Protein foldning Chaperone egenskaber af Hsp26 og Hsp42 fra Saccharomyces cerevisiae
Abstract Proteiner har længe fascineret forskere indenfor de biokemiske og molekylære grene af videnskaben. Igennem de sidste mange år har vi opbygget en viden om dem og specielt om den måde de folder på, hvilket er helt essentielt for deres funktion. Vi har stille opbygget et arsenal af teknikker og metoder vi kan karakterisere foldning ved hjælp af. Nogle gange går det dog galt for proteinerne og de folder forkert eller folder slet ikke. I disse tilfælde har vi i de seneste år fået en forståelse for hjælpeproteinerne der er til stede i cytosolen; chaperonerne. Dette essay illustrerer brugen af disse teknikker til at undersøge chaperoner egenskaberne og foldningen for to proteiner i Saccharomyces cerevisiae. Med det kan vi udvide vores forståelse af disse proteiner. Måske en dag i fremtiden kan vi udnytte dem i selv-samlende systemer. 2
Generel introduktion Det er absolut essentielt for proteiner at de er foldet korrekt. Et misfoldet protein kan give ophav til alvorlige konsekvenser, som eksempler er Alzheimers- og Parkinson syge en konsekvens af misfoldet proteinstruktur. Foldning involverer ofte først en dannelse af regulære sekundære strukturere, specielt alpha-helixer og beta-sheets og derfra tertiær struktur. De regulære sekundære strukturer folder hurtigt, pga. stabiliseringen fra intramolekylære hydrogen-bindinger. Under visse omstændigheder kan det ske at proteiner ikke foldes til deres form hvor de biokemisk har en funktion. Påvirkninger som stress, temperatur, saltkoncentration, ph og mange flere kan have indvirken på at proteiner forbliver udfoldet. Celler beskytter nogle gange deres proteiner fra denaturende påvirkning, ved hjælp af enzymer kaldet chaperoner eller heat shock proteiner. Chaperoner er proteiner som behjælper den ikke-kovalente foldning eller udfoldning af makromolekylære strukturer. Nogle celler folder aldrig uden hjælp fra chaperoner, som enten isolerer individuelle proteiner så de ikke interagerer med andre proteiner, eller ved at udfolde et misfoldet protein, så det får en chance for at folde sig korrekt. 1 Det er dog en generel misforståelse at chaperoner direkte folder proteiner. En funktion er at chaperoner modvirker aggregering af nysyntiserede peptidkæder og at allerede foldede subunits ikke danner ikke-funktionelle strukturer. 2 Mange proteiner folder spontant og uden indvirken fra chaperonerne in vivo, dog kan andre reaktioner nedsætte effektiviteten på foldning, som for eksempel aggregering (Figur 1), der kan promoveres af hydrofobe overflader. Figur 1 Reaktionsskema der viser den reversible vej fra Udfoldet(U) til Intermediat(I) og til sidst til Nativ(N). Udfoldede proteiner og deres intermediater kan under foldning danne aggregater som chaperoner proteiner skulle behjælpe imod. 3
Specielt er der en familie blandt disse chaperoner der kaldes small heat shock proteins og denne familie vil dette essay fokusere på. Stadig den dag i dag er det et område med stor udvikling (en stor del reviews findes på området så sent som fra 2007). Dette essay vil fokusere på undersøgelsen af Hsp26 og Hsp42. De er begge medlemmer af førnævnte familie hvis funktion ikke er helt klarlagt, men som stærkt formodes at have en indvirken i chaperoners generelle effektivitet. Introduktion til under-emne Heat shock proteiner Heat shock proteiner (Hsp) kaldes også stress proteiner. Det er en gruppe af proteiner som findes i alle levende celler, både i mennesker, Escheria coli og flere. Under påvirkning af cellerne af ydre kræfter så som varme eller kulde, oxygen- og glykosemangel, sker der en inducering i ekspressionen af disse proteiner og der udtrykkes et større fold af proteinerne. Hsper er dog også tilstede under normale omstændigheder i celler hvor de fungerer som chaperoner. De regnes også for at have en rolle i immunforsvaret ved at præsentere proteiner (eller peptider) på overfladen af en celle så immunforsvaret kan genkende syge celler. 3 Nogle eksempler på de bedst undersøgte Hsper er Hsp60 og Hsp70. Hsp60 er bedre kendt som GroEL/GroES komplexet som kan findes i E.coli. GroEL er en dobbelt-ringet tetradecamer hvor hver ring består af 7 subunits. Inde i ringen er der hydrofobt og regnes for det sted hvor proteinfoldningen finder sted. Den kaldes Hsp60 da hver subunit vejer ~60 kda og GroES vejer ~10 kda, hvilket gør at den har fået navnet Hsp10. Det er denne model der har lagt basis for forståelsen af chaperoneproteiner. GroEL binder ATP og gør at GroES binder sig, dette underkaster komplekset til en enorm konformationsændring 4
