Abstract: This study has been made to describe enzymes, especially their kinetics and structures, and is based on the enzyme catalase. The kinetics has been explained by the Michaelis-Menten-equation and the activation energy. A lab-test with catalase has been made and the results have been compared to the theory of the kinetics of catalase. The velocity of the reaction in different ph-levels has been illustrated by a graph and described. The use of enzymes in the industrial section has also been discussed. Washing powder is the main subject in this section of the task and the environmentally issues on other chemical solutions compared to the enzymes has also been brought up here. All in all this study has been very educational to me. 1
Indholdsfortegnelse Abstract:... 1 Indledning til opgaven... 3 Introduktion til emnet... 4 Katalase generelt:... 6 Enzymers strukturelle opbygning... 8 Katalases struktur:... 9 Enzymers virkning... 10 Reaktionshastighed:... 12 Aktiveringsenergi:... 13 Michaelis-Menten-kinetik... 14 Forsøg: Enzymet katalase... 17 Konklussion:... 19 Perspektivering: Enzymer i industrien... 19 Bilag 1... 20 Bilag 2... 21 Bilag 3... 22 Bilag 4... 23 Litteraturliste:... 24 2
Indledning til opgaven Opgaven vil behandle emnet enzymer, med udgangspunkt i enzymet katalase. For at kunne forstå katalase, dens opbygning, dens funktion, virkemåde osv., vil der først være en generel beskrivelse af enzymer og derefter vil der være en dybere forklaring af begreberne aktiveringsenergi og Michaelis-Menten-kinetik. Mere specifikt vil katalase blive beskrevet netop i forhold til ovenstående, altså først bliver der forklaret lidt generelt om katalase og derefter vil der være en beskrivelse af katalases strukturelle opbygning. Til sidst vil et forsøg med netop enzymet katalase blive inddraget, hvor vi vil teste reaktionshastigheden for en opløsning med katalysatoren og sammenligne denne med reaktionshastigheden for en opløsning uden katalysatoren. Samtidig vil dette forsøg vise om ph-værdien har nogen indflydelse på enzymets virkning. Katalases kinetik vil blive vurderet i forhold til teorien ved hjælp af en graf. Til sidst perspektiveres der til brug af enzymer i andre sammenhænge, hovedsageligt i vaskepulver. 3
Introduktion til emnet I levende organismer forekommer mange forskellige kemiske reaktioner, og de fleste af disse reaktioner er nød til at foregå hurtigt. For at få en reaktion til at gå hurtigere, kan man gøre brug af forskellige metoder. Man kan tilføje mere stof, så der sker flere kollisioner mellem molekylerne, man hæve temperaturen, så molekylerne får mere fart på, og derved øger deres kinetiske energi, så kollisionerne bliver voldsommere, og til sidst kan man tilføje en katalysator. For at en reaktion kan forekomme, skal energien ved kollisionerne være større end aktiveringsenergien. Det som en katalysator gør, er at den sænker aktiveringsenergien, så flere succesfyldte kollisioner kan opstå, og derved foregår reaktionen hurtigere. I levende organismer er det altså hovedsagligt enzymer der katalyserer de kemiske reaktioner. Man har også fundet ud af at få andre komponenter i kroppen har katalytisk effekt, f.eks. RNA-molekyler. Uden katalysatorer vil næsten alle de kemiske reaktioner foregå meget langsomt, eller slet ikke. De er altså livsnødvendige komponenter for vores krop. En definition af en katalysator kunne lyde således: Ved en katalysator forstås et stof, der uden at forbruges ved en kemisk proces, får denne til at forløbe med større hastighed mod sin ligevægtstilstand 1 Selvom enzymer indgår i reaktionen bliver de ikke opbrugt. De kan derfor katalysere flere substrater i løbet af en reaktion, og samtidig bruges igen til en anden reaktion af samme type. Enzymer er proteiner, hvilket vil sige at de består af lange kæder aminosyrer, der sidder sammen med peptidbindinger. Enzymer er meget specifikke og katalyserer helt bestemte reaktioner. For at illustrere hvor hurtigt et enzym egentlig bevirker en reaktion, tages der udgangspunkt i følgende reaktion: CO2 + H2O H2CO2 Katalysatoren (i dette tilfælde carbonanhydrase) vil forøge reaktionshastigheden for denne reaktion 107 gange og kan omdanne 105 CO2 molekyler pr. sekund. 