Immunfarvning med ny antistofcocktail som led i cancerdiagnostik af pleuravæskekoagler

Transkript

1 Immunfarvning med ny antistofcocktail som led i cancerdiagnostik af pleuravæskekoagler Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen VIA UC, Campus Aarhus Nord Udarbejdet af: Lisa Gjelstrup Kristensen Studienummer: I-vejleder: Birte Sivebæk, Lektor, Cand. Scient., VIA University College K-vejleder: Lene Lütken Sørensen, bioanalytikerunderviser, Patologisk Institut, Holstebro Antal tegn:

2 Indholdsfortegnelse Forord... 3 Læsevejledning...3 Resumé... 4 Introduktion... 5 Baggrund...5 Formål...6 Problemformulering...6 Målformulering...6 Teoretisk baggrund...7 Pleura... 7 Neoplasi... 8 Antigener & antistoffer... 9 Antigener... 9 Antistoffer... 9 Antigen-antistof binding Antistoffer i cocktail...11 Cytokeratiner: Anti-cytokeratin 7 & Anti-human cytokeratin Anti-cancer antigen Anti-thyroid transcription factor Anti-Androgen receptor Anti-Estrogen receptor Antigenekspression ved neoplasi Detektionssystem MultiVision Polymer Detection System...15 Immunhistokemisk farvning...15 Epitop demaskering ved heat-induced epitop retrieval (HIER) Blokering af endogen aktivitet Analyseprincip...16 Mayers sure hæmalun...18 Anvendt statistik...18 Cohens kappa Vægtet kappa Materialer Utensilier...20 Apparatur...21 Reagenser...21 Prøvemateriale...22 Kontroller...24 Metoder Forsøgsdesign...25 Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 1

3 Indsamling af prøvemateriale...25 Kontroller...25 Fremstilling af reagens...26 Klargøring & forbehandling af prøvemateriale...27 Immunfarvning...27 Kernefarvning (Mayers sure hæmalun)...27 Vurdering af pilotforsøg og immuncocktail...28 Scoring af immunfarvning Økonomi: antistofpanel >< antistofcocktail...28 Databehandling...29 Søgestrategi...29 Resultater Pilotforsøg TMA...29 Pilotforsøg CK7 & CK Forsøg - Antistofcocktail...34 Scoring af immunfarvning...34 Diagnostik ud fra immunfarvning med antistofcocktail...34 Resultat af immunfarvning med antistofcocktail Diagnostik af patientprøver med antistofcocktail Cohens kappa Økonomi: Antistofcocktail vs. antistofpanel...42 Diskussion Resultater...43 Koncentration af antistofcocktail...43 Coekspression af CK7 & CK Diagnostik med antistofcocktail...45 Kvalitet af immunfarvningen Diagnostik ud fra immunfarvning med antistofcocktail Økonomisk besparelse ved antistofcocktail...49 Metode...50 Konklusion Perspektivering Bibliografi Bilagsliste Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 2

4 Forord Denne opgave er det afsluttende eksamensprojekt på Bioanalytikeruddannelsen, og er afviklet i perioden den 18/3-29/ under vejledning af Birte Sivebæk og Lene Lütken Sørensen. Den praktiske del er udført i samarbejde med medstuderende Camilla Skadhauge Seerup på Patologi Institut ved Regionshospitalet Holstebro, Hospitalsenheden Vest. Projektet fokuserer på muligheden for at benytte en antistofcocktail bestående af seks antistoffer til diagnostik af primærtumor ved metastatiske celler i pleuravæske, og er henvendt til patologiske afdelinger, VIA University College og andre interesserede. Jeg vil gerne takke Patologi Institut i Holstebro for at lade mig udføre projektet hos dem, samt for den rådgivning og støtte de har ydet i projektforløbet, og Patologisk Institut ved Aalborg Universitetshospital for at have stillet TMA-blokken til rådighed. En særlig tak skal gives til den immunansvarlige bioanalytiker, Jesper Lund Lauridsen, for at have bistået med immunfarvning, herunder fremstilling af kontrolblok, forberedelse af reagenser, immunfarvning samt mikroskopi af pilotforsøg. Jeg vil også gerne takke bioanalytiker Annette Balleby og Lillan Wagner for hjælp til kørsel og farvning af immuner, og bioanalytiker Vivi Kuhr for skæring af kontrolsnit samt snit af prøvemateriale til forsøget. Endelig skal en speciel tak gives til overlæge spec. Jess Pilgaard og overlæge Tomasz Tabor for at have indvilliget i at score, vurdere og diagnosticere immunfarvningerne. Læsevejledning Opgaven er inddelt i 8 overordnede afsnit, som alle indeholder underafsnit. Afsnittene Formål, Problemformulering og Målformulering er skrevet i fællesskab med Camilla S. Seerup. Resten er skrevet af undertegnede. Der er anvendt forkortelser for ofte anvendte ord, og disse dækker over flere gradbøjninger af ordet (fx Ag = antigen, antigenet og antigener). Første gang det benyttes, skrives ordet i fuld længde efterfulgt af forkortelsen i parentes, hvorefter forkortelsen anvendes. Det anvendte referencesystem er Vancouver. Der henvises direkte til bilag i teksten. Bilagene er vedlagt opgaven i form af en cd-rom, og der er en bilagsliste i slutningen af opgaven samt på cd-rommen. Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 3

5 Resumé Immunhistokemisk farvning (IHC) er et vigtigt supplerende redskab til diagnostik af metastatiske celler i pleuravæske. Til dette formål anvendes ofte et antistofpanel (AP) bestående af cytokeratin 7 (anti-ck7), cytokeratin 20 (anti-ck20), thyroid transcription factor-1 (anti-ttf-1), cancer antigen 125 (anti-ca-125), estrogen receptor (anti-er) og androgen receptor (anti-ar), men denne metode har nogle diagnostiske begrænsninger og er forbundet med nogle betydelige økonomiske omkostninger. Det er derfor relevant at undersøge om antistofferne (Ab) kan benyttes sammen i en antistofcocktail (AC), og hvilke diagnostiske og økonomiske konsekvenser dette vil have. Der blev udført to pilotforsøg for at vurdere om anti-ck20 og anti-ck7 kunne anvendes sammen, da nogle celler kan have ekspression af begge antigener (Ag) i cytoplasma, og om Ab skulle have den koncentration, som når de farves separat, eller om den skulle være dobbelt så kraftig til AC. Til forsøget blev farvet 20 patientprøver, som tidligere var diagnosticeret med én eller flere af Ab i cocktailen, og to patologer bedømte derefter farvekvaliteten og diagnosticerede prøverne på ny. Pilotforsøgene viste, at den bedste farvning blev opnået når Ab-koncentrationen var den dobbelte af den normale, og evt. coekspression af CK7 og CK20 vil kunne ses ud fra farveresultatet. Ved at benytte en AC i stedet for et AP vil afdelingen kunne spare 277 kr. pr. kørsel, hvilket årligt vil svare til en besparelse på omkring 7742 kr. Hertil vil der kunne spares tid for personalet. Kvaliteten af farvningen med AC kan karakteriseres som good i henhold til NordiQC s bedømmelsesmetode, hvilket betyder at farvningen er acceptabel, men at protokollen bør forbedres. Specielt to områder kan justeres: koncentrationen af og inkuberingstiden for de primære Ab. Det lykkedes for patologerne at komme frem til diagnoser, som stemte overens med diagnoser stillet ved den tidligere undersøgelse, i hhv. 61% og 80% af prøverne, og en Cohens kappa-test afslørede en moderat grad af overensstemmelse mellem de to patologers diagnoser. Pga. problemer med at skelne mellem en CK20 og CA-125- reaktion kan cocktailen ikke anvendes i sin nuværende form. Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 4

