NMR-titrering NMR bruges i titreringssammenhæng sjældent til kvantitativ analyse, men derimod ofte til at bestemme syrestyrkekonstanter og chemical shift. Syrekonstanterne kan anvendes ved fortolkning af strukturer eller inden for protein NMR-spektroskopien Af Claus Cornett, Danmarks Farmaceutiske Universitet Titrering er et centralt begreb inden for kemien, og forstår man det ikke, er det meget svært at komme videre. Mange kemikere er desuden afhængige af en eller anden form for titrering for at kunne tjene deres brød. Et centralt begreb inden for den klassiske titrering er brug af en indikator, der, f.eks. vha. farvereaktion, fortæller, når titreringen er afsluttet. Også elektrokemiske og spektroskopiske titreringer er meget anvendte. I titreringssammenhænge bruges NMR sjældent til kvantitativ analyse, men derimod til at bestemme syrestyrkekonstanter. De kan bruges ved fortolkning af strukturer eller inden for protein NMR-spektroskopien ved tilordning af sure eller basiske grupper som histidinrester i proteiner. NMR kan imidlertid også bruges til at bestemme, hvilke sure eller basiske grupper der protoneres eller deprotoneres og i hvilken rækkefølge. En titreringsanalyse kan, hvis man har tid nok, foretages ved relativt lav koncentration. Man skal blot have en NMR-aktiv isotop inden for rimelig afstand af den sure eller basiske gruppe, så man kan måle chemical shift som funktion af ph. Oftest bruges 1 H, 13 C og 31 P, men også 19 F er anvendelig (og findes i mange lægemidler). 13 C og 31 P har den fordel, at de sjældent udviser koblinger, men de har hver for sig nogle ulemper. 13 C findes i mange relevante molekyler, men udviser en væsentligt dårligere følsomhed end f.eks. 31 P eller 1 H. 31 P findes ikke i nær så mange molekyler, men er særdeles interessant f.eks. i forbindelse med noninvasiv måling af intracellulær ph. I de fleste molekyler, hvor man kunne finde på at anvende 1 H, udviser protonsignalerne kobling. Forenklet analyse med moderne software Med moderne software, som f.eks. gnmr, er analysen blevet væsentligt simplere. Dvs. det er praktisk muligt at bruge samt- Figur 1. A. CH 2 -grupperne i taurin ved sur ph. ph 5,5. B. CH 2 -grupperne i taurin ved basisk ph. Ved omhyggelig justering af ph kan man få signalet fra CH 2 -grupperne til at fremstå som singlet. ph 10,8. 35
1, 2 n = 1 δ1 j,..., ) og håndtere statistikken, så man kan få nogle rimelige konfidensintervaller på de fittede parametre. Kan man klare sig uden statistikken, kan man lave denne slags fit relativt enkelt i de fleste regneark udstyret med en optimeringsfunktion. lige»titrerende«protonsignaler fra et molekyle til bestemmelse af f.eks. en eller flere pk-værdier. Vanskeligheden er efterhånden reduceret til det rent fysiske arbejde med at måle spektrene, finde noget statistisk software, der kan håndtere fitning af vektorfunk- 0 tioner ( ( δ δ,.. δ ) f( δ,...,,..., pk ph) Hvorfor er NMR velegnet til titreringer? Men hvorfor er NMR unik inden for spektroskopiske titreringer? Hvis man ser på en simpel syre-baseligevægt: AH + A + H + Vil man f.eks. i UV se forskellige signaler for AH + og A, mens man i NMR normalt ser et vægtet middel af de to signaler. Det gør NMR-spektrene simplere, idet der normalt kun er ét samlet signal fra et stofs forskellige species. Kender man pk A samt chemical shift for hhv. AH + og A, kan man beregne ph. Omvendt kan man ved at måle en serie spektre ved forskellige phværdier bestemme pk A samt chemical shift for de enkelte species. Samtidig fortæller det os, at NMR-spektre af samme molekyle kan se vidt forskellige ud ved forskellige ph-værdier. Se f.eks. figur 1 (side 35), hvor spektret af taurin er vist ved hhv. let sur og basisk ph. I praksis vil man ofte kunne beskrive chemical shift af et signal som funktion af ph efter følgende formel: for et stof med én sur gruppe. Ved ph < ca. pk