En præliminær kortlægning af steroidøstrogenudledningen fra danske rensningsanlæg De seneste år har der været stigende opmærksomhed om de danske rensningsanlæg og deres effektivitet til at fjerne steroidhormoner fra spildevandet. En ny undersøgelse giver et bud på omfanget af forureningstypen, og på at spildevandets indhold af steroidhormoner bidrager til de hormonskader, man ser på fisk Af Flemming Ingerslev, Henrik R. Andersen, Martin Hansen, Anne-Marie Jacobsen, Kristine Andersen Krogh, Tue Søeborg og Bent Halling-Sørensen. Sektionen for Miljøkemi, Institut for Analytisk Kemi, Danmarks Farmaceutiske Universitet Naturlige og syntetiske steroidøstrogener, østron (E1), 17β - østradiol (E2) og 17α-ethinyløstradiol (EE2) (p-pilleøstrogen), udskilt fra mennesker, har vist sig at nå vandmiljøet via spildevandssystemet. En række undersøgelser, især fra udlandet [1,2], har påvist, at disse udledninger er hovedårsagen til den feminisering af hanfisk, som observeres i spildevandspåvirkede vandløb. Sådanne observationer er også gjort i Danmark, om end antallet af disse undersøgelser og fund er meget begrænsede [3,4]. Der er derfor endnu ikke fuldt overblik over omfanget af dette miljøproblem i Danmark. Danske rensningsanlæg anses generelt for at være blandt de mest avancerede i Europa, og det er derfor nærliggende at spørge, om problemet med steroidøstrogener i miljøet er et generelt problem for Danmark, eller om de problemer, der kendes fra udlandet, ikke er relevante for danske forhold. Her beskrives et studie, hvor de tre steroidøstrogener (E1, E2 og EE2) er undersøgt i stikprøver udtaget fra udløbet af 19 danske spildevandsanlæg. Valget af anlæg har sikret, at alle amter og anlægstyper er repræsenteret. Forureningen med steroidøstrogener i vandmiljøet Figur 1 viser strukturen af de mest udbredte steroidhormoner i behandlet spildevand. Stofferne forekommer i vandmiljøet, hvis nedbrydnings- og fjernelsesprocesserne ikke sker hurtigt nok, når de udskilte stoffer fra den menneskelige urin føres igennem kloaksystemet til spildevandsanlægget. En mere detaljeret forklaring på de fysiologiske mekanismer, der forklarer konsekvenserne af østrogenernes reaktion med østrogenreceptorer i miljøet, og de effekter der ses i vandmiljøet, er tidligere givet i Dansk Kemi [3]. Af interesse er de processer, der styrer, hvordan stofferne når miljøet, og det er afgørende, hvad der sker i spildevandsanlæg. Som det ses i figur 1 er steroidøstrogenenerne lipofile stoffer (log Kow > 4.0), hvilket betyder, at de umiddelbart burde bindes til spildevandsslam og derfor ikke være i stand til at passere renseanlægget. Imidlertid sker der i kroppen en glucuronidkonjugering af østrogenerne, der gør forbindelserne 50 gange mere vandopløselige, hvorved de nemt udskilles med menneskets urin. Under den videre transport gennem kloaksystemet føres forbindelserne til spildevandsrensningsanlægget, hvor molekylets glucuronid-del fraspaltes af mikroorganismer. Der sker således en reaktivering af østrogenerne [5]. Hvis glucuronidfraspaltning sker tidligt, f.eks. allerede i Figur 1. Struktur og oktanol-vand fordelingskoefficienter for de undersøgte steroidøstrogener. kloaksystemet, så nedbrydes reaktiverede steroidøstrogener i rensningsanlægget og når derfor ikke vandmiljøet. Sker føromtalte de-glucuronidering sent, dvs. i eksempelvis rensningsanlæggets denitrifikationstank, så vil steroidøstrogenerne ikke nå at blive bionedbrudt eller bundet til slam i rensningsanlægget, og derved er de til stede i det behandlede spildevand. Figur 2 skitserer de processer, der bestemmer østrogenernes vej til miljøet. Kemisk analyse og effekter af steroidøstrogener i spildevand. Det er først de seneste år blevet muligt at lave kemiske analyser af steroidøstrogener i spildevand. Den store udfordring ligger i at opkoncentrere vandprøven fra volumener på op til flere liter ned til få milliliter. Den generelle teknik til dette er fastfase-ekstraktion (SPE). I den videre procedure er der brugt gaschromatografi koblet med massespektrometri (GC-MS) eller tandem-massespektrometri (GC-MS/MS) [7]. Der er også anvendt tilsvarende systemer med væskechromatografi (HPLC- MS/MS), dog med højere detektionsgrænse [8]. Endelig har immunokemiske analyser været brugt til at bestemme koncentrationen af steroidøstrogener i spildevand [9]. For alle de nævnte metoder ligger grænsen for detektion af dansk kemi, 84, nr. 5, 2003 46