6 Introduktion Baggrund IHC er en metode til at identificere specifikke molekyler, som fx proteiner (ofte i form af Ag), i celler. Metoden har i mange år været et vigtigt supplement inden for patologien til diagnostik af neoplasi, da den gør det muligt at skelne mellem malignt og benignt, undertypisere neopleasier, karakterisere lokaliteten af primær neoplasi, bestemme tumorstadiet, undersøge prognostiske faktorer samt identificere lokaliteten af primærtumor ved metastaser (1-3). En undersøgelse fra 2005 viste, at i 95% af tilfældene hvor der blev undersøgt for neoplasi, var IHC en god hjælp som en supplerende diagnostisk metode (2). På Patologisk institut i Holstebro udføres der rutinemæssigt immunfarvninger i forbindelse med diagnostik af neoplasi på histologiske og cytologiske prøver, hvoraf der årligt er ca. 30 pleuravæskekoagler, som immunfarves. Ved pleuraeffusion (øget væske i pleura) vil en prøve blive sendt til patologisk afdeling for at undersøge årsagen til tilstanden, som kan være neoplasi (primært i form af metastaser). På afdelingen fremstilles udstrygninger, som farves med Papanicolaou og undersøges ved mikroskopi. Den resterende pleuravæske centrifugeres for at fremstille et koagel, der indstøbes i paraffin (4,5). Da det alene ud fra cellernes morfologi kan være problematisk at diagnosticere maligne celler og udlede hvorfra cellerne oprindeligt stammer, udføres der IHC på pleurakoaglerne i de tilfælde, hvor der findes neoplastiske celler i udstrygningerne. Dette gøres med et AP bestående af Ab rettet mod CK7, CK20, CA-125, TTF-1, ER og AR. Primære pleurale tumorer er sjældne og metastaser stammer især fra lunger og mamma. Dertil ses ofte metastaser fra tumorer i mavetarmkanalen, kvindelige genitalier og prostata (4,6,7). De nævnte Ab kan hjælpe til at lokalisere primærtumor: CK7+/TTF-1+ indikerer lungerne, CK7+/CA-125+ indikerer tumor beliggende i de kvindelige genitalier, CK7+/ER+ indikerer mamma, AR indikerer prostata og det indbyrdes forhold mellem CK7/CK20 kan indikere en række forskellige organer (8-14). På nuværende tidspunkt anvendes ét Ab pr. snit, dvs. at der til hver farvning anvendes seks snit. Da cytologisk materiale er et virvar af løsrevne celler fra væv betyder det, at når der skæres flere snit af det indstøbte materiale, vil de samme celler ikke nødvendigvis forekomme i alle seks snit (bilag 1). Der er derfor ikke det samme morfologiske billede af cellerne, som ved histologiske snit (15). Det kan derfor være problematisk for patologen at Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 5

7 sammenholde resultaterne af de enkelte immunfarvninger, da de celler, der ses i det ene snit, ikke nødvendigvis går igen i de andre. Hvis en celle kun er til stede i ét snit er det således kun muligt at se om cellen har reageret med ét Ab. Det er derfor et ønske fra afdelingens side at teste om disse seks Ab kan indgå sammen i en AC, hvor alle seks Ab anvendes på ét og samme snit (også kaldet multiplex IHC). Derved undgås problematikken omkring hvorvidt, den samme celle har ekspression af mere end et Ag. At der kun anvendes ét snit giver ligeledes en økonomisk besparelse mht. forbruget af reagenser og arbejdsmæssigt, hvor der vil være en reducering af arbejdstiden i forbindelse med præparationen og mikroskoperingen af de enkelte præparater (16). Formål At undersøge om antistofferne CK7, CK20, TTF-1, CA-125, ER og AR kan anvendes sammen i en cocktail til diagnostik af primærtumor fra metastatiske celler i pleuravæske. Problemformulering Hvilke diagnostiske og økonomiske konsekvenser vil det have at kombinere antistofferne CK7, CK20, TTF-1, CA-125, ER og AR i en antistofcocktail til diagnostik af neoplastiske celler pleuravæske. Målformulering Vi vil undersøge hvilken koncentration af Ab i AC, der giver det bedste farveresultat. o Det vil vi gøre ved at lave et pilotforsøg, hvor vi anvender en TMA-blok med neoplasi fra Ålborg sygehus. Der er modtaget ti snit af TMA-blokken fra Ålborg sygehus, hvor vi immunfarver to snit med vores AC. På de to snit anvendes to forskellige Ab-koncentrationer: På det ene snit anvendes den anbefalede Abkoncentration, og på det andet en koncentration som er dobbelt så høj, som den anbefalede. Immunfarvningen vurderes af henholdsvis klinisk underviser, Lene Lütken Sørensen, immunansvarlige bioanalytiker, Jesper Lund Lauridsen, og undertegnede. Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 6

8 Vi vil undersøge hvordan det visuelt ser ud hvis en celle er positiv for både CK7 og CK20, som begge farver cytoplasma. o Det vil vi gøre ved at lave et pilotforsøg, hvor cellerne er både CK7 og CK20 positive. Vi vil finde arkiverede vævsblokke, hvori der er celler, som er både CK7 og CK20 positive. Vi vil immunfarve to til fem snit, afhængig af kvaliteten af det vævsmateriale vi kan finde. Vi vil vurdere om immunfarvningen med AC kan anvendes som et diagnostisk redskab o Det vil vi gøre, ved at lave immunfarvning på 20 koagler fra pleuravæsker fra forskellige patienter med kendt diagnose. Materialet er arkiveret materiale, og søges frem via patologi systemets database. Ved en blindtest vurderes farvningen af snittene af henholdsvis overlæge spec. Jess Pilgaard og overlæge Tomasz Tabor ud fra en forud bestemt farveskala, hvorefter en diagnose stilles, som derefter sammenholdes med den kendte diagnose. Der anvendes statistisk vægtet kappa-test ud fra resultaterne af patologernes bedømmelser af farvekvaliteten og der anvendes Cohens kappa på de diagnoser patologerne har stillet med AC, for at vurdere overensstemmelsen imellem patologerne. Derudover ønsker vi at udregne i hvor høj grad patologerne er i stand til at stille samme diagnose som tidligere. Dette gøres ved beregning af konkordans. Vi vil undersøge hvilke økonomiske besparelser der vil opnås ved at anvende AC. o Dette vil vi gøre ved at lave en prissammenligning af kørsel med AC og den nuværende metode, hvor antistoffernes immunfarves på hver deres snit. Dertil vil vi vurdere besparelserne på arbejdsområdet for patologer og bioanalytikere. Teoretisk baggrund Pleura Lungens overflade og indersiden af thoraxvæggen er beklædt af lungehinderne (hhv. pleura visceralis og pareitalis). Lungehinderne består af et enkelt lag mesotelceller (simple pladeepitelceller), der hviler på et tyndt lag bindevæv bestående af kollagene og elastiske fibre hvori er blod- og lymfekar. Lungehinderne er adskilt af pleurahulen, som indeholder ca. 15 ml. pleuravæske. Pleuravæsken består bl.a. af hyaluronsyre, og har til funktion at sikre, at hinderne glider gnidningsfrit i forhold til hinanden. Ved forskellige medicinske Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 7