A - 2 observeres signalet ved δ sur, ved ph > ca. pk A + 2 observeres signalet ved δ sur + δ. Er der flere sure grupper i et stof, kan man anvende en overlejring af flere udtryk i stil med ligning 1, der så kommer til at se sådan ud: (1) Ligning 3s geometriske forhold illustreret. ρ er den partielle ladning på et atom i afstanden R fra den observerede proton. Θ er vinklen mellem afstandsvektoren fra ρ til protonen og bindingen mellem (i dette tilfælde) carbonatomet og hydrogenatomet. Figur 2. Forklaring til ligning 3. ning 1 til de eksperimentelle data blev foretaget ved hjælp af curve fitting toolbox til Matlab. Afstandsafhængigheden af ρ kan udnyttes i forbindelse med strukturelle studier. For at illustrere dette vises nogle resultater fra en titrering af peptidhormonet LHRH, jeg foretog i forbindelse med mit specialestudium (så det er altså halvgamle data, målt på en Bruker HX 270 på Kemisk Lab V, Københavns Universitet [2]). LHRH har sekvensen pglu-his-trp-ser-tyr- Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH 2. I denne sammenhæng er det umid- Boks 1 Billedlig forklaring af ligning 3 Et af de væsentlige bidrag til chemical shift af en proton er det diamagnetiske bidrag fra elektronskyen omkring den (se f.eks. H.Günther, NMR-spektroskopie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1973, ISBN 3 13 487501 2), der kan anskueliggøres på følgende vis. Hvis man opfatter et H-atom, som en positiv kerne, der er indesluttet i en elektronsky, figur x1, vil der, hvis man placerer H-atomet i et magnetfelt, induceres en kredsstrøm, figur x2, der genererer et magnetfelt, der søger at modvirke ændringen (dvs. det at man har pålagt et magnetfelt), figur x3. (2) hvor N er antallet sure grupper. Da δ i er proportional med bl.a. afstanden til den sure gruppe, kan man ved en NMR-titrering bestemme ioniseringsgraden af de enkelte sure grupper og dermed de mikroskopiske syrestyrkekonstanter. Der eksisterer nogen teori for ladningers indflydelse på chemical shift for 1 H, men jeg har endnu ikke fundet en klar fremstilling, der direkte omhandler syrebaseligevægte. Følgende ligning er udledt af Schweizer et al. [1] for at kunne tilordne proton chemical shift af puriner, men skulle ifølge forfatterne beskrive effekten af en punktladning, i en given afstand og retning, på en protons chemical shift: σ er ændringen i skærmning af en proton som følge af en ladningsændring ρ ι i en given afstand, R i, og vinkel ift. bindingen til protonen (figur 2). En mere intuitiv forklaring kan ses i boks 1. I figur 3 ses resultatet af en titrering af myresyre. Fit af lig- (3) Figur x1 Proton med symmetrisk elektronsky. Figur x2 Hydrogenatomet anbringes i et magnetfelt og der induceres en kredsstrøm. Figur x3 Kredsstrømmen genererer et magnetfelt rette modsat det påtrykte. Protonen vil derfor opleve et reduceret magnetfelt, B lokal = B 0 (1 σ), hvor σ kaldes skærmningen og er af størrelsesordenen 10-6. Protonen observeres ved en frekvens, givet ved ligning I, der måles i forhold til en kendt standard og omregnes til ppm, så man slipper for 10-6 faktoren (ligning II): (I) 36
General model: goodness1 = fittedmodel1(x) = sse: 8.1836e-005 delta_acid+ddelta/(1+10^(pka-x)) rsquare: 0.9991 Coefficients (with 95% confidence bounds): dfe: 8 Ddelta = 0.2156 (0.2101, 0.2211) adjrsquare: 0.9989 delta_acid = 8.184 (8.179, 8.188) rmse: 0.0032 pka = 4.778 (4.726, 4.831) Figur 3. Chemical shift af formylprotonen i myresyre som funktion af ph, fittet til ligning 3. delbart histidinresten, hvis sidekæde forventes at have en pk A på ca. 6.7, og tyrosinresten, der forventes at have en pk A på ca 9, der er interessante. I figur 4 (side 38) ses analogt med figur 3 signalet fra histidin C(2)H, idet histidin-sidekæden primært protoneres på N(3) (N(5)H, der er den dominerende tautomere [3]). Som man kan se, er de eksperimentelle