Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 50

Transkript

1 Marts 2012 Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 50 Version 1 Til in vitro-diagnostisk brug DA QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R DA Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN prøve- og analyse-teknologier QIAGEN er den førende leverandør af innovative prøve- og analyseteknologier, der muliggør isolation og påvisning af indholdet i enhver biologisk prøve. Vore avancerede højkvalitetsprodukter og -service garanterer succes fra prøve til resultat. QIAGEN sætter standarder i: Oprensning af DNA, RNA og proteiner Nukleinsyre- og proteinanalyser MicroRNA-undersøgelser og RNAi Automatisering af prøve- og analyse-teknologier Vor opgave er at bringe dig i stand til at opnå enestående succes og gennembrud. For yderligere information, se

3 Indholdsfortegnelse Tilsigtet brug 4 Resumé og forklaring 4 Funktionsprincip 4 Automatisk viral nukleinsyreoprensning på QlAcube 4 Medfølgende materialer 9 Kittets indhold 9 Nødvendige materialer, der ikke er vedlagt 10 Advarsler og forholdsregler 11 Opbevaring og håndtering af reagenser 13 Prøveopbevaring og -håndtering 13 Procedure 14 Vigtige punkter før start 14 Håndtering af QIAamp MinElute-kolonner 14 Centrifugering 15 Behandling af QIAamp MinElute-kolonner i en mikrocentrifuge 15 Forberedelse af reagenser og buffere 15 Protokol: Oprensning af virale nukleinsyrer fra plasma eller serum 19 Kvalitetskontrol 22 Ansvarsbegrænsninger 22 Ydelsesegenskaber 22 Referencer 22 Symbolforklaring 23 Kontaktoplysninger 24 Appendiks 25 Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/2012 3

4 Tilsigtet brug QlAamp DSP Virus Spin-kit er et system, der anvender silicamembranteknologi (QlAamp-teknologi) til isolering og oprensning af virale nukleinsyrer fra biologiske prøver. Produktet er beregnet til brug af professionelle brugere, såsom laboratorieteknikere og læger, der er uddannet i molekylærbiologisk teknik. QlAamp DSP Virus Spin-kit er beregnet til in-vitro-diagnostisk brug. Resumé og forklaring QIAamp DSP Virus Spin-kit anvender veletableret teknologi til samtidig oprensning af viralt DNA og RNA. Kittet kombinerer en silicabaseret membrans selektive bindingsegenskaber med fleksible elueringsmængder på mellem 20 og 150 μl. Proceduren er egnet til anvendelse sammen med plasma og serum. Prøver kan være enten friske eller frosne, hvis de ikke har været frosne og optøede mere end én gang (se side 13). Virale nukleinsyrer elueres i Buffer AVE, klar til anvendelse i amplifikationsreaktioner eller opbevaring ved 25 C til 15 C. Funktionsprincip QIAamp DSP Virus Spin-proceduren består af 4 trin (lysering, binding, vask og eluering) og udføres vha. QIAamp MinElute kolonner i en standard mikrocentrifuge eller fuldautomatisk på QIAcube. Proceduren er designet til at minimere muligheden for prøve-til-prøve krydskontaminering og muliggør sikker håndtering af potentielt infektiøse prøver. Den simple QIAamp DSP Virus Spin-procedure er egnet til samtidig behandling af flere prøver. QlAamp DSP Virus Spin-kit kan anvendes til isolering af viralt RNA og DNA fra en bred række RNA- og DNA-vira. Præstationsegenskaber for hver virusart er imidlertid ikke blevet fastlagt og skal valideres af brugeren. Automatisk viral nukleinsyreoprensning på QlAcube Oprensning af virale nukleinsyrer vha. QlAamp DSP Virus Spin-kit kan foregå fuldautomatisk på QlAcube. Den innovative QlAcube anvender avanceret teknologi til behandling af QIAGEN centrifugeringskolonner, hvilket gør det muligt problemfrit at integrere en automatiseret prøvebehandling i laboratoriets arbejdsgang, selv ved små prøvemængder. Prøvebehandling vha. QlAcube følger de samme trin som den manuelle procedure (dvs. lysering, binding, vask og eluering), hvilket gør det muligt at anvende QlAamp DSP Virus Spin-kit til oprensning af viral nukleinsyrer af høj kvalitet. Hvis QIAamp DSP Virus Spin-kittet automatiseres på QIAcube-instrumentet, kan instrumentet behandle færre end 50 prøver pga. dødvolumener, fordampning og yderligere reagensforbrug pga. automatiseret pipettering. QIAGEN 4 Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/2012

5 garanterer kun 50 prøvepræparationer ved manuel anvendelse af QIAamp DSP Virus Spin-kittet. For at få flere oplysninger om den automatiserede procedure, bedes du se det relevante protokolark hos Opdaterede protokolark kan downloades gratis eller kan fås ved henvendelse til QIAGEN's tekniske serviceafdeling (se side 23). Figur 1. QIAcube. Lyse med QIAGEN-protease Prøver bliver lyseret under stærkt denaturerende forhold ved forhøjede temperaturer. Lyse blev udført ved tilstedeværelsen af QIAGEN-protease og Buffer AL, som sammen sikrer inaktivering af RNaser. Adsorption af QlAamp MinElute-membranen Bindingsforholdene justeres ved at tilsætte ethanol, der muliggør optimal binding af det virale RNA og DNA til membranen. Lysater overføres dernæst til en QlAamp MinElute-kolonne og virale nukleinsyrer adsorberes på silicagelmembranen samtidigt med, at lysatet trækkes igennem vha. centrifugering. Salt og ph-forhold sikrer, at protein og andre kontaminanter, som kan hæmme PCR og andre efterfølgende enzymreaktioner, ikke bliver tilbage på QIAamp MinElute-membranen. De 2 ml vaskerør (vedlagt) støtter QlAamp MinElute-kolonnen under isætningsog vasketrin. Fjernelse af restkontaminanter Nukleinsyrer forbliver bundet til membranen, mens kontaminanter effektivt vaskes væk under 3 vasketrin. Med et enkelt trin elueres stærkt oprenset viralt RNA og DNA i Buffer AVE, der er blevet ekvilibreret ved stuetemperatur. Eluering af rene nukleinsyrer Eluering udføres vha. Buffer AVE. QIAamp MinElute-kolonnerne muliggør minimale elueringsmængder på kun 20 μl. Lave elueringsmængder fører til højt koncentrerede nukleinsyreeluater. Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/2012 5