og resultatet er en patron-lignende struktur. Den chaperon-assisterede katalyse sker i flere omgange ved at ATP binder og der hydroliseres. 4 GroEL/GroES kan ikke direkte adskille proteiner der allerede er aggregeret, men det konkurrerer i pathwayen mod misfoldning og aggregering. 5 Hvor Hsp60 er et stort protein (samlet set ~1 Mda) er Hsp70 et lille protein (~70 kda). Bedre kendt som DnaK fra E.coli. Hsp40 er et hjælpeprotein til Hsp70, der øger aktiviteten ved at øge hastigheden af ATP optagelse. Der er på nuværende tidspunkt ikke en præcis forklaring på, hvordan mekanismen er. Dog ser man at Hsp70, som er bundet til ADP, har en høj affinitet til ufoldede proteiner i forhold til når Hsp70 er bundet til ATP. Det tænkes dog at Hsp70 molekyler pakker omkring et ufoldet protein indtil proteinet er foldet, hvorpå Hsp70 mister sin affinitet for det specifikke protein. Hsp70 diffunderer derefter væk. 6 Alle små Hsper (shsp) deler et α-crystallin domæne på ca. 80-100 aminosyrer, placeret ved C terminalen. N-terminalen varierer derfor i sekvens og længde alt efter, hvilket protein man ser på. 3 I gærcellen Saccharomyces cerevisiae findes der to shsper; Hsp26 og Hsp42. Begge proteiner ekspresseres i betydelig større mængde under stress. Gærceller hvor en af disse proteiner er blevet fjernet, viser dog ingen åbenlyse tegn på at termointolerans, dog sker der en aggregering af proteiner. 7 Hsp104, Hsp70 og Hsp40 er tre eksempler på disaggregerende proteiner i S. cerevisia. Hsp26 og Hsp42 regnes for at medvirke i denne mekanisme, men deres rolle i protein homeostase er endnu ikke løst. Dette essay vil kaste lys over disse to proteiner. 5
Projekt forslag Udtrykning og oprensning Både Hsp42 og Hsp26 amplificeres via gær-dna ved hjælp af PCR. For det bedste resultat skal en proteaseudtømtstreng bruges, da proteaserne tilstede i S. cerevisiae kan nedbryde det oprensede protein. 8 Cellerne inkuberes i medium til mid-log fasen, dette analyseres ved at måle A 600 indtil denne værdi er 0.6. Både før og efter de har fået lov til at inkubere, udtages prøver til senere analyse. De lyserede celler centrifugeres og først grovskilles membraner og andre store dele af cellen fra ved hjælp af filtre og centrifugering. Prøver udtages mellem hvert skridt. Ved hjælp af søjlekromatografi og en gradienteluering adskilles proteiner. De forskellige fraktioner undersøges ved hjælp af SDS-PAGE mod en markør omkring 26 kda og 42 kda, samt de udtagne prøver. Western blotting med anti-stoffer for Hsp26 og Hsp42 udføres for at se om vi har Hsp26 og Hsp42. Eller om det er stoffer med ækvivalente molvægte. Struktur Da strukturen af Hsp42 ikke eksisterer i Protein Data Banken, kunne det være en interessant ting at finde ud af. Ved hjælp af 2D Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spektroskopi får man stor indsigt i strukturen i det karakteristiske diagonale plot. Ved hjælp af en radiopuls, som vælter det nukleare spin med 90, startes et tidsrum og efter det tidsrum (t1) sendes en ny puls afsted og der foretages endnu en tidsmåling. En computer samler spektret som funktion af t1, de tidsafhængige signaler fourier transformeres til et 2D spektrum. Dog vil dette projekt fokusere på foldning. Strukturbestemmelse ville derfor kun være et sekundært mål hvis tiden viser sig at være der. Cirkular Dichroism (CD) spektroskopi Jeg vil undersøge både hvordan Hsp26 og Hsp42 selv folder, desuden også hvordan de hjælper andre proteiner med at folde. Til at se hvordan de selv folder vil jeg bruge CD. Specifikt vil jeg undersøge hvordan proteinernes sekundære struktur ændres, både som funktion af temperatur og som funktion af 6