2 Alle reaktioner er reversible og vil gå mod ligevægt, hvor reaktionshastigheden er lig 0. Da katalysatoren sænker aktiveringsenergien, betyder det at den katalyserer lige godt begge veje. Det er 1 Fra Proteiner og Enzymer af Hanne Hansen, s. 65 2 Fra Proteiner og Enzymer af Hanne Hansen, s. 63 4
altså kun hvis produktet reagerer videre eller kommer på gas-form og bevæger sig ud af systemet, at reaktionen ikke er reversibel. 3 3 Reversibel: At reaktionen kan gå bege veje. 5
Katalase generelt: E.C. 1.11.1.6. Det er enzymet katalases klassificeringsnummer. 4 E.C. står for enzym commision, og er den gruppe der fik til opgave at navngive og systematiserer enzymerne i 1955 5. Det første tal 1 står for hovedgruppen, som angiver hvilken type reaktion enzymet indgår i. Katalase er altså et enzym der katalyserer redoxprocesser. Det næste nummer, 11, angiver undergruppen. Det vil sige (i dette tilfælde med katalase) hvilken type redoxprocesser enzymerne i denne gruppe behandler. 11- tallet angiver at enzymerne her behandler reaktioner med H2O2 som acceptor altså som substrat. 6 Det næste tal angiver under-under-gruppen, og fortæller i dette tilfælde at det er en peroxidase, altså et enzym der spalter hydrogenperoxid til vand og samtidig oxiderer et organisk stof. 7 Det sidste tal angiver at det lige præcis er katalase der er tale om. Katalase er et enzym der bruges specielt til reaktioner hvor H2O2 (hydrogenperoxid) bliver omdannet, og er derfor meget specifikt som de fleste andre enzymer. I cellen bliver der nedbrudt fedtsyrer og aminosyrer, og bl.a. under disse processer, dannes der H2O2, som er meget skadeligt for cellerne, da det er et meget reaktivt stof der kan oxidere andre stoffer i cellen, og derved ødelægge deres funktion. I værste fald kan de oxidere på DNA-materialet og skabe mutation, som kan give anledning til dannelse af kræftceller. Den største koncentration af katalase-enzymer findes dog i levercellerne, da der her er mange giftstoffer der hurtigt skal reagere videre. Katalase går ind og katalyserer på omdannelsen af H2O2 til H2O og O2. Reaktionsskemaet ser således ud: 2 H2O2 2 H2O + O2 Katalase sænker aktiveringsenergien, hvilket betyder at katalysen også virker på reaktionen mod venstre. Da et enzym katalyserer således at reaktionen hurtigere vil nå sin ligevægt, burde denne reaktion være reversibel. Det er dog sjældent det er tilfældet med hydrogenperoxid i vores krop, da det som tidligere nævnt er giftigt. Derfor bliver produktet hurtigt viderereageret, og reaktionen stopper derfor først når alt hydrogenperoxiden er opbrugt. 4 Proteiner og enzymer af Hanne Hansen, s. 90 5 Proteiner og enzymer af Hanne Hansen, s. 87 6 Forklares dybere i afsnittet Virkemåde. 7 http://www.denstoredanske.dk/natur_og_milj%c3%b8/biokemi_og_molekyl%c3%a6rbiologi/biokemi/p eroxidaser 6
Nogen gange har vi dog også brug for hydrogenperoxid for at uskadeliggøre potentielt skadelige forbindelse. Når kroppen er færdig med at bruge hydrogenperoxiden, går katalasen ind og nedbryder det resterende, så det ikke skader cellerne. Katalase er så effektivt et enzym, at et enzymmolekyle kan katalyserer nedbrydningen af 5 millioner hydrogenperoxidmolekyler til vand og ilt. 8 8 Enzymer Hvor bruges de? Af Novo nordisk, s. 5 7