6 For efterfølgende applikationer, der kræver små startvolumener (f.eks. visse PCR- og RT-PCR-analyser) kan et mere koncentreret eluat øge analysesensitiviteten. For efterfølgende applikationer, der kræver en større startvolumen, kan elueringsvolumen øges op til 150 μl. En øgning i elueringsvolumen vil imidlertid nedsætte koncentrationen af nukleinsyrer i eluatet. Den udvundne eluatvolumen kan være op til 5 μl mindre end elueringsbuffervolumen, der blev anvendt på kolonnen; for eksempel resulterer en elueringsbuffervolumen på 20 μl i >15 μl færdigt eluat. Mængden af udvundet eluat afhænger af prøvens beskaffenhed. Elueret nukleinsyre indsamles i 1,5 ml elueringsrør (ET, vedlagt). Det anbefales at opbevare DNA eller RNA ved 20 C. Udbyttet af viral nukleinsyre, der isoleres fra biologiske prøver, er normalt under 1 μg. Kvantitative amplifikationsmetoder anbefales til bestemmelse af udbytte. Når nukleinsyrer, der isoleres vha. QIAamp DSP Virus Spinprotokollen, kvantificeres, skal det huskes, at der vil være ret meget mere bærer-rna i prøven end det virale RNA. 6 Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/2012

7 QIAamp DSP Virus Spin-procedure Prøve Lysering Binding Vask (Buffer AW1, anbefales) Vask (Buffer AW2) Vask (ethanol) Tørrecentrifugerin gen (anvend nyt opsamlingsrør) Kan gøres fuldautomatisk på QIAcube Eluering Rene virale nukleinsyrer Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/2012 7

8 Bærer-RNA Bærer-RNA tjener to formål. Først forbedrer det bindingen af virale nukleinsyrer til QIAamp-membranen, specielt hvis der er meget få målmolekyler i prøven. For det andet reducerer tilføjelsen af store mængder bærer-rna chancen for viral RNA-nedbrydning i de sjældne tilfælde, hvor RNase-molekyler ikke denatureres via de kaotropiske salte og detergenter i Buffer AL. Hvis bærer-rna ikke bliver tilsat til Buffer AL, kan dette føre til reduceret viral RNA eller DNAgendannelse. Forskellige forstærkningssystemer varierer i virkning, afhængig af den samlede mængde nukleinsyre til stede i reaktionen. Eluater fra dette kit indeholder både virale nukleinsyrer og bærer-rna og mængderne af bærer-rna vil i høj grad overstige mængderne af virale nukleinsyrer. Beregninger af hvor meget eluat, der skal tilføjes til efterfølgende forstærkninger, skal derfor baseres på mængden af bærer-rna, der er tilsat. For at opnå de højeste sensitivitetsniveauer af forstærkningsreaktioner, kan det være nødvendigt at justere mængden af bærer-rna, der er tilsat Buffer AL. Tilsætning af interne kontroller Anvendelse af QIAamp DSP Virus Spin-protokollen i kombination med kommercielt tilgængelige forstærkningssystemer kan kræve introduktionen af en intern kontrol i oprensningsproceduren. Intern kontrol-rna eller -DNA skal tilsættes sammen med bærer-rna'et til lysisbufferen. For optimal oprensningseffektivitet, skal interne kontrolmolekyler være længere end 200 nukleotider, da mindre molekyler ikke genvindes effektivt. Se fabrikantens vejledning for at kunne bestemme den optimale koncentration. Anvendes der en anden koncentration end den anbefalede, kan det reducere forstærkningseffektiviteten. 8 Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/2012

9 Medfølgende materialer Kittets indhold QIAamp DSP Virus Spin-kit Katalognr Antal præparater 50 QIAamp MinElute QIAamp MinElute Columns with Wash Tubes (WT) (QIAamp MinElutekolonner med vaskerør) (2 ml) 50 LT Lysis Tubes (Lysisrør) (2 ml) 50 ET Elution Tubes (Elueringsrør) (1,5 ml) 50 WT Wash Tubes (Vaskerør) (2 ml) 5 x 50 AL Lysis Buffer* (Lysisbuffer) 33 ml AW1 AW2 AVE Wash Buffer 1* (concentrate) (Vaskebuffer 1 [koncentrat]) Wash Buffer 2 (concentrate) (Vaskebuffer 2 [koncentrat]) Elution Buffer (purple caps) (Elueringsbuffer [lilla hætter]) 19 ml 13 ml 4 x 2 ml PS Protease Solvent (Proteaseopløsning) 4,4 ml Carrier QP Carrier RNA (red caps) (Bærer-RNA [røde hætter]) QIAGEN Protease (QIAGENprotease) 310 μg 1 hætteglas Håndbog 1 *Indeholder et kaotropisk salt. Benyt passende sikkerhedsforanstaltninger og brug handsker ved håndtering. Må ikke bringes i kontakt med desinfektionsmidler, der indeholder blegemiddel. For yderligere information, se side 11. Indeholder natriumazid som konserveringsmiddel. Se Forberedelse af reagenser og buffere, side 15. Hvis QIAamp DSP Virus Spin-kittet automatiseres på QIAcube-instrumentet, kan instrumentet behandle færre end 50 prøver pga. dødvolumener, fordampning og yderligere reagensforbrug pga. automatiseret pipettering. QIAGEN garanterer kun 50 prøvepræparationer ved manuel anvendelse af QIAamp DSP Virus Spin-kittet. Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/2012 9

