KONSTATERING AF INFLUENZA A OG B, PARAINFLUENZA 1 OG 2, PARAINFLUENZA 3 ELLER ADENOVIRUS VED IMMUNFLUORESCENS

Transkript

1 MONOFLUO TM KIT MONOFLUO TM KIT INFLUENZA 2 X 45 TESTS MONOFLUO TM KIT ADENOVIRUS 45 TESTS MONOFLUO TM KIT PARA-INFLUENZA TESTS MONOFLUO TM KIT PARA-INFLUENZA 3 45 TESTS KONSTATERING AF INFLUENZA A OG B, PARAINFLUENZA 1 OG 2, PARAINFLUENZA 3 ELLER ADENOVIRUS VED IMMUNFLUORESCENS IVD

2 INDHOLDSFORTEGNELSE 1- KLINISK VÆRDI PRINCIP SÆTTETS SAMMENSÆTNING FORHOLDSREGLER FOR BRUG PRØVEMATERIALE TEKNIK TIL PRØVETAGNING BEHANDLING AF PRØVER FØR I.F.-UNDERSØGELSE VIRUSISOLATION PÅ CELLEKULTUR PROCEDURE KRÆVET MATERIALE, DER IKKE MEDFØLGER REKONSTITUERING OG KONSERVERING AF REAGENSER PROCEDURE FORTOLKNING AF RESULTATERNE KVALITETSKONTROL AFLÆSNING OG FORTOLKNING AF RESULTATERNE TESTENS BEGRÆNSNINGER KVALITETSKONTROL AF TESTEN PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL REFERENCER

3 1- KLINISK VÆRDI Respiratorisk syncytial, influenza A og B, parainfluenza 1, 2 og 3 vira og adenovirus er årsag til alvorlige luftvejsinfektioner hos børn og ældre eller svækkede personer. Diagnosticeringen af disse infektioners virale eller bakterielle oprindelse er afgørende for at kunne tage de rette behandlingsmæssige forholdsregler. Diagnosticeringen af disse virussygdomme er baseret på isolation af virussen. Den serologiske diagnose giver reelt ikke tilfredsstillende resultater. Antistoftitrene stiger først signifikant 10 til 15 dage efter de begyndende kliniske tegn og kan normalt ikke konstateres hos børn. Referencemetoden vil stadig være isolation af virussen fra cellekulturen (Hela-, KB-, Hep2-celler eller fibroblastiske cellelinjer fra fosterceller) og dens identifikation fra en nasofaryngeal prøve eller bronchoalveolær lavage-væske. Prøven indsamles under fasen med størst virusudskillelse, 1 til 6 dage efter sygdommens start. Tilknytningen af monoklonale antistoffer, der er specifikke for disse vira, med respiratorisk tropisme og immunfluorescensteknikken muliggjorde hurtig diagnosticering af disse sygdomme (ved direkte undersøgelse af prøven) uden at skulle gøre brug af cellekulturmetoden, der er vanskelig at udføre. For hver af disse vira er de monoklonale antistoffer, der retter sig mod virusproteinerne, valgt. For det første pga. deres specificitet, og for det andet pga. kvaliteten af det billede, der blev observeret under brugen af immunfluorescens. Det almindelige udseende er en meget tydelig granulær eller partikelformet fluorescens i cytoplasmaet i de inficerede celler. Disse monoklonale antistoffer kan også bruges til at identificere hver af disse vira, efter de er blevet isoleret fra cellekulturen. Udbredelsen af disse forskellige infektioner har medført, at Bio-Rad vil foreslå udviklingen af en hurtig diagnosticering af sygdomme ved viral ætiologi på følgende måde: Respiratorisk syncytial virus (RSV) er skyld i mere end 60% af disse infektioner. MONOFLUO TM SCREEN RSV bruges til identifikation af denne virus med en direkte immunfluorescensteknik, der udføres i ét trin på den indsamlede prøve. Influenza A og B, parainfluenza 1, 2 og 3 vira og adenovirus er, på forskellige måder ud fra område og årstid, årsag til omkring 30% af disse infektioner. MONOFLUO TM SCREEN INFLUENZA, PARAINFLUENZA, 101

