(19) DANMARK (11) DK 173175 B1 (12) PATENTSKRIFT Patent- og Varemærkestyrelsen (51) Int.C1 8.: C 07 K 14/135 C 12 N 15/45 (21) Patentansøgning nr: PA 1990 01532 (22) Indleveringsdag: 1990-06-22 (24) Løbedag: 1988-10-31 (41) Alm. tilgængelig: 1990-08-16 (45) Patentets meddelelse bkg. den: 2000-03-06 (86) International ansøgning nr: PCT/US88/03784 (86) International indleveringsdag: 1988-10-31 (85) Videreførelsesdag: 1988-10-31 (83) Deponering af mikroorganismer. (30) Prioritet: 1987-12-23 US 137387 (73) Patenthaver: Pharmacia & Upjohn Company, 301 Henriette Street, Kalamazoo, Michigan 49001, USA (72) Opfinder: Michael Wathen, 3183 St. Anthony Drive, Portage, Michigan 49002, USA (74) Fuldmægtig: Budde, Schou & Ostenfeld A/S, Vester Søgade 10, 1601 København V, Danmark (54) Benævnelse: Polypeptid indeholdende fragmenter fra de to human respiratorisk syncytial virus-glycoproteiner F og G, vaccine indeholdende dette og ekspresslonssystem indeholdende en DNA-sekvens, der kan udtrykke polypeptidet (56) Fremdragne publikationer: Ingen (57) Sammendrag: DNA-præparater koder for hidtil ukendte, kimære glycoproteiner, der kan anvendes til frembringelse af virus-specifikke immun-responsreaktioner mod human respiratorisk syncytial virus. DNA-præparaterne omfatter strukturelle gener, der koder for glycoproteinerne, og ekspressions- og repli kat ions-pl a sm ider, der indeholder strukturgenerne. værtsceller transformeret med de ovennævnte DNA-præparater, vacciner fremstillet ud fra glycoproteinerne samt fremgangsmåder til beskyttelse af mennesker ved podning med disse vacciner er også beskrevet.
Den foreliggende opfindelse angår DNA-præparater, der koder for hidtil ukendte, kimære glycoproteiner, der kan anvendes til frembringelse af virus-specifikke immunrespons-reaktioner mod human respiratorisk syncytial virus, 5 HRSV. DNA-præparaterne omfatter strukturelle gener, der koder for glycoproteinerne og ekspressions- og replikationsplasmider, der indeholder de strukturelle gener. Opfindelsen angår også værtsceller, der er transformeret med de ovennævnte DNA-præparater samt, vacciner fremstillet ud fra 10 glycoproteinerne. HRSV blev opdaget i 1956 og findes verden over. Den forårsager sygdomme i det øvre og nedre respiratoriske system, navnlig hos spædbørn og mindre børn. Cirka 30 procent af hospitalsindlagte småbørn med akut respiratorisk sygdom 15 har respiratorisk syncytial virusinfektion. Hos ældre børn og voksne er sygdommen mildere. Hos spædbørn kræver denne alvorlige lidelse ofte hospitalsindlæggelse. Infektioner med respiratorisk syncytial virus vedrører alle segmenter af det respiratoriske system og er i almin- 20 delighed forbundet med feber, hoste, løbende næse og træthed og diagnosticeres klinisk som bronchitis, bronchiolitis, lungebetændelse, croup eller virusinfektion. Hos ældre børn og voksne er viruset i almindelighed begrænset til replikation i den øvre del af åndedrætssystemet. Spædbørn kan an- 25 gribes mere alvorligt, når viruset angriber lungerne, og beskadigelse af lungerne kan være permanent. Primær infektion med respiratorisk syncytial virus forekommer tidligt i livet, i almindelighed inden 4 års alderen. Blandt børn har sygdom forårsaget, at dette virus 30 har tendens til at forekomme mindst ån gang om året i forholdsvis skarpt definerede udbrud af flere måneders varighed. Epidemier er skarpt afgrænsede, i almindelighed i 3 til 5 måneder. Ved undersøgelser af familier har det vist sig, at børn i de tidlige skoleår hyppigt indfører viruset i hjemmet 35 og inficerer yngre medlemmer af familien mere alvorligt end 1
