Evaluering af antistofferne p63 og p40

Transkript

1 VIA UNIVERSITY COLLEGE BIOANALYTIKERUDDANNELSEN Evaluering af antistofferne p63 og p4 Kernemarkører til at differentiere mellem adenokarcinom og planocellulært karcinom Antal tegn inkl. mellemrum: Navn: Bettina Jensen Studienummer: K-vejleder: Preben Sandal, bioanalytikerunderviser, Patologisk Institut, Ålborg I-vejleder: Henning Ilsø, lektor, Bioanalytikeruddannelsen Århus

2 Forord Dette projekt er blevet til i samarbejde med Patologisk Institut, Ålborg Universitetshospital. Projektet har tilknytning til bioanalytikerfaget, immunhistokemi. Opgaven er opbygget efter IMRAD-format. På første side ses en tekstboks med anvendte forkortelser. Såvel materiale og metodeafsnit som resultatafsnit er opbygget ud fra rækkefølgen af målformuleringens 8 punkter. Alle bilag forefindes på vedlagte DVD. Tilblivelsen og udførelsen af dette projekt er, på Patologisk Institut blevet mødt med stor interesse og hjælpsomhed fra alle medarbejdere. En særlig tak til de mennesker, der har været direkte involveret i projektet. Tak til bioanalytikere og patologer fra team 2, der har indsamlet prøvemateriale. En stor tak til laboratoriet for immunhistokemi, Pia Godiksen for mikrotomi, Susanne Thomasen for fremstilling af TMA-blokke, mikrotomi samt utrættelig hjælp til diverse opgaver og Jette Boysen Møller for introduktion til farvemaskine, fremstilling af antistoffortyndinger og svar på diverse spørgsmål. For generel hjælp i laboratoriet, tak til Lis Sander og Lis Vendelbjerg. Tak til Christos Meristoudis, patolog for deltagelse og hjælp ved resultataflæsning. For uvurderlig hjælp fra opstart til slut i projektet med bl.a. mikroskopi, resultattolkning besvarelse af diverse spørgsmål og frustrations-containere, en stor tak til Søren Nielsen, specialist i immunhistokemi og Preben Sandal. Tak til Henning Ilsø for vedvarende engagement og vejledning under hele projektet Afsluttende en kæmpe tak til mine skønne gruppemedlemmer, Camilla Mørkeberg Løngaa, Malene Damgård Thomsen og Sandra Holm Riggelsen for et godt og solidt samarbejde, hvor I har været engagerede og arbejdsomme i en grad, der fordrer respekt. Aarhus d

3 Abstract Introduktion: Med udviklingen af nye behandlingsmuligheder, er det blevet afgørende, ved lungecancer, at kunne skelne præcist imellem adenokarcinom og planocellulært karcinom. Ved udredningen af lungecancer, er der ofte kun sparsomt prøvemateriale i form af små biopsier og cytologi til rådighed, og af hensyn til eventuelle molekylærbiologiske analyser, er det afgørende at klassifikation af tumorer foretages på mindst muligt prøvemateriale. Derfor ønskes det at anvende specifikke og sensitive markører, gerne i dobbeltfarvninger. Metode: 2 kloner af p63 og 2 kloner af p4 sammenholdes. Protokoller udarbejdes og den bedst egnede klon for hvert antistof udvælges. Klonerne sammenholdes og det bedste antistof udvælges. Antistoffet afprøves på cytologi og i en dobbeltfarvning med Napsin A, hvor overensstemmelse både mellem histologiske og cytologiske analyseresultater samt diagnoseafgivelser vurderes. Resultater: Bedst egnede protokoller, demaskering og titer, blev: DAK-p63; CC1, 1:15, N/A; CC1, 1:3 og BC28; CC1, 1:2. Bedste kloner: DAK-p63 og BC28. p4 vælges som bedste antistof. Analyseresultaterne fra dobbeltfarvning med p4 og Napsin A fremviser generel overensstemmelse mellem cytologi og histologi. Ved diagnoseafgivelserne ses overensstemmelse mellem diagnoser i patologisystemet og diagnoser afgivet af patolog. Konklusion: p4 er det bedst egnede antistof til at skelne imellem ADC og SCC. Om p4 skal indgå i en dobbeltfarvning med Napsin A eller en anden relevant markør kræver yderligere studier. Sammenfattende er standardiserede valideringsprocedurer vigtige for at kvalitetssikre de immunhistokemiske og -cytokemiske analyser. 3

4 Indholdsfortegnelse FORORD... 2 ABSTRACT... 3 INDHOLDSFORTEGNELSE... 4 INTRODUKTION... 7 BAGGRUND... 7 FORMÅL... 8 PROBLEMFORMULERING... 8 MÅLFORMULERING... 8 TEORI... 1 PRÆSENTATION AF LUNGETUMORER... 1 PRÆSENTATION AF ANTISTOFFERNE P63, P4 OG NAPSIN A PRÆSENTATION AF BENCHMARK ULTRA DEMASKERINGSMETODER IMMUNHISTOKEMI ANALYSEPRINCIP FOR OPTIVIEW/ULTRAVIEW BILLEDAFLÆSNING OG SCORE-SYSTEMER MATERIALER OG METODER APPARATUR REAGENSER PRØVEMATERIALE FREMGANGSMÅDE RESULTATER UDARBEJDELSE AF PROTOKOLLER VALG AF BEDSTE KLON AF P63 OG BEDSTE KLON P BEDSTE KLONER UDVALGT TIL KLINISK VALIDERING AFPRØVNING AF P4 PÅ 4 DUPPRÆPARATER OG TMA-KLINISK AFPRØVNING AF NAPSIN A DOBBELTFARVNING P4 BC28 OG NAPSIN A DIAGNOSEKORREKTHED DISKUSSION BEDST EGNEDE PROTOKOLLER BEDSTE KLON AF P63 OG BEDSTE KLON AF P SEMIKVANTITATIV VURDERING AF DAK-P63 OG BC28 PÅ NEOPLASIER... 4 VALG AF BEDST EGNEDE ANTISTOF AFPRØVNING AF BEDST EGNEDE ANTISTOF PÅ TMA-KLINISK OG CYTOLOGI AFPRØVNING AF NAPSIN A PÅ TMA-KLINISK OG CYTOLOGI DOBBELTFARVNINGER MED P4 OG NAPSIN A DIAGNOSEKORREKTHED VURDERING AF PROJEKTETS VALIDITET OG RELIABILITET KONKLUSION PERSPEKTIVERING

5 REFERENCELISTE... 5 BILAGSOVERSIGT PÅ DVD...FEJL! BOGMÆRKE ER IKKE DEFINERET. BILAG POWERPOINT FRA VENTANA BILAG UTENSILER BILAG ANTISTOFFER OG DILUENT BILAG DETEKTIONSKIT ØVRIGE REAGENSER BILAG SKITSER OVER TMA-BLOKKE BILAG LITTERATURSØGNING OG EVIDENSVURDERING BILAG UDARBEJDELSE AF TMA-BLOKKE BILAG PROTOKOL BILAG ANTISTOFPRODUCENTENS ANBEFALINGER BILAG FREMSTILLING AF ANTISTOF-FORTYNDINGER SAMT TITERVÆRDIER BILAG PROTOKOLLER ANVENDT VED AFPRØVNING AF TITERVÆRDIER OG DEMASKERINGSMETODER BILAG PROCEDURER BILAG PROCEDURER VED MIKROSKOPI OG RESULTATVURDERING BILAG BILAG BILAG AFLÆSNINGSSKEMA FOR P63, 4A BILAG AFLÆSNINGSKEMAER FOR P63, DAK-P

6 BILAG AFLÆSNINGSSKEMAER FOR P4, N/A BILAG AFLÆSNINGSSKEMAER FOR P4, BC BILAG AFLÆSNINGSSKEMA TIL TMA-NEOPLASI BILAG AFLÆSNINGSSKEMA TIL TMA-VMS, NSCLC BILAG AFLÆSNINGSSKEMA TIL TMA-LUNGE MB1, ADENOKARCINOM BILAG AFLÆSNINGSSKEMA FOR TMA-LUNGE MB2 29, PLANOCELLULÆRT KARCINOM BILAG AFLÆSNINGSSKEMA TIL TMA-NEUROENDOKRIN BILAG AFLÆSNINGSSKEMAER PÅ DOBBELTFARVNING, JUSTERING AF NAPSIN A Forkortelser anvendt i opgaven NSCLC, ikke-småcellet karcinom SCLC, småcellet karcinom LCC, storcellet karcinom ADC, adenokarcinom SCC, planocellulært karcinom Forsidebillede: d TMA, tissue mikro array NBF, neutral bufferet formalin PBP-gruppe, professions-bachelor-projekt gruppe Illustration fra forside:

7 Introduktion Baggrund Lungecancer er en af de hyppigste cancerformer i verden med en incidens i 28 på ca. 1,6 mio. 5-års overlevelsen på verdensplan er ca. 5,8 % (1). I Danmark diagnosticeres årligt ca. 435 nye tilfælde af lungecancer. Prognosen i Danmark er lidt bedre med en 5-års overlevelse på ca. 1 %. Den generelt dårlige prognose skyldes bl.a. at knap 7 % af patienterne ved diagnosetidspunktet allerede har en fremskreden lungecancer med metastasering til fx hjerne, binyrer og lever (2; 3). Den primære årsag til udviklingen af lungecancer er tobaksrygning men andre karcinogener som fx asbest og radon kan også være medvirkende årsager (4). Lungecancer opdeles overordnet i 2 hovedgrupper SCLC og NSCLC, sidstnævnte ses i ca. 8 % af tilfældene (5). NSCLC kan yderligere opdeles i ADC, SCC og LCC. Den procentvise fordeling af førnævnte karcinomer var i Danmark i 27 følgende ADC 69 %, SCC 25 % og LCC 6 % (3). SCC har sin oprindelse i pladeepithel, der har undergået metaplasi og den ses ofte lokaliseret i hovedbronkier. ADC udgår derimod fra kirtelepithel og er ofte perifert beliggende (6). Med tilgængeligheden af mere målrettede behandlinger er det vigtigt, i de tilfælde, hvor det morfologisk er umuligt at stille en specifik diagnose, at anvende immunhistokemiske analysemetoder til at skelne mellem ADC og SCC (5). Dette stiller store krav til de immunhistokemiske undersøgelsers pålidelighed, pga. af de behandlingsmæssige tiltag, der iværksættes ud fra disse, fx gives tillægsbehandling med Bevacizumab 1 kun til patienter diagnosticeret med ADC. Behandlingen kan derimod give fatale bivirkninger for patienter med SCC, såsom hæmoragi i lungerne (7). Derudover er behandlingen økonomisk krævende, hvilket derfor også nødvendiggør en præcis diagnosticering (3). Immunhistokemisk er antistoffet p63 en vigtig kernemarkør til at detektere SCC, hvor fx antistoffet Napsin A er en egnet cytoplasmamarkør for ADC (8; 9). Sensitiviteten for p63 er høj ca. 1 % men specificiteten er derimod forholdsvis lav ca. 6 %, hvilket bl.a. skyldes, at den ofte ses udtrykt i ADC. For at imødekomme denne problematik har 1 Angiogenese hæmmende antistof (3). 7

8 antistoffet p4, der er en isoform af p63, vist sig anvendelig med en højere specificitet på ca. 98 % for SCC og med en sensitivitet på 1 % (7). En høj specificitet er vigtig, både i forhold til at stille en korrekt diagnose og for at tilgodese, at der ofte kun er sparsomt prøvemateriale til rådighed i form af små biopsier og cytologi (1). Ydermere skal der tages højde for, at der efterfølgende skal være prøvemateriale til eventuelle molekylærbiologiske undersøgelser som fx EGFR eller ALK (5). Patologisk Institut på Ålborg Universitetshospital har et ønske om at erstatte p63 med p4 til at skelne mellem SCC og ADC, hvis p4 viser sig bedre egnet. På nuværende tidspunkt udføres der årligt ca. 85 p63-immunfarvninger på lungemateriale (11). Før p4 kan implementeres til brug i rutinen, skal antistoffet valideres. Dette indbefatter, at der udarbejdes en egnet protokol og at antistoffet valideres til klinisk brug. Ydermere er afdelingen interesseret i, at benytte antistoffet i en dobbeltfarvning fx sammen med cytoplasmamarkøren Napsin A. Dobbeltfarvningen skal anvendes til at skelne mellem ADC og SCC og derudover tilgodeser dobbeltfarvningen også den begrænsede mængde prøvemateriale. Formål Formålet med dette projekt er at evaluere antistoffet p4 og sammenholde det med, det allerede implementerede, antistof p63. Dette gøres med henblik på at finde det bedst egnede antistof til at skelne mellem ADC og SCC. Dernæst sammenlignes klinisk histologisk- med tilhørende cytologisk materiale for at validere analyseprotokollen på cytologisk prøvemateriale. Supplerende anvendes det udvalgte antistof i en dobbeltfarvning med Napsin A. Problemformulering Hvilket antistof er den mest optimale markør til at skelne mellem ADC og SCC, både på histologisk og cytologisk prøvemateriale? Målformulering 1. Først findes den bedst egnede protokol for p4, herunder klonerne p4 BC28 og p4 N/A samt p63, klon DAK-p63 2 ved at anvende 3 forskellige 2 Protokol til p63, klon 4A4 forefindes på afdelingen. 8

