Fysikken bag Massespektrometri (Time Of Flight) Denne note belyser kort fysikken bag Time Of Flight-massespektrometeret, og desorptionsmetoden til frembringelsen af ioner fra vævsprøver som er indlejret i en såkaldt matrix. Teknikken er egentlig meget simpel og ganske godt illustreret på animationen shell 4-5. Vævsprøven, som man vil undersøge, blandes med en matrix (latin: stammoder), som kan opfattes som et slags hjælpemateriale. Blandingen af matrix- og vævsmateriale lægges i samples på en glasplade (se figur 1a) Figur1a figur 1b figur 1c (kilde: Flere til science, shell 4-5) Matrixmaterialer skal have følgende egenskaber: De skal være holdbare, så længe de er opblandet med vævsprøven, men alligevel nemme og få til at fordampe og ionisere ved koncentreret energitilførsel eksempelvis fra en laser (se figur 1b). Det fordampede og ioniserede matrixmateriale leverer efterfølgende protoner til det ligeledes fordampede vævsmateriale. Det ioniserede vævsmateriale kan accelereres op og analyseres i massespektroskopet. (se figur 1c) Fordampnings-/eroderingsprocessen af materialet betegnes desorption. Matrixmaterialer med de ønskede egenskaber består typisk af store molekyler, men har en forholdsvis lav molekylvægt. Materialerne absorberer laserenergi i det infrarøde og ultraviolette område af spektret. En typisk anvendt laser er Nitrogenlaser med en bølgelængde på 337 nm (se indsat annonce figur 2). Som det fremgår af annoncen udsender laseren lyset i form af korte pulser med en varighed på 3,5 ns (1 ns = 10-9 s). Energien i den enkelte lyspuls er 170 μj (1 μj = 10-6 J). Energien i den enkelte lyspuls er lille, men da varigheden af den er meget kort bliver spidseffekten stor. Figur2 Opgave: Vis at spidseffekten og middeleffekten som beskrevet i annoncen for laseren er henholdsvis 45 kw og 3 mw. Akronymet (forkortelsen) MALDI-TOF står for Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight. 1
Massespektroskopi Endelsen skopi, stammer fra græsk og betyder se/betragte og bruges om det at se noget ved hjælp af synet (Gyldensdals åbne encyklopædi). For eksempel kaldes kikkertundersøgelse af mavesækken for gastroskopi; undersøgelse af noget småt for mikroskopi, undersøgelse af lys fra stofmaterialer spektroskopi og undersøgelse af molekylers masse massespektroskopi. Det anvendte apparat i massespektroskopi kaldes et massespektrometer, hvis opbygning og virkemåde vi nu skal se nærmere på. Massespektrometer (Time Of Flight) Skematisk kan man repræsentere spektrometeret som bestående af 4 hovedbestanddele. 1) ionisationsområdet 2) accelerationsområde 3) flyvetidsområde(masseanalysen) 4) iondetektorområdet. På figur 3 er vist en principskitse af et lineært time-of-flight-massespektrometer. Figur 3 1) Ionisationsområdet Ionisationen af vævsprøven er beskrevet ovenfor under beskrivelsen af matrix. 2
2) Accelerationsområdet. En spændingsforskel U bevirker at der dannes et elektrisk felt mellem pladerne. Feltets retning er fra den positivt ladede plade mod den negativt ladede plade. En ioniseret partikel med ladning Q vil blive påvirket af en elektrisk kraft F el =Q E, der vil accelerere ionen (se figur 4) Styrken af det elektriske felt E afhænger af spændingsforskellen U og afstanden d mellem pladerne. Jo større spændingsforskellen er og jo mindre afstanden mellem pladerne er, desto større bliver den elektriske feltstyrke. Den fysiske sammenhæng er Af formlen ses, at enheden for feltstyrken er Figur 4a Figur 4b En ladet partikel, der befinder sig i et elektrisk felt mellem to plader vil besidde en elektrisk potentiel energi E pot-el. For at få en forståelse af hvad denne energi afhænger af, vil vi lave en analogi til den potentielle energi i tyngdefeltet (se figur 4b). En partikels potentielle energi i tyngdefeltet nær jordoverfladen afhænger af to fysiske størrelser. Partiklens masse m og højden h over et valgt nulniveau for energien (jordoverflade, gulv etc). E pot-tyngde = m g h, g er tyngdeaccelerationen, og er et mål for styrken af tyngdefeltet. I Danmark er den 9,82 N/kg. 3