andre familiemedlemmer. Den kliniske konsekvens af infektionen er alvorligst den første gang og bliver mildere hos ældre individer, der er immunologisk bedre beskyttede. Sekundære virkninger af respiratorisk syncytial virus 5 kan strække sig fra en svag infektion til alvorlig lungebetændelse og dødsfald. Inflammation af åndedrætssystemet er ansvarlig for de fleste symptomer. Fuldstændig helbredelse sker i de fleste tilfælde i løbet af &n til tre uger under produktion af antistoffer, der synes at vedvare livet igen- 10 nem. I De Forenede Stater har ca. 30 procent af 1 år gamle spædbørn og 95 procent af fem år gamle børn cirkulerende respiratorisk syncytialt virus-antistof. Gen-infektioner hos ældre spædbørn, børn og voksne med antistoffer er for det meste milde sygdomme i den øvre del af det respiratoriske 15 system i form af forkølelser. Omend lave udbytter af virus i cellekultur har hindret HRSV-research, er viruset blevet grundigt studeret. HRSV er et paramyxovirus, der indeholder en enkelt negativ streng af RNA, der transkriberes i 10 overvejende monocistroniske 20 budbringere. Budbringerne er blevet isoleret og translateret in vitro. Produkterne er blevet karakteriseret ved gelelektroforese, peptidkortlægning og immuno-udfældning som værende af samme art som strukturelle proteiner, der isoleres fra virioner. De strukturelle proteiner omfatter et hoved-nucleo- 25 capsid-protein (N; molekylvægt ca. 42.000), et nucleocapsidphosphoprotein (P; molekylvægt ca. 34.000), et stort nucleocapsid-protein (L; molekylvægt ca. 200.000), et indesluttet matriksprotein (M; molekylvægt ca. 26.000), et matriksglycoprotein (ca. 22.000) og to indesluttede glycoproteiner, 30 fusions-glycoproteinet (F; molekylvægt ca. 68.000 til 70.000) og et andet, methionin-fattigt glycoprotein (G; molekylvægt ca. 84.000 til 90.000). Desuden vides et viralt kodet protein på ca. 9.500 dalton og andre små proteiner at være til stede i inficerede celler, jfr. Collins et al., Identification of 35 a tenth mrna of HRSV and assignment of polypeptides to the 10 viral genes, J. of Virol. 12, 572-578 (1984) og deri 2
3,. angivne referencer. Yderligere arbejder, der beskriver den molekylære biologi med hensyn til HSRV, omfatter følgende: (1) Collins et al., Nucleotide Sequence of the gene encoding the fusion (F) glycoprotein of human respiratory Syncytial 5 virus, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, ål, 7683-7687 (december 1984), der angiver gensekvensen for F-glycoproteinet, (2) Collins et al., The la Protein Gene of Human Respiratory Syncytial Virus: Nucleotide Sequence of the mrna and a Related Polycistronic Transcript, Virology, 141, 283-291 10 (1985), der angiver gensekvensen for 1A-proteinet, (3) Collins et al., The Envelope-Associated 22K Protein of Human Respiratory Syncytial Virus: Nucleotide Sequence of the mrna and a Related Polytranscript, J. of Virol., 54, (nr. 1), 65-71 (april 1985), der angiver gensekvensen for 22K- 15 proteinet, (4) Wertz et al., Nucleotide sequence of the G protein gene of human respiratory syncytial virus reveals an unusual type of viral membrane protein, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, $2, 4075-4079 (juni 1985), der angiver gensekvensen for G-glycoproteinet, og (5) Collins et al., Correct 20 Sequence for the Major Nucleocapsid Protein mrna of Respiratory Syncytial Virus, Virology, 146, 69-77 (1985), der angiver gensekvensen for 00 -proteinet. F- og G-glycoproteinerne af HRSV har lignende modstykker i de andre paramyxovira. Ligesom HRSV har andre 25 paramyxovira et F-glycoprotein, der er associeret med fusion af cellemembraner, jfr. P.W. Choppin og A. Scheid, Rev. Infect. Dis. 2., 40-61 (1980) og Merz et al., J. Exp. Med. 151, 275-288 (1980). Det aktive paramyxovirus F-protein består af disulfid-forbundne underenheder, F1 og F2, der 30 dannes ud fra en inaktiv precursor (F0) ved en specifik indre spaltning med cellulære proteaser, jfr. Scheid og Choppin, Virol. BO., 54-66 (1977). Det andet hoved-glycoprotein for de fleste paramyxovira betegnes HN-proteinet og er associeret med disse viras hæmagglutinin- og neuraminidase- 35 aktiviteter. Omend HRSV-G-proteinet ikke har de ovennævnte enzymatiske aktiviteter, er både G- og HN-glycoproteinerne