4 ADENOVIRUS bruges til at bekræfte eller afkræfte tilstedeværelsen af én af disse vira med en direkte immunfluorescensteknik, der udføres i ét trin på den indsamlede prøve. Ved en positiv reaktion kan den mistænkte virus identificeres ved hjælp af: - MONOFLUO TM KIT INFLUENZA (kode 52209) - MONOFLUO TM KIT PARA-INFLUENZA (kode 52211) - MONOFLUO TM KIT PARA-INFLUENZA 3 (kode 52212) - MONOFLUO TM KIT KIT ADENOVIRUS (kode 52210) 2- PRINCIP MONOFLUO TM KIT Influenza-testsættet er beregnet til konstatering af influenza-virus A og B i inficerede celler med den indirekte immunfluorescensteknik ved hjælp af monoklonale antistoffer, der er specifikke for hver af disse vira. MONOFLUO TM KIT Adenovirus-testsættet er beregnet til konstatering af de forskellige virusstammer af adenovirus. MONOFLUO TM KIT para-influenza 1+2-testsættet er beregnet til konstatering af typerne 1 eller 2 af parainfluenzavirussen, og MONOFLUO TM KIT para- Influenza 3-testsættet er beregnet til konstatering af parainfluenzavirustype 3. Disse monoklonale antistoffer binder sig til det antigen, der optræder i cytoplasmaet i de inficerede celler, der er indsamlet fra prøver med sekreter eller celleekssudat fra luftvejene, eller efter isolation af virussen fra cellekulturer. Tilføjelsen af fluoresensmærket anti-igg-konjugat fra mus gør de celler, der har bundet sig til de monoklonale antistoffer, fluorescerende. De celler, der binder sig til de specifikke, monoklonale antistoffer, der retter sig mod virusproteinerne, fremviser fluorescens, hovedsageligt cytoplasmisk, med et granuløst eller partikelformet udseende ved undersøgelse med fluorescensmikroskop. 3- SÆTTETS SAMMENSÆTNING Opbevaringsbetingelser og udløbsdato fremgår af etiketten på pakken. Reagenserne er holdbare indtil udløbsdatoen på etiketten, hvis de opbevares ved +2 8 C, og der ingen mikrobiel kontamination forekommer (også i åben tilstand). 102

5 MONOFLUO TM KIT INFLUENZA (kode 52209) ETIKET REAGENSER PRÆSENTATION R1a Monoclonal Monoklonale antistoffer (mus) 1 x 2,5 ml Antibody Anti-influenza A (klon IA52/9) (pipetteflaske) anti-influenza A Konserveringsmiddel: < 0,1% natriumazid R1b Monoclonal Monoklonale antistoffer (mus) 1 x 2,5 ml Antibody Anti-influenza B (klon IB82/2) (pipetteflaske) anti-influenza B Konserveringsmiddel: < 0,1% natriumazid R2 Negative Negativ kontrol (kultursupernatant) 1 x 2,5 ml control Konserveringsmiddel: < 0,1% natriumazid (pipetteflaske) R3 Concentrated Koncentreret konjugat (10X) : 1 x 1 ml Conjugate Antistof (får), anti-igg-buffer fra mus mærket (pipetteflaske) (10X) med fluoresceinisothiocyanat med Evans Blue Konserveringsmiddel: < 0,2% natriumazid R4 Mounting Monteringsmedium (klar til brug): 1 x 3 ml medium Bufferet glycerol til immunfluorescens (pipetteflaske) Konserveringsmiddel: < 0,1% natriumazid MONOFLUO TM KIT ADENOVIRUS (kode 52210) ETIKET REAGENSER PRÆSENTATION R1 Monoclonal Monoklonale antistoffer (mus) 1 x 2,5 ml Antibody anti-adenovirus (klon H60 og H72) (pipetteflaske) Adenovirus Konserveringsmiddel: < 0,1% natriumazid R2 Negative Negativ kontrol (kultursupernatant) 1 x 2,5 ml control Konserveringsmiddel: < 0,1% natriumazid (pipetteflaske) R3 Concentrated Koncentreret konjugat (10X) : 1 x 1 ml Conjugate Antistof (får), anti-igg-buffer fra mus mærket (pipetteflaske) (10X) med fluoresceinisothiocyanat med Evans Blue Konserveringsmiddel: < 0.2% natriumazid R4 Mounting Monteringsmedium (klar til brug): 1 x 3 ml medium Bufferet glycerol til immunfluorescens (pipetteflaske) Konserveringsmiddel: < 0,1% natriumazid 103