9 demaskeringsprocedurer samt forskellige titerværdier for de primære antistoffer. Til dette anvendes en TMA-normal blok Med anvendelse af NordiQC-score 4 laves en kvalitativ vurdering af de enkelte kloner med de forskellige demaskeringer og antistoftitere og derefter udvælges den bedste klon for henholdsvis p63 og p4. 3. En H-score 5 anvendes til semikvantitativ undersøgelse af reaktioner i forskellige cancertyper med den bedste klon af p63 og p4. Dette gøres på klinisk TMAneoplasi blok og forskellige TMA-lunge 6 blokke. Kvalitativt undersøges samtidigt for eventuel krydsbinding Ud fra målformuleringspunkt 3. udvælges det bedst egnede antistof. 5. Med Patologisk Instituts faste protokol for immunfarvninger på cytologisk materiale, afprøves det bedst egnede antistof på 4 af de indsamlede cytologiske duppræparater, 2 ADC og 2 SCC for at undersøge om titerværdien kan overføres direkte fra histologisk til cytologisk prøvemateriale eller om der eventuelt skal foretages justeringer. 6. Patologisk Institut har endvidere faste protokoller for dobbeltfarvninger på cytologisk materiale, ud fra disse afprøves det bedst egnede antistof sammen med Napsin A på de indsamlede cytologiske duppræparater, 2 ADC og 2 SCC for at vurdere om titerværdien for Napsin A skal optimeres. 7. Semikvantitativt vurderes dobbeltfarvningerne anvendt på alle duppræparaterne samt tilhørende histologisk TMA-blok, med en klinisk score 8 for at afdække, om der er overensstemmelse mellem histologiske og cytologiske immunfarveresultater. 3 TMA: Tissue Micro Array er en paraffinblok med forskellige vævsstykker indstøbt (32). 4 NordiQC-score inddeler analyseresultaterne i: Optimal, good, borderline og poor (13). 5 H-score anvendes til vurdering af farveintensitet og udbredelse af den immunhistokemiske farvning i tumorcellerne (24). 6 TMA-lunge blokke består af følgende; TMA-ADC, TMA-SCC, TMA-blandet (ADC, SCC og storcellet karcinom) og TMA-neuroendokrine karcinomer/karcinoider. 7 Krydsbinding er uønsket uspecifik binding i andre vævsstrukturer fx cytoplasma og serum (24). 8 Med klinisk score vurderes tumorcellerne i antal % og farveintensitet (19). 9

10 8. Afsluttende sammenholdes diagnoserne bestemt ud fra aflæsning af dobbeltfarvningerne på de cytologiske præparater med de faktiske diagnoser fra patologisystemet. Dette gøres for klinisk at validere det bedst egnede antistof på cytologisk prøvemateriale til at indgå i en dobbeltfarvning, med henblik på at opnå brugbare analyseresultater til at skelne mellem ADC og SCC. Teori Der fortælles indledende om forskellige typer af lungecancer. De 3 anvendte antistoffer præsenteres og beskrives i forhold til, hvilke væv de reagerer i. Afsluttende præsenteres farvemaskine, demaskeringsmetoder, analyseprincipper for detektionssystemerne samt de anvendte scoresystemer. Præsentation af lungetumorer Planocellulært karcinom Der findes forskellige varianter af SCC. Kombinationen af den ofte centralt placerede tumor, der øger mulighederne for operabelt indgreb, sammenholdt med den langsomme vækst, bevirker at SCC generelt har en bedre prognose. Histologiske og cytologiske karakteristika SCC udgår ofte fra mucosa i de centrale bronkier og kan både være keratiniserende, højt differentierede og ikke-keratiserende, lavt differentierede SCC. Vækstmønstret kan være krybende langs den bronkiale mucosa og mikroinvasivt eller det kan være penetrerende med nedadgående invasiv vækst. Cytologisk ses ofte nekrotisk baggrund og ødelagte celler. Tumorcellerne er primært enkeltliggende eller i sheets. Pleomorfe og bizarre celleformer, som spindelformede og haletudseformede, er typiske og der ses store/umodne celler. Kernerne er pleomorfe og kan fremstå pyknotiske. Der ses hyperkromasi og groft granulerede kromatin og under 1 % af kernerne har synlige nukleoler. Cytoplasma er velafgrænset og tæt og ses enten rigeligt og keratiniseret eller mere sparsomt og ikke-keratiniseret (4). Adenokarcinom ADC er kendetegnet ved deres kirtelstrukturer eller mucinproduktion samt forskellige vækstmønstre. Overordnet findes der 2 typer af ADC, bronkogent- og bronkiolo-aveolært. ADC betragtes som aggressiv med en dårlig prognose, da den ofte er hurtigt voksende og tidligt metastaserende (4). 1

11 Histologiske og cytologiske karakteristika ADC udgår fra det pseudolagdelte cylinderepithel beliggende i de sekundære bronkier og bronkioler. Tumorcellerne ses lejret i acinære- eller papillære strukturer og ligner slimproducerende bægerceller. Ved bronkiolo-alveolært karcinom ses tumor som diffus og infiltrerende eller som perifert voksende. Tumorcellerne er papillært lejret og mucinproducerende (4). Cytologisk ses en granuleret blodtilblandet baggrund med ødelagte hæmatologiske celler. Tumorcellerne er lejret i 3-demensionelle syncytier eller papillære grupper. Celleformerne er kendetegnet ved at være ensartede runde/ovale med store excentrisk lejrede kerner indeholdende en stor centralt beliggende nukleole. Kromatinet er uregelmæssigt fordelt og groft granuleret. Cytoplasma kan indeholde store vakuoler men ellers er cytoplasmaet fint vakuoliseret (4). Storcellet karcinom Kategorien, LCC, indbefatter en gruppe af forskellige hurtigt voksende lavt differentierede karcinomer af ukendt oprindelse. Tumorudbredelsen er ofte omfattende med lymfogen og hæmatogen metastasering (4). Histologiske og cytologiske karakteristika Histologisk ses en diffus infiltration i form af sheets indeholdende store udifferentierede celler, der hverken vokser acinært eller er mucinproducerende (4). Cytologisk ses cellerige præparater med tumordiatese og små løse enkeltliggende cellegrupper i irregulære syncytier. Der ses en udtalt cellepleomorfi og store uregelmæssige runde/ovale kerner. Kromatinstrukturen er groft granuleret, ujævnt fordelt og med clearing -områder. I kernerne ses ofte multiple uregelmæssige nukleoler. Der er rigeligt cytoplasma med en svag afgrænsning, det fremstår homogent (4). Neuroendokrine tumorer De neuroendokrine tumorer inddeles i 4 typer, de udviser alle forskellige varianter af vækstmønstre som fx palisadering, rosette-strukturer, trabekularitet og organoide øer. De adskilles primært ud fra tilstedeværelsen af nekrose samt deres mitose-aktivitet (4). 11

12 Småcellet karcinom SCLC vurderes som aggressiv med en dårlig prognose, den er hurtigt voksende og tidligt metastaserende. SCLC stadieinddeles hovedsaligt i form af begrænset - eller udbredt og altså ikke ud fra TNM-systemet 9 (4). Histologiske og cytologiske karakteristika Tumoren udvikles i de store bronkier og vokser ind i submucosa. Tumorcellerne er lokaliseret i små øer og er ofte ovale/runde og sidder som havrekorn på et aks, oat-cells. Ved invasiv vækst afstødes tumorceller i store mængder (4). Cytologisk ses lokal tumordiatese. Tumorcellerne er lejret i løse grupper og er karakteriseret ved moulding. Cellerne er små med pleomorfe kerner med hyperkromatisk groft granuleret kromatin eller med en finere granuleret kromatinstruktur (salt/peber). Der ses sjældent nukleoler, ligesom cytoplasma er sparsomt eller mangler helt (4). Storcellet neuroendokrin karcinom Storcellet neuroendokrin karcinom forekommer sjældent men som SCLC er den også tidligt metastaserende og har en dårlig prognose. Histologiske og cytologiske karakteristika Storcellet neuroendokrin karcinom har varierende neuroendokrine vækstmønstre og områder med nekrose samt høj mitose-aktivitet. Cytologisk ses store celler, der kan mangle nukleoler og have en fint granuleret kromatinstruktur eller de kan have groft granuleret kromatinstruktur og indeholde nukleoler. Cytoplasmamængden er begrænset (4). Karcinoider Karcinoider opdeles i typiske og atypiske karcinoider, de er typisk langsomt voksende og mindre tilbøjelige til at metastasere, dog ses metastasering hyppigere hos atypiske karcinoider. Karcinoider har en bedre prognose (4). Histologiske og cytologiske karakteristika Typiske og atypiske karcinoid har varierende neuroendokrine vækstmønstre. Der ses ofte forskellige vækstmønstre i samme tumor. Der ses ikke nekrose. Cytologisk ses ensartede tumorceller, der kan minde om plasmaceller. I atypiske karcinoider ses også cellepleomorfi. Kernerne har fint granuleret kromatin (salt/peber) og i nogle celler ses små nukleoler. Cytoplasma fremstår fint granuleret (4). 9 TNM-systemet står for T: tumor (størrelse og beliggenhed), N: patologiske lymfeknuder (antal og beliggenhed) og M: metastasering. TNM-systemet anvendes både prognostisk og til behandlingsplanlægnin 12

13 Afsluttende kan neuroendokrin uddifferentiering observeres i 1-2 % af SCC-, ADC- og storcellede karcinomer, ses dog oftest i ADC. Indsamling af egnet prøvemateriale er afgørende for, den præcise klassifikation af de enkelte tumorer. Næsten 5 % af lungekarcinomer udtrykker heterogenitet og derved kan klassifikation, på små biopsier m.m., være problematisk (4). Præsentation af antistofferne p63, p4 og Napsin A p63 og p4 Nogle af de mest anvendte immunhistokemiske markører til at skelne mellem SCC og ADC er p63, p4, TTF-1, CK5 1 og Napsin A. Med brug af antistof p63 ses en del falskpositive reaktioner i ADC, rammes derimod en isoform af p63, ΔNp63 med antistoffet p4 øges specificiteten for SCC (1). p63 er lokaliseret på kromosom 3q27-29 og er strukturelt homologt med p53 og funktionsmæssigt fungerer de begge som tumorsupressorgener. p63 er en transkriptionsfaktor (TP63), der har 2 promotorer, der producerer 2 forskellige typer af proteinet, p63, den ene type TAp63 indeholdende transaktiveringsområdet og den anden type ΔNp63 mangler det. ΔNp63 virker som inhibitor på p53 og derved begrænses både reparation af beskadigede celler og inducering af apoptose, samtidig øges tumorgenesen ved at cellerne holdes på et stamcellelignende fænotypeniveau (1). p63 er udtrykt i lymfocytter, basalcellekerner i kirtelstrukturer i prostata, mamma og bronkier, i placenta i trophoblaster samt i kerner i epithel, herunder epidermis, esophagus, tonsil, urothel, ectocervix og vagina. ΔNp63 (p4) ses primært i basalceller, hvor TAp63 ses positiv højere oppe i epithellaget i differentierede celler. ΔNp63 (p4) ses overudtrykt i SCC, hvorimod der ses tab af TAp63. Dette gør antistoffet p4 betydeligt mere specifik for SCC end antistoffet p63. p4 ses også i trophoblaster i placenta. p63 ses udtrykt i ca. 7 % af SCC (1). Napsin A NAPSA-genet koder for proteinet, Napsin A som fungerer som inhibitor for aktiveringen af asparagin protease. Dette har indflydelse på foldning og modificering af proteiner (12). Napsin A ses primært udtrykt i lungerne og nyrerne. I lungerne udtrykt i type II pneumocytter, hvor det medvirker til syntesen af surfaktant protein B, samt sekundært i 1 TTF-1 er en kernemarkør for ADC og CK5 er en cytoplasmamarkør, der kan anvendes til SCC (8). 13