Figur 2. Steroidøstrogeners vej fra udskilning fra mennesket til miljøet via spildevandssystemet. steroidøstrogener i spildevand i området 0,1 til 1 ng/l. Indtil videre har GC-MS/MS været den bedste og derfor også mest udbredte metode. Fælles for alle analysemetoder er, at de pga. de lave koncentrationsniveauer er meget krævende mht. ekspertise, tid og omkostninger. På trods af besværet med at gennemføre kemiske analyser foreligger der efterhånden mange analyseresultater for spildevand fra en lang række lande. I en tidligere artikel i Dansk Kemi rapporteredes en oversigt over analyseresultater [3] for de omtalte stoffer. Det fremgik, at typiske koncentrationer er under 10 ng/l. Maksimalkoncentrationer er sjældent over 50 ng/l, og stofferne forefindes i størstedelen af de prøver, der undersøges. Artiklen bragte også en sammenfatning af de eksisterende arbejder, der er lavet, om hvor lave steroidøstrogenkoncentrationer, der skal til, før der observeres hormonrelaterede effekter på fisk. For de tre stoffer i denne undersøgelse var tallene 8, 0,5 og 0,03 ng/l for hhv. E1, E2 og EE2, altså koncentrationer omkring den analytiske detektionsgrænse. Det er derfor vigtigt at pointere, at de eksisterende detektionsniveauer generelt ikke er lave nok til at analysere stofferne i koncentrationer, der ligger under effektgrænsen. I forbindelse med vurderingen af analyseresultaternes betydning er alene detektionen af steroidøstrogener nok til at sige, at det er sandsynligt at observere effekter på fisk ved udløb fra spildevand med ringe fortynding. Undersøgelsens metode I nærværende studie blev der indsamlet prøver i oktober og november 2002. Fra hvert af de 19 anlæg blev der udtaget én prøve i løbet af undersøgelsesperioden. Derfor må det understreges, at undersøgelsen betragtes som præliminær, idet det begrænsede antal prøver udelukker enhver form for præcis vurdering af en lang række spildevandstekniske parametres betydning for steroidøstrogeners skæbne i spildevandsanlæg. Af figur 3 (side 48) ses en oversigt over de regioner i Danmark, der indgik i undersøgelsen samt antallet af prøver fra hver region. Endvidere er anlæggenes maksimale kapacitet angivet. Det har ikke været muligt at afsløre anlæggenes præcise identitet, men kun om prøverne stammer fra anlæg i Storkøbenhavn, Nord- og Vestsjælland, Sydsjælland og Lolland- Falster, Fyn, Nordjylland eller Syd- og Midtjylland. De enkelte anlæg, der indgik i undersøgelsen, var udvalgt mhp. at få størst mulig variation mht. byer og land, recipienttype og anlægsstørrelse. Anlægsstørrelser er angivet, som det antal personækvivalenter, de er designede til at kunne håndtere. Det skal bemærkes, at flere anlæg reelt har en overkapacitet i forhold til den reelle belastning. De udtagne prøver var vandføringsvægtede døgnprøver. Dvs. at der igennem et helt døgn udtages en delprøve hver gang en fastsat mængde spildevand f.eks. 200 liter har passeret udløbet. De udtagne prøver sammenblandes og udgør således en gennemsnitsprøve for det pågældende døgn. Fra de opsamlede prøver overførtes ved døgnets afslutning 2 liter til to syreskyllede enliters glasflasker med glaslåg. Efter indsamling blev de transporteret til laboratoriet hurtigst muligt, hvilket for de sjællandske og fynske prøver var inden for 12 timer, mens 47 dansk kemi, 84, nr. 5, 2003