Enzymers strukturelle opbygning Som tidligere nævnt er enzymer proteiner og har derfor samme opbygning. Dvs. at de har en primær struktur, sekundær struktur, tertiær struktur og nogle har også en kvartiær struktur. Den primære struktur 9 angiver rækkefølgen af aminosyrerne, og netop denne rækkefølge bestemmer hvilken form proteinet skal have. Den sekundære struktur 10 skyldes de hydrogenbindinger der bliver dannet, det vil sige de bindinger der opstår mellem det dobbeltbundede oxygenatom fra karboxyl-gruppen 11 og hydrogenatomet fra amino-gruppen 12. Disse bindinger er svage, men da de bliver gentaget, er de stadig i stand til at holde proteinet samlet. Sidekæderne i proteinet styrer hvordan den tertiære struktur 13 kommer til at se ud, ved at der dannes flere bindinger. Den tertiære struktur kan altså indeholde både alfa-helixer og beta-foldede plader. Disse bindinger holder proteinet i en særlig form, så det kan indeholde flere sekundære strukturer. Der er stadig kun tale om en polypeptidkæde 14, altså en proteinkæde. Er flere polypeptidkæder/proteinkæder koblet sammen til et stort protein, har man den kvartiære struktur. 15 Alle enzymer har et såkaldt active site, (på dansk; det aktive sæde) som er den del der kan danne og bryde bindinger og det er her substratet bindes til enzymet. Det aktive sæde består af et bindingssæde og et katalyserende sæde. 9 Se bilag 1, figur 3 10 Se bilag 2, figur 4 11 Se bilag 1, figur 1 12 Se bilag 1, figur 1 13 Se bilag 2, figur 5 14 Polypeptidkæde: En kæde af aminosyrer der er bundet sammen med peptidbindinger. Disse bindinger er dannet ved kondensationsreaktioner, altså ved fraspaltning af vand (se bilag 1, figur 1 og 2). 15 Se bilag 2, figur 6 8
Katalases struktur: Enzymet katalase har man fundet i næsten alle aerobe organismer. 1617 Katalase er et af de enzymer der består af den kvartiære struktur, dvs. den har fire polypeptider, der er bundet sammen til et stort protein. Katalase har ligesom alle andre enzymer et aktivt site, men lige på katalase, har det den afgørende effekt at det kun er hydrogenperoxid der passer i det aktive site. Det betyder at enzymet kun virker på det stof og derfor er katalase absolut specifikt. Katalase er bygget op på den kvartiære form, hvilket betyder at den har fire polypeptidkæder, der bundet sammen til et stort protein (Se figuren til højre). 18 Mere specifikt, er det et hæmprotein ligesom hæmoglobin. Det betyder at enzymet har fire hæmgrupper, hvori der er bundet et Jern(II) molekyle i hver gruppe. De fire hæmgrupper indgår i det aktive site, altså det område hvor substratet bliver sætter sig fast og bliver omdannet. Jern(II) molekylerne kan i sig selv katalyserer, og det samme kan hæmgrupperne, men hele enzymet katalyserer med en effektivitet der er ca. 10 millioner større end for hæmgrupperne alene. 19 16 Aerobe organismer, er organismer der behøver ilt for at fungere 17 http://www.biosite.dk/leksikon/catalase.htm 18 Figuren er fra http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/16/im/antioxsys/antioxsys.vlu/page/vsc/de/ch/16/im/anti oxsys/catalasen.vscml.html 19 http://bioeksp.rigelsen.dk/oevelser/katalase.htm 9
Enzymers virkning Som tidligere nævnt, har enzymer et såkaldt active site, som substratet binder sig til og bliver omdannet i. Reaktionen ser således ud: E + S ES E + P E = Enzymet, S = Substratet, ES = Enzym-substrat-komplekset og P = Produktet. Umiddelbart kan man ikke se hvad der helt præcist sker med enzymet og substratet i denne reaktion, men viser vi det på billedformat, giver det bedre mening: Figuren viser ovenstående reaktion på billedeform. Dog skal det lige siges at der her kun vises det aktive site af enzymet, da hele enzymet er meget større end selve det aktive site. Her kan man se at enzymet er tilpasset substratet, hvilket gør enzymet meget specifikt (nogle enzymer kan også ændre form, så substratet passer til det aktive sæde). (Lavet af Helene Zgaya) Homogen og heterogen opløsning: Enzymer kan indgå i en homogen opløsning, eller en heterogen opløsning. I en homogen opløsning, er enzymer blandet i, og der kan ikke ses forskel i selve væsken. I en heterogen opløsning kan enzymet f.eks. være bundet til et metal og sidder på overfladen. Altså, jo større overfladeareal i en heterogen blanding, jo bedre en katalyse kan man opnå. 10