denaturant (f.eks. Guadinium-HCl eller Urinstof). Dette vil give en indsigt i de termodynamiske data for proteinet (f.eks. entalpien og den frie energi af denaturationen). CD vælges pga. det har stor fleksibilitet, det kan bruges til at måle let og hurtigt over en stor mængde af betingelser; variende temperatur, ph og tilstedeværelsen af diverse co-faktorer. Ved hjælp af far-uv spectrum kan man måle vigtige karakteristika for den sekundære struktur. Disse spektra kan direkte bruges til at måle, hvor stor en brøkdel af proteinet der er i en bestemt konformation. CD giver ganske vist en mindre indsigtsfuld analyse af strukturen, i forhold til krystallografi og NMR spektroskopi, men har store fordele grundet metoder nævnt ovenover. Nuclear magnetic resonans For at undersøge om Hsp26 og Hsp42 har chaperone egenskaber vil jeg starte med at se på opbygningen af dem. Som tidligere nævnt deler Hsper et α-crystallin domæne og ved hjælp af NMR vil jeg se om Hsp26 og Hsp42 ligeledes har dette domæne. NMR teknikken jeg vil bruge baseres på et spektra, hvor man ser på afvigelser i de kemiske skift for 13 C α og 13 CO. De giver information om den sekundære struktur, som let kan udledes fra de fremkomne resultater, om C-terminalen har den samme konformation som α-crystallin. 9 Denne teknik bruges da, der ikke opnås større opløsning og det er det førende redskab, hvis man skal undersøge på atomart niveau. Chaperone egenskaber For at teste om mine proteiner har chaperone egenskaber, vil jeg underkaste dem et aggregat som proteinerne skulle udredde. Das og Surewicz viste at β-kæden fra insulin aggregerer når disulfid-bindingerne mellem α- og β-kæden blev reduceret, f.eks. ved hjælp af Dithiothreitol (DTT). 10 7
I en inkuberet opløsning der indeholder Insulin og DTT kan man måle absorbansen under øget tilsætning af protein. Udførslen skulle ske under variende temperatur og med pludselige shock opvarmninger. Aggregater der må absorbere mere, udreddes og foldes korrekt hvilket kan undersøges ved almene NMR teknikker. Dette forsøg kunne videreudvikles for at indlemme site-directed mutagenesis, for at se om mutanter ville være bedre eller dårligere til at udredde aggregater. Yderligere kunne det også grænses ud til in vivo forsøg, hvor man ser på de proteiner der ekspreseres i cytosolen. Disse kan også danne aggregater. Man kan få en fornemmelse over vigtigheden af Hsp26 og Hsp42, ved at deletere en af dem i gærcellen og måle om der dannes flere aggregater. I et andet forsøg kunne begge deleteres. Begge dele ville give en god indsigt i de egenskaber proteinerne har in vivo. Perspektivering Målet med dette forsøg er at kaste lys på Hsp26 og Hsp42. Jeg føler mig overbevist om, at efter denne serie forsøg, vil man have en bedre forståelse for, hvordan proteinerne virker og måske have løst en struktur til pdb.org. Hvis dette forsøg er succesfuldt vil man have opnået større forståelse for gruppen af proteiner kaldet chaperoner, et område der mangler en del forståelse på. Grundforskning har også sin ret, måske er der en gruppe, der kan bygge videre på resultaterne. De næste mange skridt ville være at foretage yderligere forsøg for, at kortlægge chaperoneproteiner helt så man kunne kontrollere dem. Man kunne forestille sig, at de ville blive nyttige i selvsamling af f.eks. nanosystemer eller overflader behandlet med proteiner. 8
Anerkendelser Sisse Poulsen og Kirstine Steffensen for korrekturlæsning. Alle PS A + C studerende tilskrevet essay nr. 6 for gruppemøde, udveksling af ideer, generel god indflydelse og opbakning. Referencer [1] Shortle D. (1996) The denatured state (the other half of the folding equation) and its role in protein stability FASEB J. 10(1): 27-34 [2] Ellis R. J. og van der Vies S. M. (1991) Molecular chaperones Annu. Rev. Biochem. 60:321-347 [3] Lindquist S, Craig EA (1988) The heat-shock proteins Annual review of genetics 22: 631-677 [4] Chen S. et al. (1994) Location of a folding protein and shape changes in GroEL-GroES complexes imaged by cryoelectron microscopy Nature 371:261-264 [5] Fenton, WA and Horwich, AL (2003) "Chaperonin-mediated protein folding: fate of substrate polypeptide." Q Rev Biophys 36(2): 229-256 [6] Mayer, MP and Bukau, (2005) "Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism." B Cell Mol Life Sci. 62: 670-684 [7] Haslbeck, M., Braun, N., Stromer, T., Richter, B., Model, N., Weinkauf, S., og Buchner, J. (2004) EMBO J. 23, 638 649 [8] Jones EW (1991) Tackling the protease problem in S. cerevisiae Methods Enzymol 194: 428 453 [9] Schwarzinger, S., Kroon, GJA, Foss, TR, Chung, J., Wright, PE, og Dyson, HJ (2001) Sequence dependent correction of random coil NMR chemical shifts J. Am. Chem. Soc. 123, 2970 2978 [10] Das,KP og Surewicz,WK (1995) Temperature-induced exposure of hydrophobic surfaces and its effect on the chaperone activity of α-crystallin FEBS Lett., 369, 321 325. 9