9 tilstande, især hjerteinsufficiens, pneumoni og neoplasi, forekommer pleuraeffusion, og der foretages en cytologisk undersøgelse af pleuravæsken for at finde årsagen til den øgede mængde væske i pleurahulen (4,17). Neoplasi Neoplasi er dannelse af tumorer på grundlag af autonom celleproliferation. Den grundlæggende årsag til dette er mutationer i cellernes DNA. De gener der rammes er især tumorsupressorgener, protoonkogener, repairgener og apoptosegener. Der kan være mange årsager til mutationerne, herunder infektioner, kroniske inflammationstilstande, kemiske stoffer, arvelige faktorer, alder, køn samt UV-stråling, radioaktiv og ioniserende stråling. Neoplasier kan være benigne eller maligne. Benigne tumorer er karakteriseret af langsom, lokal/velafgrænset vækst med uniforme celler, der ligner de oprindelige. Maligne tumorer er derimod karakteriseret af hurtig og invasiv vækst, samt evnen til at metastasere. Cellerne og cellekerner er polymorfe med en forhøjet kerne/cytoplasma-ratio (større kerne, mindre cytoplasmamængde). Hertil ses hyperkromasi (kraftig farvning), uregelmæssig kromatinstruktur (ujævnheder i kernen af mørke og lyse områder), uregelmæssig kernemembran med markerede kanter, og mange, ofte abnorme, mitoser. Desuden er cellerne er som regel lavt differentierede. Maligne celler mister ydermere ofte cytoplasmatiske karakteristika som fx cilier, men disse kan også være bevarede dog på en overdreven/ukontrolleret måde (18,19). I serøse væsker som pleura kan det være problematisk at diagnosticere neoplastiske celler alene ud fra cellernes morfologi. En af årsagerne til dette er, at pleura indeholder mesotelceller, som er meget alsidige celler med en meget variabel morfologi. De celler, som er involveret i en række processer (reaktive mesotelceller) har et variabelt morfologisk udseende, der kan have træk til fælles med maligne celler, fx forstørrede, hyperkromatiske og pleomorfe kerner, og forhøjet kerne/cytoplasmaratio (bilag 2). Reaktive mesotelceller vil dog ofte ligne nabomesotelcellerne. En anden årsag er, at celler i et væskemedium runder op pga. overfladespændingen, hvilket ændrer de neoplastiske celles oprindelige form (7,15). Primære pleurale tumorer (benigne tumorer eller malignt mesoteliom) er sjældne, og en cytologisk undersøgelse af pleuravæske er derfor hyppigst anvendt til diagnostik af pleural karcinose, dvs. metastatisk spredning af maligne tumorer til pleura. Ca. 1/3 af maligne neoplasier metastaserer til lungerne nogle typer hyppigere end andre, og metastaser spredes ofte til pleura via blod- og lymfekar. De maligne tumorer der hyppigst metastaserer Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 8

10 til pleura er lunge- og mammakarcinomer. Derudover ses ofte spredning fra karcinomer i thyroidea, mavetarmkanalen, prostata, ovarier og uterus (4,6). Antigener & antistoffer Antigener Ag er organiske makromolekyler (proteiner, lipider, polysakkarider, nukleotider), som genkendes af immunsystemet og som kan give anledning til dannelse af Ab. På ydersiderne af Ag-molekylet er én eller flere strukturer kaldet antigene determinanter eller epitoper, hvortil Ab kan bindes (20). Antistoffer Ab er glycoproteiner, nærmere betegnet immunglobuliner (Ig). Der findes fem Ig-klasser (IgA, IgE, IgD, IgG og IgM). Den basale struktur af Ig består af to identiske lette (L) polypeptidkæder og to identiske tunge (H) polypeptidkæder, der holdes sammen af disulfidbindinger, som er opbygget omkring en akse (Fig. 1). H- og L-kæderne har områder i aminosyresekvensen som er konstante, dvs. den er ens for forskellige Ab, og områder med stor variabilitet. I de variable områder findes ydermere områder som er hypervariable, hvor Ag bindes. Der er fem mulige sekvenser i den konstante del af H- kæderne. Disse kæder benævnes α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), µ (IgM) og γ (IgG), og det er disse kæder, der danner grundlaget for opdelingen af Ig i de fem førnævnte klasser. De konstante dele af L-kæderne kan enten være af κ- eller λ-typen. Ig kan vha. en enzymatisk spaltning med papain opdeles i to fragmenter kaldet Fab (fragment antigen binding) og Fc (fragment crystalline). Fab-delen udgør den Ag-bindende aktivitet mens Fc-delen udgør de klasse-specifikke funktioner (20). Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 9

11 Figur 1. Struktur af Ab. Kilde: (20,21) + egen produktion. Ved IHC er det primært Ab af IgG-klassen, og i mindre grad IgM-klassen, som anvendes. Til analyseformål anvendes enten polyklonale og monoklonale Ab. Polyklonale Ab stammer fra forskellige kloner, og man har dermed mange forskellige Ab, med varierende affinitet og specificitet, rettet mod forskellige epitoper. De produceres ved at injicere et dyr med Ag, hvilket medfører at dyret vil producere Ab, som frigives i blodet. Disse Ab isoleres fra serum udtaget fra dyret. Monoklonale Ab stammer fra den samme celleklon, og de er derfor fuldstændig ens molekyler rettet mod én og samme epitop på Ag. Denne type Ab produceres ved at udtage lymfocytter fra milten af et immuniseret dyr, der smeltes sammen med myelomceller, hvorved der dannes et udødeligt, Ab-producerende hybridom. Hybridomet dyrkes i kulturer for at opnå mange identiske Ab-producerende celler, og Ab høstes fra dette dyrkningsmedie (22). Antigen-antistof binding Reaktionen mellem Ag og Ab involverer ikke-kovalente bindinger i form af: 1) ionbindinger, dvs. tiltrækning mellem ioniske grupper med modsat ladning. 2) hydrogenbindinger, dvs. binding mellem hydrofile grupper som fx -OH og -COOH. 3) hydrofobe bindinger, dvs. binding mellem to hydrofobe grupper. 4) van der Waalske kræfter, som er bindinger mellem dipolære molekyler. Bindingerne er som udgangspunkt svage, men når de forekommer i et stort antal vil bindingsstyrken være høj (23). Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 10