14 cytoplasma i alveole makrofager pga. fagocytose. I nyrerne ses Napsin A udtrykt i de proximale tubuli, hvor det er involveret i katabolismen af lysosomale proteiner (13). Napsin A ses udtrykt i ca 8 % af ADC dog med en markant lavere frekvens i lavt differentierede ADC. SCC er negativ for Napsin A (14). Præsentation af Benchmark ULTRA Ventana Benchmark Ultra er en fuldautomatisk farvemaskine til immunfarvninger med plads til 3 objektglas. Hvert objektglas placeres i en særskilt skuffe med tilhørende varmeplade, derved kan objektglassene håndteres individuelt fx ved manuelle titreringer (15). Demaskeringsmetoder Demaskering anvendes til at gøre epitoper immunreaktive efter fiksering og til at blotlægge svært tilgængelige epitoper. Demaskeringen kan overordnet foregå på 3 måder, ved forbehandling med proteolytiske enzymer, med HIER 11 eller ved en kombination af de 2 metoder. Ved demaskering med proteolytiske enzymer spaltes peptidbindinger tæt på de NBFmethenbroerne, der dannes under fiksering, blokerende naboproteiner fraspaltes og der skabes en øget permeabilitet i vævet (8). HIER foretages i en passende buffer, fx Ultra CC1, som er en Tris/EDTA-buffer med ph 8,5 eller Ultra CC2, der er en citrat-buffer med ph 6 (13). Demaskering med HIER bevirker, at methenbroer brydes, Ca-ioner der er komplekstbundne og epitopmaskerende fjernes, der sker en rehydrering af vævet, der medfører en øget permeabilitet og svært tilgængelige epitoper blotlægges pga. proteindenaturering (8). Cytologiske præparater skal formalinfikseres inden HIER ellers er der risiko for tab af cytologiske detaljer. HIER er i stand til både at affarve celler og demaskere epitoper i farvede imprints (8). Immunhistokemi Immunhistokemi kan anvendes til at studere og indhente viden om patogenetiske mekanismer, identifikation og klassifikation af neoplastiske processer samt prognostisk og terapeutisk klassifikation (8). 11 HIER, Heat induced epitop retrieval 14

15 Analyseprincip for OptiView/UltraView Da OptiView ikke farver rødt, skiftes til UltraView ved dobbeltfarvning. Disse foretages ved at lave 2, på hinanden følgende, enkeltfarvninger ved samme kørsel. Analyseprincip for OptiView Et primært antistof binder til antigener i vævet. Dernæst bindes et sekundært antistof, der er mærket med flere ikke-endogenaktive HQ (hydroxy-chinoner)-haptener til det primære antistof. Disse fungerer som en HQ-linker, der øger farveintensiteten, idet et større antal tertiære antistofmolekyler bindes hertil. Det tertiære antistof er en multimer mærket med HRP (horseradish peroxidase), der binder til haptenerne på det sekundære antistof. Når DAB kromogen tilsættes reagerer det med HRP og H 2 O 2 og derved dannes en farvet forbindelse, der udfældes i vævet oven på antigerne (16). Fig. 1 Analyseprincip for OptiView, for reference se bilag 1. Analyseprincip for UltraView Det primære antistof tilsættes og binder til antigener i vævet. Dernæst tilsættes et amplifikationskit bestående af amplifier A, kanin-anti-mus og amplifier B, mus-anti-kanin. Derefter tilsættes en multimer, der er et tertiært antistof, som er mærket med HRP via longarm-linkers, multimeren binder til de sekundære antistoffer. Når DAB kromogen tilsættes reagerer det med HRP og reagenset H 2 O 2 og derved dannes en farvet forbindelse, der udfældes i vævet oven på antigerne (17). 15

16 Fig. 2 Analyseprincip for UltraView, for reference se bilag 1. Billedaflæsning og score-systemer Foruden anvendelsen af nedenstående score-systemer, er der også lavet en kvalitativ vurdering af krydsbinding, uspecifik baggrundsfarvning og endogen reaktion. Krydsbinding forstået som en uønsket uspecifik reaktion i andre vævsstrukturer fx reaktion med en kernemarkør i cytoplasma og serum. Uspecifik baggrundsfarvning defineret som en reaktion, der ikke involverer det pågældende antistof og den epitop, det er rettet mod. Endogen reaktion set som egen-farvning pga. endogent biotin, ses ofte i nyre og lever (13). Der er anvendt 3 forskellige score-systemer til resultataflæsning af immunfarvningerne. NordiQC-score er anvendt som en kvalitativ vurdering af analyseresultater på TMAnormal. Med NordiQC- score inddeles analyseresultaterne i 4 kategorier. 1. Optimal, farvningen er perfekt eller tæt på perfekt i alle inkluderede væv. 2. Good, farvningen er fuld acceptabel i alle inkluderede væv, dog kan protokollen optimeres for at sikre den bedste farveintensitet og signal-støj ratio Borderline, farvningen er utilstrækkelig fx pga. generelt svag farvning eller falsk negativ farvning af ét af de inkluderede væv eller pga. en falsk positiv farvereaktion. Protokollen bør optimeres. 12 Signal-støj ratio: Når niveauerne for det ønskede signal sammenholdes med uønsket baggrundsfarvning. 16

17 4. Poor, farvningen er meget utilstrækkelig fx pga. falsk negativ farvning i flere af de inkluderede væv eller pga. udpræget falsk positiv reaktion. Protokollen må optimeres hurtigst muligt (13). H-score anvendes som en semikvantitativ vurdering af immunfarvning på tumorceller. Antallet af tumorceller i %, der har reageret sammenholdes med farveintensiteten og scoren beregnes ud fra formel: H-score = (% v/) + (% v/1) 1 + (% v/2) 2 + (% v/3) 3 13 H-score værdierne er beliggende fra til 3 og opdeles efter ekspressionsgrad (18). H-score -9 negativ, H-score lav ekspression og H-score 15-3 høj ekspression. Klinisk score anvendes som en semikvantitativ vurdering af dobbeltfarvningen. Med den kliniske score vurderes antal i % af reagerede tumorceller samt en gennemsnitlig farveintensitet for alle tumorceller (19). Der fastsættes en cut-off værdi på 1 %. Inddeling af grupper i; : -9 % negativ 1: 1-49 % positiv og 2: 5-1 % er positiv. Intensitet inddeles i; : negativ, 1: svag, 2: moderat og 3: intens. Materialer og metoder Apparatur 1. Ventana Benchmark Ultra. Instrumentnummer: ULTRA Fabrikant: ROCHE 2. Tissue-Tek, filmpålægningsmaskine. Instrumentnummer: Fabrikant: Sakura For anvendte utensiler, se bilag : Ingen reaktion, 1+: svag reaktion, 2+: moderat reaktion og 3+: intens reaktion. 17

18 Reagenser Antistoffer - p63, klon: 4A4, monoklonal mus. Isotype: IgG2a, kappa. Producent: DAKO - p63, klon: DAK-p63, monoklonal mus. Isotype: IgG2a, kappa. Producent: DAKO - p4, klon: N/A, polyclonal kanin. Isotype: Kanin IgG. Producent: Biocare Medical - p4, klon: BC28, monoclonal mus. Isotype: IgG1. Producent: Biocare Medical - Napsin A, klon: IP64, monoclonal mus. Isotype: IgG2b. Producent: Leica For lot-numre, åbnings- og holdbarhedsdato, se bilag 3. Detektionskit - OptiView DAB IHC Detections Kit - UltraView Universal DAB Detection Kit og UltraView Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit samt et amplification Kit For producent, lot-numre, åbnings- og udløbsdatoer samt øvrige reagenser, se bilag 4. Prøvemateriale Histologisk prøvemateriale Følgende TMA-blokke er anvendt i projektet: - TMA-normal, TMA-neoplasi (41 væv med forskellige cancere), TMA-lunge MB1 (15 ADC), TMA-lunge MB2 (15 SCC), TMA-VMS (NSCLC; 5 ADC, 5 SCC og 5 LCC), TMA-neuroendokrin (karcinoider; 2 atypiske, 4 typiske, 4 SCLC og 4 storcellet) og TMA-klinisk (1 karcinoid, 2 blandingstumorer, 1 SCC og 12 ADC). For oversigt over TMA-blokke, se bilag 5. Cytologiske prøvemateriale Af cytologisk prøvemateriale er der anvendt duppræparater fra lungevæv indeholdende tumorceller. Fremgangsmåde Litteratursøgning For litteratursøgning, herunder inklusions-/eksklusionskriterier, søgeprotokol og evidensvurdering, se bilag 6. Kvalitetsniveau Kvalitetsniveauet for dette projekt er tilsvarende Patologisk Instituts kvalitetskrav ved validering af antistoffer. Dvs. at der blev anvendt, allerede fastlagte, protokoller udarbejdet 18

19 af Patologisk Institut, disse er kendetegnet ved at være specifikt valideret til brug i laboratoriet på de tilhørende farvemaskiner m.m. Det var kun titerværdi og demaskeringsmetode, der blev varieret. Indsamling af prøvemateriale Indsamling af klinisk prøvemateriale foregik i tidsrummet til Ved modtagelse af frys på lungevæv, blev ufikseret lungevæv, indeholdende tumor duppet på 1 Plusglas, derefter luftfikseret og nedfrosset i -8 C fryser. Der blev indsamlet 31 patientprøver, hvoraf 6 blev udtaget. 3 patientprøver var ikke cancere, 1 prøve blev udtaget grundet teknisk fejl på farvemaskine og efter vurdering, med klinisk score på cytologi, blev endnu 2 patientprøver udtaget, idet de ikke indeholdt egnet cellemateriale. Sammenlagt blev 25 patientprøver analyseret, hvor både histologi og cytologi fandtes egnet til vurdering. Følgende tumorer er repræsenteret; 1 karcinoid, 2 blandingstumorer (1 ADC med neuroendokrin uddifferentiering og 1 adenosquamøst), 1 SCC og 12 ADC. Fremstilling af TMA-blokke TMA-neuroendokrin og TMA-klinisk blev fremstillet til dette projekt. For fremstilling af henholdsvis TMA-blokkene, se bilag 7. Kontroller Følgende kontroller er anvendt ved immunfarvningerne: - K1, kontrol til p63/p4, indeholdende appendix, tonsil, pancreas og lever. Skal fremvise positiv kernereaktion i pladeepithel i tonsil og være negativ i øvrige væv. - K4, kontrol til Napsin A, indeholdende; thyroidea, lunge, placenta og prostata. Skal fremvise positiv cytoplasmareaktion i alveolemakrofager og type II pneumocytter i lunge, kan farve cytoplasma i placenta og skal ellers være negativ i øvrige væv. - Interne positive kontroller i TMA-blokkene består primært af normal tonsil med pladeepithel og som intern negativ kontrol, blev levervæv anvendt. Hvis ikke andet er angivet, er kontrollerne godkendt ved de forskellige immunfarvninger. 19

20 Resultataflæsning Alle analyseresultater er aflæst af PBP-gruppe og af bioanalytiker/patolog/specialist i immunhistokemi fra Patologisk Institut. Ved uoverensstemmelser noteres og anvendes aflæsningsresultatet afgivet af den erfarne medarbejder. Resultataflæsning af dobbeltfarvning på både TMA-klinisk og duppræparaterne er foretaget blinded af patologen. Resultatbearbejdning foretages med 3 forskellige score-systemer. Ved den tekniske validering vurderes immunfarvningerne med NordiQC score. Immunfarvninger på de forskellige TMA-blokke vurderes med H-score. Dobbeltfarvningerne på histologi og cytologi vurderes med klinisk score. De bedst egnede protokol Alle immunfarvninger udført for at finde den bedst egnede protokol, blev foretaget med OptiView på TMA-normal. Da p63 4A4 anvendes som reference, blev der foretaget én farvning med afdelingens faste protokol (48) med denne klon. For titer, demaskering og protokol-resumé, se bilag 8. Med udgangspunkt i producentens anbefalinger for titerværdi, blev indledende 3 forskellige titere afprøvet på hver klon. Med en faktor 4 øges/mindskes titeren. For producentens anbefalinger og anvendte titerværdier, se bilag 9 og 1. De forskellige titere afprøves med 3 forskellige grundprotokoller; DAK-p63, N/A, BC28, demaskering CC1, histologi DAK-p63, N/A, BC28, demaskering CC2, histologi DAK-p63, N/A, BC28, demaskering Protease 1, histologi For resumé af protokoller, se bilag 11. For procedurer, gældende alle immunfarvninger, herunder præparering af prøvemateriale, kørsel på farvemaskine, efterbehandling og montering (2). Se bilag 12. Ved mikroskopering og vurdering med NordiQC-score blev det besluttet, i samråd med specialist i immunhistokemi, at afprøve endnu 1 titer for hver klon. Herefter blev bedste protokoller for de 3 kloner udvalgt. Ved mikroskopering blev immunfarvningerne kvalitativt vurderet, sensitiviteten blev vurderet ud fra ekspression i trophoblaster i placenta og specificiteten ud fra falsk- positive/negative resultater. Krydsbinding og uspecifik baggrundsfarvning blev vurderet ud fra reaktioner i fx cytoplasma og serum samt ved vurdering om, baggrunden fremstod klar med tydeligt differentierede farveudfældninger. For fremgangsmåde ved mikroskopi og resultatvurdering, se bilag 13. 2