10 Nødvendige materialer, der ikke er vedlagt Der skal altid anvendes en egnet laboratoriekittel, éngangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. Der findes mere information i de tilhørende sikkerhedsdatablade (material safety data sheets, MSDSs), som kan fås hos den pågældende leverandør. Ethanol ( %)* Pipetter og pipettespidser (for at forhindre krydskontaminering anbefaler vi stærkt at anvende pipettespidser med aerosolskærme) Varmeblok til lysering af prøver ved 56 C Mikrocentrifuge (med rotor til 1,5 ml og 2 ml rør) Vortexer For prøver <200 μl: 0,9 % NaCl-opløsning * Der må ikke anvendes denatureret alkohol, som indeholder andre stoffer, såsom methanol eller methylethylketon. For at sikre, at prøver bliver behandlet korrekt i QIAamp DSP Virus Spin-kitproceduren, anbefaler vi på det kraftigste, at instrumenter (f.eks. pipetter og varmeblokke) kalibreres i henhold til fabrikantens anbefalinger. 10 Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/2012

11 Advarsler og forholdsregler Til in vitro-diagnostik Der skal altid anvendes en egnet laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. Yderligere informationer findes i de relevante sikkerhedsdatablade (material safety data sheets, MSDS). De findes online i bekvemt og kompakt PDF-format på hvor sikkerhedsdatabladene for hvert QIAGEN-kit og hver kit-komponent kan læses og udskrives. FORHOLDSREGEL: Der må IKKE tilsættes blegemiddel eller syreholdige opløsninger direkte til affald, der indeholder Buffer AL eller Buffer AW1. Buffer AL og Buffer AW1 indeholder guanidinhydrochlorid, som kan danne højt reaktive forbindelser, når de kombineres med blegemiddel. Hvis væske, der indeholder disse buffere, spildes, rengøres med egnet laboratoriedetergent og vand. Hvis den delte væske indeholder potentielt infektiøse midler, rengøres det påvirkede område først med laboratoriedetergent og vand og dernæst med 1 % (v/v) natriumhypochlorit. Hvis bufferflaskerne er beskadigede eller lækker, bæres der handsker og beskyttelsesbriller, når flaskerne bortskaffes for at undgå personlig skade eller skade på andre. QIAGEN har ikke testet det flydende affald, der genereres af QIAamp DSP viruscentrifugeringsproceduren mht. resterende infektiøse materialer. Kontamination af væskeaffaldet med smitsomme reststoffer er højst usandsynlig, men kan ikke fuldstændigt udelukkes. Derfor skal flydende affald betragtes som infektiøst og håndteres og bortskaffes i henhold til lokale sikkerhedsbestemmelser. De følgende risiko- og sikkerhedssætninger gælder komponenter af QIAamp DSP Virus Spin-kit: Buffer AL Xn Indeholder guanidinhydrochlorid: skadelig, irritament. Risiko- og sikkerhedssætninger: * R22-36/38, S * R22: Farlig ved indtagelse; R36/38: Irriterer øjnene og huden; S13: Må ikke opbevares sammen med fødevarer, drikkevarer og foderstoffer; S26: Kommer stoffet i øjnene, skylles straks grundigt med vand og læge kontaktes; S36: Brug særligt arbejdstøj; S46: Ved indtagelse, kontakt omgående læge, og vis denne beholder eller etiket. Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/

12 Buffer AW1 (koncentrat) Xn Indeholder guanidinhydrochlorid: skadelig, irritament. Risiko- og sikkerhedssætninger: R22-36/38, S QIAGEN-protease (QP) Xn Indeholder subtilisin: sensibilisator, irritament. Risiko- og sikkerhedssætninger: * R37/ , S /37/ timers nødoplysninger Her kan i nødstilfælde fås medicinske informationer hele døgnet rundt (på engelsk, fransk og tysk): Giftinformationscentralen, Mainz, Tyskland Tlf: * R22: Farlig ved indtagelse; R36/38: Irriterer øjnene og huden; R37/38: Irriterer åndedrætsorganerne og huden; R41: Risiko for alvorlig øjenskade; R42: Kan give overfølsomhed ved indånding; S13: Må ikke opbevares sammen med fødevarer, drikkevarer og foderstoffer; S22: Undgå indånding af støv; S24: Undgå kontakt med huden; S26: Kommer stoffet i øjnene, skylles straks grundigt med vand og læge kontaktes; S36: Brug særligt arbejdstøj; S36/37/39: Brug særligt arbejdstøj, egnede beskyttelseshandsker og briller/ansigtsskærm; S46: Ved indtagelse, kontakt omgående læge, og vis denne beholder eller etiket. 12 Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/2012