Kofaktorer: Kofaktorer er enzymers hjælpere, og mange enzymer virker ikke uden disse. Man snakker om to typer: Koenzymer: Er ofte vitaminer eller også produceret ud fra vitaminer. Koenzymet er en del af det aktive sæde i de enzymer der behøver en kofaktor. De gør at substratet bedre kan binde sig til enzymet. Enzymaktivatorer: Er som regel uorganiske stoffer. De sætter sig i det aktive sæde, så det bliver tilgængeligt for substratet. Hæmmere: Kompetetive hæmmere: Hæmmere der konkurrer med substraterne om pladsen i det aktive sæde. Hvis substratkoncentrationen er høj, er der større sandsynlighed for at det er substratet eller kofaktoren der binder sig til enzymet, og ikke hæmmeren. Grunden til at hæmmeren kan sætte sig i det aktive sæde, er hvis det kemisk ligner det substrat, som enzymet normalt vil binde sig med. Ikke-kompetetive hæmmere: Hæmmere der sætter sig andetsteds i enzymet, altså som ikke er i det aktive sæde. Dette ændrer bindingerne og derved passer substratet ikke længere i det aktive sæde. 11
Reaktionshastighed: Selvom enzymer får reaktionerne til at løbe hurtigere, afhænger hastigheden af flere ting: Substratkoncentration: For at enzymerne kan binde et substrat til sig, er det nødvendigt at der er en vis koncentration af substrat, for at disse to kan finde hinanden så at sige. Substratet i sig selv gør ikke reaktionshastigheden større, så den større koncentration af substratet der kræves, er for at enzymerne nemmere kan finde frem til et substratmolekyle og derved kan reagere. Enzymkoncentration: Enzymkoncentrationen er naturligvis også vigtig for reaktionshastigheden. Det er enzymmolekylerne der får hele reaktionen til at løbe hurtigere, så jo større koncentration af enzymer er, jo flere substrater kan reagerer med enzymerne og des mere produkt bliver der dannet på kortere tid. Temperatur: Enzymerne er afhængige af temperaturen. Ved 0 grader er der næsten ingen enzymaktivitet, da molekylerne bevæger sig meget langsomt. Den optimale temperatur for enzymer ligger mellem 35 og 45 C 20. Ved højere grader falder enzymaktiviteten utrolig meget og enzymet holder helt op med at virke ved omkring 60 C. Det skyldes at enzymet bliver denatureret, da molekylerne bevæger sig så hurtigt at bindingerne bliver brudt. Da enzymet er utrolig afhængigt af strukturen, mister det sin funktion delvist eller helt, når strukturen ændres, og derved går reaktionen langsommere eller stopper helt. ph: Den rigtige ph-værdi er også meget vigtig for enzymet, men en uoptimal ph-værdi ødelægger ikke enzymet. Det mister sin virkning, men denne kan genvindes, når ph-værdien igen er optimal for det pågældende enzym. Den optimale ph-værdi er forskellig alt efter hvilket enzym vi kigger på. F.eks. er pepsin mest effektivt ved en ph-værdi på 2, da den i vores mavesaft. Derimod er spytamylase mest effektiv ved 6,7, da den befinder sig i vores spyt. 20 Biokemi og genetik af Oluf Nielsen og Anni Springborg, s 70. 12
Aktiveringsenergi: Det der får en reaktion til at foregå, er kollisioner mellem molekylerne. Men ikke nok med det, skal sammenstødene også være kraftige nok. Det kan bedst illustreres ved to bilers sammenstød. Hvis to biler triller ind i hinanden, sker der ikke så meget. Hvis de derimod støder sammen med en hastighed på 90 km/t, bliver bilerne totalsmadret. Derfor er der ikke særlig mange reaktioner der kan foregå ved stuetemperatur, da molekylerne ikke bevæger sig hurtigt nok til at kunne opnå en højere energi ved kollisionerne, end aktiveringsenergi. Det aktiveringsenergien der virker som stopklods for reaktionerne. Det er dog en livsnødvendig stopklods, da mange reaktioner ellers ville forekomme ved almindelig stuetemperatur. Den kinetiske energi (bevægelsesenergien) skal altså være større end aktiveringsenergien ved kollisionen af