resultater for histidin C(2)H protonen i LHRH ikke af helt så god kvalitet som for formylprotonen i myresyre. Den bestemte pk A -værdi tillader dog, at man kan konkludere, at der ikke er evidens for, at histidinresten er hydrogenbundet via N(3) eller N(5)H, hvilket ville forventes at føre til en ændring af pk A -værdien. Hvis der havde været tale om et protein, ville man have konkluderet, at histidinresten er tilgængelig for solventet og ikke så dybt begravet i strukturen, at den først bliver tilgængelig for solventet ved sur eller basisk ph, når proteinet denaturerer/ændrer foldning. Titreringens kvalitet er i dette tilfælde bestemt af lav koncentration (dårligt signal-støjforhold) og tætliggende signaler. Som man kan se på ligning 3 og figur 2, aftager effekten af en ladningsændring groft sagt med kvadratet på afstanden, så man ikke vil forvente mærkbare effekter ved afstande over ca. 6-7 Å. Som man kan se i figur 5, side 38, virker ph-forløbet for tyrosinrestens sidekæde derfor umiddelbart overraskende, da man ud fra den primære struktur først ville forvente en ændring af chemical shift omkring ph 9-10. Phenolgruppen på tyrosinresten begynder da også som forventet at titrere ved ph ca. 8. Samtidig er der en mærkbar effekt i området ph 4-6, hvor histidinresten formodentlig er i nærheden af tyrosinresten, (II) hvor γ er protonens magnetogyriske forhold, σ er skærmningen for den proton, man ønsker at bestemme chemical shift for, σ 0 er skærmingen for standarden, der f.eks. kan være TMS (tetramethylsilan). Hvis hydrogenatomet indgår i en kemisk binding, f.eks. til et carbonatom, bliver elektronskyen assymetrisk, figur x4, og der bliver mulighed for interessante effekter. Figur x4 skitse af den assymetriske elektronsky svarende til en C-H binding ændret σ i ligning II til σ + σ og får så: δ ny = σ 0 (σ + σ) = σ 0 σ - σ En positiv ladning vil tiltrække elektronskyen, og en negativ ladning vil frastøde den og derved give anledning til en ændring af elektronskyens tæthed omkring protonen, der herved vil»opleve«en ændring i det lokale magnetfelt, hvilket svarer til en ændring af skærmningen og skrives som σ. Man får derved (ΙΙΙ) Figur x5 Den positive ladning trækker i elektronskyen tættere på protonens plads, σ > 0, δ bliver mindre (ligning III), man snakker om øget skærmning Figur x7 Den negative ladning skubber til elektronskyen mindre tæt på protonens plads, σ < 0, δ bliver større (ligning III), man snakker om mindsket skærmning. Figur x6 Den positive ladning trækker i elektronskyen mindre tæt på protonens plads, σ < 0, δ bliver større (ligning III), man snakker om mindsket skærmning. Figur x8 Den negative ladning skubber til elektronskyen tættere på protonens plads, σ > 0, δ bliver mindre (ligning III), man snakker om øget skærmning. Kigger vi på 4»nemme«tilfælde (x5, x6, x7, x8) ser vi en forklaring på cos(θ)leddet, det er simpelthen lettere at forskyde elektronskyen langs bindingen, og det betyder noget hvilken ende af bindingen ladningen trækker/skubber fra. Det er også klart, at afstanden mellem ladningen og elektronskyen må betyde noget. Det hele kompliceres af, at der også er induktive effekter via bindingerne, hvilket også kan ændre σ. Sammenligner man figur x5-x8 med ligning 3, kunne man få den mistanke, at ligning 3 anvender den omvendte fortegnskonvention. Et nærmere studie af Schweizer et. al s artikel ([1]) bekræfter denne nagende mistanke, dels opgiver de negative værdier for Dd for de carbonbundne protoner i purin ift. benzen, dels måler de i forhold til ekstern chloroform og vender skalaen omvendt, så man skal holde tungen lige i munden, når man læser gamle NMR-artikler fra før man blev 100% enige om skalaer og chemical shift retning. Så hvis man vil anvende ligning 3 på vore dages terminologi, skal man gange Ds med -1. 37