MILJØ Resultater og diskussion Detektions- og kvantificeringsgrænser for analysen er angivet i tabel 1. Det fremgår af tabellen, at steroidøstrogenerne kunne detekteres i koncentrationer ned til 0,1 ng/l (for E2 og EE2) og til 2 ng/l (E1). Det er vigtigt at understrege betydningen af kvantifikationsgrænsen, som den grænse hvorunder højden af den chromatografiske top ikke kan bestemmes med tilfredsstillende statistisk sikkerhed. I prøverne er der altså fundet steroidøstrogener, men i niveauer under kvantifikationsgrænsen, hvor usikkerheden er stor. Resultatet af de kemiske analyser er vist i tabel 2, og som det fremgår, er der en række prøver, hvor østrogenkoncentrationen ligger under kvantifikationsgrænsen. Som tidligere beskrevet er der kun analyseret 19 prøver. Det er måske grunden til, at der ikke er fundet sammenhænge mellem de forskellige anlægs karakteristika (størrelse, beliggenhed, tekniske opbygning osv.). Dog ses der umiddelbart to tendenser i datamaterialet. Dels forekommer steroidøstrogener med en højere frekvens og ved lidt højere koncentrationer i prøver fra Storkøbenhavn end i de andre regioner, og dels tyder resultaterne på, at problemet ikke er så udbredt i Jylland. At problemet især ses i spildevand fra Storkøbenhavn kan skyldes den høje befolkningstæthed. Det bør dog understøttes af flere analyser. Transporten til laboratoriet af prøver fra jyske anlæg var af nogle dages varighed (i et enkelt tilfælde hele fem dage). Det er sandsynligt, at transporttiden har været for lang, så nedbrydnings- og sorptionsprocesser har betydet, at stofferne ikke kunne analyseres i prøverne. En anden mulig forklaring kan være den højere tilledning af industrispildevand (uden indhold af steroidøstrogener) til de jyske anlæg. Det kan konkluderes, at der er fundet steroidøstrogener i 15 ud af de 19 anlæg. I 8 ud af 19 prøver blev der fundet koncentrationer over kvantifikationsgrænsen på 1 ng/l for E2 og EE2 og 2 ng/l for E1. E1 er fundet i færrest prøver (3), men til gengæld i de højeste koncentrationer. Det hyppigst forekommende stof var E2, men fundene er oftest under 1 ng/l, hvor Figur 3. Viser antallet af prøver udtaget fra de enkelte regioner i Danmark. Prøverne er analyseret for steroidøstrogener. Endvidere ses de enkelte anlægs kapacitet (antal personækvivalenter, PE). Data er baseret på oplysninger fra personale på de enkelte renseanlæg. de jyske prøver kunne være op til 5 døgn undervejs. De var derfor afkølede til 4 C. I laboratoriet blev prøverne inden 24 timer filtreret med et glasfiberfilter og efterfølgende forsuret med koncentreret svovlsyre til ph 3. Spildevandet blev inddelt i prøver af 1 liter, som hver blev tilsat 100 ng 17E -østradiolacetat, der fungerer som intern standard for den efterfølgende ekstraktion og analyse. Fra de forbehandlede prøver blev steroidøstrogenerne og den interne standard ekstraheret med C18kolonner (Bond Elut, 500 mg/3 cc, Varian, Harbor City, CA, USA). Østrogenerne blev elueret med 5 ml acetone. Ekstrak- Østron (E1) 17E -østradiol (E2) 17D-ethinyløstradiol (EE2) LOD * 0,1 ng/l 0,1 ng/l LOQ 2 ng/l 1 ng/l 1 ng/l Regressionkoefficient R2 0,9989 0,9992 0,9991 * Årsagen til at der ikke er angivet nogen detektionsgrænse for østron er, at det anvendte instrument var indstillet til at afskære signalet hvis en algoritme der sammenligner MS-MS spektre af prøven og en kontrol viser at det i prøven detekterede stof ikke er det samme som i kontrollen. Der er altså tale om en afskæring der skyldes at den kvalitative usikkerhed på analysen er for stor. Ved det angivne detektionsniveau sker denne afskæring selvom den kvantitative usikkerhed på målingen stadig er så lille at kvantifikation er mulig. Tabel 1. Detektions- og kvantifikationsgrænser for steroidøstrogenanalyserne anvendt i dette studie. terne blev inddampet og oprenset på en kolonne med 1 g kiselgel 60 (Merck, Darmstadt, Tyskland) deaktiveret med 1,5% vand, der elueres med 5 ml af en 35:65 acetone:hexanblanding. Prøverne blev igen inddampet og derivatiseret ved reaktion med N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamid (MSTFA) i en time ved 60 C. Ekstraktet blev opløst i n-hexan og analyseret med GC-MS/MS (se ref. [7] for detaljer). Kvantificeringen skete ved brug af en tipunkts standardkurve, der blev fremstillet ved spiking af postevand. Resultaterne blev korrigeret for tab i oprensning ved at bruge genfindingen af 17E -østradiol-acetat. Som blindprøve blev ligeledes brugt postevand. dansk kemi, 84, nr. 5, 2003 egentlig kvantificering ikke er mulig. Men man skal huske, at