13 Opbevaring og håndtering af reagenser QIAamp MinElute-kolonner bør opbevares ved 2 8 C ved ankomst. Alle buffere kan opbevares ved stuetemperatur (15 25 C). Frysetørret bærer-rna kan opbevares ved stuetemperatur (15 25 C) indtil udløbsdatoen på kittets kasse. Bærer-RNA kan kun opløses i Buffer AVE; opløst bærer-rna skal straks tilsættes Buffer AL som beskrevet på side 15. Denne opløsning skal forberedes frisk og er stabil ved 2 8 C i op til 48 timer. Ubrugte portioner bærer-rna opløst i Buffer AVE bør nedfryses i alikvoter ved 20 C. Frysetørret QIAGEN-protease (QP) kan opbevares ved stuetemperatur (15 25 C) indtil kittets udløbsdato uden at påvirke dens ydelse. QIAGEN-protease (QP) rekonstitueret i protaseopløsning (PS) er stabil i op til et år, når det opbevares ved 2 8 C, men kun indtil kittets udløbsdato. Det skal undgås at opbevare QIAGEN-proteasestamopløsning ved stuetemperatur i længere tidsperioder. Rekonstitueret vaskebuffer 1 (AW1) og rekonstitueret vaskebuffer 2 (AW2) er stabile i op til år, når de opbevares ved stuetemperatur (15 25 C), men kun indtil udløbsdatoen på kittets æske. Prøveopbevaring og -håndtering Efter prøvetagning og centrifugering, kan plasma eller serum opbevares ved 2 8 C i op til 6 timer. Ved langtidsopbevaring anbefales det at fryse dem ned ved 20 C eller 80 C i alikvoter. Frosne plasma- eller serumprøver må ikke optøs mere end én gang. Gentagen fryse-optøning resulterer i denaturering og udfældning af proteiner, der resulterer i reducerede virale titre og derfor reduceret udbytte af virale nukleinsyrer. Cryopræcipitater, der er dannet under fryse-optøningen vil endvidere tilstoppe QIAamp MinElute-kolonnemembranen. Hvis cryopræcipitater er synlige, bør de pelleteres via centrifugering ved ca x g i 3 minutter. Den rensede supernatant bør fjernes og behandles straks uden at forstyrre pelleten. Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/

14 Procedure Vigtige punkter før start Undersøg kit-komponenterne for skader efter modtagelsen af kittet. Hvis blisterpakkerne eller flaskerne med buffer er beskadigede, kontaktes QIAGENs tekniske service eller den lokale forhandler. Ved spild af flydende materiale, se Advarsler og forholdsregler (side 11) Anvend ikke beskadigede kit-komponenter, da deres anvendelse kan resultere i ringe ydelse af kittet. Anvend altid RNase-frit udstyr. Pipettespidserne skal altid skiftes mellem væskeoverførsler. For at minimere krydskontaminering anbefaler vi anvendelse af pipettespidser med aerosolbarriere. Alle centrifugeringstrin udføres ved stuetemperatur (15 25 C). Anvend altid engangshandsker og tjek regelmæssigt, at de ikke er kontaminerede med prøvemateriale. Bortskaf handskerne, hvis de bliver kontaminerede. For at minimere krydskontaminering må der kun åbnes ét rør ad gangen. Der må ikke anvendes kit-komponenter fra andre kit med de kit, som du aktuelt anvender, medmindre lotnumrene er identiske. Undgå mikrobiel kontaminering af kitreagenserne. For at sikre beskyttelse mod muligt infektiøst materiale anbefaler vi at arbejde under forhold med laminær luftstrøm, indtil prøverne er lyserede. Dette kit må kun anvendes af personale, der er uddannet til in vitrodiagnostisk laboratoriepraksis. Håndtering af QIAamp MinElute-kolonner På grund af nukleinsyre-amplifikationsmetodernes høje sensitivitet skal følgende forholdsregler overholdes, når der håndteres QIAamp MinElute-kolonner for at undgå krydskontaminering mellem prøveforberedelser: Tilsæt forsigtigt prøven eller opløsningen i QIAamp MinElute-kolonnen. Pipettér prøven i QIAamp MinElute-kolonnen uden at gøre kolonnens kant våd. Skift pipettespidser mellem alle væskeoverførsler. Det anbefales at bruge pipettespidser med aerosolbarriere. Undgå at røre QIAamp MinElute-membranen med pipettespidsen. Efter alle puls-vortex-trinnene centrifugeres mikrocentrifugerørene kortvarigt for at fjerne dråber fra lågets inderside. 14 Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/2012

15 Brug handsker under hele proceduren. Skift handsker med det samme, hvis de kommer i berøring med prøven. Centrifugering Vaskerør og elueringsrør til alle centrifugeringstrin er vedlagt kittet. Centrifugering af QIAamp MinElute-kolonner udføres ved ca x g for at reducere centrifugestøj. Centrifugering af QIAamp MinElute-kolonner ved fuld hastighed vil ikke påvirke DNA- eller RNA-udbyttet. For tørrecentrifugeringen efter endt vaskeprocedure og for eluering skal centrifugeringen udføres ved fuld hastighed. Alle centrifugeringstrin skal udføres ved stuetemperatur (15 25 C). Behandling af QIAamp MinElute-kolonner i en mikrocentrifuge Luk QIAamp MinElute-kolonnen før den anbringes i mikrocentrifugen. Centrifugér som beskrevet. Fjern QIAamp MinElute-kolonnen og vaskerøret fra mikrocentrifugen. Anbring QIAamp MinElute-kolonnen i et nyt vaskerør. Bortskaf filtratet og vaskerøret. Bemærk, at filtratet kan indeholde farligt affald og skal bortskaffes behørigt. Åbn kun én QIAamp MinElute-kolonne ad gangen og vær omhyggelig med at undgå aerosol-dannelse. For effektiv parallelbehandling af flere prøver på én gang anbefaler vi at fylde et rack med vaskerør, således at QIAamp MinElute-kolonnerne kan overføres efter centrifugeringen. Brugte vaskerør med filtrat kan bortskaffes og de nye vaskerør med QIAamp MinElute-kolonner kan anbringes direkte i mikrocentrifugen. Forberedelse af reagenser og buffere Forberedelse af RNA Når der forberedes viralt RNA, skal der arbejdes hurtigt ved de manuelle trin af proceduren og Appendikset på side 25 læses før der startes. Forberedelse af QIAGEN-protease Tilsæt hele indholdet af hætteglasset med 4,4 ml protaseopløsning (PS) til hætteglasset med frysetørret QIAGEN-protease (QP) og bland grundigt. For at undgå, at det skummer, blandes det ved at vende hætteglasset på hovedet adskillige gange. Sørg for, at QIAGEN-protease (QP) er fuldstændigt opløst. Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/