6 MONOFLUO TM KIT PARAINFLUENZA 1+2 (kode 52211) ETIKET REAGENSER PRÆSENTATION R1 Monoclonal Monoklonale antistoffer (mus) 1 x 2,5 ml Antibody anti-parainfluenza 1 og 2 (klon P2 128/14) (pipetteflaske) parainfluenza Konserveringsmiddel: < 0,1% natriumazid R2 Negative Negativ kontrol (kultursupernatant) 1 x 2,5 ml control Konserveringsmiddel: < 0,1% natriumazid (pipetteflaske) R3 Concentrated Koncentreret konjugat (10X): 1 x 1 ml Conjugate Antistof (får), anti-igg-buffer fra mus mærket (pipetteflaske) (10X) med fluoresceinisothiocyanat med Evans Blue Konserveringsmiddel: < 0,2% natriumazid R4 Mounting Monteringsmedium (klar til brug): 1 x 3 ml medium Bufferet glycerol til immunfluorescens (pipetteflaske) Konserveringsmiddel: < 0,1% natriumazid MONOFLUO TM KIT PARAINFLUENZA 3 (kode 52212) ETIKET REAGENSER PRÆSENTATION R1 Monoclonal Monoklonale antistoffer (mus) 1 x 2,5 ml Antibody anti-parainfluenza 3 (klon Pi3 5/12) (pipetteflaske) parainfluenza 3 Konserveringsmiddel: < 0,1% natriumazid R2 Negative Negativ kontrol (kultursupernatant) 1 x 2,5 ml control Konserveringsmiddel: < 0,1% natriumazid (pipetteflaske) R3 Concentrated Koncentreret konjugat (10X): 1 x 1 ml Conjugate Antistof (får), anti-igg-buffer fra mus mærket (pipetteflaske) (10X) med fluoresceinisothiocyanat med Evans Blue Konserveringsmiddel: < 0,2% natriumazid R4 Mounting Monteringsmedium (klar til brug): 1 x 3 ml medium Bufferet glycerol til immunfluorescens (pipetteflaske) Konserveringsmiddel: < 0,1% natriumazid 104

7 4- FORHOLDSREGLER FOR BRUG Kvaliteten af resultaterne afhænger af overholdelsen af følgende regler for god laboratoriepraksis: Undgå at anvende forældede reagenser. Undgå at blande eller kombinere reagenser fra sæt med forskellige partinumre i den samme procedure. Lad reagenserne stabilisere sig ved stuetemperatur før brug ( C). Benyt engangsmateriale, eller hvis dette ikke er muligt, udstyr af glas, som er vasket og skyllet grundigt med demineraliseret vand. Brug en ny pipettespids til hver prøve. Kontrollér kvaliteten af det demineraliserede vand. Hvis der observeres fluorescerende organismer på en negativ kontrol, skal det vand, der anvendes, steriliseres ved filtrering. Undgå, at konjugatet tørrer på pladen under farvningen. SUNDHEDS- OG SIKKERHEDSMÆSSIGE FORHOLDSREGLER Benyt engangshandsker. Undgå at "pipettere med munden". Betragt alt materiale, der har været i direkte kontakt med prøvematerialer, som kontamineret og derfor smitsomt. Undgå at spilde. Overhold altid de gældende teknikker og forholdsregler til beskyttelse mod mikrobiologiske farer ved håndtering og bortskaffelse af de materialer og biologiske produkter, der anvendes til reaktionen. ADVARSEL: R3-reagens (koncentreret konjugat) indeholder natriumazid med en koncentration <0,2%. Xn - Sundhedsskadelig R22-32: Farlig ved indtagelse. Udvikler meget giftig gas ved kontakt med syre. S28-60: Kommer stof på huden vaskes straks med store mængder vand. Dette materiale og dets beholder skal bortskaffes som farligt affald. Sikkerhedsdatablad for håndtering af materialet udleveres efter anmodning. 105