12 Antistoffer i cocktail Cytokeratiner: Anti-cytokeratin 7 & Anti-human cytokeratin 20 Cytokeratiner (CK) er en gruppe af intermediære filamentproteiner, der udgør cytoskelettet i stort set alle epitel- og mesotelceller, hvor de er koncentreret omkring kernen og cellemembranen (22,24,25). CK består af en central region bestående af 310 aminosyrer, som er omgivet af domæner af varierende længder og sekvenser. Det er disse domæner der er immunogene, og er ansvarlige for CK s forskellige egenskaber og funktioner. De intermediære filamentproteiner er en familie bestående af mindst 20 forskellige CK. De er nummereret fra 1-20 på baggrund af deres molekylevægt og ladning. CK inddeles i to overordnede grupper: CK type I/A (CK 9-20) med et surt isoelektrisk punkt, og CK II/B (CK 1-8) med et basisk-neutralt isoelektrisk punkt. Næsten alle CK danner par således, at en specifik type I CK danner par med en bestemt type II CK (fx CK1 med CK20), og epitelceller indeholder dermed mindst to CK. Denne ekspression af CK kan til dels ses i neoplastiske celler, og danner dermed grundlaget for brugen af IHC (22,24,25). Anti-CK7 er et monoklonalt, kanin-ab. Immunogenet er et syntetisk peptid, som svarer til det korresponderende domæne nær N-terminalen af det humane CK7 (24). CK7 findes i det meste kirtelepitel, og i normalt væv vil en CK7-reaktion kunne ses i simpelt epitel i galde- og pancreasgange, lungen, endometrium, renale samlerør og i follikelcellerne i thyroidea. CK7 ses ydermere i mesotelceller, i overgangsepitel og i enkelte endotelceller. Ved neoplasi ses ofte CK7-ekspression ved adenokarcinomer i galdegange, mamma, lunger, endometrium, ovarie, ventrikel, pancreas m.fl. (se nærmere tabel 1). Den sammenholdte ekspression af CK7 og CK20 er et vigtigt redskab til differentiering af karcinomer (se nedenfor) (22,25,26). Der kan dog være afvigelser i immunprofilen (9-11,22,26). En positiv immunfarvning med det anvendte detektionssystem vil ses som rødt cytoplasma (se tabel 1) (27). Anti-CK20 er et monoklonalt, muse-ab. Immunogenet stammer fra cytoskelet-materiale udtaget fra human duodenal mucosa (28). I modsætning til andre CK har CK20 en forholdsvis begrænset ekspression i vævet, og ses næsten udelukkende i epitelcellerne i tarmkanalen, i urotel og i hudens Merkelceller. Ved neoplasi ses der primært CK20- ekspression ved tumorer udgående fra det væv, der normalt er positivt for CK20: Adenokarcinomer i colon og rektum, samt i urotel- og Merkelcellekarcinomer (22,25,26). Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 11

13 Yderlig ekspression ved neoplasi kan ses i tabel 1. Studier har vist, at når ekspressionen af CK20 sammenholdes med ekspressionen af CK7, er det muligt at differentiere karcinomer: CK20+/CK7+ ses i næsten alle karcinomer i overgangsepitelet i blæren, mucinøse ovariekarcinomer samt adenokarcinomer i ventriklen, galdegange, pancreas og bronkioalveolerne. CK20+/CK7- er karakteristisk for Merkelcellekarcinom og adenokarcinom i colon. CK20-/CK7+ ses ved adenokarcinomer i lunger, bryst, endometrium, thyroidea og ovarie (ikke-mucinøst). CK20-/CK7- karakteriserer ofte adenokarcinomer i nyre og prostata, små-cellet karcinomer i lunger, karcinomer i lever og pladeepitelkarcinomer. Der kan dog være afvigelser i immunprofilen (9-11,22,26). En positiv immunfarvning med det anvendte detektionssystem vil ses som blåt cytoplasma (se tabel 1) (27). Anti-cancer antigen 125 Anti-CA-125 er et monoklonalt, muse-ab. Immunogenet er ovariecancer-cellelinie OVCA433 fra patienter med serøst papillært cystedenokarcinom, afledt fra ascitesvæske (29,30). CA-125 er et onkoføtalt, mucinlignende glycoprotein med ukendt funktion, som primært findes i cellemembranen. Proteinet ses hos voksne i mesotelceller og på overfladen af mange cylinderepitelceller specielt i tuba uterina, endometrium, endocervix og mamma. Ved neoplasi ses ekspression af CA-125 i næsten alle tilfælde af malignt mesoteliom og serøst adenokarcinom i ovarium. Derudover kan CA-125 være positiv ved adenokarcinomer i cervix uteri, pancreas, galdegange m.fl. (22,31). Der kan ses en oversigt i tabel 1. En positiv immunfarvning med det anvendte detektionssystem vil ses som blåfarvning af cellemembranen og evt. cytoplasma (se tabel 1) (27). Anti-thyroid transcription factor-1 Anti-TTF-1 er et monoklonalt kanin-ab. Immunogenet er et syntetisk peptid, som svarer til det korresponderende domæne nær N-terminalen af det humane TTF-1 (32). TTF-1 er et nukleært protein, som er medlem af Nkx-2-familien af homeodomæne DNA-bindende transkriptionsfaktorer. TTF-1 er påvist i thyroidea (C-celler og follikelceller), i epitelet i parathyroidea og lungerne samt i visse områder af hjernen, hvor det spiller en rolle i reguleringen af generne. I thyroidea styrer TTF-1 transskriberingen af generne for thyroglobulin, thyroperoxidase og thyrotropin receptor. I lungerne promoverer TTF-1 Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 12