to molekyler. En spontan reaktion er en reaktion der frigiver energi, men en reaktion der kræver energi, ikke er spontan. Det er ændringen i den frie energi der afgør om en reaktion er spontan eller ej. Hvis reaktanternes frie energi er større end produktets, frigives der energi, og reaktionen er derfor spontan. Omvendt, hvis produktets fri energi er større end reaktanternes, kræver reaktionen tilførsel af energi, og den forekommer derfor ikke spontant. Selvom en reaktion er spontan, kræver den alligevel noget energi for at komme i gang. Den kræver noget energi for at komme over aktivering-puklen 21 Enzymer sænker aktiveringsenergien, så reaktionen kan starte. Den virker altså kun på spontane reaktioner, da den kun hjælper molekylerne over puklen. Som man kan se af figuren til højre, reaktanternes energi højere end produktet, hvilket stemmer overens med at det er en spontan reaktion. Der bliver altså frigivet energi. Katalysatoren påvirker ikke hastighedskonstanten. 21 Se figuren: Molekylerne skal ramme hinanden med så kraftig en kollision at den kinetiske energi er større end aktiveringsenergien. 13
Michaelis-Menten-kinetik Michaelis-Menten: Udgangspunkt: Michaelis-Menten-ligningen fortæller noget om reaktionshastigheden afhænger af koncentrationen af substrat og enzym, samt hastighedskonstanterne i de forskellige trin. Da dette er i starten af reaktionen, er der dannet så lidt produkt at reaktionshastigheden for enzym + produkt enzymprodukt-komplekset er ubetydelig. Når enzymet og substratet reagerer og danner enzym-substrat-komplekset, kan der ske en af to ting med dette kompleks. Det kan enten blive til enzymet + produktet eller det kan gå tilbage til enzymet + substratet. Hastigheden for reaktionen ES E + P er det langsomme trin i hele reaktionen og derfor det hastighedsbestemmende trin. Det må kunne skrives som V = k3 [ES], hvor hver gang at koncentrationen af ES stiger med 1, stiger reaktionshastigheden med k3, som er vores hastighedskonstant, der er afhængig af temperatur og tryk. Den maksimale hastighed opnås når alle enzymer er brugt i enzym-substrat-komplekset, da de resterende substrater reagerer så langsomt uden katalysatoren (enzymet), at det ikke får betydning for reaktionshastigheden. Derfor må den maksimale hastighed være hastighedskonstanten gange koncentrationen af den samlede mængde enzymer (på grafen vises dette som det sidste stykke, hvor linjen er parallel med x-aksen): VMax = k3 [ET] = k3 [ES + E] Vi dividerer vores hastighed V, med den maksimale hastighed VMax, og får: V V Max = k 3 [ES] k 3 [ES] + [E] = [ES] [ES + E] Michaelis-Menten-konstanten er den substratkoncentration der giver den halve VMax. Her er substratkoncentrationen stadig lille. Det betyder at reaktionshastigheden her er ligefrem proportional med koncentrationen af substrat. Denne del af grafen kaldes første orden, da 14
substratkoncentrationen er i 1. potens. 0. orden er når hastigheden er uafhængig af substratkoncentrationen, altså når alle enzymer er bundet til et substrat. (Se figuren nedenfor 22 ) Ligevægtskonstanten (Michaelis-Menten-konstanten) er: Km = [E] [S] [ES] Denne del udtrykker E + S ES. E og S er reaktanter, mens ES er produktet i denne ligning. Hvis KS er stor, er en eller begge af reaktanernes koncentration større end koncentrationen af produktet, og reaktionen vil gå mod højre. En reaktion i ligevægt vil altid prøve at modvirke enhver påvirkning af reaktionen, til den er i ligevægt igen. Alle reaktioner går mod ligevægt. Når en reaktion er i ligevægt, er ligevægtskonstanten lig 1. Vi isolerer koncentrationen af ES og indsætter i vores brøk med de to hastigheder: Km = [E] [S] [ES] V VMax = [ES] = [E] [S] [E] [S] K m [E] [S] + [E] K m K m Ved at dividerer med [E] i tæller og nævner og derefter rykke lidt rundt på ligningen får vi at V VMax = [S] K m [S] K + 1 m V VMax ([S] + 1) = [S] K m K m V VMax = 1 [Km] + 1 S [S] V = V Max [S] + K m Og så har vi altså Michaelis- Menten-ligningen. 22 Figuren er fra http://www.biotechacademy.dk/undervisningsprojekter/enzymer/teori/enzymer/enzymkinetik.aspx. Jeg har dog tilføjet de områder der viser 1. orden, 0. ordens kinetik. 15