associeret med tilknytningen af virus. Disse glycoproteiner er også strukturelt lignende, idet de har en usædvanlig hydrofob signal-anker-region ved deres amino-terminal, jf. Wertz et al., PNAS Az, 4075-4079 (1985) og Elango et al., 5 J. Virol. U., 481-489 (1986). Der findes ingen tilgængelige effektive vacciner til bekæmpelse af HRSV. Talrige forsøg er blevet gjort på at opnå en virksom vaccine mod HRSV. Friedewald et al., Journal of the American Medical Association, 204, 690-694 (20. maj 10 1968), beskriver propageringen af respiratorisk syncytial virus i okseembryonisk nyrevævskultur. Virus, der dyrkes ved 34*C eller 28'C, får ikke nedsat infektivitet eller virulens. HRSV, der dyrkes ved 26'C, omend associeret med en nedsættelse af infektivitet for voksne, kan ikke komme i 15 betragtning til anvendelse til prævention af infektion hos voksne, eftersom viruset har begrænset infektivitet og er dårligt immunogent. Kim et al., Pediatrics, AR, 745-755 (november 1971) angiver, at inaktiveret respiratorisk syncytial virus-vaccine 20 fremstillet ud fra virus, der er dyrket ved 26'C, stimulerer udviklingen af høje niveauer af serum-antistof hos spædbørn og børn fra 6 måneder til 13 år, men hindrer ikke infektion. McIntosh et al., Pediatric Research, R, 689-696 (1974) diskuterer to eksperimentelle, levende respiratoriske syn- 25 cytial virus-vacciner, &I fremstillet ud fra virus dyrket ved 26'C, og den anden fremstillet ud fra en temperaturfølsom mutant, der vokser godt ved 32 C og slet ikke ved 37 C eller højere. Den første vaccine er utilfredsstillende, eftersom den ikke beskytter mod infektion, når intervallet 30 mellem vaccination og udsættelse for infektion er større end 4 måneder. Den anden vaccine er også utilfredsstillende derved, at den øjensynligt mister sin temperaturfølsomhed hos nogle vaccinerede individer. Craighead, Journal of Infectious Diseases, 121, 749-35 753 (juni 1975) diskuterer forsøg udført i 1966, hvor flere grupper af forskere hos spædbørn og mindre børn afprøvede 4
et formaldehyd-behandlet alun-udfældet virus dyrket i vævskultur. Ved påfølgende udsættelse for vild virus udviste modtagerne af vaccinen et accentueret mønster af åndedrætssystemlidelser. Craighead konkluderer, at immunisering med 5 formaldehyd-behandlet virus forøger sygdommens alvor. Wright et al., Journal of Pediatrics, AA, 931-936 (juni 1976) beskriver bedømmelsen hos spædbørn af en temperaturfølsom, levende attenueret respiratorisk syncytial vaccine. Omend denne vaccine, når den indgives i et dosis- 10 niveau, der er tilstrækkeligt højt til at inficere alle seronegative spædbørn, forårsager mild sygdom i det øvre respiratoriske system, opnås der ved nedsættelse af dosen ikke et acceptabelt niveau med hensyn til infektivitet. Viruset er også genetisk ustabilt, eftersom der er tegn på 15 tab af temperaturfølsomhed hos én vaccineret person. Der er tegn på potensering af naturlig sygdom med denne vaccine, og gen-infektion forekommer blandt de vaccinerede individer. I US patentskrifterne nr. 4.122.167 og nr. 4.145.252 beskrives en fremgangsmåde til attenuering af virioner ved 20 seriepassage gennem humane diploide lunge-fibroblaster, og i US patentskrift nr. 4.517.304 beskrives en metode til produktion af immunogenisk aktive HRSV-proteiner på cellemembranerne af udsatte celler, der dyrkes i kultur. Disse celler injiceres dernæst i en værtsorganisme til fremkaldelse 25 af et immunrespons. Det rekombinante vaccinia-virus-ekspressionssystem vides særskilt at udtrykke G- og F-glycoproteinerne af HRSV, jfr. Ball et al., Expression of the Major Glycoprotein G of Human Respiratory Syncytial Virus from Recombinant Vaccinia 30 Virus Vectors, P.N.A.S., USA, fil, 246-250 (1986) og Olmsted et al., Expression of the F Glycoprotein of Respiratory Syncytial Virus by a Recombinant Vaccinia Virus: Comparison of the Individuel Contributions of the F and G Glycoproteins to Host Immunity, P.N.A.S., USA, $2, 7462-7466 (1986). Disse 35 to glycoproteiner er også påvist at inducere immunobeskyttelse hos pattedyr mod en udsættelse for levende HRSV-virus, 5