21 Valg af bedste klon for p63 og p4 Ud fra NordiQC-score afgivet for at finde de bedst egnede protokoller kunne analyseresultaterne fra de enkelte kloner sammenholdes. På dette grundlag blev den bedste klon for p4 udvalgt. Begrundelsen for valg af bedste klon af p63 er, at den ene klon udgår af produktion. Afprøvning af de 2 udvalgte kloner Alle immunfarvninger, der blev udført for at finde frem til den bedst egnede klon blev foretaget med OptiView på følgende TMA-blokke; TMA-neoplasi, TMA-lunge MB1, TMA-lunge MB2, TMA-VMS og TMA-neuroendokrin. Grundprotokol 849 blev anvendt, se bilag 11. Ved mikroskopering vurderedes vævet først kvalitativt som positivt eller negativt. Med udgangspunkt i tumorcellerne, vurderedes semikvantitativt udbredelse og farveintensitet. Tumorceller kendetegnet bl.a. ved lejring fx kirtelstrukturer, store kerner, kromatinstruktur samt celle- og kernepleomorfi. H-score blev beregnet og nedskrevet i tabel og eventuel krydsbinding og uspecifik baggrundsfarvning blev noteret. Aflæsningsresultater afgivet af PBP-gruppe blev sammenholdt med resultater afgivet af specialist i immunhistokemi og bedste antistof blev udvalgt til videre validering. Enkeltfarvning med p4 og Napsin A på cytologi Indledende blev der udført en oversigtsfarvning på alle duppræparater med May Grünewald Giemsa. Med p4 blev der afprøvet en enkeltfarvning på TMA-klinisk og 4 udvalgte duppræparater med OptiView. Grundprotokol 849 blev anvendt til TMA-klinisk og 82 blev anvendt til cytologi. For protokol-resumér, se bilag11 og 14. Efterfølgende blev Napsin A afprøvet på TMA-klinisk og de 4 udvalgte duppræparater. Protokol 69 blev anvendt til TMA-klinisk og 693 blev anvendt på duppræparaterne. For protokol-resumé, se bilag 15. Titerværdien for Napsin A på cytologi blev justeret. Den histologiske vurdering af immunfarvningerne blev fortaget med udgangspunkt i, at vævsmorfologien fremstod tydeligt og differentieret. Ved mikroskopering af duppræparaterne, blev farvningen vurderet i forhold til sensitivitet og farveintensitet samt om kerne- og cytoplasmastrukturer fremstod tydeligt. I samråd med patolog blev enkeltfarvningerne, herunder titere fundet egnet til at indgå i dobbeltfarvning på både histologi og cytologi. Endvidere ønskede patologen en farvning 21

22 med TTF-1 for at bekræfte farvningen med Napsin A. Denne blev ikke vurderet af PBPgruppen. Dobbeltfarvning med p4 og Napsin A Dobbeltfarvning blev foretaget med UltraView og blev indledende udført på TMA-klinisk og 4 udvalgte duppræparater og efterfølgende igen på TMA-klinisk og så på samtlige duppræparater. Protokol 69 blev anvendt på histologi og protokol 693 på cytologi. For protokol-resumé, se bilag 15. Resultataflæsning ved mikroskopi blev foretaget med klinisk score, en semikvantitativ vurdering af den gennemsnitlige udbredelse og farveintensitet for alle tumorceller i hele præparatet. Afsluttende foretog patolog en blinded resultataflæsning samt diagnosticering på henholdsvis histologi og cytologi. Disse resultater blev sammenholdt med PBPgruppens aflæsningsresultater og diagnoseforslagene blev sammenholdt med diagnoserne i patologisystemet. Resultater Først fremlægges resultater opnået under arbejdet med at finde frem til de bedst egnede protokoller for DAK-p63, p4 BC28 og p4 N/A. Ud fra NordiQC-score udvælges den bedste klon af p4, denne sammenholdes med DAK-p63. Dernæst fremvises resultater, i form af H-score, vedrørende validering af de 2 udvalgte kloner på forskellige kliniske TMA-blokke og derudfra vælges det bedst egnede antistof. Efterfølgende præsenteres resultater fra validering af både enkeltfarvning og dobbeltfarvning med Napsin A på det klinisk indsamlede prøvemateriale. Afsluttende opstilles komparativt resultaterne vedrørende diagnosticering af patolog på både cytologisk og histologisk materiale sammenholdt med diagnoser fra patologisystemet. For eksempler på virtuel mikroskopi, se bilag

23 Udarbejdelse af protokoller Afprøvning af forskellige demaskeringsmetoder og titere på DAK-p63 samt p4 N/A og p4 BC28. NordiQC-score ved forskellige protokoller Antistofklon Demaskering Titer NordiQC score Kommentar 1. kørsel p63 4A4 CC1 1:8 Good Ingen falsk negative/positive reaktioner Protease 1 1:15 Poor 1:5 Poor Falsk negativ reaktion i trophoblaster i placenta og i pladeepithel i esophagus Falsk negativ reaktion i trophoblaster i placenta og i basalceller i prostata Falsk negativ reaktion i pladeepithel i tonsil, i DAK-p63 1:2 Poor 1:15 Borderline trophoblaster i placenta, i urothel i blære, i basalceller i prostata og i pladeepithel i esophagus. CC1 CC2 1:5 Borderline 1:2 Borderline 1:15 Borderline 1:5 Borderline 1:2 Borderline Falsk positiv reaktion i sertoliceller i testis Falsk positiv reaktion i sertoliceller i testis 1:4 Poor Falsk negativ reaktion i pladeepithel i tonsil, i Protease 1 1:15 Poor 1:6 Poor trophoblaster i placenta, i basalceller i prostata og i urothel i blære og i pladeepithel i esophagus p4 N/A CC1 1:4 Good Ingen falsk positive/negative reaktioner 1:15 Good 1:6 Borderline Fokalt manglende reaktion i basalceller i prostata 1:4 Borderline CC2 1:15 Borderline 1:6 Borderline Fokalt manglende reaktion i basalceller i prostata 1:2 Poor Falsk negativ reaktion i pladeepithel i tonsil, i Protease 1 1:75 Poor trophoblaster i placenta, i basalceller i prostata og i p4 BC28 CC1 1:3 Poor 1:2 Optimal urothel i blære og i pladeepithel i esophagus Ingen falsk positive/negative reaktioner og ingen uspecifik baggrundsfarvning 1:75 Good Moderat reaktion i pladeepithel og svag reaktion i 23

24 1:3 Good trophoblaster CC2 1:2 Optimal 1:75 Good 1:3 Poor Ingen falsk positive/negative reaktioner og ingen uspecifik baggrundsfarvning Moderat reaktion i pladeepithel og svag reaktion i trophoblaster Falsk negativ reaktion i trophoblaster i placenta og falsk negativ reaktion fokalt i basalceller i prostata 2. kørsel DAK-p63 CC1 1:15 Borderline Falsk positiv reaktion i sertoliceller i testis p4 N/A CC1 1:3 Borderline Falsk negativ reaktion, fokalt manglende reaktion i basalceller i prostata, ingen uspecifik baggrundsfarvning p4 BC28 CC1 1:1 Good Uspecifik baggrundsfarvning i testis Tabel 1 NordiQC score og kommentarer til analyseresultaterne for DAK-p63, p4 N/A og p4 BC28 på TMA-normal ved forskellige demaskeringsmetoder og forskellige titere. For aflæsningsskemaer se bilag 16 (4A4), 17 (DAK-p63), 18 (N/A), 19 (BC28). p63 4A4 Er implementeret i rutinen på Patologisk Institut og fungerer som reference i dette projekt. p63 4A4 A B C D Fig. 3 Immunfarvning med p63 4A4 på TMA-normal i A) tonsil x1, B) prostata x1, C) placenta x2 og D) testis x1. Demaskering: CC1 og titer, 1:8. I tonsil ses en moderat reaktion i pladeepithel, svag reaktion i lymfocytter og svag uspecifik baggrundsfarvning. I prostata ses en moderat reaktion i basalceller. I placenta ses svag reaktion i trophoblaster og i testis ses ingen reaktion. Se bilag

25 Bedst egnede protokoller for DAK-p63, N/A og BC28 DAK-p63 DAK-p63 1:15 A B C D Fig. 4 Immunfarvning med DAK-p63 på TMA-normal i A) tonsil x1, B) prostata x1, C) placenta x2 og D) testis x1. Demaskering: CC1 og titer, 1:15. I tonsil ses en intens/moderat reaktion i pladeepithel og svag reaktion i lymfocytter. I prostata ses en moderat reaktion i basalceller. I placenta ses svag reaktion i trophoblaster og i testis ses svag reaktion i sertoliceller og svag uspecifik baggrundsfarvning. Se bilag 17. DAK-p63 1:2 A B C D Fig. 5 Immunfarvning med DAK-p63 på TMA-normal i A) tonsil x1, B) prostata x1, C) placenta x2 og D) testis x1. Demaskering: CC1 og titer, 1:2. I tonsil ses en intens reaktion i pladeepithel, moderat reaktion i lymfocytter og svag uspecifik baggrundsfarvning. I prostata ses en intens reaktion i basalceller. I placenta ses svag reaktion i trophoblaster og i testis ses svag reaktion i sertoliceller. Se bilag

26 p4 N/A p4 N/A 1:3 A B C D Fig. 6 Immunfarvning med p4 N/A på TMA-normal i A) tonsil x1, B) prostata x1, C) placenta x2 og D) testis x1. Demaskering: CC1 og titer, 1:3. I tonsil ses en moderat reaktion i pladeepithel. I prostata ses en svag reaktion i basalceller samt fokal falsk negativ reaktion i basalceller. I placenta ses svag reaktion i trophoblaster og i testis ses ingen reaktion. Se bilag 18. p4 N/A 1:15 A B C D Fig. 7 Immunfarvning med p4 N/A på TMA-normal i A) tonsil x1, B) prostata x1, C) placenta x2 og D) testis x1. Demaskering: CC1 og titer, 1:15. I tonsil ses en intens reaktion i pladeepithel og svag reaktion i cytoplasma i muskelceller. I prostata ses en intens reaktion i basalceller og svag uspecifik baggrundsfarvning. I placenta ses svag reaktion i trophoblaster samt svag fokal reaktion i cytoplasma og i testis ses svag uspecifik baggrundsfarvning. Se bilag

27 p4 N/A 1:6 A B C D Fig. 8 Immunfarvning med p4 N/A på TMA-normal i A) tonsil x1, B) prostata x1, C) placenta x2 og D) testis x1. Demaskering: CC1 og titer, 1:6. I tonsil ses en moderat reaktion i pladeepithel. I prostata ses en svag reaktion i basalceller samt fokalt manglende reaktion i basalceller. I placenta ses ingen reaktion i trophoblaster og testis fremviser ingen reaktion. Se bilag 18. BC28 BC28 1:2 A B C D Fig. 9 Immunfarvning med p4 BC28 på TMA-normal i A) tonsil x1, B) prostata x1, C) placenta x2 og D) testis x1. Demaskering: CC1 og titer, 1:2. I tonsil ses en intens reaktion i pladeepithel. I prostata ses en intens reaktion i basalceller. I placenta ses en svag reaktion i trophoblaster og testis fremviser ingen reaktion. Se bilag 19. BC28 1:1 A B C D Fig. 1 Immunfarvning med p4 BC28 på TMA-normal i A) tonsil x1, B) prostata x1, C) placenta x2 og D) testis x1. Demaskering: CC1 og titer, 1:1. I tonsil ses en intens 27