K M = K 2+K 3. Hvis k2, altså hastigheden for reaktionen fra ES-komplekset er større end k3, kan Km K1 skrives som K M = K 2 K 1, og i dette tilfælde vil en stor KM fortælle at bindingerne mellem substrat og enzym er svage og vil gå tilbage til udgangspunktet substrat + enzym. Grafen for Michaelis-Menten er dog ikke særlig nem at arbejde med. Derfor kan man omskrive Michaelis-Menten ligningen og få en nemmere metode til at beregne VMax og KM: Udgangspunkt: V = V Max [S] [S]+K m Dividerer brøken med [S] og tager derefter den reciprokke værdi af alle led: 1 1 V = V Max 1 + K M V = 1 + K M V Max V Max [S] Så kommer grafen til at se således ud: 1 [S] 23 Dette kaldes Lineweaver-Burk plot, og ligningen er nu på formen y = b + ax, og man kan derfor nemmere regne KM og VMax da det er vores hældningkoefficient i en lineær funktion. 23 Fra http://www.biotechacademy.dk/undervisningsprojekter/enzymer/teori/enzymer/enzymkinetik.aspx 16
Forsøg: Enzymet katalase Formål: At undersøge enzymet katalases katalytiske egenskaber ved forskellige ph-værdier. Dette gøres ved at der laves fem forsøg med to reagensglas i hver. En kontrolprøve uden katalase plus en opløsning med katalase. Vi lader de fem forsøg reagerer på den samme tid, 10 min, fra vi tilsætter vores kartoffelstykker på ca. 1 g, til vi tilsætter svovlsyre, som standser reaktionen. Ved titrering kan vi regne på hvor meget hydrogenperoxid der har været tilbage efter første reaktion, derefter beregne nedbrydningshastigheden ved de forskellige ph-værdier og dermed finde ud af hvor effektivt katalase er, stadig ved de forskellige ph-værdier. Vores første reaktionsligning så således ud: 2 H2O2 2 H2O + O2 Her spaltes hydrogenperoxid til vand og ilt. Reaktionen ville kunne foregå uden katalysator, men meget langsomt. ph-værdien fortæller om hvor surt eller basisk et stof er. En syre er et stof der har modtaget en H+ ion og en base er et stof der har afgivet en H+ ion. Dette er en heterogen reaktion, da kartoflen ikke er opløst. Derfor er det vigtigt at man så vidt som muligt prøver at lave det samme overfladeareal på alle 5 stykker kartoffel, da det er her stoffet og enzymerne reagerer. Titrering med 0,2 Molær KMnO4 fortæller hvor meget H2O2 der har været tilbage, og som dermed ikke har reageret. Ved at titrerer på vores opløsning med KMnO4, kan man bestemme volumen og regne stofmængden af KMnO4, og dermed beregne nedbrydningshastigheden for hver ph-værdi. Vi titrerer på 5 ml fra hver opløsning fra første reaktion, en ad gangen, dog først på dem med katalase. 24 24 Se bilag 3 og 4 17
Reaktionsligningen for den anden reaktion ser således ud: 5H2O2 + 2KMnO4 +6H + 2Mn 2+ + 5O2 + 8H2O + 2K + Man kan se at redoxprocessen er blevet afstemt, da den samlede elektriske ladning er ens på begge sider af reaktionspilen, samt der er det samme antal atomer på begge sider af reaktionspilen. Vi er interesseret i at finde stofmængden af KMnO4, så vi kan regne stofmængden af den hydrogenperoxid der var tilbage efter forsøget, både med kartofler og uden, for så til sidst at kunne regne nedbrydningshastigheden: Bruger formlen n = C V, til at beregne KMnO4 s stofmængde i de 10 forsøg (5 med katalase og 5 uden). Herefter ganges resultatet med 2,5, da forholdet mellem KMnO4 og H2O2 er 2:5. Vi har nu stofmængden for H2O2 og kan sætte ind i formlen v = n standart n prøve. 