jfr. Stott et al., Human Respiratory Syncytial Virus Glycoprotein G Expressed from Recombinant Vaccinia Virus Vector Protects Mice Against Live-virus Challenge, Journal of Virology, 2, 607-613 (1986), Walsh et al., Immunization with 5 Glycoprotein Subunits of Respiratory Syncytial Virus to Protect Cotton Rats Against Viral Infection, Journal of Infectious Diseases, 1198-1204 (1987), Wertz et al., Expression of the Fusion Protein of Human Respiratory Syncytial Virus from Recombinant Vaccinia Virus Vectors and Protection 10 of Vaccinated Mice, Journal of Virology, 293-301 (1987), og Elango et al., Resistance to Human Respiratory Syncytial Virus (RSV) Infection Induced by Immunization of Cotton Rats with a Recombinant Vaccinia Virus Expressing the RSV G Glycoprotein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1906-1910 (1986). 15 Den foreliggende opfindelse angår et polypeptid, der indeholder en signalsekvens og mindst ft immunogent fragment fra begge humane respiratoriske syncytiale virus-glycoproteiner F og G. Anvendelsen af dette protein som en vaccine, fremgangsmåder til hindring af HRSV-beslægtet sygdom og 20 fremstilling af dette protein under anvendelse af rekombinant-teknik omfattes også af den foreliggende opfindelse. De i det følgende definerede udtryk anvendes i nærværende beskrivelse. Udtrykket "cellekultur" refererer til samlingen af voksende celler afledt fra enten en multicel- 25 lulær plante eller et multicellulært dyr, der tillader cellerne at forblive levedygtige uden for den oprindelige plante eller det oprindelige dyr. Udtrykket "i nedadgående retning" identificerer sekvenser, der strækker sig længere i ekspressionsretningen, og kodningsregionen er f.eks. i nedadgående 30 retning fra initieringskodonen. Betegnelsen "mikroorganisme" omfatter både enkelte cellulære prokaryote og eukaryote organismer, f.eks. bakterier, actinomycetes og gærarter. Udtrykket "operon" er en komplet enhed af genekspression og -regulering, herunder strukturelle gener, regulator-gener 35 og kontrolelementer i DNA, der genkendes af regulator-genprodukt. Udtrykket "plasmid" refererer til en autonomt selv- 6
replikerende, extrakromosomal cirkulær DNA og omfatter både ekspressions- og ikke-ekspressionstyperne. Når en rekombinant mikroorganisme eller cellekultur beskrives som vært for et ekspressionsplasmid, omfatter udtrykket "ekspressionsplasmid" 5 både extrakromosomal, cirkulær DNA og DNA, der er blevet inkorporeret i værtkromosomet eller -kromosomerne. Når et plasmid opretholdes af en værtcelle, replikeres plasmidet enten stabilt af cellerne under mitose som en autonom struktur eller som en inkorporeret del af værtens genom. Udtrykket 10 "promotor" er en region af DNA, der er involveret i bindingen af RNA-polymerasen til initiering af transkription. Udtrykket "DNA-sekvens" refererer til et enkelt- eller dobbeltstrenget DNA-molekyle, der er sammensat af nucleotidbaser, adenosin, thymidin, cytosin og guanosin. Udtrykket "i det væ- 15 sentlige rent" refererer til en sammensætning af protein, der ikke indeholder andet paramyxovirus-protein end det ønskede rekombinante kimære glycoprotein. Skønt de i det væsentlige rene proteiner kan være forurenet med lave niveauer af værtcellebestanddele, er proteinet frit for for- 20 