RNA) til lysisglas (LT), luk låget og bland med impuls-vortex i 15 sekunder. For at sikre effektiv lysering, er det væsentligt, at prøven og lysisbuffer (AL) blandes grundigt for at give en homogen opløsning. Lysisbuffer (AL) indeholder intern kontrol. Eftersom lysisbuffer (AL) har en høj viskositet, sørges der for, at den korrekte mængde lysisbuffer (AL) tilsættes ved nøje pipettering eller ved hjælp af en egnet pipette såsom en Eppendorf multistep-pipette eller lignende. Tilsæt ikke QIAGEN Protease (QP) direkte til lysisbuffer (AL). 4. Inkubér ved 56 C (±1 C) i 15 min (±1 min). 22 QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/2007

23 _DA :34 Uhr Seite Centrifugér lysisglas (LT) i 5 sekunder ved fuld hastighed for at fjerne dråber fra den indvendige side af låget. 6. Skift handsker og åbn Lysis Tube (LT) forsigtigt. 7. Tilsæt 600 μl ethanol (96 100%) til lysisglasset (LT), luk låget og bland grundigt med impuls-vortexmixer i 15 sekunder. Inkubér 5 min. (±1 min.) ved stuetemperatur (15 25 C). 8. Centrifugér lysisglas (LT) i 5 sekunder ved fuld hastighed for at fjerne dråber fra den indvendige side af låget. 9. Isæt QIAamp MinElute-kolonnen i VacConnector (VC) på vakuumsystemet (se figur 3, side 19). Indsæt en Column Extender (EXT) i den åbne QIAamp MinElute Column. Protokol Behold Wash Tube (WT) til tørrecentrifugering på trin Skift handsker og åbn kun ét glas ad gangen. 11. Hæld forsigtigt hele lysatet fra trin 7 ind i Column Extender (EXT) på QIAamp MinElute Column uden at gøre kanten våd. Undgå at røre QIAamp MinElute Column-membranen med pipettespidsen. 12. Tænd for vakuumpumpen. Når lysatet er blevet trukket gennem QIAamp MinElute Column, åbnes ventilen på vakuumsystemet og vakuumet udløses. Hvis der behandles flere QIAamp MinElute Columns samtidig, anbefaler vi at lukke VacValve på hver kolonne, når lysatet er passeret igennem for at kunne reducere varigheden af dette vakuumtrin. Hvis lysatet ikke er passeret helt igennem membranen efter 15 min., bortskaffes QIAamp MinElute Column og proceduren med en ny prøve gentages. Vakuumsystemetets ventil bør anvendes til hurtig udløsning af vakuumtrykket. 13. Tilsæt 600 μl vaskebuffer 1 (AW1) til QIAamp MinElute-kolonne. Fjern forsigtigt og bortskaf Column Extender (EXT) og luk ventilen på vakuumsystemet. Når vaskebuffer 1 (AW1) er blevet trukket gennem QIAamp MinElute-kolonnen, åbnes ventilen og vakuumet udløses. For at undgå krydskontaminering sørges der for, at de fjernede kolonneforlængere (EXT) ikke krydser over til tilstødende QIAamp MinElute-kolonner. 14. Tilsæt 750 μl vaskebuffer 2 (AW2) til QIAamp MinElute-kolonnen uden at gøre kanten våd. Undgå at røre QIAamp MinElute-kolonnemembranen med pipettespidsen. Lad låget på kolonnen stå åben og luk ventilen på vakuumsystemet. Når vaskebuffer 2 (AW2) er blevet trukket gennem QIAamp MinElute-kolonnen, åbnes ventilen og vakuumet udløses. QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/

24 _DA :34 Uhr Seite 24 Protokol 15. Tilsæt 750 μl ethanol (96 100%) til QIAamp MinElute-kolonnen uden at gøre kanten våd. Undgå at røre QIAamp MinElute-kolonnemembranen med pipettespidsen. Lad låget på kolonnen stå åben og luk ventilen på vakuumsystemet. Når ethanol er blevet trukket gennem QIAamp MinElute Column, åbnes ventilen og vakuumet udløses. Anvend pipettespidser med aerosolskærm til at tilsætte ethanol til QIAamp MinElute-kolonnen. 16. Luk låget på QIAamp MinElute Column, fjern den fra vakuumsystemet og bortskaf VacConnector (VC). Anbring QIAamp MinElute-kolonnen i vaskeglasset (WT) gemt fra trin 9 og centrifugér ved fuld hastighed (ca x geller o/min) i 1 min. for at tørre membranen helt. Bortskaf Wash Tube (WT) med filtratet. Undlades tørrecentrifugeringen kan det føre til hæmning af den efterfølgende analyse. 17. Anbring QIAamp MinElute Column i en ny Wash Tube (WT) og inkubér med låget åbent i 56 C i 3 minutter, således at eventuel tilbagebleven væske kan fordampe. 18. Anbring QIAamp MinElute Column i en ren Elution Tube (ET) og bortskaf Wash Tube (WT). Åbn låget på QIAamp MinElute-kolonnen forsigtigt og tilsæt 20 μl til 60 μl elueringsbuffer (AVE) (afhængig af den efterfølgende analyse) til midten af membranen. Luk låget og inkubér ved stuetemperatur (15 25 C) i 3 min. Centrifugér ved fuld hastighed (ca x geller o/min) i 1 min. for at eluere de virale nukleinsyrer. Følg vedligeholdelsesproceduren for vakuumsystemet efter udførelse af denne protokol (se håndbogen, der var vedlagt vakuumsystemet for yderligere oplysninger). 24 QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/2007

25 _DA :34 Uhr Seite 25 QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/

26 _DA :34 Uhr Seite QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/2007

27 _DA :34 Uhr Seite 27 QIAamp DSP-viruskithåndbog 11/

28 _DA :34 Uhr Seite 28 Australia Orders Fax Technical Austria Orders 0800/ Fax 0800/ Technical 0800/ Belgium Orders Fax Technical Canada Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) China Orders Fax Technical Denmark Orders Fax Technical Finland Orders Fax Technical France Orders Fax Technical Offers Germany Orders Fax Technical Hong Kong Orders Fax Technical Ireland Orders Fax Technical Italy Orders Fax Technical Japan Telephone Fax Technical Korea (South) Orders Fax Technical Luxembourg Orders Fax Technical The Netherlands Orders Fax Technical Norway Orders Fax Technical Singapore Orders Fax Technical Sweden Orders Fax Technical Switzerland Orders Fax Technical UK Orders Fax Technical USA Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) DA 11/2007 Sample & Assay Technologies