8 5- PRØVEMATERIALE 106 Disse vira findes kun i sekreter og celleekssudat fra de øvre luftveje. For at udføre direkte diagnosticering ved hjælp af fluorescens skal du indsamle afskallede celler fra nasale eller tracheobronchiale sekreter. Hvis virussen skal isoleres fra cellekulturer, kan immunofluorescensteknikken også anvendes på celler, der er inficeret in vitro, så snart den cytopatiske effekt kan konstateres TEKNIK TIL PRØVETAGNING Influenza A og B, parainfluenza 1, 2 og 3 vira og adenovirus er blevet undersøgt i prøver, der indeholder nasale eller tracheobronchiale sekreter, der er indsamlet ved pensling med en bomulds-q-tip eller ved opsugning eller nasal udskylning med PBS-bufferopløsning. Luftvejssekreterne kan overføres til laboratoriet for direkte undersøgelse af prøver i immunfluorescens. I tilfælde af viral isolation indsamles sekreterne i et passende transportmedium til opbevaring af virussen: helst i en saltvandsopløsning eller et bufferet MEM-medium (da nogle vira med respiratorisk tropisme mister deres infektionsevne i et surt medium) og beriget med bestemte stoffer, der skal beskytte viraene: bovin albumin, gelatine, serum fra kyllinger, saccharose og antibiotika. Følgende formel er et eksempel: MEM, 5 mg/ml bovin albumin, 4,76 mg/ml HEPES, 0,22 mg/ml natriumbikarbonat, U/ml penicillin, mcg/ml streptomycin. Prøven bør transporteres til isolation i nedfrosset eller kold tilstand. Indsamlingen af en tilstrækkelig mængde sekret er et vigtigt element. Det er normalt mere effektivt og praktisk at indsamle luftvejssekreter, som ofte er slimede sekreter, ved opsugning med et lille rør, der er forbundet med en prøvetagningsflaske, hvor røret føres op i barnets næse. Systemet er tilgængeligt i handlen under navnet "slimsug". Når der ikke kan foretages en opsugning ved barnets sengeleje, kan der anvendes en sprøjte med stor kapacitet (50 ml), en manuel vakuumpumpe eller, hvis det er muligt, et elektrisk sugesystem. I nogle tilfælde, f.eks. ved bronchiolitis, er barnets næse tør, og det er ikke muligt at indsamle tilstrækkelige mængder sekret. I dette tilfælde kan der anvendes udskylning med en nasal klystersprøjte: få millimeters opløsning indføres i det ene næsebor, og denne væske opsuges derefter straks.