urenende strukturelt og ikke-strukturelt viralt protein, der produceres af replikerende paramyxovira. Udtrykket "egnet vært" refererer til en cellekultur eller mikroorganisme, der er kompatibel med et rekombinant plasmid og vil tillade plasmidet at replikere til inkorporering i dets genom eller 25 til at blive udtrykt. Udtrykket "i opadgående retning" identificerer sekvenser, der skrider frem i modsat retning af ekspressionen. Eksempelvis er den bakterielle promotor i opadgående retning fra transkriptionsenheden, medens initierings-kodonen er i opadgående retning fra kodningsre- 30 gionen. Den foreliggende opfindelse omfatter en række molekylære, genetiske manipulationer, der kan opnås på en række forskellige, kendte måder. Manipulationerne kan opsummeres som opnåelse af en cdna af proteinet, kloningen og replike- 35 ringen af cdna'et i E. coli og ekspressionen af den ønskede cdna i en egnet vært. De følgende beskrivelser vil i detaljer 7
angive de forskellige metoder, der er tilgængelige til at udtrykket proteinet, og efterfølges af specifikke eksempler på foretrukne metoder. De specifikke sekvens- og basenummererings-positioner for et bestemt polypeptid, glycoprotein 5 FG, er angivet i skema 9. Generelt kan den nomenklatur og de generelle laboratorieprocedurer, der kræves i forbindelse med den foreliggende opfindelse, findes i Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 10 Cold Spring Harbor, New York, 1982 (Maniatis). Alle E. coli-stammer dyrkes på Luria-næringsmedium (LB) med glucose, Difco's Antibiotic Medium nr. 2 og M9- medium suppleret med glucose og syre-hydrolyserede caseinaminosyrer. Stammer med resistens over for antibiotika holdes 15 ved de lægemiddelkoncentrationer, der er beskrevet i Maniatis. Transformationer udføres i overensstemmelse med den metode, der er beskrevet af Rowekamp og Firtel, Dev. Biol., 22, 409-418 (1980). Alle enzymer anvendes i overensstemmelse med fabri- 20 kantens instruktioner. Transformanter analyseres ved kolonihybridisering som beskrevet i Grunstein og Wallis, Methods in Enzymology, 379-388. Efter hybridisering fjernes sonderne og opbevares, og filtrene vaskes i 0,1% SDS, 0,2x SSC i i alt 3 timer med 25 5 ændringer på hver 400 ml. Filtrene lufttørres grundigt, monteres og autoradiograferes under anvendelse af Kodak X- OMAT AR-film og Dupont Cronex Lightnening Plus-intensificerings-sigter i 16 timer ved -70 C. Til sekvensbestemmelse af plasmider fremstilles renset 30 plasmid-dna i overensstemmelse med de metoder, der er beskrevet i Maniatis. Ende-mærkede DNA-fragmenter fremstilles og analyseres ved de kemiske sekvensbestemmmelsesmetoder ifølge Maxam og Gilbert med de modifikationer, der er beskrevet af Collins og Wertz, J. Virol., 65-71 (1985). 35 Nucleotidstørrelser er angivet i enten kilobaser (kb) eller basepar (bp). De pågældende værdier er anslåede 8
værdier, der hidrører fra agarosegel-elektroforese. Det første trin til opnåelse af ekspression af protein er opnåelse af den DNA-sekvens, der koder for proteinet fra cdna-kloner. Denne sekvens klones derpå i et ekspressions- 5 plasmid, der er i stand til at dirigere transkription af genet og tillade effektiv translation af transkriptionen. Biblioteksmetoden til opnåelse af cdna-kodende protein er beskrevet generelt i Maniatis og specifikt i Collins og Wertz, cdna Cloning and Transcriptional Mapping of Nine 10 Polyadenylated RNAs Encoded by the Genome of HRSV, Proc. Natl. Acad. USA A2, 3208-3213 (1983) og de dermed relaterede publikationer N. Elango et al., Resistance to Human Respiratory Syncytial Virus (RSV) Infection induced by Immunization of Cotton Rats with a Recombinant Vaccinia Virus Ex- 15 pressing the RSV G Glycoprotein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1906-1910 (1986) og R.A. Olmstead et al., Expression