effektniveauet også er på få ng/l. Undersøgelserne konfirmerer derfor tidligere resultater [3,4]. Endvidere viser de, som de første i Danmark, at udledningen af steroidøstrogener fra danske spildevandsanlæg er et generelt landsdækkende problem og ikke kun kan kobles til særlige regioner eller anlægstyper. Vores situation svarer derfor til den, der rapporteres i udenlandsk litteratur [1,10]. De fundne koncentrationsniveauer er på niveau med de effektkoncentrationer, der er vist at forårsage reproduktionsskader på fisk. Miljøstyrelsens anbefalede værdier for inititalfortyndingen (faktor 10 for de fleste recipienter [11]) kan 48
Region Østron 17β -estradiol 17α-ethinylestradiol Anlæg 1 ND < 1 ng/l < 1 ng/l Storkøbenhavn Anlæg 2 ND 1,1 ng/l 1,4 ng/l Anlæg 3 ND < 1 ng/l 1,3 ng/l Anlæg 4 3,3 ng/l 1,0 ng/l 2,1 ng/l Anlæg 1 ND < 1 ng/l ND Nord- og Anlæg 2 ND < 1 ng/l 1,0 ng/l Vestsjælland Anlæg 3 ND ND 2,1 ng/l Anlæg 4 ND < 1 ng/l ND Sydsjælland Anlæg 1 ND < 1 ng/l < 1 ng/l og Lolland- Anlæg 2 ND < 1 ng/l 1,2 ng/l Falster Anlæg 3 ND < 1 ng/l ND Anlæg 1 ND < 1 ng/l ND Fyn Anlæg 2 18 ng/l < 1 ng/l ND Anlæg 3 ND < 1 ng/l < 1 ng/l Nordjylland Syd- og midtjylland Anlæg 1 ND ND ND Anlæg 2 ND ND ND Anlæg 1 2,5 ng/l ND ND Anlæg 2 ND ND ND Anlæg 3 ND ND ND Tabel 2. Koncentration af steroidøstrogener i analyserede spildevandsprøver. ND betegner, at stofferne ikke er detekteret. derfor ikke reducere koncentrationen af steroidøstrogener til et niveau, der ligger flere størrelsesordener under effektniveauet. Resultaterne støtter derfor den konklusion, udenlandske undersøgelser også har vist, at spildevandets steroidøstrogenindhold bidrager væsentligt til de hormonrelaterede skader, man ser på hanfisk og andre vandlevende organismer. E-mail-adresse: Flemming Ingerslev, fi@dfh.dk Referencer 1. Desbrow C, Routledge EJ, Brighty GC, Sumpter JP, Waldock M. 1998. Identification of Estrogenic Chemicals in STW Effluent. 1. Chemical Fractionation and in Vitro Biological Screening. Environ.Sci.Technol. 32:1549-1557. 2. Routledge EJ, Sheahan DA, Desbrow C, Brighty GC, Waldock M, Sumpter JP. 1998. Identification of Estrogenic Chemicals in STW Effluent. 2. In Vivo Responses in Trout and Roach. Environ.Sci.Technol. 32:1559-1565. 3. Andersen HR, Ternes TA, Halling-Sørensen B. 2002. Steroidøstrogener i renset spildevand kan være årsag til effekter på danske fisk. Dansk Kemi. 83:28-31. 4. Christiansen LB, Plesner T. 2001. Intersex og andre effekter på reproduktionssystemet i skalle og bækørred - relation til østrogener og østrogenlignende stoffer. Århus Amt (Århus regional municipality), Højbjerg, Denmark. 5. Ternes TA, Kreckel P, Mueller J. 1999. Behaviour and occurrence of estrogens in municipal sewage treatment plants - II. Aerobic batch experiments with activated sludge. Sci.Tot.Env. 225:91-99. 6. Geyer HJ, Et al. Bioaccumulation and Occurence of Endocrine- Disrupting Chemicals (EDCs), Persistent Organic Pollutants (POPs), and Other Organic Compouds in Fish and Other Organisms Including Humans. In:J Bioaccumulation (Beek B, ed), 2000; 7. Ternes TA, Stumpf M, Mueller J, Haberer K, Wilken RD, Servos M. 1999. Behaviour and occurrence of estrogens in municipal sewage treatment plants - I. Investigations in Germany, Canada and Brazil. Sci.Tot.Env. 225:81-90. 8. Lagana A, Fago G, Marino A, Santarelli D Liquid chromatography tandem mass spectrometry applied to the analysis of natural and synthetic steroids in environmental waters. Analytical Letters 2001; 34: 913-926. 9. Huang CH, Sedlak DL Analysis of oestrogenic hormones in municipal wastewater effluent and surface water using enzyme-linked immunosorbent assay and. Environmental Toxicology and Chemistry 2001; 20: 133-139. 10. Spengler W, Körner W, Metzger M. 2001. Substances with estrogenic activity in effluents of sewage treatment plants in southwestern Germany. 1. Chemical analysis. Environ.Toxicol.Chem. 20:2133-2141. 11. Miljøstyrelsen. 1999. Vejledning om bekendtgørelse om spildevandstilladelser efter miljøbeskyttelseslovens kapitel 3 og 4. 5. Miljøstyrelsen, Strandgade, København. 49 dansk kemi, 84, nr. 5, 2003