14 transskriberingen af overfladeproteinerne A-D og Claracelle sekretorisk protein, mens TTF-1 s funktion i hjernen er ukendt. Ved neoplasi ses ekspression af TTF-1 ved forskellige former for karcinomer i thyroidea samt ved de fleste neoplasmer i lungerne, dog yderst sjældent ved planocellulære lungekarcinomer (oversigt kan ses i tabel 1) (22,33). En positiv immunfarvning med detektionssystemet vil ses som røde kerner (se tabel 1) (27). Anti-Androgen receptor Anti-AR er et monoklonalt, muse-ab, og immunogenet er et syntetisk peptid, der svarer til aminosyre af den humane androgen receptor, koblet til keyhole limpet hemocyanin (34,35). AR er et nukleoprotein, der fungerer som transkriptionsregulator for androgener. I normalt væv kan AR påvises i bl.a. mamma, prostata, hud og slimhinden i mundhulen. I neoplastisk væv kan AR først og fremmest ses i forbindelse med adenokarcinomer i prostata og mamma (oversigt kan ses i tabel 1) (22,25). En positiv immunfarvning med det anvendte detektionssystem, vil ses som blå kerner (se tabel 1) (27). Anti-Estrogen receptor Anti-ER er et monoklonalt muse-ab, og immunogenet er en rekombinant af det humane estrogen receptor protein (36). ER er et nukleoprotein, der fungerer som transkriptionsregulator for kvindelige kønshormoner, og medierer effekten af disse ved vækst og differentiering i bl.a. det kvindelige og mandlige forplantningssystem og mammakirtler. Molekylet har et centralt DNA-bindende domæne, et hormonbindende domæne ved C-terminalen og et transkriptionsaktiverende domæne ved N-terminalen. Der findes to typer, ERα og ERβ, hvor ERα er den type, der benyttes til diagnostik. I normalt væv kan ER påvises i epitel og stroma i østrogenfølsomme væv som mamma og de kvindelige genitalier, samt i mindre grad i epitel i bl.a. thyroidea og pancreas. I neoplastisk væv ses ER ligeledes primært i tumorer i væv som er følsomt for kvindelige kønshormoner, dvs. karcinomer i mamma, endometrium og ovarierne. Derudover kan ER også påvises ved adenokarcinomer i prostata m.fl. (se nærmere tabel 1) (22,25,37). En positiv immunfarvning med detektionssystemet vil ses som blå kerner (se tabel 1) (27). Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 13

15 Antigenekspression ved neoplasi Tabel 1 er en oversigt over ekpressionen af forskellige Ag ved maligne neoplasier, og giver et udgangspunkt for hvordan AC kan benyttes til udredning af lokalisering af primærtumor. Oversigten skal dog tages med forbehold, da der kan forekomme afvigelser i Ag-ekspressionen (14,38-48). Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 14

16 Detektionssystem MultiVision Polymer Detection System Immunreaktionen visualiseres vha. et ét-trins polymer detektionssystem. Systemet er en cocktail af to forskellige sekundære Ab-polymerer med hver deres enzym-label: 1) ged-anti-mus/ alkaline phosphatase (ALP). 2) ged-anti-kanin/horseradish peroxidase (HRP) Polymeren består af en aminosyre-rygrad kaldet for dextran, hvortil Fab-delen af de sekundære Ab og enzymerne er bundet. Systemet er i stand til at visualisere flere Ag på samme tid. Detektionssystemet indeholder derudover chromogenerne LVred og LVblue. LVRed vil reagere med HRP, hvilket giver et rødt reaktionsprodukt, mens LVblue vil reagere med ALP og danne et blåt reaktionsprodukt (27). Immunhistokemisk farvning Epitop demaskering ved heat-induced epitop retrieval (HIER) Da prøvematerialet er fikseret med 4% neutral phosphatbufferet formaldehyd (NBF) er det nødvendigt at udføre en epitop demaskering før immunfarvningen. Dette skyldes, at NBF ofte har en negativ indvirkning på Ag i væv og celler, hvorved Ag-intensiteten hæmmes (maskering). Det menes at NBF påvirker Ag-intensiteten på følgende måder (22): 1. Maskering af epitoper, som følge af: - konformative ændringer i Ag - immobilisation af nabo-makromolekyler (sterisk hindring) - kompleksbinding af metalioner (især calciumioner) 2. Kemisk modifikation af reaktive aminosyrer i epitopen 3. Ekstraktion af Ag under fikseringen HIER-metoden bygger på opvarmning af vævssnit i en passende buffer eller saltopløsning. Den præcise mekanisme bag metoden er ukendt, men det menes at den har følgende virkninger (22): Opbrydning af de NBF-inducerede tværbroer, som er opstået under fikseringen. Fjernelse af kompleksbundne og epitopmaskerende calciumioner. Rehydrering af væv/celler, hvilket medfører forbedret penetration. Denaturering af protein, hvilket blotlægger skjulte epitoper. Måden hvorpå snittene opvarmes er ikke specielt kritisk, og der kan benyttes en mikrobølgeovn, en varmeplade, et vandbad m.fl. Derimod har kogemediets temperatur, Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 15

17 samt den tid, hvor snittene befinder sig deri, stor betydning for demaskeringens effektivitet: Temperaturer > 100 C kan medføre at kollagene fibre løsner sig fra glasset, hvilket kan give fortolkningsmæssige problemer, samt at varmefølsomme epitoper ikke demaskeres optimalt. Shi et al (49) påviste en sammenhæng mellem temperaturen (T) og varmebehandlingstiden (t), benævnt varmebehandlingsforholdet (T x t), dvs. desto lavere temperatur, desto længere tid skal prøvematerialet opvarmes. Det optimale varmebehandlingsforhold for de enkelte Ab giver forbedret morfologi og optimal demaskering (22). Valget af kogemedium har ligeledes betydning for demaskeringens effektivitet. Specielt to egenskaber ved kogemediet spiller ind: 1) Kogemediets ph, som påvirker den demaskerende effekt for nogle Ag. Hvilken ph, der er optimal, varierer. 2) Kogemediets evne til at kompleksbinde eller udfælde calciumioner og andre metalioner. Som nævnt er kompleksbundne metalioner medvirkende til maskering af epitoperne, og desto flere ioner kogemediet kan binde, jo bedre bliver demaskeringseffekten (22). Blokering af endogen aktivitet Da detektionssystemet benytter to enzymatisk markører, som forekommer endogent i en række celler i humant væv, er det nødvendigt at blokere/hæmme denne endogene enzymaktivitet inden immunreaktionen igangsættes for at undgå falsk-positive farveresultater (22). Dette gøres med Hydrogen Peroxidase Block, som vil bindes til endogent peroxidase, hvorved dette ikke vil kunne reagere med chromogenet (bilag 3) (27,50). Analyseprincip Vævssnittene inkuberes med AC, hvor de primære Ab vil binde sig til de specifikke Ag i cellerne, som de er rettet mod (fig. 2: Trin 1). De overskydende Ab vaskes væk med buffer, hvorefter snittene inkuberes med Multivision Polymer cocktailen. Ged-anti-mus/ALP binder sig til de primære muse-ab (anti-ck20, anti-ca-125, anti-er/ar), og ged-antikanin/hrp binder sig til kanin-ab (anti-ck7, anti-ttf-1) (fig. 2: Trin 2). Der vaskes igen med buffer for at fjerne ubunde polymerer. ALP visualiseres med LVblue. ALP hydrolyserer naphtholphosphatestere (substrat) i LVblue til phenolforbindelser og phosphater. Phenolforbindelserne binder til diazoniumsalt (chromogen), hvorved der produceres et blåt produkt (fig. 3). Herefter skylles med buffer inden HRP visualiseres med Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 16

18 LVred. Ved tilstedeværelse af chromogenet, der fungerer som elektrondonor, vil HRP katalysere omdannelsen af H 2 H 2 (substrat) til H 2 O, hvorved chromogenet oxideres til et rødt produkt (fig. 4) (fig. 2: Trin 3) (22,27,51). Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 17 63