I den elektriske verden kan vi på samme måde argumentere: Den elektriske potentielle energi afhænger af partiklens ladning Q, den elektriske feltstyrke E og afstanden d fra et valgt nulniveau for elektrisk potentiel energi. Den elektriske potentielle energi for en metalplade der er elektrisk forbundet med jorden er 0. (man siger at pladen er elektrisk jordet ) Formlen for elektrisk potentiel energi: Produktet E d er lig med spændingsforskellen U mellem pladerne(ofte 2-20kV). Den elektriske potentielle energi kan derfor skrives Konklusion: For et givet spændingsfald vil molekylernes elektrisk potentielle energi afhænge af deres ladning. Molekyler med samme ladning vil have samme elektrisk potentiel energi (uanset deres masse!). Molekyler med stor ladning vil have større elektrisk potentiel energi end molekyler med lille ladning. Oversigt over analoge fysiske størrelser i tyngdefeltet og det elektriske felt er indsat i nedenstående skema. Tyngdefelt Masse m Feltstyrke g Feltkraften F t = m g Højde h over nulniveau for E pot-tyngde Elektrisk felt Ladning Q Feltstyrke E Feltkraften F el =Q E Afstand d fra nulniveau E pot-el Energibetragtninger For makroskopiske partiklers bevægelse i et tyngdefelt har luftmodstanden som regel en vis betydning. Men hvis gnidning og luftmodstanden er lille, vil man ofte kunne se bort fra dem. I disse situationer viser det sig, at summen af partiklens potentielle- og kinetiske energi er konstant. Dette gælder også for ladede partiklers bevægelse i et elektrisk felt (se figur 5). E pot-el + E kin = konstant (1) Ved hjælp af (1) kan vi beregne farten af den ladede partikel når den har gennemløbet strækningen d mellem pladerne med spændingsforskellen U I begyndelsessituationen er E kin 1 = 0 og i slutsituationen er E pot-el 2 = med 0. Vi får da. E pot-el 1 = E kin2, (2) figur 5 Hvor m er massen af et ionfragment dannet i ionisationsområdet. Laserpulserne danner ioniserede fragmenter af prøven med mange forskellige masser. 4
Masserne måles i atomare enheder u (1u = 1,66 10-27 kg). I spektroskopisk litteratur kaldes 1u også for 1Da (Dalton). TOF-massespektrometeret kan detektere ionmasser på op til ca. 30000u. Opgave: Isoler farten af ligningen (2) og vis v (3) Alle de dannede ioner har ladninger, der udgør et helt tal z gange elementarladningen e., hvor z = 1, 2, 3, (4) Opgave: Vis vha (3) og (4) at farten af ionerne kan skrives: (5) Resultatet af ovenstående betyder, at farten af ionerne - for et given spændingsforskel - kun afhænger af forholdet mellem massen m og antallet af ladninger z. Partikler med stor masse bevæger sig derfor langsommere end partikler med lille masse forudsat de har samme ladning. Det er dette faktum som udnyttes i tidsmåleområdet med længden L. Her måles flyvetiden for de forskellige ioner inden disse rammer iondektektoren, hvor størrelsen af ladningen detekteres. I tidsmåleområdet er der ikke noget elektrisk felt og ikke nogen elektrisk kraftpåvirkning på ladningerne, som derfor bevæger sig med konstant fart i dette område. Sammenhængen mellem strækning L, fart v og flyvetid t er L = v t (6) Opgave: Løs ligningen (6) med hensyn til t og indsæt udtrykket for v fra (5). Vis at flyvetiden er Konklusion: Ioner med lille vil nå detektoren først, ioner med stor vil ankomme sidst. Spektrometeret er altså i stand til separere fragmenter af prøven efter ved at måle flyvetiden. Ved at plotte den relative forekomst (relative intensitet) af ioner som funktion af deres massespektrum. fås et (kilde: Flere til science, shell 4-5) 5