General model: General model: fittedmodel2(x) = fittedmodel2(x) = delta_acid+ddelta/(1+10^(pka-x)) delta_acid+ddelta/(1+10^(pka-x)) Coefficients (with 95% Coefficients (with 95% confidence bounds): confidence bounds): Ddelta = -0.9682 (-1.05, -0.8862) Ddelta = -0.9682 (-1.05, -0.8862) delta_acid = 8.407 (8.355, 8.458) delta_acid = 8.407 (8.355, 8.458) pka = 6.574 (6.409, 6.739) pka = 6.574 (6.409, 6.739) Figur 4. Chemical shift af C(2)H-protonen i histidinresten i LHRH som funktion af ph, fittet til ligning 3. men er længere væk ved ph > 6. Dette fænomen indikerer en konformationsændring af peptidet i ph-området ca. 5-6. Denne konklusion bestyrkes yderligere ved at observere forløbet af tryptophan C(4)H, der ses i figur 6. Disse konklusioner understøttes desuden af andre data samt resultater fra modelling, men det er en anden historie. Figur 5. Chemical shift af de aromatiske signaler i tyrosinresten i LHRH som funktion af ph. Røde linjer: signaler fra tyrosin C(3)H og C(5)H. Blå: signaler fra tyrosin C(2)H og C(6)H. Selv om der kun er to observerede signaler fra hvert protonpar er der ikke tale om en ægte dublet (AA BB - system), så kun signalernes position er anført. Måling af chemical shift Man måler i praksis chemical shift ift. et andet signal, der sættes til en kendt værdi. I vandig opløsning anvendes gerne DSS (dimethyl-4-silapentan-sulfonsyre) eller TSP (trimethylsilylpropansyre) som f.eks. natriumsalt, da de har en udmærket opløselighed i vand og har et signal (fra de tre methylgrupper), der i praksis ofte sættes til 0. Der er imidlertid det lille problem, at efterhånden som ph bliver lavere, begynder signalet at flytte (DSS ved ph <= ca. 2, TSP ved højere ph), så i hvert fald TSP er uegnet som standard ved titreringer, DSS kan bruges ved ph > 2. Vandsignalet flytter også ved æn- CFS - Pumper Flowtech - Lobe rotor pumper Dockweiler - Pharmarør og fittings Bardiani - Ventiler ITT - Membranventiler AFLEX - Flexible PTFE slanger AdvantaPure - Silicone slanger MBS - Varmevekslere Staitech - Rendamp udstyr 38
ANALYTISKKEMI Praktisk anvendelse af ph-afhængighed af chemical shift. En interessant og måske endda ikke helt almindelig anvendelse af chemical shift af vandsignalet i koncentreret svovlsyre kan ses på følgende adresse: http://www.processnmr.com/fox-app/alkltn.htm (testet 24/9-2003), hvor NMR anvendes til online proceskontrol. En»ny«chemical shift reference, kaldet DSA (figur Y1), er lige blevet publiceret. DSA er særligt velegnet i det sure område, men refereres til at være brugbar til ph ca. 10, uden inflydelse af temperatur på chemical shift i området 278 K 318 K. Figur 6. Chemical shift af signalerne fra C(4)H-protonen i tryptophanresten i LHRH som funktion af ph. Figur Y1. 4,4-dimethyl-4-silapentan-1-ammoniumtrifluoroacetat, DSA Kilder: http://www.spectroscopynow.com/spy/basehtml/spyh/1,,5-5-7-0-60427ezine-0-4,00.html Org. Lett. 2003, 5(19), 3511-3513 James Nowicks hjemmeside: http://www.chem.uci.edu/people/faculty/ jsnowick/ 31 P NMR-spektroskopi af celler, hvor man ønsker at bestemme intracellulære ph noninvasivt. E-mail-adresse: Claus Cornett: cc@dfuni.dk dring af ph, hvilket ofte udnyttes, hvis det ligger i vejen for andre signaler. Man kan f.eks. også benytte signalet fra formylprotonen fra myresyre som standard, idet dennes chemical shift som funktion af ph er kendt, under den forudsætning at dette signal ikke interfererer med andre signaler. En anden mistelten man skal tage i ed er metalioner, der ofte bindes til ladede grupper eller lonepair og dermed også ændrer de observerede chemical shifts. Fænomenet kendes f.eks. fra Referencer 1. M. P. Schweizer, S. I. Chan, G. K. Helmkamp & P. O. P. Ts o. J. Am. Chem. Soc., 86, (1964), 696. 2. C. Cornett. Specialerapport. Kemisk labortorium V, Københavns Universitet, 1985. 3. W. F. Reynold, I. R. Peat, M.- H. Freedman & J. Lyerla Jr. J. Am. Chem. Soc., 95, (1973), 328. 39