16 Der må ikke tilsættes QIAGEN-protease (QP) direkte til Buffer AL. QIAGEN-protease (QP) rekonstitueret i protaseopløsning (PS) er stabilt i et år, når det opbevares ved 2 8 C, men kun indtil kittets udløbsdato. Det skal undgås at opbevare QIAGEN-proteasestamopløsning ved stuetemperatur i længere tidsperioder. Tilsættelse af bærer-rna til Buffer AL* Tilsæt 310 μl Buffer AVE til røret med 310 μg frysetørret bærer-rna for at opnå en opløsning af 1 μg/μl. Opløs bærer-rna helt, del det i alikvoter af praktisk størrelsesomfang og opbevar dem ved 25 C til 15 C. Alikvoter af bærer-rna må ikke fryse-optøs mere end 3 gange. Bærer-RNA opløses ikke i Buffer AL. Det skal først opløses i Buffer AVE og dernæst tilsættes Buffer AL. Beregn den nødvendige mængde af Buffer AL bærer RNA-blanding pr. batch prøver ved at vælge antallet af prøver, der skal behandles samtidigt fra Tabel 1, side 17. Ved større antal prøver kan mængderne beregnes vha. nedenstående prøveberegner: n x 0,22 ml = y ml y ml x 28 μl/ml = z μl hvor: n = antallet af prøver, der skal behandles samtidigt y = beregnet mængde Buffer AL z = mængde af bærer-rna Buffer AVE der skal tilsættes Buffer AL Bland forsigtigt ved at vende bunden i vejret på røret 10 gange. For at undgå skumning, må der ikke bruges vortex. * Indeholder kaotropisk salt. Benyt passende laboratoriesikkerhedsforanstaltninger og brug handsker ved håndtering. Må ikke bringes i kontakt med desinfektionsmidler, der indeholder blegemiddel. Se side 11 for sikkerhedsinformation. 16 Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/2012

17 Tabel 1. Mængder (Vol.) af Buffer AL og bærer-rna Buffer AVEblanding påkrævet for specifikke antal (No.) prøver for QIAamp DSP Virus Spin-proceduren Antal prøver Mængde Buffer AL (ml) Mængde bærer RNA AVE (μl) Antal prøver Mængde Buffer AL (ml) Mængde bærer RNA AVE (μl) 1 0,22 ml 6,2 μl 13 2,86 ml 80,1 μl 2 0,44 ml 12,3 μl 14 3,08 ml 86,3 μl 3 0,66 ml 18,5 μl 14 3,30 ml 92,4 μl 4 0,88 ml 24,6 μl 16 3,52 ml 98,6 μl 5 1,10 ml 30,8 μl 17 3,74 ml 104,7 μl 6 1,32 ml 37,0 μl 18 3,96 ml 110,9 μl 7 1,54 ml 43,1 μl 19 4,18 ml 117,0 μl 8 1,76 ml 49,3 μl 20 4,40 ml 123,2 μl 9 1,98 ml 55,4 μl 21 4,62 ml 129,4 μl 10 2,20 ml 61,6 μl 22 4,84 ml 135,5 μl 11 2,42 ml 67,8 μl 23 5,06 ml 141,7 μl 12 2,64 ml 73,9 μl 24 5,28 ml 147,8 μl Prøveforberedelsesproceduren er optimeret til 5,6 μg bærer-rna pr. prøve. Hvis mindre bærer-rna har vist sig at være bedre til dit forstærkningssystem, overføres kun den påkrævede mængde af opløst bærer-rna til rørene med Buffer AL. For hvert mikrogram bærer-rna påkrævet pr. forberedelse tilsættes 5 μl Buffer AVE-opløst bærer-rna pr. milliliter Buffer AL. Brug af mindre end 5,6 μg bærer-rna pr. prøve skal valideres for hver særlige prøvetype og efterfølgende analyse. Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/

18 Buffer AW1* Tilsæt 25 ml ethanol ( %) til en flaske med 19 ml Buffer AW1-koncentrat, som beskrevet på flasken. Afkryds feltet på etiketten for at angive, at der er blevet tilsat ethanol. Opbevar rekonstitueret Buffer AW1 ved stuetemperatur (15 25 C). Rekonstitueret Buffer AW1 er stabilt i op til et år, når det opbevares ved stuetemperatur, men kun indtil kittets udløbsdato. Rekonstitueret Buffer AW1 blandes altid ved at ryste det, før proceduren startes. Buffer AW2 Tilsæt 30 ml ethanol ( %) til en flaske med 13 ml Buffer AW2- koncentrat, som beskrevet på flasken. Afkryds feltet på etiketten for at angive, at der er blevet tilsat ethanol. Opbevar rekonstitueret Buffer AW2 ved stuetemperatur (15 25 C). Rekonstitueret Buffer AW2 er stabilet i op til et år, når det opbevares ved stuetemperatur, men kun indtil kittets udløbsdato. Rekonstitueret Buffer AW2 blandes altid ved at ryste det, før proceduren startes. Eluering af nukleinsyrer Elueringsbuffer bør ekvilibreres til stuetemperatur før det anvendes på kolonnen. * Indeholder kaotropisk salt. Benyt passende laboratoriesikkerhedsforanstaltninger og brug handsker ved håndtering. Må ikke bringes i kontakt med desinfektionsmidler, der indeholder blegemiddel. Se Advarsler og forholdsregler på side 11. Indeholder natriumazid som konserveringsmiddel. 18 Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/2012