9 I de fleste tilfælde kan der indsamles mindst 0,2 til 0,5 ml sekret ved nasal opsugning. Dette materiale overføres derefter til laboratoriet eller placeres i det relevante transportmedium til virusisolation på cellekultur. Opbevaring i mindre end 3 timer ved stuetemperatur (18-30 C) ændrer ikke kvaliteten af de virale antigener i prøven. Det anbefales at opbevare en viral isolation koldt (+2-8 C), men inokulationen af cellekulturer må ikke forsinkes for meget, da smitteevnen falder selv efter nedfrysning ved - 70 C BEHANDLING AF PRØVER FØR I.F.-UNDERSØGELSE I laboratoriet er det nødvendigt at foretage flere på hinanden følgende afvaskninger af det opsugede materiale for at få en suspension af nasale celler uden slim. Forbered den nødvendige volumen PBS-buffer til behandling og afvaskning ved at fortynde den koncentrerede opløsning i forholdet 1:10 i sterilt, destilleret vand. Føj 5 ml PBS til ca. 0,5-1 ml sekret. Ryst forsigtigt. Centrifugér i 10 minutter ved 500 g ved +2-8 C. Dekantér supernatantvæsken. Føj 5 ml PBS til præcipitatet og centrifugér. Gentag afvasknings proceduren 2 eller 3 gange for fuldstændigt at fjerne slimen. Føj 1 ml PBS til cellepræcipitatet efter den sidste centrifugering. Homogeniser suspensionen ved pipettering. Kom cellerne på pladerne. Udfør cellebinding og -farvning (se farvningsteknik) VIRUSISOLATION PÅ CELLEKULTUR Da nogle af disse vira med respiratorisk tropisme er termolabile, er det vigtigt at inokulere cellekulturerne så hurtigt som muligt efter prøveindsamlingen. Nedfrys og optø testprøver i laboratoriet, så cellerne åbner sig og frigiver viruspartikler. Centrifugér i 10 minutter ved 500 g ved +2-8 C for at fjerne cellerester (2.000 omdr./min.). Inokulér den cellekultur, der skal bruges til dette formål, med den indsamlede prøve. De anvendte celler er Hep2, Hela eller KB samt diploide cellelinjer fra humane fosterfibroblaster i et MEM-medium, der indeholder 5 til 8 % serum fra kalvefostre. 107

10 Afhængigt af hvilken flaske der anvendes til cellekultur, vil volumen af inokulum- og kulturmedium variere. Hvis der anvendes Leighton-rør, skal kulturen inokuleres med 0,3 ml prøve. Lad denne kontakt finde sted i 2 timer og 30 minutter ved 37 C, og fortynd derefter til 1,2 ml med kulturmediet. Hvis der anvendes en 25 cm 3 flaske, skal du inokulere med 1 ml prøve. Inkubér ved +37 C i 2 timer og 30 minutter, og fortynd derefter til 12 ml med kulturmediet. Inkubér cellerne ved +37 C, indtil der observeres en cytopatisk effekt for virussen (ca. 4 til 6 dage). Observation af cytopatisk effekt Observér den inokulerede celle med et omvendt-faset optisk mikroskop, og følg udviklingen af den cytopatiske effekt: progressiv separation af mere eller mindre runde og lysbrydende, små celler med nogle kerneinklusioner for influenza- og parainfluenza-viraene, store runde celler, der danner aggregater for adenovirus. Hvis den cytopatiske effekt stadig ikke kan observeres efter 6 til 8 dage efter inokulering af en prøve, skal du alligevel fortsætte med farvningen. På dette tidspunkt kan der være tilstrækkelig virusformeringen til konstatering med immunfluorescens. Der kan derefter foretages endnu en overførsel på cellerne. 6- ANALYSEPROCEDURE KRÆVET MATERIALET, DER IKKE MEDFØLGER Destilleret eller helt demineraliseret vand Blegemiddel Sugende papir Engangshandsker Fosfatbuffer (PBS) ph 7,2 til IF (koncentreret 10X) - 50 ml - kode Acetone Sterile Pasteur-pipetter Automatiske eller halvautomatiske, justérbare eller forudindstillede pipetter til fordeling af 10 til 200 µl og 1 ml. Graduerede testrør med en kapacitet på 10 ml eller 25 ml Engangsrør Rør til centrifugering 108