28 reaktion i pladeepithel. I prostata ses en intens reaktion i basalceller. I placenta ses en svag reaktion i trophoblaster og testis fremviser svag uspecifik baggrundsfarvning. Se bilag 19. Valg af bedste klon af p63 og bedste klon p4 Med NordiQC score vurderes det kvalitativt, at de 2 kloner, der fremviser bedste analyseresultater på TMA-normal er p63 4A4 og p4 BC28 men da klonen, 4A4 udgår af produktion, vælges DAK-p63. Se bilag 17 (DAK-p63) og 19 (BC28). Bedste kloner udvalgt til klinisk validering Semikvantitativ vurdering, med H-score, af immunfarvninger med BC28 og DAK-p63 i forskellige cancertyper fra TMA-neoplasi blok samt TMA-lunge blokke; TMA-MB1, TMA-MB2, TMA-VMS og TMA-neuroendokrin. H-score og ekspressionsgrad af BC28 og DAK-p63 i forskellige tumorer Tumorer Antal prøver Positive Prøver H-score 1-149, lav ekspression Aflæst af: PBP-gruppe Specialist i immunhistokemi BC28 DAK-p63 H-score H-score 15-3, høj 1-149, lav ekspression ekspression H-score 15-3, høj ekspression Lungetumorer SCC ADC LCC SCLC neuroendocrine carcinoma Large cell neuroendocrine carcinoma Lymfomer Diffuse large b- cell lymphoma B-cell T-cell lymphoma peripheral - Andre neoplasier Mamma ductal carcinoma Ovary serous I carcinoma Cervix uteri adeno carcinoma Pancreas adeno

29 carcinoma 1 Urothel carcinoma Rhabdo myo sarcoma Tumorer med H-score -9, negative Lungetumorer: Squamous sarcoma, atypisk neuroendocrine karcinoider og typisk neuroendocrine karcinoider Lymfomer: Hodgkin Classic lymphoma, Hodgkin mixed lymphoma, Follicular lymphoma, Mantle cell lymphoma og T-cell lymphoma anaplastic Andre neoplasier: Colon adeno carcinoma, kidney clear cell carcinoma, thyroid follicular carcinoma, ovary clear carcinoma, ovary endometrie carcinoma, testis semin, prostate adeno carcinoma,intest carcinoid, melanoma, GIST (gastro intestinal stromal tumor) og Leio myo sarcoma Tabel 2 Analyseresultater, aflæst af PBP-gruppe samt specialist i immunhistokemi på DAK-p63 og BC28, herunder antal positive/negative resultater samt H-score udtrykt ved ekspressionsgraden for de 2 immunfarvninger i forskellige tumortyper. Ved uoverensstemmelser mellem vurderinger foretaget af PBP-gruppe og specialist i immunhistokemi er begge aflæsningsresultater angivet. For eksakte H-score værdier på de forskellige TMA-blokke, se bilag Specificitet for henholdsvis p4 og p63 Mamma ductal karcinom fra TMA-neoplasi A a Fig. 11 Mamma ductal ( ) fra TMA-neoplasi, immunfarvning med A) BC28 x5 og B) DAK- p63 x5. BC28 har fået en H-score på og DAK-p63 har fået H-scoren 2 og der ses endvidere svag krydsbinding i cytoplasma. Se bilag 2. 29

30 SCC fra TMA-neoplasi A B Fig. 12 SCC ( ) fra TMA-neoplasi, immunfarvning med A) BC28 x5 og B) DAK- p63 x5. BC28 har fået en H-score på 22 og DAK-p63 har fået H-scoren 22 og der ses svag krydsbinding i cytoplasma. Se bilag 2. ADC fra TMA-neoplasi A B Fig. 13 ADC ( ) fra TMA-neoplasi, immunfarvning med A) BC28 x5 og B) DAK- p63 x5. BC28 har fået en H-score på 2 og DAK-p63 har fået H-scoren 4 og der ses svag krydsbinding i cytoplasma. Se bilag 2. 3

31 SCLC fra TMA-neuroendokrin A B C D Fig. 14 SCLC fra TMA-neuroendokrin, immunfarvning med DAK-p63 øverst og BC28 nederst x1. A)1-2146, H-score på 55 og svag krydsbinding i serum. B) , H-score på 5. C) , H-score på. D) , H-score på. DAK-p63 fremstår med en svag kernereaktion i SCLC, hvorimod BC28 ikke reagerer i SCLC. Se bilag 24. LCC fra TMA-neuroendokrin A B C D Fig. 15 LCC fra TMA-neuroendokrin, immunfarvning med DAK-p63 øverst og BC28 nederst x1. A)12-267, H-score på 5. B) , H-score på 15 og svag krydsbinding i serum. C) , H-score på. D) , H-score på. DAK- 31

32 p63 fremstår med en svag til moderat kernereaktion og ingen reaktion med BC28. Se bilag 24. Lymfomer fra TMA-neoplasi A B C D Fig. 16 Lymfomer fra TMA-neoplasi, immunfarvning med DAK-p63 øverst og BC28 nederst x1. A)Diffuse Large B lymph , H-score på 19 og svag krydsbinding i cytoplasma. B) B-Cell , H-score på 6. C) Diffuse Large B lymph , H-score på. D) B-Cell , H-score på. DAK-p63 giver en tydelig kernereaktion og der ses ingen reaktion i BC28. Se bilag 2. Afprøvning af p4 på 4 duppræparater og TMA-klinisk Indledende immunfarvning med BC28 på cytologi Test af p4 BC28 1:2 på 2 ADC og 2SCC og tilhørende TMA-klinisk Patologinummer Vurdering af duppræparater Vurdering af TMA-klinisk Tumortype ADC Fokalt positiv, reaktion i 1-49 % af tumorcellerne Fokalt positiv, reaktion i 1-49 % af tumorcellerne , svag reaktion i alveole ADC makrofager og pneumocytter type II SCC Positiv, reaktion i 5-1 % af tumorcellerne, områder med Positiv, reaktion i 5-1 % af tumorcellerne nekrose SCC Positiv, reaktion i 1-49 % af tumorcellerne. Positiv, reaktion i 5-1 % af tumorcellerne Tabel 3 Vurdering af BC28 på 4 duppræparater, 2 ADC og 2 SCC. Der er anvendes en fastlagt protokol for cytologi (udarbejdet af Patologisk Institut) og samme titer 1:2, som der bruges histologisk. 32

33 For BC28 vælges titerværdi 1:2 også for cytologi til at indgå i dobbeltfarvningen. Afprøvning af Napsin A Patologisk Institut har en fastlagt protokol på Napsin A med en titer på 1:75 til cytologisk prøvemateriale. Denne afprøves og titer justeres til 1:25 Napsin A A B Fig. 17 Dobbeltltfarvning med Napsin A på cytologi, ADC tumorceller. A) x4 farvet med titer 1:75, her ses en intens reaktion i cytoplasma i alveole makrofag og svag til ingen reaktion i tumorceller. B) x4 titer 1:25, her ses en moderat reaktion i tumorceller. For Napsin A vælges titer 1:25 til at indgå i dobbeltfarvningen. Se bilag 25. Dobbeltfarvning p4 BC28 og Napsin A Indledende dobbeltfarvning med p4 BC28 og Napsin A Patologinummer Kommentarer til cytologi Kommentarer til histologi ADC ADC SCC SCC Moderat reaktion i 1-49 % af tumorcellerne for Napsin A Moderat reaktion i 1-49 % af tumorcellerne for p4 Ingen reaktion for Napsin A, heller ikke i alveole makrofager Moderat reaktion i 5-1 % af tumorcellerne for p4 Ingen reaktion for Napsin A i tumorceller Intens reaktion i 1-49 % af tumorcellerne for p4 Intens reaktion i 5-1 % af tumorcellerne for Napsin A Svag reaktion i 1-49 % af tumorcellerne for p4 Ingen reaktion for Napsin A Moderat/intens reaktion i 5-1 % af tumorcellerne for p4 Ingen reaktion for Napsin A i tumorceller Moderat reaktion i 5-1 % af tumorcellerne for p4 Tabel 4 Vurdering af indledende kørsel med dobbeltfarvning på 4 duppræparater. 33

34 Semikvantitativ vurdering med klinisk score af dobbeltfarvning på duppræparater og TMA-klinisk. Patologinummer Napsin A 1:25 grp./intensitet * / / * / / / Klinisk score afgivet af: PBP-gruppe Patolog Klinisk score, cytologi Klinisk score, histologi / p4 1:2 grp./intensitet Napsin A 1:2 grp./intensitet p4 1:2 grp./intensitet / / / / / / 2/3 3*/3 2/2 2/3 / / 2/3 / 1/3 1/2 / 2/2 2/3 2/2 1/2 1/ /3 / 2/2 / / 2/2 / 2/ /2 / 2/2 / / /3 2/2 / / / 2/2 / 1/3 2/3 2/3 2/2 / / 2/ / /1 2/2 / 2/ /1 /1 / 2/1 / /1 2/3 / /1 2/2 / / / / / / / / / Kan ikke vurderes få tumorceller 2/2 2/3 / 1/1 / 2/ /2 / 2/2 / /3 / 2/2 / 2/ / / / / /2 2/1 / 2/3 2/2 / /1 / 1/1 2/2 1/2 2/2 / / 2/3 / 2/ /2 2/3 / 2/3 / / / / / /3 / 2/2 / 2/2 Tabel 5 Klinisk score af dobbeltfarvning, afgivet af PBP-gruppe og af patolog, på duppræparater og tilhørende TMA-klinisk. Ved uoverensstemmelser mellem vurderinger 34

35 foretaget af PBP-gruppe og patolog er begge aflæsningsresultater angivet. Forkortelsen: grp. henviser til mængden af tumorceller. *Tumoren er ADC med neuroendokrin uddifferentiering, pga. heterogenitet er der standset ud 2 steder i tumorvævet, så begge vævstyper er repræsenteret. * Der kan max gives en vurdering på 2. Specificitet for p4 og Napsin A Dobbeltfarvning med p4 og Napsin A A B Fig. 18 ADC fra TMA-klinisk og duppræparat, patologinummer , dobbeltfarvning med Napsin A og p4. A) x1 Histologi, klinisk score for Napsin A 2/3 og for p4 /. B) x5 Cytologi, klinisk score for Napsin A 2/2 og for p4 /. Se bilag 26. Dobbeltfarvning med p4 og Napsin A A B Fig. 19 SCC fra TMA-klinisk og duppræparat, patologinummer , dobbeltfarvning med Napsin A og p4. A) x1 Histologi, klinisk score for Napsin A / og for p4 2/2. Der ses fokal reaktion med Napsin A, der kan reagerer i type II pneumocytter. B) x5 Cytologi, klinisk score for Napsin A / og for p4 2/2. Se bilag

36 Dobbeltfarvning med p4 og Napsin A A B C Fig. 2 Adenosquamøst karcinom fra TMA-klinisk og duppræparat, patologinummer A) x1 Histologi, enkeltfarvning med TTF-1, der ses kernereaktion i ADCtumorceller. Dobbeltfarvning med Napsin A og p4. B) x1 Histologi, klinisk score for Napsin A / og for p4 1/3. C) x1 Cytologi, klinisk score for Napsin A / og for p4 2/3. Se bilag 26. Diagnosekorrekthed Komparativ opstilling af diagnoser Diagnoser afgivet af patolog og diagnoser fra patologisystemet Patologinummer Diagnose på cytologi Diagnose på histologi Diagnose fra patologisystem ADC med neuroendokrin? evt. ADC? uddifferentiering ADC med neuroendokrin? evt. ADC? uddifferentiering SCC SCC Adenosquamøst SCC SCC SCC SCC SCC SCC SCC SCC SCC SCC SCC SCC, ikke keratiniserende ADC ADC ADC ADC ADC ADC ADC ADC ADC SCC SCC SCC, keratiniserende SCC SCC SCC, lavt differentieret ADC ADC ADC ADC ADC ADC ADC, med clear cell?? uddifferentiering ?? ADC, lavt differentieret SCC SCC SCC 36