19 Protokol: Oprensning af virale nukleinsyrer fra plasma eller serum Denne protokol er til oprensning af virale nukleinsyrer fra 200 μl plasma eller serum vha. QIAamp DSP Virus Spin-kit og en mikrocentrifuge. For automatiseret oprensning vha. QIAamp DSP Virus Spin-kit med QIAcube, se Brugermanualen til QIAcube (QIAcube User Manual) og det relevante protokolark. Vigtigt punkt før start Alle centrifugeringstrin udføres ved stuetemperatur (15 25 C). Ting, der skal gøres før start Ekvilibrér prøver til stuetemperatur (15 25 C). Ekvilibrér Buffer AVE til stuetemperatur for eluering i trin 14. Indstil en varmeblok til 56 C ± 3 C til anvendelse i trin 4. Sørg for, at Buffer AW1, Buffer AW2 og QIAGEN-protease (QP) er blevet forberedt i henhold til vejledning på side Tilsæt bærer-rna rekonstitueret i Buffer AVE til Buffer AL i henhold til vejledningen på side 15. Procedure 1. Pipettér 25 μl QIAGEN-protease (QP) i et lysisrør (LT). Læs Forberedelse af reagenser og buffere, side 15, for information om resuspendering af QIAGEN-protease (QP) i proteaseopløsning (PS). 2. Tilsæt 200 μl plasma eller serum til et lysisrør (LT). Hvis prøvemængden er mindre end 200 μl tilsættes den behørige mængde på 0,9 % natriumchloridopløsning for at bringe mængden af protease og prøve op til i alt 225 μl. 3. Tilsæt 200 μl Buffer AL (der indeholder 28 μg/ml bærer-rna). Luk hætten og bland ved at puls-vortexe i 15 sekunder. For at sikre effektiv lysering, er det væsentligt, at prøven og Buffer AL blandes grundigt for at give en homogen opløsning. Der må ikke tilsættes QIAGEN-protease (QP) direkte til Buffer AL. 4. Inkuberes ved 56 C ± 3 C i 15 minutter ± 1 minut i en varmeblok. Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/

20 5. Centrifugér kortvarigt lysisrøret (LT) for at fjerne dråber fra lågets inderside. 6. Tilsæt 250 μl ethanol ( %) til prøven, luk låget og bland grundigt med impuls-vortexmixer i 15 sekunder. Inkubér lysatet med ethanol i 5 minutter ± 30 sekunder ved stuetemperatur (15 25 C). Hvis den omgivende temperatur overstiger 25 C, skal ethanol afkøles på is, inden lysatet tilsættes. 7. Centrifugér røret kortvarigt for at fjerne dråber fra lågets inderside. 8. Overfør forsigtigt alt lysatet fra trin 7 til QIAamp MinElute-kolonnen uden at gøre kanten våd. Luk hætten og centrifugér ved ca x g i >1 minut. Anbring QIAamp MinElute-kolonnen i et rent 2 ml vaskerør (WT) og bortskaf vaskerøret med filtratet. Hvis lysatet ikke er kommet helt gennem kolonnen efter centrifugering, skal der centrifugeres igen ved en højere hastighed, indtil QIAamp MinElutekolonnen er tom. 9. Åbn forsigtig QIAamp MinElute-kolonnen og tilsæt 500 μl Buffer AW1 uden at gøre kanten våd. Luk hætten og centrifugér ved ca x g i 1 minut. Anbring QIAamp MinElute-kolonnen i et rent 2 ml vaskerør (WT) og bortskaf vaskerøret med filtratet. 10. Åbn forsigtig QIAamp MinElute-kolonnen og tilsæt 500 μl Buffer AW2 uden at gøre kanten våd. Luk hætten og centrifugér ved ca x g i >1 minut. Anbring QIAamp MinElute-kolonnen i et rent 2 ml vaskerør og bortskaf vaskerøret med filtratet. 11. Åbn forsigtig QIAamp MinElute-kolonnen og tilsæt 500 μl ethanol ( %) uden at gøre kanten våd. Luk hætten og centrifugér ved ca x g i >1 minut. Bortskaf vaskerørene med filtratet. Ethanolrester i eluatet kan forårsage problemer i efterfølgende anvendelser. Nogle centrifugerotorer kan vibrere ved deceleration, hvilket resulterer i, at gennemløb, der indeholder ethanol, får kontakt med QIAamp MinElutekolonnen. Udtagning af QIAamp MinElute-kolonnen og vaskerøret fra rotoren kan også forårsage, at gennemløb kommer i kontakt med QIAamp MinElute-kolonnen. 12. Anbring QIAamp MinElute-kolonnen i et rent 2 ml vaskerør (WT). Centrifugér ved fuld hastighed (ca x g) i 3 minutter ± 30 sekunder for at tørre membranen helt. 13. Anbring QIAamp MinElute-kolonnen i et nyt 2 ml vaskerør (WT), åbn låget og inkubér montagen ved 56 C ± 3 C i 3 minutter ± 30 sekunder for at tørre membranen helt. Dette trin har til formål at lade eventuel tilbagebleven væske fordampe. 20 Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/2012

21 14. Anbring QIAamp MinElute-kolonnen i et Elution Tube (ET) og bortskaf vaskerøret med filtratet. Åbn låget på QIAamp MinElutekolonnen forsigtigt og tilsæt μl Buffer AVE til midten af membranen. Luk låget og inkubér ved stuetemperatur i 5 minutter. Centrifugér ved fuld hastighed (ca x g) i >1 minut. Sørg for, at elueringsbufferen er ekvilibreret til stuetemperatur. Hvis eluering foretages i små mængder (<50 μl), skal elueringsbufferen påføres på midten af membranen for at færdiggøre eluering af bundet RNA og DNA. Elueringsmængden er fleksibel og kan tilpasses i henhold til kravene til den efterfølgende anvendelse. Husk, at den genvundne elueringsmængde er ca. 5 μl mindre end elueringsbuffermængden, der blev anvendt på kolonnen. Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/