11 Immunfluorescensplader - kode (2 brønde) eller (6 brønde) Dækstrimler Fluorescerende mikroskop Beholder til biologisk farligt affald REKONSTITUERING OG OPBEVARING AF REAGENSER R3: Fortynd indholdet af flasken med 9 ml fosfatbuffer for at få en brugsklar opløsningsfortynding. Efter fortynding er anti-igg-konjugat fra mus holdbart i 3 måneder, hvis det opbevares ved +2-8 C og ikke udsættes for mikrobiel kontaminering PROCEDURE CELLEAPPLIKATION OG -BINDING Direkte undersøgelse på prøven - Fordel 20 µl af den behandlede prøve (cellecentrifugeringsrester) på en pladebrønd. - Lufttør pladerne med et tørreapparat eller ved stuetemperatur (18-30 C). - Fiksér i et acetonebad ved -20 C i 5 minutter. - Lad pladerne lufttørre. Cellekultur på plade - Vask pladen to gange i 1 minut i et PBS-bad. - Lad pladen lufttørre. - Fiksér i et acetonebad ved -20 C i 5 minutter. Cellekultur i flasker - Fjern mediet. Indsaml cellerne ved at skrabe 1 ml PBS ind. - Opløs cellerne ved at opsuge og udtømme ved hjælp af en konisk pipette flere gange. - Fortsæt derefter med celleapplikation og -binding som ved direkte undersøgelse på prøven ANTISTOFAPPLIKATION 1. Forbered den nødvendige volumen fosfatbuffer (PBS) til afvaskning ved at fortynde den koncentrerede opløsning i forholdet 1:10 i sterilt, destilleret vand. 2. Forbered konjugat R3 (se kapitel 6.2) 109

12 3. Fordel en dråbe af de specifikke, monoklonale R1-antistoffer (R1a og R1b for influenza A og B) i de første brønde (første og anden brønd for influenza A og B), mens du sikrer dig, at hele cirkeloverfladen er dækket. 4. Fordel en dråbe negativ kontrol (R2) i den efterfølgende brønd. 5. Inkubér pladen i 30 minutter ved +37 C i en fugtig inkubator. 6. Når inkubationstiden er udløbet, skal du vaske pladen forsigtigt med PBS ved hjælp af en vaskeflaske. 7. Vask to gange i 2 til 5 minutter med PBS. Ryst forsigtigt. 8. Lad pladen lufttørre. 9. Ryst forsigtigt det fortyndede konjugat (R3). Fordel en dråbe af det fortyndede konjugat (R3) i hver brønd. 10.Inkubér i 30 minutter ved 37 C i et fugtkammer. 11.Efter inkubationen skal du vaske pladen forsigtigt med PBS ved hjælp af en vaskeflaske. 12.Vask to gange i 2 til 5 minutter med PBS. Ryst forsigtigt. 13.Dyp pladen (få sekunder) i destilleret vand. 14.Lad pladen lufttørre. 15.Montér med dækstrimmel ved hjælp af det bufferede glycerol (R4). Kontrollér, at der ikke er luftbobler på pladen. Forsegl pladen med lakken. 7- FORTOLKNING AF RESULTATERNE KVALITETSKONTROL Farv en referenceplade samtidigt med positive og negative celler AFLÆSNING OG FORTOLKNING AF RESULTATERNE Undersøg pladerne med et fluorescerende mikroskop ved en forstørrelse på X100 og X400: Aflæsning af brønd med negativ kontrol: der blev ikke observeret nogen fluorescerende celler efter undersøgelse af hele brønden. Positiv reaktion: intra-cytoplasmisk, granulær fluorescens blandt andre rødlige celler. Der blev observeret mindst én karakteristisk fluorescerende celle. Negativ reaktion: der blev ikke observeret nogen fluorescerende celler efter undersøgelse af alle brøndene. 110