19 Mayers sure hæmalun Mayers sure hæmalun (MSH) er en kernefarvning, der gør det muligt at orientere sig i vævet. MSH indeholder metalkompleksfarvestoffet Aluminium-Hæmatein (Al-Hæmatein), som er fremstillet ved at oxidere hæmatoxylin til anionfarvestoffet hæmatein, der danner komplekser med aluminion-ioner. Al-Hæmateins positive aluminiumsgruppe vil bindes til de negativt ladede fosfatradikaler i DNA og RNA ved kompleksbindinger med ligandudskiftning af H 2 O (finder primært sted ved ph > 3) eller ved hydrofob stabilisering (finder primært sted ved ph < 3). Når kompleksbindingen er etableret vil metalionerne være placeret mellem farvemolekylerne og vævskomponenterne. Hydrofob stabilisering kræver at DNA-helixen er despiraliseret, hvilket sker, når ph < 3 pga. den høje koncentration af hydrogenioner. I begyndelsen sker en form for iontrækning, hvor det positivt ladede farvestof tiltrækkes af de negativt ladede nukleinsyrer i vævskomponenten. Herefter opstår en hydrofob stabilisering mellem farvestoffets upolære grupper og vævskomponentens polære grupper, hvilket medfører, at de nærliggende vandmolekyler fortrænges yderligere og danner en polær vandkappe omkring komplekset. Efter farvning med Al-Hæmatein skylles vævssnittene med H 2 O. Ved ph 7 skifter Al- Hæmateinkomplekset farve fra rødbrun til blåviolet ( blåning ) (52). Anvendt statistik Cohens kappa Cohens Kappa er en statistisk test til at måle graden af overensstemmelse mellem to uafhængige bedømmeres vurdering af kvalitative/kategoriske variabler, der tager hensyn til muligheden for, at en fælles enighed omkring en observation udelukkende kan være tilfældig. Til dette formål benyttes Kappa-koefficient (κ), som er et mål for sand enighed, dvs. enighed ud over det forventede ved tilfældigheder. κ er dermed defineret som (53): Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 18

20 κ = p 0 p 1 p p 0 er den observerede enighed, og p t er andelen af enighed, som forventes at være tilfældig. p 0 p 1 er et udtryk for hvor meget den observerede enighed er bedre end tilfældigt og 1 p 1 udtrykker hvor meget bedre den observerede enighed potentielt kan blive i den situation, hvor der er perfekt enighed. For at beregne p 0 og p 1 opstilles data som regel i en krydstabel (54). Den mest simple er en 2x2 tabel (53): 1 1 Celle a og d indikerer antallet af prøver, hvor lægerne er enige om hhv. svar A og svar B, mens celle b og c angiver antallet af prøver, hvor lægerne er uenige. f 1 og f 2 angiver det totale antal prøver, hvor læge 2 har givet hhv. svar A og svar B. Tilsvarende gælder for læge 1 og g 1 og g 2. n angiver det totale antal. Summen af frekvenserne i celle a og d giver frekvensen af den observerede enighed, og ved at dividere dette med n fås p 0 (53): p 0 ( a + d) = n Da andelen af den forventede enighed er baseret på antagelsen om, at de to vurderinger er uafhængig af hvilken læge, der udfører dem, beregnes frekvensen for tilfældig enighed på følgende måde (53): p 1 f1 g n = 1 f 2 g + n n κ er et tal mellem -1 og 1. For at bedømme hvor stærk graden af overensstemmelse er ud fra κ kan man benytte Landis og Koch s retningslinjer (55): 2 Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 19

21 Cohens kappa kan benyttes til at analysere norminale data (54). Vægtet kappa Når der er tale om ordinale data vil der være en naturlig rangorden mellem de forskellige kategorier (fx poor, borderline, good, optimal), og det er derfor relevant at fokusere på graden af uoverensstemmelse, da det vil være værre, hvis læge 1 vurderer prøven som "poor" og læge 2 vurderer den som "optimal", end hvis læge 1 vurderer den som "bordeline" og læge 2 som "poor". For at reflektere graden af uoverensstemmelse kan κ vægtes således, at den lægger større vægt på store uenigheder end mindre uenigheder. Vægtet κ kan defineres som (53): κ w = wf n 0 wf Ʃwf 0 er summen af de vægtede observerede frekvenser, og Ʃwf 1 er summen af de vægtede frekvenser forventet ved tilfældigheder. κ kan vægtes på forskellige måder, men kvadratiske vægtning er den som er den mest relevante i dette forsøg (53,56): w i wf i j 1 = k i-j er forskellen mellem rækkekategorien på skalaen og kolonnekategorien på skalaen, dvs. antallet af kategorier af uoverensstemmelse, og k er antallet af point på skalaen. Vægtet kappa bedømmes på samme måde som Cohens kappa (53) Materialer Utensilier Mikrotom Immunbrønd (plastik rack) Mikroskop FLEX IHC Microscope Slides Varmeskab Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 20

22 Pipetter + pipettespidser Skyllekar Kar til hæmatoxylin-farvning Dako user-fillable reagent bottle Apparatur Saukra Tissue-Tek Film TM, Serienr.: Dako PT-link, serienr.: PT1194Y0908, Ref.nr.: PT10126 Dako Autostainer LINK 48, Serienr.: A51104D0902 Reagenser IHC: Antistoffer: MultiVision Polymer Detection System: MultiVision anti-rabbit/hrp + anti-mouse/alp polymers: Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 21

23 Kernefarvning (Mayers sure hæmatoxylin): Mayers sure hæmalun Alkohol 96% Alkohol 99% Prøvemateriale 10 snit fra TMA-blok med malignt væv (bilag 4). 3 snit fra paraffinindstøbt blærebiopsi, arkiv: 1. snit med normale celler. 2. snit med maligne celler, lavt differentierede. 3. snit med maligne celler, højt differentierede. 20 patientprøver, paraffinindstøbte pleuravæskekoagler: Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 22

24 Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 23

25 Kontroller Paraffinindstøbt blok med kontrolvæv (fig. 5)(tabel 8): Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 24

26 Metoder Forsøgsdesign Indsamling af prøvemateriale Vi fik tilsendt 10 snit fra en TMA-blok til pilotforsøget efter aftale med Patologisk Institut ved Ålborg sygehus, hvoraf vi benyttede to. De 20 patientprøver til forsøget samt blærevævet til CK7-CK20-pilotforsøget blev fundet i arkivet på Patologisk Institut, Holstebro, vha. afdelingens elektroniske patologisystem. Blærevævet blev udvalgt på baggrund af sandsynligheden for, at der ville være en positiv CK7-CK20-reaktion i de samme celler. Inklusionskriterierne for patientprøverne var: 1) prøvematerialet skulle være pleuravæskekoagel, 2) der skulle være en forholdsvis klar diagnose (dvs. lokalisering af primærtumor), og 3) der skulle ved den tidligere undersøgelse have været anvendt mindst ét af Ab fra AC. Kontroller Da afdelingen ikke var i besiddelse af en kontrolblok til cocktailen blev der lavet en ny. Der blev udtaget normalt væv (tonsil, mamma, prostata, lunge, appendix og salpinx) fra seks arkivblokke, som højst sandsynligt ville være positive for de seks Ab i cocktailen (3). Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 25