22 Kvalitetskontrol I overensstemmelse med QIAGENs ISO-certificerede kvalitetsstyringssystem testes hvert lot af QIAamp DSP Viral Spin-kit efter fastlagte specifikationer for at sikre en ensartet produktkvalitet. Ansvarsbegrænsninger Systemets ydelse er blevet fastlagt vha. plasma- og serumprøver for isolering af virale nukleinsyrer. Det er brugerens ansvar at validere systemets ydelse for procedurer, der anvendes i deres laboratorium, og som ikke er dækket af QIAGENydelsesundersøgelser. For at minimere risikoen for en negativ indvirkning på diagnostiske resultater skal der anvendes hensigtsmæssige kontroller for efterfølgende anvendelser. For yderligere validering anbefales retningslinjerne i International Conference on Harmonisation of Technical Requirements (ICH) i ICH Q2(R1) Validation of Analytical Procedures: Text And Methodology. Diagnostiske resultater, der genereres, skal fortolkes sammen med andre kliniske eller laboratoriemæssige resultater. Ydelsesegenskaber Se for ydelsesegenskaber af QIAamp DSP Virus Spin-kittet. Referencer QIAGEN opretholder en stor, opdateret online-database over videnskabelige publikationer, der benytter QIAGENs produkter. Omfattende søgemuligheder gør det nemt at finde de artikler, der er brug for, enten ved en enkel søgning på nøgleord eller ved at specificere anvendelse, forskningsområde, titel, etc. En fuldstændig referenceliste kan fås ved at besøge QIAGENs referencedatabase online på eller kontakte QIAGENs tekniske service eller den lokale forhandler. 22 Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/2012

23 Symbolforklaring <N> Indeholder tilstrækkelige reagenser til <N> prøvepræparationer Læs brugsvejledningen Anvendes inden In vitro-diagnostisk medicinsk produkt Katalognummer Vigtig oplysning Lotnummer Materialenummer Dele Volumen Temperaturbegrænsning Producent Ved ankomst Ved levering opbevares QlAamp MinElute Columns ved 2 8 C Skriv den aktuelle dato ned efter tilsætning af ethanol til flasken Tilsætter Indeholder Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/

24 Lyofiliseret Rekonstituér i Ethanol Guanidin-hydrochlorid Subtilisin Fører til Kontaktoplysninger QIAGENs tekniske service leverer høj kvalitet og er altid til rådighed. De tekniske serviceafdelinger er bemandet med erfarne videnskabsmænd med omfattende praktisk og teoretisk erfaring inden for prøve- og analyseteknologier og i brugen af QIAGENs produkter. Kontakt os i tilfælde af spørgsmål eller vanskeligheder vedrørende QIAamp DSP Virus Spin-kit eller QIAGENs produkter generelt. QIAGENs kunder er en vigtig kilde til information om avancerede eller specialiserede anvendelser af vore produkter. Denne information er en hjælp for andre videnskabsfolk, såvel som for forskerne ved QIAGEN. Vi vil derfor opfordre dig til at kontakte os, hvis du har forslag omkring produktydeevne eller nye anvendelser og teknikker. For teknisk bistand og yderligere information henvises til vort tekniske supportcenter på eller du kan henvende dig til en af QIAGENs tekniske serviceafdelinger eller lokale forhandlere (se bagsiden eller besøg QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden, Tyskland 24 Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/2012

25 Appendiks Håndtering af RNA Ribonukleaser (RNase) er meget stabile og aktive enzymer, som normalt ikke kræver kofaktorer, for at være aktive. RNaser er svære at inaktivere og kun små mængder er nok til at nedbryde RNA. Derfor må der ikke anvendes laboratoriematerialer af glas eller plastik uden først at eliminere en eventuel RNase-kontaminering. Vær forsigtig med ikke utilsigtet at introducere RNaser til RNA-prøven under eller efter isoleringsproceduren. For at skabe og bevare et RNase-fri miljø, når der arbejdes med RNA, skal de følgende forholdsregler overholdes under forbehandling og brug af engangs- og flergangsbeholdere og opløsninger. Generel håndtering Arbejdet med RNA skal altid følge principperne for korrekt mikrobiologisk og aseptisk arbejdsteknik. Hænder og støvpartikler kan bære bakterier og skimmelsvampe og leverer dermed den hyppigste årsag til RNasekontaminering. Derfor skal der altid bæres latex- eller vinylhandsker, når der arbejdes med reagenser eller RNA-prøver, for at undgå RNase-kontaminering via huden eller fra støvet laboratorieudstyr. Skift laboratoriehandskerne hyppigt og hold rørene lukkede. Plastikprodukter, der ikke er til engangsbrug Plastikprodukter, der ikke er til engangsbrug, skal behandles før brug for at sikre, at de er RNase-fri. Plastikprodukter skal skylles grundigt med 0,1 M NaOH,* 1 mm EDTA* efterfulgt af RNase-fri vand* (se Opløsninger, side 26). Alternativt kan chloroform-resistente plastikprodukter skylles med chloroform* for at inaktivere RNaser. * Der skal altid anvendes en egnet laboratoriekittel, éngangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. Der findes mere information i de tilhørende sikkerhedsdatablade (material safety data sheets, MSDSs), som kan fås hos den pågældende leverandør. Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/