of the F Glycoprotein of Respiratory Syncytial Virus by a Recombinant Vaccinia Virus: Comparison of the Individual Contributions of the F and G glycoproteins to Host Immunity, 20 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7462-7466 (1986). Kloner fremstilles ved indsætning af cdna i PstIspaltet pbr322, til hvilket homopolymere dele af dgtp enzymatisk er blevet tilført ved 3'-enderne ved spaltningsstedet. Homopolymerdele af dctp sættes enzymatisk til 3'- 25 endestillingerne af cdna-molekylerne i overensstemmelse med de metoder, der er beskrevet af Mainatis. Ideelt set bør der tilføres 10-30 rester af dctp eller dgtp til maksimering af kloningseffektiviteten. cdna'en og plasmidet sammenføres og transformeres i E. coli. Klonerne indeholdende cdna med 30 fuld længde detekteres med sonder af mærket viral cdna eller oligonucleotider, der er komplementære til dele af gensekvenserne, efterfulgt af restriktionsenzymanalyse og DNAsekvensbestemmelse. Oligonucleotider syntetiseres kemisk i overensstem- 35 melse med phosphoramidit-triester-metoden i fast fase, der først er beskrevet af Beaucage og Caruthers, Tetrahedron 9 DK 173175 B1
Letters, 22 (20), 1859-1862 (1981), under anvendelse af et automatiseret synteseapparat som beskrevet i Needham-Van- Devanter et al., Nucleic Acids Res., 22, 6159-6168 (1984). Rensning af oligonucleotider sker enten ved nativ acrylamid- 5 gelelektroforese eller ved anionbytnings-hplc som beskrevet af Pearson og Regnier, J. Chrom., 255, 137-149 (1983). Sekvensen af de syntetiske oligonucleotider kan verificeres ved anvendelse af den kemiske nedbrydningsmetode ifølge Maxam og Gilbert, Grossman og Moldava, eds., Academic 10 Press, New York, Methods in Enzymology, Z, 499-560 (1980). Til opnåelse af et højt niveau af ekspression af et klonet gen i et prokaryotisk system er det essentielt at konstruere ekspressionsvektorer, der som et minimum indeholder en kraftig promotor til dirigering af mrna-transkription, 15 et ribosom-bindingssted til translations-initiering, og en transkriptionsterminator. Eksempler på regulatoriske regioner, der er egnede til dette formål, er promotor- og operator-regionen af E. coli-tryptophan-biosyntesevejen, der er beskrevet af Yanofsky, Kelley og Horn, J. Bacteriol., 158, 20 1018-1024 (1984) og den venstrevendte promotor af phag lambda (PL) som beskrevet af Herskowitz og Hagen, Ann. Rev. Genet., 399-445 (1980). Proteinerne produceret i E. coli vil ikke foldes på korrekt måde på grund af tilstedeværelsen af cystein-rester 25 og på grund af manglen på egnede post-translationelle modifikationer. Under rensning fra E. coli skal de udtrykte proteiner først denatureres og dernæst renatureres. Dette kan udføres ved opløseliggørelse af de E. coli-producerede proteiner i guanidin-hc1 og reduktion af alle cystein-rester- 30 ne med fi-mercaptoethanol. Proteinet renatureres derpå enten ved langsom dialyse eller ved gelfiltrering, jfr. US patentskrift nr. 4.511.503. Detektering af proteiner opnås ved metoder, der er kendte i teknikken, f.eks. radioimmunobestemmelser eller 35 Western blotting-metoder eller immunoudfældning. Rensning fra E. coli kan ske under anvendelse af metoder, der er 1 0
beskrevet i US patentskrift nr. 4.511.503. Ekspression af heterologe proteiner i gær er velkendt og beskrevet. Methods in Yeast Genetics, Sherman et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982) er et anerkendt værk, 5 der beskriver de forskellige metoder, der anvendes til produktion af proteiner i gær. Til opnåelse af et højt niveau af ekspression af et gen i gær er det essentielt at forbinde genet til et kraftigt promotor-system som i prokaryoten og også at tilvejebringe 10 effektiv transkriptions-terminerings-/polyadenylerings-sekvenser fra et gær-gen. Eksempler på egnede promotor-forbindelser omfatter GAL1,10, jfr. Johnston og Davis, Mol. and Cell. Biol., A, 1440-1448 (1984), ADH2, jfr. Russell et al., J. Biol. Chem. 258, 2674-2682 (1983), PHO5, EMBOJ. 