27 Salpinx, mamma, appendix og lunge viste sig dog også at være positive for CK7. Der sås ikke reaktion for CA-125 i salpinx, og det er muligt at årsagen er, at farvningen af CK7 overskygger CA-125. På trods af den manglende positive kontrol for CA-125 valgte vi at benytte kontrollen til forsøget. Dette skyldes, at vi vidste at nogle af patientprøverne tidligere var fundet positive for CA-125, og disse kunne dermed benyttes som uofficielle, positive kontroller. Der blev medtaget ét kontrolsnit til hver af de 20 patientprøver. Afdelingen medtager normalt ikke negative kontroller, men der var medtaget negativt kontrolvæv i form af normal lever i TMA-blokken. Denne kontrol var negativ ved begge koncentrationer i TMA-forsøget, hvilket understøtter specificiteten af Ab. Fremstilling af reagens Ab og detektionssystemet til de enkelte forsøg blev fremstillet i henhold til afdelingens Ab-fortyndingsliste (bilag 5) (57) og instruktion til fremstilling af LVRed og LVBlue (58): Pilotforsøg TMA: Pilotforsøg CK7-CK20: Forsøg: Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 26

28 Klargøring & forbehandling af prøvemateriale På et mikrotom blev skåret ét 3,5 µm tykt snit af hver af de paraffinindstøbt pleurakoagler samt af blærevævene. Snittene blev skåret af en bioanalytiker på afdelingen for at sikre, at snittene var af en god kvalitet til immunfarvningen. Snittene blev opsamlet på FLEX IHC Microscope Slides og anbragt i en immunbrønd (rack), som blev sat i et varmeskab, hvor snittene blev de tørret i 45 minutter ved 60 C. Efter tørringen blev snittene anbragt i maskinen PT-link (high ph-buffer), som automatisk foretog afparaffinering og epitop demaskering ved HIER (kørselsrapporter for pilotforsøgene og forsøget kan ses i bilag 6-8). Herefter blev racket først dyppet 10 gange og henstod bagefter i 5 min. i et skyllekar med vaskebuffer. Glassene blev skyllet på begge sider med vaskebuffer i sprøjteflasker og rackene blev placeret i maskinen Autostainer LINK 48. Inden kørslen blev sat i gang blev der dryppet vaskebuffer på glassene. Snittene fra TMA-blokken var på glas ved modtagelse og blev derfor ikke skåret på afdelingen, men ellers gennemgik de samme behandling som det øvrige prøvemateriale. Immunfarvning Inden farvningen foretog Autostainer en blokering af endogen aktivitet med Hydrogen Peroxidase Block. Glassene blev inkuberet med AC, herefter med Multivision Polymer Cocktail Rabbit/HRP + Mouse/ALP og til sidst med først LVBlue og så LVRed. Efter hvert trin blev der skyllet med buffer (kørselsrapporter for pilotforsøgene og forsøget kan ses i bilag 9-11). Ved pilotforsøget med TMA-blokken blev det ene snit inkuberet med AC hvor Ab var i de koncentrationer producenterne anbefaler, mens det andet snit blev behandlet med AC hvor koncentrationen af Ab var dobbelt så høj (jævnfør tabel 5). Kernefarvning (Mayers sure hæmalun) Kernefarvningen (og dehydrering) blev udført manuelt på følgende måde: Mayers sure hæmalun i 3 min. Rindende H 2 O i 3 min. 96% ethanol i 1,30 min. 99% ethanol i 1,30 min. 99% ethanol i 1,30 min. 99% ethanol i 1,30 min. Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 27

29 99% ethanol i 1,30 min. Til sidst blev der automatisk sat dækglas på snittene ved hydrofob montering i Saukra Tissue-Tek Film TM. Vurdering af pilotforsøg og immuncocktail Immunfarvningerne af snittene i pilotforsøgene blev vurderet i mikroskop af immunansvarlige bioanalytiker, klinisk underviser og undertegnede. Prøvematerialet blev blindet, hvorefter to af afdelingens patologer vurderede farvningen ud fra en forudbestemt score (se nedenfor) og stillede en diagnose. Som hjælp til diagnosticeringen fik patologerne oplyst den kliniske information for den enkelte patient, der var til rådighed da prøverne i sin tid blev diagnosticeret. Vurderingen af de enkelte prøver blev udført med udgangspunkt i et skema (bilag 12). Scoring af immunfarvning Scoringen af kvaliteten af farvningen er baseret på NordiQC s vurderingsmetode, hvor hver farvning markeres som (59): Optimal: Farvningen er perfekt eller næsten perfekt. Good: Farvningen er fuldt acceptable, men protokollen bør optimeres fx for at opnå bedre farveintensitet. Borderline: Farvningen er utilstrækkelig, fx pga. svag farveintensitet eller falsk negativ/positiv farvereaktion. Protokollen bør optimeres. Poor: farvningen er yderst utilstrækkelig, fx pga. falsk negativ/positiv farvereaktion. Der er et presserende behov for optimering af protokollen. Økonomi: antistofpanel >< antistofcocktail Det økonomiske aspekt er beregnet på baggrund af afdelingens prislister for immunkørsler. For at bedømme den årlige prisforskel ved at benytte den ene metode frem for den anden er der fremsøgt prøver i afdelingens elektroniske patologisystem. Inklusionskriterierne var: 1) undersøgelserne skulle være fra ) Pleuravæskekoagler med diagnose, som har fået foretaget IHC. 3) Undersøgt med én eller flere af de Ab, der indgår i AC. Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 28

30 Databehandling Databehandling og udregninger er foretaget i Microsoft Excel Patologerne har ved de fleste prøver givet flere bud på en diagnose, hvilket er normalt ved cytologiske undersøgelser. Den statistiske test kan dog kun håndtere ét svar, og derfor er den diagnose som stod først, blevet betragtet som værende den, patologen mener er den mest sandsynlige, og det er den som er blevet benyttet til Cohens kappa. Patologerne benytter til tider overordnede betegnelser til diagnostik, mens de andre gange er mere specifikke. For ikke at få for mange kategorier ved beregning af Cohens kappa er visse organer derfor samlet under den overordnede betegnelse. Dette gælder for: øvre gastrointestinal (ventrikel, pancreas og galdegange) og kvindelige genitalier (ovarium, tuba uterina, úterus, cervix, vagina). Der er benyttet en online-regnemaskine til beregning af Cohens kappa og vægtet kappa: Søgestrategi Der er fokuseret på engelsk-sproget, videnskabelig litteratur i form af lærebøger og peerreview-artikler. For specifik information om de anvendte Ab er benyttet producenternes hjemmeside og Nordiqc.org. Der er søgt litteratur i biblioteket på Patologisk Institut i Holstebro, på Statsbiblioteket i Aarhus, i Pubmed, Google Scholar og Google. Nogle af artikler er fundet ud fra referencelister i allerede fundne bøger og artikler. Litteratursøgning og -vurdering blev gennemført på baggrund af søgeprotokollen i bilag 13. Resultater Pilotforsøg TMA I tabel 12 ses udvalgte resultater af immunfarvningen af to snit fra TMA-blokken. Specielt for CK7 og TTF-1 har det stor betydning for farveintensiteten hvilken koncentration af Ab der benyttes. Dette ses i fig. 6a-b og 9a-b, hvor de væv, som er blevet behandlet med ACfortyndingen, har en kraftigere farveintensitet både mht. cytoplasma og kerner. For CK20 i Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 29