25 10 min Når vi har fundet nedbrydningshastighederne for de forskellige ph-værdier, kan vi lave en graf med hastigheden som funktion af ph-værdien. (Se bilag 3 for resultater og graf). Forklaring af grafen: 26 Man kan både ud fra grafen, men også på selve beregningerne se at katalase er mest effektivt ved en ph-værdi på omkring de 5,6. Det er dog svært at sige særlig præcist, da vi kun har målt på 5 forskellige ph-værdier. Dog giver grafen os et billede af at katalase er afhængig af en bestemt ph-værdi, for at kunne arbejde effektivt. Man kan se hastigheden ved ph-værdien 3,7 er lig 0. Det vil sige at reaktionen går lige så hurtigt med katalase, som den gør uden, ved denne phværdi. Det betyder at den slet ikke har nogen virkning. Ved ph-værdien 8,0, er effektiviteten faldet igen. Generelt har katalasen ikke haft nogen voldsomt stor effekt, men det kan have noget at gøre med de kartofler vi brugte. Da det er længe siden de er blevet gravet op fra jorden, og enzymer har en begrænset levetid, må man kunne antage at enzym-koncentrationen ikke har været helt i top. 25 Se bilag 4, figur 10. 26 Bilag 4, figur 11. 18
Konklussion: I denne opgave er enzymers (proteiners) strukturelle opbygning blevet beskrevet ved begreberne; primær, sekundær, tertiær og kvartiær struktur. Der er samtidig gjort rede for hvordan enzymet katalase er opbygget. Derudover er enzymers kinetik blevet beskrevet ved aktiveringsenergi, Michaelis-Menten-Ligningen og hvad der påvirker et enzyms effektivitet både positivt og negativt. Der er blevet lavet et forsøg der omhandlede katalase og dens effektivitet ved forskellige phværdier. Reaktionshastigheden for katalase ved de forskellige ph-værdier, er blevet vist grafisk og forklaret. Til sidst er der blevet perspektiveret til enzymer i industrien (hovedsagligt i vaskepulver) og argumenteret for hvorfor enzymer er et miljørigtigt produkt at benytte. Perspektivering: Enzymer i industrien I industrien er man meget interesseret i at bruge enzymer, bl.a. til at få diverse reaktioner til at gå hurtigere. Det skyldes at enzymer nemme at kontrollere, forstået på den måde at de er meget specifikke og samtidig arbejder ved stuetemperatur, samt man har flere simple metoder til at stoppe virkningen for et enzym. Enzymer er noget der findes naturligt og de belaster ikke miljøet så hårdt, både fordi de virker ved temperatur på ca. 30 C til ca. 60 C og ved almindeligt atmosfærisk tryk, så man ikke behøver særligt udstyr for at opretholde de optimale vilkår for virkning, men også fordi aminosyrerne hurtigt kan vende tilbage til naturen, når enzymet nedbrydes. Mange naturlige enzymer bruges i industrien, det er bare mikroorganismers enzymer der bliver anvendt her. Enzymer i vaskeindustrien er meget effektive. Der findes forskellige enzymer, til at fjerne forskellige pletter. F.eks. anvendes Proteaser til at nedbryde proteinpletter, ved at nedbryde dem til mere opløselige polypeptider, lipaser bruges til at nedbryde fedtpletter og amylaser bruges til at nedbryde stivelse. Der er i hvert fald ingen tvivl om at enzymer kan erstatte mange mere giftige stoffer, som er svære at nedbryde efter brug, hvor enzymer nedbrydes biologisk. Enzymerne kan gå ind og spalte proteinernes peptidbindinger ved vandoptagelse. De første vaskemiddelenzymer var ikke særlig effektive, da de ikke kunne tåle den høje ph der var i vaskepulveret, men ved at muterer bakterier har man været i stand til at udvikle og forbedre enzymerne. 27 Enzymer er også blevet brugt utrolig meget i medicinalindustrien, da de bl.a. katalyserer de reaktioner der sker, når vi indtager medicin. 27 Proteiner og enzymer af Hanne Hansen, s 118. 19
Bilag 1 Figur 1: Aminosyre. Flere aminosyrer sætter sig sammen som i figur 2. (Lavet af Helene Zgaya i paint) Figur 2: Denne figur viser tre aminosyrer der laver en kondensationsreaktion, hvor vand bliver fraspaltet. Derved får vi tre aminosyrer der er bundet sammen med en peptidbinding mellem hver aminosyre.(lavet af Helene Zgaya i paint) Figur 3: Den primære struktur for et protein. Forkortelserne repræsenterer forskellige aminosyrer. I denne struktur er de bundet sammen ved peptidbindinger på grund af kondensationsreaktioner. (se figur 1)(Lavet af Helene Zgaya i paint) 20