26 Glasprodukter Glasprodukter skal behandles før brug for at sikre, at de er RNase-fri. Glasprodukter, der anvendes til RNA-arbejde, skal rengøres med detergent, skylles grundigt og bages i ovnen ved >240 C i fire eller flere timer (natten over, hvis det er nemmere) før anvendelse. Autoklavering alene vil ikke helt inaktivere mange RNaser. Bagning i ovnen vil både inaktivere ribonukleaser og sikre, at ingen andre nukleinsyrer (såsom plasmid-dna) forbliver på overfladen af glasproduktet. Alternativt kan glasprodukter behandles med DEPC* (diethylpyrocarbonat). Dæk glasproduktet med 0,1 % DEPC i vand natten over (12 timer) ved 37 C, og autoklavér dernæst eller varm op til 100 C i 15 minutter for at fjerne overskydende DEPC. Corex rør bliver RNase-fri ved behandling med DEPC og ikke ved at bage dem. Dette vil reducere fejlprocenten af denne type rør under centrifugering. Elektroforesebeholdere Elektroforesebeholdere skal rengøres med detergentopløsning (f.eks. 0,5 % SDS),* skylles med vand, tørres med ethanol,* og dernæst fyldes med en opløsning af 3 % brintoverilte.* Efter 10 minutter ved stuetemperatur skal elektroforesebeholderne skylles grundigt med RNase-fri vand. Opløsninger Opløsninger (vand og andre opløsninger) skal behandles med 0,1 % DEPC. DEPC vil reagere med primære aminer og kan ikke anvendes direkte til behandling af Tris-buffere. DEPC er meget ustabilt ved tilstedeværelsen af Trisbuffere og nedbrydes hurtigt i ethanol og CO 2. Når Tris-buffere forberedes skal vand behandles med DEPC først og dernæst skal Tris opløses for at fremstille den passende buffer. * Der skal altid anvendes en egnet laboratoriekittel, éngangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemikalier. Der findes mere information i de tilhørende sikkerhedsdatablade (material safety data sheets, MSDSs), som kan fås hos den pågældende leverandør. Plastikprodukter, der anvendes til visse elektroforesebeholdere er ikke resistente over for ethanol. Vær forsigtig og tjek leverandørens vejledning. 26 Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/2012

27 DEPC er en stærk, men ikke absolut, RNase-hæmmer. Det anvendes almindeligt ved en koncentration på 0,1 % for at inaktivere RNaser på glas eller plastikprodukter eller for at skabe RNase-fri opløsninger og vand. DEPC inaktiverer RNaser vha. kovalent modifikation. Spormængder af DEPC vil modificere purinrester i RNA vha. carboxylering. Carboxyleret RNA oversættes med meget lav effektivitet i cellefri systemer. Dets evne til at danne DNA:RNAeller RNA:RNA-hybrider påvirkes ikke alvorligt, medmindre en stor fraktion af purinresterne er blevet modificeret. Rest-DEPC skal altid fjernes fra opløsninger eller beholdere vha. autoklavering eller opvarmning til 100 C ± 3 C i 15 minutter ± 1 minut. Tilsæt 0,1 ml DEPC til 100 ml af den opløsning, der skal behandles, og ryst den kraftigt for at bringe DEPC i opløsning eller lad opløsningen inkubere i >12 timer ved 37 C ± 3 C. Autoklavér i 15 minutter ± 1 minut for at fjerne spor af DEPC. Det kan være ønskeligt at teste vandkilder for tilstedeværelse af kontaminerende RNaser, da mange kilder destilleret vand er fri for RNaseaktivitet. QIAamp DSP Virus Spin-kittets buffere gøres ikke RNase-fri vha. DEPCbehandling og er derfor fri for DEPC-kontaminering. Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/

28 Denne side er med vilje tom 28 Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/2012

29 Denne side er med vilje tom Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/

30 Denne side er med vilje tom 30 Håndbog til QIAamp DSP Virus Spin-kit 03/2012

31 Varemærker: QIAGEN, QIAamp QIAcube, MinElute (QIAGEN Group); Corex (Corning, Inc.). Registrerede navne, varemærker osv. anvendt i dette dokument, selv når de ikke specifikt er markeret som sådan, skal ikke betragtes som værende juridisk ubeskyttede. Begrænset licensaftale for QIAamp DSP Virus Spin-kit Brug af dette produkt betyder, at enhver køber eller bruger af QIAamp DSP Virus Spin-kit accepterer følgende vilkår: 1. QIAamp DSP Virus Spin-kittet må kun bruges i overensstemmelse med Håndbogen til QIAamp DSP Virus Spin-kit, og kun med de komponenter, der følger med kittet. QIAGEN giver ingen licens, under nogen intellektuel ejendomsret, til at bruge eller inkorporere komponenterne i dette kit med komponenter, der ikke er inkluderet i dette kit, undtagen som beskrevet i Håndbogen til QIAamp DSP Virus Spin-kit og yderligere protokoller, som er tilgængelige på 2. Udover de udtrykkeligt givne licenser giver QIAGEN ingen garanti for, at dette kit, og/eller brugen af det, ikke overtræder tredjeparts rettigheder. 3. Dette kit og dens komponenter er under licens til engangsbrug og må ikke genbruges, genoprettes eller videresælges. 4. QIAGEN afviser specifikt alle andre licenser, udtrykte eller underforståede, end dem, der udtrykkeligt er angivet. 5. Køberen og brugeren af kittet indvilliger i ikke at tage, eller lade andre tage, skridt der kunne føre til, eller fremme, handlinger der forbydes ovenfor. QIAGEN kan håndhæve forbudene i denne begrænsede licensaftale i enhver ret, og vil inddrive alle undersøgelses- og retsomkostninger, herunder advokatsalærer, i ethvert søgsmål for at håndhæve denne begrænsede licensaftale samt alle deres intellektuelle ejendomsrettigheder i forbindelse med kittet og/eller komponenterne deri. For opdaterede licensbetingelser henvises til QIAGEN. Alle rettigheder forbeholdes.

32 Australia Austria Belgium Brazil China Denmark Finland France Germany Hong Kong India Ireland Italy Japan Korea (South) Luxembourg Mexico The Netherlands Norway Singapore Sweden Switzerland UK DA Sample & Assay Technologies