31 fig. 5a-b ses ligeledes at blåfarvningen af cytoplasma er kraftigere i snittet med ACfortyndingen (fig. 7b). Effekten af Ab-fortyndingen for ER/AR og CA-125 er mindre udtalt, men farveintensiteten af kerner (ER/AR) og cytoplasma (CA-125) er dog en smule bedre for de snit, der er behandlet med AC-fortyndingen (fig. 8b og 9b) end dem, der blev behandlet med den anbefalede fortynding (fig. 8a og 9a) (billederne kan ses i stor størrelse i bilag 14). Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 30

32 Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 31

33 Pilotforsøg CK7 & CK20 Forsøget med immunfarvning med anti-ck7 og anti-ck20 på blærevævet viste at cellernes cytoplasma kan fremstå på tre måder (figur 10a-c i tabel 13): Cytoplasma kan være farvet rødt, dvs. visualisering af CK7 (grøn pil), eller blåt cytoplasma, dvs. visualisering af CK20 (rød pil). Dertil kan farven på cytoplasma være en blanding af rød og blå, hvilket giver forskellige brun-lilla nuancer og indikerer coekspression af de to Ab (gul pil). Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 32

34 Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 33

35 Forsøg - Antistofcocktail Scoring af immunfarvning Patologerne var fuldstændig enige i deres scoring af immunfarvningen med AC (tabel 14), og det er dermed underordnet at lave en vægtet kappa, da der jo ikke er tvivl om, at der er tale om en perfekt grad af overensstemmelse. Score Prøve Patolog 1 Patolog 2 A-T Good Good Tabel 14. Resultat af patologers vurdering af immunfarvningens kvalitet. Kvaliteten af immunfarvningen med AC blev vurderet som good, hvilket betyder at farvningen er acceptabel, men at protokollen bør forbedres. Data kan ses i bilag 15. Diagnostik ud fra immunfarvning med antistofcocktail Forsøget afslørede, at det var vanskeligt for patologerne at vurdere hvorvidt en celle var positiv for CK-20 eller CA-125, hvilket gjorde det svært at diagnosticere de prøver, hvor dette var aktuelt. På trods af dette fandt patologerne frem til den samme diagnose, som var blevet stillet ved den tidligere undersøgelse, i mere end halvdelen af prøverne. Data fra forsøget ses i bilag 15 og bilag 16. Resultat af den tidligere undersøgelse kan ses i tabel 7. Resultat af immunfarvning med antistofcocktail I det følgende gennemgås resultatet af farvningen med AC. Når der benyttes ordet celle(r) er der tale om maligne celler. Billederne kan ses i fuld størrelse i bilag 17. Prøve A indeholdte celler med ekspression af CK7 (fig. 11a) og CK20 (fig. 11b). Ved den tidligere IHC var der derudover fundet celler med CA-125-ekspression, men disse blev ikke fundet i præparatet. Figur 11a. Prøve A, celle positiv for CK7 (grøn pil) (x400). Figur 11b. Prøve A, celle positiv for CK20 (grøn pil) (x400). Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 34

36 I prøve B var enkelte maligne celler positive for CK7 (fig. 12a), og der var ansamlinger af celler, hvoraf nogle var positive for ER (fig. 12b). Patolog 1 havde fundet enkelte CK20- positive celler, men disse kunne ikke genfindes. Figur 12a. Prøve B, celle positiv for CK7 (x400). Figur 12b. Prøve B, celler positive for ER (grønne pile) (x400). Der var CK7-positive celler i prøve C (fig. 13a). Der blev ligeledes fundet celler med positiv membran- og eller cytoplasmareaktion, og patologerne var i tvivl om der var tale om CK20- eller CA-125. Da den tidlige farvning var negativ for CK20 og positiv for CA- 125, og der ved visse celler var tydelige membranreaktion, har vi vurderet at der er tale om CA-125 (fig. 13b). Figur 13a. Prøve C, celle positiv for CK7 (grøn pil) (x400). Figur 13b. Prøve C, celle positiv for CA-125 (grøn pil) (x400). Prøve D indeholdt celler positive for CK7. Vi mener derudover, at der er positiv reaktion for TTF-1, som også var positiv ved den tidligere IHC (fig. 14). Figur 14. Prøve D, celle positiv for CK7 (gul pil) og TTF-1 (grønne pile) (x400). Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 35

37 I prøve E ses celler positive for CK7 (fig. 15). Der var af patolog 1 fundet positive CK20- celler og positive CA-125-celler. Det lykkedes ikke at genfinde celler der med sikkerhed var CK20-positive, men der var CA-125-positive celler (fig. 13). Figur 15. Prøve E, celler positive for CK7 (grønne pile), celle positiv for CA-125 (gul pil) (x400). Prøve F indeholdt celler positive for CK7 og CK20 (fig. 16). Patolog 1 havde dertil fundet celler med CA-125-ekpression, men disse kunne ikke genfindes. Figur 16. Prøve F, celler positive for CK7 (grønne pile), celle positiv for CK20 (gul pil) (x400). Der var CK7-positive og CA-125-positive celler i prøve G (fig. 17a og 17b). Det var problematisk for patologerne at vurdere om der var tale om CK20 eller CA-125, men da den tidligere IHC var positiv for CA-125 og negativ for CK20, har vi tolket dem som CA- 125-positiv. Figur 17a. Prøve G, celle positiv for CK7 (grøn pil) (x400). Figur 17b. Prøve G, celle positiv for CA-125 (grøn pil) (x400). Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 36

38 I prøve H fandtes CK7-positive celler (fig. 18a). Der var tvivl om hvorvidt der var CK20 eller CA-125-reaktion, men på baggrund af den tidligere IHC er cellerne tolket, som CA- 125-positive (fig. 18b). Figur 18a. Prøve H, celle positiv for CK7 (x400). Figur 18b. Prøve H, celle positiv for CA-125 (grøn pil) (x400). Prøve I indeholdt celler med ekspression af hhv. CK7 og ER/AR (fig. 19). Figur 19. Prøve I, celle positiv for CK7 (grøn pil) og celler positive for ER (gule pile) (x400). I prøve J var celler med klart positiv reaktion for CK7 i cytoplasma og TTF-1 i kerner (fig. 20). Figur 20. Prøve J, celler positive for CK7 (gule pile) og TTF-1 (grønne pile) (x400). Prøve K indeholdt celler positive for CK7, og enkelte celler der var både CK7 og TTF-1- positive (fig. 21). Lisa Gjelstrup Kristensen (122026) 37