Bilag 2 Figur 4: Begge figurer er eksempler på den sekundære struktur i et enzym. Rækkefølgen af aminosyrerne afgør om strukturen bliver til en alfahelix (til venstre) eller om strukturen bliver til et betafoldeblad (til højre). Det er hydrogenbindingerne (markeret med grøn) der danner disse strukturer. De lilla pinde er sidegrupperne. Billedet er fra http://www.biotechacademy.dk/undervisningsprojekter/amp/teori/proteinstruktur.aspx. Figur 5: viser den tertiære struktur for et protein. Som det fremgår af figuren er der både alfahelixer og betafoldede plader i den samme proteinkæde. Bogstaverne repræsenterer de enkelte aminosyrer. Billedet er fra http://www.biotechacademy.dk/undervisningsprojekter/am p/teori/proteinstruktur.aspx. Figur 6: Den kvartiære struktur. Hver farve på figuren repræsenterer en proteinkæde, altså en tertiær struktur. Disse fire polypeptidbindinger er bundet sammen til et stort protein. Ikke alle proteiner har den kvartiære struktur. 21
Bilag 3 Resultater og beregninger fra forsøget: Vi brugte følgende ph-værdier til forsøget og fik følgende resultater ved titrering: Figur 7. ph-værdi: Med katalase: Uden katalase: 3,7 6,0 ml = 0,006 L 6,0 ml = 0,006 L 4,5 5,8 ml = 0,0058 L 6,1 ml = 0,0061 L 5,6 5,2 ml = 0,0052 L 6,0 ml = 0,006 L 8,0 5,7 ml = 0,0057 L 6,2 ml = 0,0062 L 8,6 5,7 ml = 0,0057 L 6,2 ml = 0,0062 L Figur 8. Skema for beregnede værdier i titreret opløsning med katalase. Aflæste antal ml brugt KMnO4 før opløsningen blevet farvet lyserød. ph Stofmængde for KMnO4 (n = C V) Stofmængde for H2O2 (n KMnO4 2,5) 3,7 0,2 mol 0,006 L = 0,0012 mol 0,0012 mol 2,5 = 0,003 L 4,5 0,2 mol 0,0058 L = 0,00116 mol 0,00116 mol 2,5 =0.0029 L 5,6 0,2 mol 0,0052 L = 0,00104 mol 0,00104 mol 2,5 =0,0026 L 8,0 0,2 mol 0,0057 L = 0,00114 mol 0,00114 mol 2,5 =0,00285 L 8,6 0,2 mol 0,0057 L = 0,00114 mol 0,00114 mol 2,5 = 0,00285 Figur 9. L Skema for beregnede værdier i titreret opløsning uden katalase. Aflæste antal ml brugt KMnO4 før opløsningen blevet farvet lyserød. ph Stofmængde for KMnO4 (n = C V) Stofmængde for H2O2 (n KMnO4 2,5) 3,7 0,2 mol 0,006 L = 0,0012 mol 0,0012 mol 2,5 = 0,003 L 4,5 0,2 mol 0,0061 L = 0,00122 mol 0,00116 mol 2,5 = 0,00305 L 5,6 0,2 mol 0,006 L = 0,0012 mol 0,00104 mol 2,5 = 0,003 L 8,0 0,2 mol 0,0062 L = 0,00124 mol 0,00114 mol 2,5 = 0,0031 L 8,6 0,2 mol 0,0062 L = 0,00124 mol 0,00114 mol 2,5 = 0,0031 L 22
Hastighed v Bilag 4 Indsætter de beregnede stofmængder i formlen v = n standart n prøve : Figur 10. ph Nedbrydningshastigheden 10 min 3,7 4,5 5,6 8,0 8,6 v = 0,003 mol 0,003 mol 10 min v = = 0 0,00305 mol 0,0029 mol 10 min v = v = v = 0,003 mol 0,0026 10 min 0,0031 0,00285 10 min 0,0031 0,00285 10 min = 1,5 10 5 = 4,0 10 5 = 2,5 10 5 = 2,5 10 5 0,000045 0,00004 0,000035 0,00003 Reaktionshastighed ved forskellige ph-værdier med enzymet katalase. 0,000025 0,00002 0,000015 Serie1 0,00001 0,000005 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ph-værdi Figur 11: Grafen er forklaret på side 13. 23
Litteraturliste: Internetsider: http://www.biotechacademy.dk/undervisningsprojekter/enzymer/teori/enzymer.aspx http://www.denstoredanske.dk/natur_og_milj%c3%b8/biokemi_og_molekyl%c3%a6rbiologi/bi okemi/katalase http://www.biosite.dk/leksikon/catalase.htm http://bioeksp.rigelsen.dk/oevelser/katalase.htm http://www.denstoredanske.dk/natur_og_milj%c3%b8/biokemi_og_molekyl%c3%a6rbiologi/bi okemi/peroxidaser Bøger: Hansen, Hanne: Proteiner og Enzymer. 1. udg. Systime, 1991. (Bog) V. Sjaastad, Øystein m.fl.: Mennesket Fysiologi. 2. udg. Gads Forlag, 2006. (Bog) Nielsen, Oluf og Anni Springborg: Biokemi og Genetik. 5. udg. Nyt Nordisk Forlag Arnold Busck, 2011. (Bog) Novo Nordisk: Enzymer - hvor bruges de. 1. udg. Novo Nordisk, 1984. (Bog) Mainz, Jan: Biokemi. 1. udg. Munksgaard, 1995. (Bog) Zubay, Geoffrey: Biochemistry. 2. udg. Macmillan, 1988. (Bog) 24