37 ADC ADC ADC SCC SCC SCC ?? ADC, lavt differentieret ADC ADC ADC Adenosquamous ADC ADC SCC SCC SCC, lavt differentieret ADC ADC ADC ?? Karcinoid SCC SCC SCC, keratiniserende, evt. metastase Tabel 6 Diagnoser afgivet (blinded) af patolog på cytologi og histologi. Disse sammenholdes med allerede afgivne diagnoser i patologisystemet. Diskussion Sammenfattende er følgende resultater fremkommet. Bedst egnede protokoller blev; DAKp63, demaskering CC1, titer 1:15, N/A, demaskering CC1, titer 1:3 og BC28, demaskering CC1, titer 1:2. Ved den kvalitative vurdering med NordiQC-score fremkom 4A4 og BC28 som bedste kloner for henholdsvis p63 og p4. Dog vælges DAK-p63, da 4A4 udgår. På neoplasier, lungetumorer og lymfomer vurderes DAK-p63 og BC28 og p4 vælges som det bedst egnede antistof til den videre kliniske validering på cytologi. Både ved den indledende dobbeltfarvning med p4 og Napsin A samt den efterfølgende dobbeltfarvning ses generel overensstemmelse mellem de histologiske og cytologiske analyseresultater. Endelig er hovedparten af diagnoseafgivelser for cytologi og histologi samstemmende, undtaget diagnosticering af karcinoid, blandingstumorer og lavt differentierede tumorer. Bedst egnede protokoller Valideringsprocessen består overordnet af 2 faser, første fase omhandler den tekniske optimering med udarbejdelse af protokoller og anden fase, er den kliniske validering, hvor bedst egnede antistof vælges ud fra antistoffets specificitet, sensitivitet, reproducerbarhed og robusthed. Immunfarvninger foretaget i forbindelse med at finde frem til bedst egnede protokoller blev udført på TMA-normal. Den tekniske optimering på TMA-normal skyldes at i normalvæv, er både morfologi og ekspressionsgrad af de forskellige celle- og vævskomponenter velkendte og derved kan de rent tekniske faktorer tydeligere vurderes. 37

38 DAK-p63 Af tabel 1 fremgår det, at DAK-p63 med demaskering CC1 og titer 1:15 fik NordiQCscoren, borderline. I fig. 4 ses, at trophoblasterne i placenta fremstår tydeligere ved titer 1:15 end ved 1:2 i fig. 5. Dette indikerer en øget sensitivitet ved titer, 1:15 og derfor vælges denne, selvom der stadig ses en falsk positiv reaktion i sertoliceller i testis. Jf. fig. 4 er pladeepithel i tonsil intenst farvet, der ses en svag reaktion i lymfocytter og fokal uspecifik kernefarvning. Da p63 reagerer i lymfocytter er det forventeligt, at se denne reaktion, derimod er den uspecifikke kernefarvning uønsket. I fig 5. ses lymfocytterne moderat farvede og ydermere ses en svag uspecifik baggrundsfarvning. Basalceller i prostata udviser en intens reaktion med titer 1:15 og moderat reaktion ved 1:2. Der ses en tendens til, ved høje titere, at farveintensitet, forekomst af krydsbinding og især uspecifik baggrundsfarvning stiger. N/A At vælge N/A, demaskering CC1, titer 1:3 (tabel 1) som bedste protokol er en afvejning af sensitivitet kontra specificitet. Ved fortynding 1:15 ses, i fig. 7, intens reaktion i tonsilpladeepithel, ingen reaktion i testis og reaktion i trophoblaster i placenta samtidig ses krydsbinding i cytoplasma og uspecifik baggrundsfarvning i både prostata og placenta. Dette bevirker, at vævsmorfologien fremstår mere utydeligt. Ved titer 1:6 (fig. 8), ses moderat reaktion i pladeepithel i tonsil og ingen reaktion i testis, der ses falsk negativ reaktion i flere basalceller i prostata samt i trophoblaster i placenta. Titerværdi 1:3 (fig. 6) vælges pga. en tydeligere differentieret vævsmorfologi men fokalt ses falsk negativ reaktion i basalceller i prostata samt meget svagt farvede tropoblaster. Pladeepithel i tonsil er moderat farvet og der ses ingen reaktion i testis. Når sensitiviteten var høj ved titer 1:15 var specificiteten lav og vice versa ved titer 1:6. Specificitet blev valgt frem for sensitivitet for at bevare en differentieret vævsmorfologi, som er afgørende for, at patologen kan orientere sig i vævet. Ifølge Rossi et al (21) er morfologien grundlæggende ved diagnosticering og klassifikation af lungecancere. BC28 I tabel 1 ses, at BC28 med demaskering CC1 og titer 1:2 fik scoren, optimal. For yderligere at øge sensitiviteten blev titer 1:1 (fig. 1) afprøvet men herved sås en svag uspecifik baggrundsfarvning i testis. Dette fænomen blev ikke observeret ved titer 1:2 (fig. 9) og derfor blev denne titer valgt. Ved begge titerværdier fremstod pladeepithel i tonsil samt basalceller i prostata intenst farvet, hvorimod trophoblaster i placenta var svagt 38

39 farvede. Ud fra reaktionen i trophoblasterne, viste en højere titer ikke umiddelbart en øget sensitivitet. Demaskering Jf. tabel 1, er det tydeligt, at protease 1 ikke var egnet, idet alle immunfarvninger med denne demaskering fik scoren, poor. CC1 fremstod med lidt bedre resultater end CC2, CC1 havde ikke scoren, poor og færre analyseresultater med scoren, borderline. Valg af demaskeringsmetoder blev taget med udgangspunkt i Patologisk Instituts standard for validering af antistoffer. Ifølge NordiQC (13) er demaskering i form af HIER forenelig med over 8 % af alle antistoffer. Den anvendte buffers ph har også indflydelse på kvaliteten af demaskeringen, det har vist sig at ph 8-9 er egnet til de fleste epitoper. Disse informationer understøtter resultatet af CC1 som optimal demaskeringsmetode. Ved brug af protease, er det afgørende at kende fikseringstiden og da denne ofte er ukendt, er det vanskeligt at styre demaskeringen, hvorved risikoen stiger for proteindenaturering og beskadigelse af vævsmorfologi. Dette øger forekomsten af falsk negative resultater og det har betydning for analysens reproducerbarhed og robusthed, som bliver vanskeligere at sikre. Titer For klonerne DAK-p63 og N/A var producentens anbefalinger, vedrørende titerværdi, højere end de valgte titere. Dette skyldes primært, at producenten ofte anbefaler højere titere end nødvendigt, under den forudsætning, at de enkelte laboratorier optimerer protokollen. En anden faktor, der spiller ind på fastsættelse af titer, er den enkelte patolog, der kan have et ønske om en specifik farveintensitet, for et givent antistof. Som eksempel på variation af titerværdi kan nævnes p63 klon 4A4 i Nonaka et al (22) anvendes titer 1:2, i Bishop et al (7) er titer 1:7 og i Kim et al (23) bruges titer 1:1. Grundprotokol Når ét antistof erstattes af et andet, er det ifølge DAKO (24) forsvarligt, at anvende den, i forvejen, implementerede grundprotokol. Ovenstående analyseresultater vurderes både som valide og pålidelige, dette skal dog ses i lyset af, at grundprotokollerne allerede var fastlagt af Patologisk Institut. Om der kunne være opnået forbedringer ved finjustering af fx inkubationstider, temperaturer, udskiftning af diluent m.m. er ikke afklaret. Goldstein et al (19) oplister følgende faktorer, der skal undersøges ved optimering af antistoffer; 39

40 forbehandling fx blokering af endogen enzymaktivitet, enzym-demaskering, valg af demaskeringsbuffer, valg af varmekilde, inkubationstid, detektionssystem og chromogen. Flere af disse parametre er ikke varieret i dette projekt. Bedste klon af p63 og bedste klon af p4 Ud fra NordiQC-score i tabel 1 udvælges BC28 med scoren, optimal som den bedste klon af p4 og for p63 gælder det, at 4A4 fik scoren, good men idet den udgår, vælges DAKp63, der har scoren, borderline. Det forekommer paradoksalt, set i lyset af det kontinuerlige arbejde med kvalitetsudvikling/-forbedring, at den nye DAK-p63 klon fremviser dårligere resultater end 4A4, i dette studie. p4, N/A er polyklonal, idet klonen binder til flere eptioper på samme antigen kan sensitiviteten øges men samtidig kan specificiteten nedsættes og risikoen for krydsbinding stige. N/A fremviste markant mere uspecifik baggrundsfarvning og krydsbinding i fx cytoplasma end BC28, der er monoklonal. At antistoffet er monoklonalt er dog, ifølge Bordeaux et al (25), ikke automatisk ensbetydende med, at det har en høj specificitet, også andre faktorer spiller ind fx antistoffets affinitet og eventuel kontaminering. Vedrørende affinitet skal antistoffets 3-dimensionelle proteinstruktur helst passe som nøgle i en lås til antigents 3-dimensionelle struktur for at sikre en optimal reaktion. Kontaminering kan forekomme, når det monoklonale antistof høstes fx fra ascites-væske i en mus. Denne væske kan indeholde andre antistoffer end de ønskede. Semikvantitativ vurdering af DAK-p63 og BC28 på neoplasier Med anvendelse af neoplasivæv undersøges både i hvilke væv og cancertyper, der sker en reaktion, hvilket er et udtryk for antistoffets specificitet samt hvordan reaktionen ses ved forskellige ekspressionsgrader, dette er et udtryk for antistoffets sensitivitet. Samtidig afdækkes i hvilken udstrækning krydsbinding og endogen reaktion finder det sted. Jf. tabel 2 fremgår det, at DAK-p63 og BC28 opnår samme resultat ved SCC, ud af 19 væv ses lav ekspression i 1 væv og høj ekspression i 18 væv. For ADC reagerer DAK-p63 i 5 ud af 21 væv, hvor BC28 reagerer i 2, begge udviser lav ekspression. Ligeledes reagerer begge markører i LCC, da denne kategori diagnostisk kan være lidt af en rodekasse er det ikke utænkeligt, at der kan være tale om et lavt differentieret SCC eller være tale om heterogenitet. 4

41 Der ses ingen reaktion med BC28 i nogle af de neuroendokrine tumorer, p63 viser lav ekspression i SCLC og storcellet neuroendokrint karcinom. Heller ikke i lymfomer reagerer BC28, derimod reagerer p63 i diffus large B cell lymfom, henholdsvis lav og høj ekspression samt i B-cell lymfom med lav ekspression. I andre neoplasier ses for BC28 reaktion i pancreas adenokarcinom, lav ekspression og urothel karcinom, både lav og høj ekspression. p63 reagerer i mamma ductal karcinom, høj ekspression, ovarie serøs 1 karcinom og cervix uteri adenokarcinom, lav ekspression, urothel karcinom, høj ekspression og ved Rhabdo myo sarkom ses lav ekspression. I de øvrige cancertyper reagerer ingen af markørerne. Generelt udviser BC28 en højere specificitet, da klonen kun reagerer med få tumortyper udover SCC. Ved BC28 ses endvidere mindre krydsbinding sammenlignet med DAK-p63. Sammenfattende, for både DAK-p63 og BC28, vedrørende H-score gælder det, at en høj H-score/ekspression ved SCC er udtryk for en høj sensitivitet, hvorimod en høj H-score/ekspression ved ADC er udtryk for en lav specificitet. Der er ikke fundet artikler, der omhandler studier med klonerne DAK-p63 og BC28, derimod findes studier, der sammenholder klonerne, p63 4A4 og p4 polyklonal. Samtlige anvendte artikler konkluderer, at p4 har en højere specificitet end p63 fx Pelosi et al (26), Bishop et al (7) og Nobre et al (1). Jf. fig. 11 fremgår det, at DAK-p63 er positiv med svag krydsbinding i cytoplasma i mamma ductal karcinom, der ses ingen reaktion med BC28. Lignende analyseresultater ses med DAK-p63 i forhold til SCLC med svag krydsbinding i serum(fig. 14), storcellet neuroendokrin karcinom med svag krydsbinding i serum (fig. 15) og ved diffus large B cell lymfom og B-cell lymfom (fig. 16) med svag krydsbinding i cytoplasma. BC28 er ikke positiv i nogle af de ovennævnte væv og der ses heller ikke hverken krydsbinding eller uspecifik baggrundsfarvning. I fig. 13 ses reaktion i ADC med både BC28 og DAK-p63. BC28 reagerer i få tilfælde af ADC ifølge studie af Bishop et al (7) ses reaktion med p4 i under 5 % af ADC, hvorimod p63 reagerer i ca. 31 % af ADC. Det overrasker derfor ikke, at BC28 fremviser en svag reaktion i få ADC under den kliniske validering. 41