13 Bemærk: Aflæs pladerne straks for at opnå bedre resultater. Pladerne kan dog opbevares ved +2-8 C i mørke i 24 timer. 8- BEGRÆNSNINGER FOR TESTEN Diagnosticering af en nylig infektion kan kun fastlægges på baggrund af en kombination af kliniske observationer og serologiske data. Resultatet af en enkelt test udgør ikke tilstrækkeligt bevis til en diagnosticering af en nylig infektion. 9- KVALITETSKONTROL AF TESTEN Ydeevnen for MONOFLUO TM KIT-sættene kontrolleres ved hjælp af plader dækket med positive og negative kontroller. De testes med monoklonale antistoffer, der er specifikke for hver virus, samt med negativ supernatant. Resultaterne er som følger: med monoklonale antistoffer: tilstedeværelsen af fluorescerende celler, intensitet ++ med kultursupernatant: ingen fluorescerende celler. 10- PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL Alle producerede reagenser fremstilles i overensstemmelse med vores kvalitetssikringssystem, lige fra modtagelsen af råmaterialerne til markedsføringen af slutproduktet. Hvert parti gennemgår kvalitetskontrol og markedsføres kun, hvis det opfylder de foruddefinerede kvalitetskriterier. Dokumentation vedrørende produktion og kontrol af hvert parti opbevares inden for Bio-Rad. 111

14 11- REFERENCES 1. AYMARD M. Les orthomyxoviridés : les virus grippaux. Virologie médicale par J. MAURIN, 1985, (Edit. Flammarion, Médecine - Sciences). 2. BREESE-HALL C., GLIMAN J.M., BREESE B.B., DOUGLAS R.O. Jr. Parainfluenza viral infections in children. Correlation of shedding with clinical manifestation. J. Pediatr. 1977, 91, DENOYEL C.A., REGNIER L., ALOTH B. Anticorps monoclonaux et diagnostic des infections oculaires à Adénovirus. Biologie Prospective - Colloque, 1988, Pont à Mousson, France. 4. FREYMUTH F., QUIBRIAC M., PETITJEAN J., DAON F., BESNARD A., PIERRE C. Mise en évidence des antigènes viraux par immunofluorescence : méthode rapide de détection et d'identification des virus respiratoires. Revue Française des Laboratoires, 1985, 137, GADNER P.S., MC QUILLIN J., MC GUCKIN R., DITCHBURN R.K. Observations on clinical and immunofluorescence diagnosis of parainfluenza virus infections. Br. Med. J., 1971, 2, SINGER M., Développement d'un réactif pour le diagnostic du virus respiratoire syncitial par Immunofluorescence Directe, Mémoire C.N.A.M. en bio-inductrielle et agro-alimentaire, LENNETTE E.H, SCHMIDT N.J. Diagnostic procedures for viral, Rickettsial and Chlamydial infections. Fifth edition "American Public Health Association", LUCAS G., POTHIER P., DELAGNEAU J.F. Diagnostic rapide du Virus Respiratoire Syncytial (VRS) par immunofluorescence indirecte à l'aide d'anticorps monoclonaux. Biologie Prospective - 6ème colloque, 1985, Pont à Mousson, France. 9. MARSTON R.Q., VAUGHAN E.R. Parainfluenza 3 assay and growth in tissue culture Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1960, 104, POTHIER P., DENOYEL G.A., GHIM S., PRUDHOMME DE SAINT MAUR G., FREYMUTH F. Use of Monoclonal Antibodies for rapid detection of Influenza A virus in nasopharyngeal secretions. Eur. J. Clin. Microbiol., 1986, 5 N 3,

15 11.POTHIER P., DENOYEL G.A., PRUDHOMME DE SAINT MAUR G., DROUET E., FREYMUTH F. Rapid diagnosis of Influenza B virus infections by immunofluorescence with monoclonal antibodies in nasopharyngeal aspirates. Ann. Inst. Pasteur/Virologie, 1986, 137E, WONG D.T., WELLIVER C., RIDDLESBERGER K.R., SUN M.S., OGRA P.L. Rapid diagnosis of Parainfluenza virus infection in children. J. Clin. Microbiol., 1982, 16,

16 112

17 113

18 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /2006 Fax.: +33 (0) code: