Mikrobiologiske processer og sundhed 1. CASE: Hjælp en landmand med sundhedsproblemer i svinebesætning En landmand, der fodrer sine grise med vådfoder, oplever døde grise og grise med diarre. Han frygter for trivslen i sin svinebestand og hermed også for sit levebrød. Dør hans grise, får han ingen indkomst, og grise der ikke trives er et dyreetisk problem. Fig. 1. DET ER NOGET VÆRRE SVINERI En landmand oplever pludselig at mange af hans svin lider af diarre. Desværre medfører dette at flere at svinene dør på grund af alvorlige tarmproblemer. Landmanden har kontaktet Aarhus Universitet i Foulum, som har bedt ham om at indsende prøver af det vådfoder, grisene bliver fodret med. Under jeres besøg i Foulum skal I hjælpe med at analysere prøverne og efterfølgende udarbejde et svar til landmanden. 2. BAGGRUND Fermentering (gæring) er en proces, hvorunder mikroorganismer frigør kemisk energi fra sukkerarter eller andre organiske molekyler under iltfri (anaerobe) eller næsten iltfri betingelser. Fermentering er en meget gammel og udbredt praksis, der bruges i produktionen af f.eks. vin, øl, brød, spegepølse, yoghurt og ost. Fermentering giver anledning til ændringer i smag, konsistens og udseende og til dannelse af f.eks. alkohol, mælkesyre eller andre stoffer med konserverende virkning. I mange dele af verden er fermenterede fødevarer de største fødekilder. F.eks. kassava i Afrika. Afrikanerne river først kassavaen, hvorefter de sætter den i blød i 24 timer. Herved fermenteres kassavaen og de cyanogene glucosider, som er giftige stoffer for mennesker, uskadeliggøres. Formålet med fermentering af disse produkter er derfor at konservere og afgifte, og derved at gøre det muligt at spise dem. Fermentering af foder til dyr har været brugt også historisk. Man talte før i tiden om at sætte foderet i støb, hvilket ganske enkelt betød, at man blandede foderet med vand og lod det stå natten over, før man gav det til dyrene. Man kan sammenligne det med surdej eller yoghurt, hvor der også sker en vækst af mælkesyrebakterier enten spontant eller ved tilsætning af en starterkultur. Når vand og foder blandes, går fermenteringen i gang (Figur 2). I den første fase (Fase 1) stiger antal af mælkesyrebakterier og gær, og koncentrationen af mælkesyre, eddikesyre og ethanol øges. ph reduceres. I Fase 1, grundet den stadigvæk høje ph og den relativt lave koncentration af mælkesyre, kan patogene bakterier vokse, f.eks. Enterobakterier, der inkluderer E. coli og Salmonella. Den lave ph og den høje koncentration af mælkesyre i Fase 2 giver vådfoderet biosafety. Dette betyder, at potentielle patogene bakterier har svært ved at vokse eller dør. Derfor, som vist i Figur 1, stiger antallet af enterobakterier i den første fase for bagefter at blive reduceret. Konklusionen er derfor, at vådfoder i den første fase af fermenteringen ikke har en god mikrobiologisk kvalitet, mens kvaliteten i den anden fase er god. 1
Fodring af grisene med fermenteret foder af god kvalitet (Fase 2) fremmer lav ph i maven samt øger koncentrationen af mælkesyre i mave og tyndtarm. Dette medfører lave niveauer af enterobakterier i hele mavetarmkanalen, der igen medvirker til at forebygge fravænningsdiarré og reducerer risikoen for Salmonella i slagtesvin. Fodring med god kvalitet fermenteret vådfoder har derfor en positiv effekt på dyrenes tarmsundhed og reducerer risikoen for infektioner med zoonotiske ( zoonose : sygdomme og infektioner, der kan overføres fra dyr til mennesker) bakterier fra svinekød. Endvidere reducerer fodring med fermenteret vådfoder brug af antibiotika i svineproduktion. Dette er med til at mindske risikoen for udvikling af antibiotikaresistente bakterier, hvilket er et stigende sundhedsproblem. Yderligere har det vist sig, at smågrise, der fodres med vådfoder, har lettere ved at tillære sig de nye spisebetingelser forbundet med fravænning fra soen, hvilket forebygger dehydrering og fald i foderoptagelse. Dette gør dyrene mere modtagelige overfor infektioner i forbindelse med fravænning. Desværre går det ud over dyrenes vækst at bruge fermenteret vådfoder, formentlig som følge af den sure smag (dyrene spiser mindre) samt nedbrydning af tilsatte aminosyrer (lysin) under fermenteringen. Fermentering af korndelen alene har dog vist sig at kunne forebygge den vækstnedsættelse, der ses ved brug af fermenteret fuldfoder. På den anden side øger fodring med fermenteret vådfoder af dårlig mikrobiologisk kvalitet risikoen for diarré og andre infektioner hos grisene. I Danmark bliver ca. 40% af slagtesvin fodret med vådfoder (som er fermenteret til en mindre eller højere grad). På verdensplan, f.eks. Holland, Canada, Frankrig og Storbritannien, er vådfodring til svin også udbredt. Figur 2. Vådfoderets egenskaber over tid ved inkubering ved 20 C. 2
3. FORMÅL MED ØVELSEN Formålet med øvelsen er at analysere vådfoderprøverne for forskellige parametre, der kan hjælpe med at finde årsagen til den høje dødelighed blandt grisene. Prøverne skal undersøges for: ph Temperatur Antal mikroorganismer: Mælkesyrebakterier, Enterobakterier, hæmolytiske Escherichia coli, Clostridium perfringens, gær og skimmelsvampe Koncentration af ethanol Koncentration af organiske syrer 4. ARBEJDSGANG UNDER BESØG I FOULUM: 1) Hver gruppe får udleveret en vådfoderprøve fra en landmand. 2) ph og temperatur måles. Spredning på agarplader: 3) Ti gram prøve afvejes i en pose, 90 ml pepton medium hældes i (fortynding 1:10) og omrystes kraftigt (stomaches) i 2 min. for at løsne bakterierne fra partiklerne.. 4) Der laves en 10 folds fortyndingsrække i rør med 9 ml pepton medium ved at overføre 1 ml suspension med en pipette (se Figur 3). 5) Der bruges fem agarplader: MRS til mælkesyrebakterier; MacConkey til enterobakterier; blodagar til hæmolytiske E. coli, MCA til gær og skimmel, og TSC til Clostridium perfringens. Pladerne påføres holdnummer og fortyndingen i bunden. 6) På MRS, MacConkey, blodplader og MCA laves pladespredning ved at overføre 0,1 ml suspension med en pipette til de selektive agarplader fra fortyndingsrørene jvf. tabel 1. 7) Dråberne spredes på agarpladerne vha. en Drigalski spatel. Spred dråben på alle medier med samme fortynding, MCA pladen som den sidste i rækken. Der bruges en ny spatel for hver fortynding. 8) Til Cl. perfringens (TSC): (se Figur 4.b) laves pladespredning ved at overføre 1ml suspension med en pipette til TSC agarplader fra fortyndingsrør jvf. tabel 1. Der hældes flydende TSC medium ovenpå og prøven blandes med mediet ved at lave cirkulære bevægelser (pour plate metode). 9) Pladerne lukkes med låg og vendes på hovedet. 10) Jvf. Tabel 1 placeres pladerne i plastikposer (aerob inkubering) eller i bøtter (jars) til anaerob inkubering. 11) Pladerne inkuberes ved stuetemperatur eller 38ºC (se Tabel 1) og kolonierne tælles på skolen. 3
Figur. 3. Procedure for at lave en fortyndingsrække. Figur. 4. Spread plate metode og pour plate metode. Tabel 1. Dyrkning af forskellige mikroorganismegrupper fra en slagtesvins gødningsprøve på selektive medier. MacConkey Blod agar MRS MCA TSC Selektivitet Enterobacteriaceae Hæmolytiske E. coli Mælkesyrebakterier Gær og skimmel svampe Clostridium perfringens Fortyndinger 10 1 til 10 6 10 1 til 10 6 10 1 til 10 6 10 1 til 10 6 10 1 til 10 6 Inkubering Iltforhold aerobt Aerobt Anaerobt aerobt Anaerobt Tid (døgn) 1 1 3 3 3 Temperatur 38 0 C 38 0 C ~20 0 C ~20 0 C ~20 0 C 4
12) Kolonier tælles på færdiglavede plader (forberedt inden) og kimtal beregnes (se beregning af kimtal nedenfor). 13) De færdiglavede plader tages med tilbage på skolen til sammenligning med egne resultater. 14) Koncentration af mælkesyre og kortkædede fedtsyrer samt ethanol i de to prøver udleveres. 15) Diskussion af resultaterne i plenum. Beregning af kimtal: Eksempel 1 (kun tælling fra én fortynding): 24 kolonier talt på in 10 4 plade cfu/g prøve = 10 (fortynding af den oprindelige prøve) x 10 (fordi vi har spredt 0.1ml) x fortynding x antal talte kolonier cfu/g = 10 x 10 x 10000 x 24 = 2.4 x 10 7 log cfu = log af værdien log cfu/g prøve = 7.38 Eksempel 2 (to tællinger fra to forskellige fortyndinger): 146 kolonier talt på en 10 3 plade og 19 kolonier talt på en 10 4 plade cfu/g prøve = 10 (fortynding af den oprindelige prøve) x 10 (fordi vi har spredt 0.1ml) x fortynding x antal af talte kolonier total antal kolonier = 146 + 19 = 165 total volumen = 10 3 +10 4 =1.1x10 3 ml antal kolonier per ml i gennemsnit = 165/(1.1x10 3 )= 150x10 3 /ml cfu/g prøve=10 x 10 x 1000 x 150 =1.5 x 10 7 log cfu/g prøve = 7.18 Morfologi under mikroskopet: 16) Der påføres en dråbe vand på et objektglas. 17) Èn koloni fra hver af de færdiglavede plader berøres med et øjenål og overføres til et objektglas. 18) Morfologi undersøges i mikroskopet (Se Figur 5). 5
Figur 5. Typisk morfologi af forskellige mikroorganismer. 5. TILBAGE PÅ SKOLEN: 1) Egne plader tages med hjem til tælling (se beregning af kimtal ovenfor). 2) Hver gruppe skal skrive et brev til landmanden med resultaterne samt kommentarer om kvaliteten af prøverne og resultaternes betydning for dyrenes sundhed. Som hjælp til dette henvises til http://vsp.lf.dk/viden/foder/opslagstavlen/mikrobiologiske%20analyser_vaadfoder.aspx, hvor normalværdi for ph og normalindhold af mikroorganismer, organiske syrer samt ethanol i vådfoder er vist. Brevet afleveres til læreren, som sender det videre. 6