42 Variation i aflæsning Ved den semikvantitative vurdering, udtrykt med H-scoren, var aflæsningsforskelle mellem PBP-gruppen og specialist i immunhistokemi primært defineret ved forskelle i vurdering af farveintensitet, hvilket medførte at PBP-gruppens H-score resultater generelt lå lavere. Dette medførte dog kun i få tilfælde en ændring i ekspressionsvurderingen fx ved immunfarvning med BC28 på TMA-neoplasi, der gav PBP-gruppen pancreas adenokarcinom H-scoren 5 og med cut-off værdi < 1, regnes den for negativ, specialist i immunhistokemi gav H-scoren 15, der ligger over cut-off værdien og vurderes som lav ekspression. Pga. manglende kendskab og erfaring forvekslede PBP-gruppen få gange stromale celler med tumorceller og fik derved afgivet en ukorrekt H-score. For at imødekomme usikkerhed på resultataflæsningerne er H-scoreværdier fra specialist i immunhistokemi anvendt. Ifølge Rossi et al (21) afhænger analyseresultater af den enkelte patologs ekspertise i at klassificere de forskellige lungecancere. Af hensyn til projektets pålidelighed er det derfor vigtigt, at resultataflæsningen godkendes af en person havende ekspertise i aflæsning af immunfarvninger. Med anvendelse af aflæsning, foretaget med multiplexing-teknik mindskes de postanalytiske fejl. Det forudsætter dog subjektiv involvering at kunne sammenholde disse resultater med øvrige kliniske data, men som udgangspunkt må den maskinelle aflæsning give en mere ensartet og korrekt vurdering, idet subjektive faktorer udelukkes og variation mindskes. Valg af bedst egnede antistof De semikvantitative vurderinger af DAK-p63 og BC28 på neoplasivæv anvendes som grundlag for valg af det bedst egnede antistof. Antistoffet p4 fremstår mere specifikt med mindre tendens til krydsbinding og uspecifik baggrundsfarvning end p63. Dette ses bl.a. ved SCC, fig. 12 og ADC, fig.13, hvor der ses krydsbinding i cytoplasma med DAK-p63. Studier i artikler som fx Bishop et al (7), Pelosi et al (27) og Nonaka et al (22) anvender p4 polyklonal og det undrer, at p4 monoklonalt ikke er afprøvet. På Patologisk Institut anvendes immunhistokemisk monoklonale antistoffer langt hyppigere end polyklonale, om dette er en generel tendens er ikke afdækket. Ovenstående artikler konkluderer alle, at p4 er mere velegnet end p63, idet p4 er mere specifik for SCC. Der er ikke fundet litteratur, der modsiger, at p4 er bedre egnet til at skelne imellem SCC og ADC end p63. p4 vælges som det bedst egnede antistof til videre klinisk validering på cytologi. 42

43 Afprøvning af bedst egnede antistof på TMA-klinisk og cytologi Inden p4 anvendes i en dobbeltfarvning med Napsin A afprøves titerværdien anvendt histologisk på cytologi med henblik på en eventuel justering. Af tabel 3 fremgår det, at der er overensstemmelse mellem de histologiske og cytologiske analyseresultater ved begge ADC og den ene SCC, I prøve vurderes andelen af farvede tumorceller højere histologisk 5-1 % end cytologisk 1-49 % men da et duppræparat ikke nødvendigvis er repræsentativt for tumor, er det forventeligt med en vis variation mellem histologi og cytologi. Rossi et al (21) nævner forskellige studier, der nævner overensstemmelse mellem histologi og cytologi i henholdsvis 88 %, 93 % og 96 % af tilfældene af NSCLC. Dog ses en lavere overensstemmelse ved SCC, 53 % og ADC 66 %. I samråd med patolog besluttes det at overføre titerværdi 1:2 på cytologi. Den cytologiske kernereaktion er karakteriseret ved at være differentieret og distinkt. Da ca. 7 % af lungecancerne er inoperable, er det afgørende at immunfarvninger, udført i forbindelse med klassifikation af lungetumorer, kan foregå med immuncytokemi. Ved immuncytokemi er analyseprincippet det samme men forskelle ved bl.a. afparaffinering (udføres ikke på cytologi) og fx kortere demaskering må tilgodeses, ved at anvende protokoller valideret til cytologi. Ifølge Fowler et al (28) er det bl.a. vigtigt at være opmærksom på forskelle i præparation af cytologi sammenlignet med histologi, da dette kan få afgørende betydning for immunfarvning og resultataflæsning. Ved beskadigelse af præparatet fx overdemaskering kan cellemorfologien ødelægges. Afprøvning af Napsin A på TMA-klinisk og cytologi Til dobbeltfarvning med p4 blev følgende markører overvejet; TTF-1, CK5 og Napsin A. Med valget af TTF-1, endnu en kernemarkør, vil risikoen for dobbeltfarvning af kerner stige og dette kan besværliggøre resultataflæsning, når farvningerne ikke fremstår tydeligt differentierede. Dog anbefaler flere artikler denne 2-hit model fx Rossi et al (21) og Rekhtman et al (29). Vælges CK5 vil dobbeltfarvningen bestå af 2 markører specifikke for SCC. Fordelen ved denne kombination er, at CK5 ville kunne bekræfte p4, ulempen er, at det ville blive vanskeligere at detektere heterogenitet og fx adenosquamøst karcinom. Disse fordrer ofte yderligere immunfarvninger med fx TTF-1 for at bekræfte tilstedeværelsen af eventuelle ADC-tumorceller. Napsin A blev valgt, da den detekterer ADC og er en cytoplasmamarkør. Dette til trods for at Napsin A har en forholdsvis lav sensitivitet, Kim et al (23) finder en sensitivitet for Napsin A på 69 % og ifølge NordiQC 43

44 detekteres NapA i 6-9 % af ikke mucinøse ADC (13). Napsin A har derimod en høj specificitet, Kim et al (23) finder en specificitet på 98 %. Travis et al (9) anbefaler en 2-hit model bestående af enten p4 og TTF-1 eller p4 og Napsin A. Med udgangspunkt i Patologisk Instituts fastlagte protokoller for farvning med Napsin A på både histologi og cytologi udføres en indledende dobbeltfarvning. Titer for Napsin A til histologi er 1:2 og på cytologi 1:75. Jf. fig. 17 ses intens farvereaktion i alveole makrofag og svag reaktion i tumorceller. Ved justering af titer til 1:25 ses i fig. 18 moderat farvede tumorceller. Ved en højere titer øges sensitiviteten, idet tumorceller med lav ekspression farves kraftigere. Det er vigtigt, at en højere titer ikke bliver på bekostning af et differentieret cellebillede. Bliver reaktionen for kraftig maskeres cytoplasmamorfologien, hvilket vanskeliggør identifikation af tumorceller, herunder deres aktivitetsniveau og dette er ikke ønskeligt, særligt ikke i forbindelse med klassifikation af lavt differentierede tumorer. Dobbeltfarvninger med p4 og Napsin A Travis et al (9) anbefaler et generelt begrænset brug af immunhistokemiske undersøgelser for at sikre prøvemateriale til molekylærbiologiske undersøgelser, velvidende at det kan være svært ved klassifikation af fx lavt differentierede tumorer. Aflæsningsresultaterne fra den indledende dobbeltfarvning i tabel 4 viser små variationer mellem farvninger udført på henholdsvis histologi og cytologi. Med Napsin A ses, i prøve , cytologisk en moderat reaktion i 1-49 % af tumorcellerne, histologisk ses en kraftigere reaktion i en større gruppe af tumorceller 5-1 %. I prøve reagerer ADC-tumorceller ikke med hverken p4 eller Napsin A men da Napsin A, ifølge NordiQC (13), har en forholdsvis lav sensitivitet 6-9 % for ikke-mucinproducerende ADC og 2-3 % for mucinproducerende ADC, er risikoen for, at Napsin A ikke har detekteret antigenet, sandsynlig. I begge SCC-duppræparater ses ingen reaktion med Napsin A, ved p4 ses små variationer mellem cytologi og histologi. I prøve ses en lidt kraftigere reaktion histologisk end cytologisk. I prøve ses derimod en kraftigere reaktion cytologisk i 1-49 % af tumorcellerne, hvor der histologisk ses en svagere reaktion i 5-1 % af tumorcellerne. Sammenfattende ses en tydelig kernereaktion med p4 og Napsin A reagerer i cytoplasma i tumorceller, alveole makrofager og type II pneumocytter. Den overvejende overensstemmelse mellem histologi og cytologi gør at dobbeltfarvningen findes egnet til afprøvning på samtlige duppræparater og TMA-klinisk. 44

45 Jf. tabel 5 ses overensstemmelse mellem resultaterne på henholdsvis cytologi og histologi, igen ses små variationer i mængden af vurderede tumorceller samt farveintensitet men dette er forventeligt, idet cytologien ikke er fuldstændig repræsentativ for histologien. Disse variationer skal medregnes ved den endelige diagnoseafgivelse. Travis et al (9) anbefaler at cytologi og histologi, hvor begge er til stede, altid skal sammenholdes for at stille så specifik og korrekt en diagnose som muligt. Variation i aflæsning Indledningsvis blev niveauerne vedrørende intensitet defineret sammen med patologen, inden selve resultatvurderingen med den kliniske score blev udført. Dette blev ikke gjort ved resultatafgivelse med H-score og måske derfor vurderede PBP-gruppen generelt flere tumorceller svage og moderate end specialist i immunhistokemi, hvilket resulterede i en generelt lavere H-scoreværdier. Ved prøverne , , og skyldes forskelle i resultataflæsning, at patologen har aflæst på duppræparater, der både af patologen og PBPgruppen er vurderet som negative, idet de lå under cut-off værdien. I prøve kunne PBP-gruppen ikke identificere tumorceller, dette var muligt for patologen. Dobbeltfarvning I fig 18 ses ingen reaktion for p4 i ADC men Napsin A reagerer i histologien i 5-1 % af tumorcellerne, der ses en intens cytoplasmafarvning og cytologisk ses en moderat reaktion. Både cytologisk og histologisk ses tydeligt og differentieret celle- og vævsmorfologi. Napsin A har en tendens til at danne grynede præcipitater og dette kan sløre cytoplasma-morfologien og vanskeliggøre aflæsningen. Pelosi et al (27) anbefaler dobbeltfarvning med 2 kernemarkører, p4 og TTF-1, både for at sikre en optimal aflæsning af cytoplasmatiske detaljer og for at tilgodese eventuelt manglende/beskadiget cytoplasma, der fx kan ses i duppræparater og smears. Ved dobbeltfarvning på SCC (fig.19) udviser p4 en moderat reaktion i 5-1 % af tumorcellerne, dette gældende for både histologi og cytologi. Idet Napsin A reagerer i type II pneumocytter og alveolemakrofager ses også farveudfældning med Napsin A i SCC, uden tilstedeværelse af ADC-tumorceller. Jf. fig. 2 ses patientprøve diagnosticeret med adenosquamøst karcinom, p4 reagerer både i celle- og vævspræparet, intens reaktion i 1-49 % tumorcellerne i histologien og 5-1 % i cytologien. Napsin A reagerer derimod ikke hverken histologisk eller cytologisk. Dette kan enten skyldes at Napsin A ikke udtrykkes på tumorcellerne eller at ADC-tumorceller 45

46 ikke er repræsenteret. For at afdække årsagen til den manglende Napsin A farvning, kan immunfarvning med TTF-1 bekræfte en eventuel tilstedeværelse af ADC-tumorceller. TTF-1 har ifølge NordiQC (13) en høj specificitet og en sensitivitet på 6-85 % for ADC. I billede A ses en kernereaktion med TTF-1 i de ADC-tumorceller, der ikke reagerede med Napsin A. Sammenfattende ses ved dobbeltfarvning på TMA-klinisk og samtlige duppræparater, generel overensstemmelse mellem cytologi og histologi. Der er ikke fundet litteratur vedrørende denne dobbeltfarvning, der be- eller afkræfter dette resultat. Dog anbefaler Travis et al (9) bl.a. p4 og Napsin A som cocktail til klassifikation af NSCLC-NOS 14. Ifølge Bishop et al (7) er p4 polyklonal afprøvet på små biopsier og cytologi med fremragende resultat men yderligere validering på cytologi er påkrævet. Diagnosekorrekthed Diagnoserne på histologi og cytologi blev afgivet blinded for at sikre, at vurderingerne alene blev foretaget på fx cytologi uden påvirkning af viden om tilhørende histologi og vice versa. Det er hensigtsmæssigt, at diagnosticeringen alene kan foretages ud fra cytologisk prøvemateriale, da hovedparten af udredningerne kun foretages på cytologi. Ud fra tabel 6 fremgår det diagnoserne, ADC og SCC lige så hyppigt kan stilles på cytologi som histologi. Diagnosticering var derimod problematisk ved ADC med neuroendokrin uddifferentiering, adonosquamøst karcinom, ADC med clear cell uddifferentiering, lavt differentierede ADC og karcinoid men dette var gældende både for histologi og cytologi, så igen var vurderingerne samstemmende. Det er forventeligt, at netop blandingstumorer, der er kendetegnet ved heterogenitet og lavt differentierede tumorer er vanskelige at diagnosticere og at dette fordrer yderligere immunfarvninger enten på flere vævs-core (ved heterogenitet) eller immunfarvninger som fx synaptophysin og chromogranin ved klassifikation af neuroendokrine tumorer, markører som fx CK (karcinom) og CD45 (lymfom) for at afdække tumors oprindelse Skoog et al (3). Også brug af specialfarvninger som fx PAS, idet Napsin A kun detekterer imellem 2-3 % mucinproducerende ADC, kan det være relevant at udføre mucifarvning. 14 NSCLC-NOS er lavt differentierede tumorer, der ikke har kunnet klassificeres og derved har fået betegnelsen NOS (not otherwise specified). Anvendelsen af denne diagnose ønskes begrænset mest muligt (9). 46