15 675-680 (1982) og MFal. Et multikopi-plasmid med en selektiv markør såsom Lue-2, URA-3, Trp-1 eller His-3 er også ønskeligt. MFal-promotoren foretrækkes. MFal-promotoren i en vært af a-associerings-typen er konstitutiv, men mangler diploider eller celler med a-associations-typen. Den kan imidlertid 20 reguleres ved forøgelse eller formindskelse af temperaturen i værter, der har en ts-mutation ved ft af SIR-stederne. Virkningen af en sådan mutation ved 35 C på en celle af a- typen er en aktivering af det normalt "tavse" gen, der koder for a-associerings-typen. Ekspressionen af det "tavse" a- 25 associations-type-gen ophæver igen virkningen af MFal-promotoren. Ved formindskelse af væksttemperaturen til 27 C reverseres hele processen, dvs. at a-associerings-typen fjernes, og MFal aktiveres, jfr. Herskowitz og Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern, Jones og 30 Broach, eds., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY, 181-209 (1982). Polyadenylerings-sekvenserne tilvejebringes ved 3'- endesekvenserne af ethvert af de højt udtrykte gener, f.eks. ADH1, MFal eller TPI, jfr. Alber og Kawasaki, J. of Mol. 35 and Appl. Genet. 1, 419-434 (1982). Et antal gærekspressionsplasmider såsom YEp6, YEp13 1 1
DK 173175 Bi og YEp24 kan anvendes som vektorer. Et gen, der har interesse, kan fusioneres til enhver af de ovennævnte promotorforbindelser og dernæst ligateres til plasmiderne til ekspression i forskellige gær-værter. Disse plasmider er fuld- 5 stændigt beskrevet i litteraturen, jfr. Botstein et al., Gene, A, 17-24 (1979) og Broach et al., Gene, 1, 121-133 (1979). Der anvendes to metoder ved transformering af gærceller. I itt tilfælde omdannes gærceller først til proto- 10 plaster under anvendelse af zymolyase, lyticase eller glusulase, efterfulgt af tilsætning af DNA og polyethylenglycol (PEG). De PEG-behandlede protoplaster regenereres derpå i et 3%'s agarmedium under selektive betingelser. Enkeltheder ved denne metode er angivet i offentliggørelserne af Beggs, 15 Nature (London), 275, 104-109 (1978) og Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7, 1929-1933 (1978). Den anden metode involverer ikke fjernelse af cellevæggen. I stedet behandles cellerne med lithiumchlorid eller -acetat og PEG og anbringes på selektive plader, jfr. Ito et al., J. Bact. 153, 163-168 20 (1983). cdna'en kan ligateres til forskellige ekspressionsvektorer til anvendelse ved transformation af værtscellekulturer. Vektorerne indeholder alle gensekvenser til initiering af transkription og translation af de proteiner, der er 25 forenelige med den værtscelle, der skal transformeres. Desuden indeholder vektorerne fortrinsvis en markør til tilvejebringelse af en phenotypisk egenskab til udvælgelse af transformerede værtsceller, f.eks. dihydrofolat-reduktase eller metallothionein. Desuden kan en replikationsvektor 30 indeholde en replikon. Illustrerende eksempler på cellekulturer, der kan anvendes til produktionen af proteiner, er celler af insekteller pattedyroprindelse. Pattedyrs-cellesystemer vil ofte være i form af monolag af celler, omend der også kan anvendes 35 pattedyrs-cellesuspensioner. Illustrerende eksempler på pattedyrs-cellelinjer omfatter VERO- og HeLa-celler, kine- 12