47 Udover betydningen, af den enkelte patologs ekspertise i aflæsning, vælges diagnosekoder heller ikke entydigt af patologerne. Denne variation må også medregnes, når patologens resultater sammenholdes med diagnoserne fra patologisystemet, der er afgivet af andre patologer. Afsluttende er det ikke bestemt om Napsin A fremover skal være markøren, der indgår i en dobbeltfarvning med p4. Yderligere studier må foretages for at finde den bedst egnede cocktail til at skelne imellem ADC og SCC. Vurdering af projektets validitet og reliabilitet Overordnet vurderes dette projekt, herunder forsøgsdesign og resultater, at være pålideligt med empirisk underbyggede konklusioner fra henholdsvis eget projekt og fra videnskabelige artikler. Arten og antallet af prøvemateriale vurderes som tilstrækkeligt. Der er anvendt positivt og negativt kontrolmateriale ved immunfarvningerne. Allerede optimerede grundprotokoller til brug i laboratoriet er anvendt og resultataflæsningen er godkendt af specialist i immunhistokemi eller patolog. Forslag til forbedringer kunne være, at verificere de enkelte antistoffer, binder de, hvor det er tiltænkt, variere flere parametre ved den tekniske optimering fx inkubationstid og reagenser, foretage yderligere validering på cytologi både med p4 som enkeltfarvning og i en cocktail og gøre dette på forskelligt cytologisk materiale fx celleblokke og smears. Det er vigtigt, at valideringsprocedurer er standardiserede, så tilfældigheder ikke bliver kendetegnende for, hvad og hvordan der valideres. Dette ville medføre en noget elastisk kvalitetssikring af de anvendte analyser og er ikke foreneligt med klinisk anvendelse. Konklusion Målet med dette projekt var at finde den mest optimale markør, p63 eller p4 til at skelne imellem ADC og SCC både på histologisk- og cytologisk prøvemateriale. Indledende måtte protokoller for de anvendte kloner udarbejdes, dette for at sikre optimale tekniske vilkår for analysen, herunder valg af demaskeringsmetode samt antistoftiter. Ved en kvalitativ vurdering blev samtlige immunfarvninger aflæst og klonerne, p4 BC28 og p63 DAK-p63 blev udvalgt til den videre kliniske validering. Efterfølgende vurderes semikvantitativt samtlige immunfarvninger på neoplasivæv og p4 vælges som det bedst egnede antistof til at skelne mellem ADC og SCC. p4 er kendetegnet ved at have en 47

48 højere specificitet, en høj sensitivitet og en markant lavere frekvens af krydsbinding og uspecifik baggrundsfarvning end p63. p4 s titerværdi, anvendt histologisk, findes egnet til cytologi og til at indgå i en dobbeltfarvning med Napsin A. Efter justering af Napsin A s titerværdi udføres dobbeltfarvning på indsamlet klinisk materiale. Den semikvantitative resultataflæsning på henholdsvis histolog og cytologi viser overensstemmelse mellem resultaterne på alle patientprøver. Vanskeligheder ved at aflæse fx lavt differentierede tumorer og blandingstumorer var gældende både histologisk og cytologisk. Ved den afsluttende komparative analyse af diagnoseafgivelse på cytologi og histologi sammenholdt med diagnoser fra patologisystemet sås samme mønster, overensstemmelse af aflæsningsresultaterne ved ADC og SCC men vanskeligheder ved lavt differentierede tumorer og blandingstumorer. Dobbeltfarvningen med p4 og Napsin A er ikke tilstrækkeligt valideret og det kræver yderligere studier at afdække om Napsin A sammen med p4 vil være mere optimal end fx en dobbeltfarvning med p4 og TTF-1 eller CK5. Generelt stemmer projektets resultater overens med andre lignende studier. Undersøgelsen og dens resultater vurderes til at have en høj troværdighed og validitet, dog kan forbedringer i forhold til at variere flere parametre fx ved udarbejdelse af protokoller med fordel udføres. For at sikre en høj analysekvalitet, er det vigtigt at standardisere validerings- og evalueringsprocedurer. Perspektivering Med indførsel af kræftpakkerne blev der lagt fokus på forløbskoordination, samarbejdet mellem de enkelte afdelinger og sektorer. Målet er effektive patientforløb, med patienten i centrum, kendetegnet ved en sundhedsfaglig indsats af høj faglig kvalitet. Der ønskes erfaringsudveksling på tværs af specialer, udvikling af kræftbehandling, hvor der løbende inkluderes nye behandlingsformer, nye teknologiske muligheder, nye ideer og nye måder at organisere sig på (5). Patologisk Institut, herunder laboratorie for immunhistokemi indgår i dette samarbejde og må bidrage ved, i en kontinuerlig vekselvirkning, at forbedre og kvalitetssikre analysemetoder og samtidig kunne imødekomme krav om udvikling af nye analyser i forbindelse med udvikling af nye behandlingsmuligheder. Både udvikling af nye 48

49 tillægsbehandlinger til kemoterapi fx med bevacizumab og udviklingen af targeteret terapi fx crizotinib forudsætter at nye analyser inkluderes. Med den generelt dårlige prognose, gældende for lungecancerpatienter er nye behandlingsmuligheder tiltrængte. I denne sammenhæng er det bioanalytikerens arbejde, at indgå i denne udvikling og bidrage med at udvikle og sikre pålidelige og præcise analysemetoder. Ved klassifikation af lungecancere er resultatvurderingen bl.a. afhængig af analysekvaliteten og derfor er det afgørende at fx immunfarvninger af høj kvalitet anvendes. Ved implementering af antistoffet, p4 forbedres muligheden for at skelne mellem ADC og SCC. Dette sikrer en bedre behandlingsplanlægning, som i første omgang kommer patienten til gode men som også har et økonomisk og samfundsmæssigt aspekt. De nye behandlingsmuligheder er udgiftstunge og derfor er det vigtigt, at kun egnede patienter tilbydes denne behandling. Samfundsmæssigt er det ønskeligt, at flest mulige helbredes, at de vender tilbage til arbejdsmarkedet og bliver en ressourcemæssig gevinst og ressourcer er jo bl.a. en forudsætning for at drive et velfungerende sundhedsvæsen (31). 49

50 Referenceliste 1. Cancer, WHO International Agency for Research on. Globocan. [Online] [Citeret: 9.. ktober 213.] 2. Engholm, G., et al. NORDCAN: Cancer Incidence, Mortality, Prevalence and survival in Nordic Countries. [Online] [Citeret: 9.. Oktober 213.] 3. Teknologivurdering, Sundhedsstyrelsen Monitorering og Medicinsk. Ny medicinsk behandling med Bevacizumab (Avastin) og Pemetrexed (Alimta) til patrienter med ikke-småcellet lungekræft - en MTV-baseret vurdering. København : Sundhedsstyrelsen, 29. Medicinsk teknologivurdering af kræftlægemidler. 4. Travis, W.D.et al. World Health Organisation Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of the Lung, Pleura, Thymus and Heart. Lyon : IARC Press, Sundhedsstyrelsen. Pakkforløb for lungekræft. København : Sundhedsstyrelsen, Young, Barbara, Stewart, William og O'Dowd, Geraldine. Wheather's Basic Pathology. Nottingham : Churchill Livingstone Elsevier, 211. Fifth edition. 7. Bishop, Justin A., et al. p4 (DNp63) is superior to p63 for the diagnosis of pulmonary squamous cell carcinoma. Modern Pathology. 212, Årg. 25, pp Vyberg, Mogens. Anvendt immunhistokemi. København : Bioanalytikeruddannelsen København, udgave. 9. Travis, William D., et al. Diagnosis of Lung Cancer in Small Biopsies and Cytology. Implications of the 211 International Association for the Study of Lung Cancer/American Thoracic Society/European Respiratory Society Classification. s.l. : Arch Pathol Lab Med, Nobre, Ana Rita, Albergaria, André og Schmitt, Fernando. p4: A p63 Isoform Useful for Lung Cancer Diagnosis - A Review of the Physiological and Pathological Role of p63. Acta Cytologica. 213, Årg. 57: Møller, Jette Boysen. Afdelingsbioanalytiker for immunhistokemisk laboratorie. Pers. comm. oktober Wikipedia. [Online] [Citeret: 27. november 213.] NordiQC. NordiQC. [Online] [Citeret: 22.. oktober 213.] e-immunohistochemistry. [Online] [Citeret: 27. november 213.] Benchmark ULTRA. Ventana. [Online] Roche. [Citeret: 29. november 213.] 5

51 16. Ventana. [Online] Roche. [Citeret: 3. december 213.] Ventana. [Online] Roche. [Citeret: 3. december 213.] Semi-Quantitative IHC. Pathogenesys. [Online] [Citeret: ] Goldstein, Neal S., et al. Recommendations for Improved Standardization of Immunohistchemistry. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 27, Årg. 15, PRI. [Online] Region Nordjylland. [Citeret: 12. december 213.] d51a69fd4f94&sfupdated=true&doccol=eaaa34fb-b9eb-4cb-bf32-29f8eb7db&rec=false&pubid=46873f7b86347ab25796c3178b Rossi, Giulio, et al. Subtyping Non-Small Cell Lung Cancer: Relevant Issues and Operative Recommendations for the Best Pathology Practice. International Journal of Surgical Pathology. 213, Årg. 21, 4, Nonaka, Daisuke. A Study of DeltaNp63 Expression in Lung Non-Small Cell Carcinomas. Am J Surg Pathol. 212, Årg. 36, Kim, Gou-Young, et al. A Minimal Immunhistochemical Panel for Subtyping Poorly Differentiated Non-Small Cell Lung Carcinoma: A Tissue Microarray Study Simulating Small Biopsy Conditions. J Lung Cancer. 212, Årg. 11, 1, DAKO. Education Guide, Pathology, Immunohistochemical Staining Methods. California : DAKO, 29. 5th. edition. 25. Bordeaux, Jennifer, et al. Antibody validation. BioTechniques. 21, 48, Pelosi, Giuseppe, et al. DeltaNp63 (p4) Distribution Inside Lung Cancer: A Driver Biomarker Approach to Tumor Characterization. Inernational Journal of Surgical Pathology. 213, Årg. 21, 3, Pelosi, Giuseppe, et al. DeltaN63 (p4) and Thyroid Transciption Factor-1 Immunoreactivity on Small Biopsies or Cellblocks for Typing Non-Small Cell Lung Cancer. A Novel Two-Hit, Sparing- Material Approach. Journal of Thoracic Oncology. 212, Årg. 7, Fowler, Larry J og Lachar, Whitney A. Application of Immunohistochemistry to Cytology. Arch Pathol Lab Med. 27, Årg Rekhtman, Natasha, et al. Immunohistochemical algorithm for differentiation of lung adenocarcinoma and squasmous cell carcinoma based on large series of whole-tissue sections with validation in small specimens. Modern Pathology. 211, 24,

52 3. Skoog, L. og Tani, E. Immuncytochemistry: an indispensable technique in routine cytology. Cytopathology. 211, 22, Chien, Chun-Ru og Shih, Ya-Chen Tina. Economic evaluation of bevacizumab in treatment of non-small cell lung cancer (NSCLC). Dove medical press. 212, Årg. 2, 4, Wikipedia. Wikipedia. [Online] [Citeret: 1.. oktober 213.] Johnson, Hunter, et al. Thyroid Factor 1 and Napsin A Double Stain: Utilizing Different Vendor Antibodies for Diagnosing Lung Adenocarcinoma. ACTA Cytologica. 212, 56,

53 Bilag 1 Powerpoint fra Ventana 53

54 54

55 55

56 56

57 57

58 58

59 59

60 6

61 61

62 62

63 63

64 64