sisk hamsterovarie-cellelinjer (CHO), WI38, BHK, COS-7 eller MDCK-cellelinjer. Som angivet ovenfor indeholder den vektor, der anvendes til at transformere værtscellen, fortrinsvis gensekvenser 5 til initiering af transkriptionen og translationen af proteinets gensekvens. Disse sekvenser betegnes som ekspressions-kontrolsekvenser. Når værtscellen er af pattedyr- eller insektoprindelse, opnås illustrerende, anvendelige ekspressions-kontrolsekvenser fra SV-40-promotoren, jfr. Science, 10 221, 524-527 (1983), CMV I.E.-promotoren, jfr. Proc. Natl. Acad. Sci. Al, 659-663 (1984), metallothionein-promotoren, jfr. Nature, 296, 39-42 (1982) eller baculovirus-polyhedrinpromotoren (insektceller), jfr. Virol., 131, 561-565 (1983). Plasmidet eller replikerende eller integrerende DNA-materiale 15 indeholdende ekspressions-kontrolsekvenserne spaltes under anvendelse af restriktionsenzymer og indstilles i størrelse som nødvendigt eller ønskeligt og ligateres med cdna, der koder for proteiner, under anvendelse af metoder, der er velkendte i teknikken. 20 Ligesom i tilfældet med gær skal der, når der anvendes højere dyre-værtsceller, inkorporeres polyadenylerings- eller transkriptions-terminator-sekvenser fra kendte pattedyrsgener i vektoren. Et eksempel på en terminator-sekvens er polyadenylerings-sekvensen fra oksevæksthormon-genet. 25 Yderligere gen-sekvenser til regulering af replikation i værtscellen kan inkorporeres i vektoren, f.eks. sådanne, der findes i okse-papillomavirus-type-vektorer, Saveria- Campo, "Bovine papilloma-virus DNA: a eukaryotic cloning vector", DNA Cloning Vol. II - A practical approach, Glover, 30 ed., IRL Press, Arlington, Virginia, 213-238 (1985). Den foretrukne ekspressionsvektor, der anvendes til at udtrykke proteiner i kinesiske hamsterovarie-celler (CH0), er en overføringsvektor psvcow7, der replikerer i både CHOog E. coli-celler under udnyttelse af ampicillin-resistens, 35 og dihydrofolat-reduktase-gener som markører i henholdsvis E. coli- og CHO-celler. Plasmid psvcow7 tilvejebringer også 13
den polyadenylerings-sekvens fra oksevæksthormon, der er nødvendig til ekspression i CHO-celler. Plasmid psvcow7 spaltes, og der indsættes en viral promotor og cdna'er. Den foretrukne ekspressionsvektor, der anvendes ved 5 dannelse af rekombinant baculovirus til ekspression af proteiner i insektceller, er pac373, jfr. Smith et al., Mol. Cell. Biol., 2, 2156-2165 (1983). Plasmidet replikerer i E. coli-celler under udnyttelse af ampicillin-resistens og tilvejebringer det eukaryotiske promotor- og polyadenyle- 10 rings-signal fra baculovirus-polyhedrin-genet til ekspression af gener. Plasmid pac373 spaltes, og en cdna indsættes stødende op til promotoren. Dette nye plasmid cotransficeres med baculovirus (Autograpa californica kerne-polyhedrosisvirus)-dna i insektceller ved calciumphosphat-fældning. 15 Rekombinant baculovirus, i hvilket pac373-polyhedvin-genet indeholdende en cdna er erstattet med det residente virale polyhedrin-gen ved homolog rekombination, detekteres ved "dot blot"-hybridisering under anvendelse af 32P-mærket cdna som en sonde, jfr. Summers og Smith, a Manual of Methods 20 for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas A & M University, College Station, TX, 29-30 (1986). Insektceller inficeret med rekombinant baculovirus kan også differentieres ved hjælp af deres okklusions-negative morfologi, eftersom indsætningen af cdna'en i polyhedrin-genet 25 hindrer syntesen af dette okklusions-dannende protein. Den foretrukne ekspressionsvektor, der anvendes i forbindelse med okse-papilloma-virus (BPV) til ekspression af proteiner, er ptfw9 (plasmidet ptwf9 er deponeret i overensstemmelse med Budapest-traktaten. Plasmid ptfw9 opret- 30 holdes i en E. coli-vært og er deponeret ved Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, USA, den 17. november 1986 og har fået deponeringsnummeret NRRL B-18141). Plasmidet replikerer i E. coli under udnyttelse af ampicillin-resistens og tilvejebringer muse-metallothionein-promo- 35 toren og SV40-polyadenylerings-signalet til ekspression af gener. Plasmid ptfw9 spaltes, og en cdna indsættes stødende 14
op til promotoren. Dette nye plasmid spaltes derpå for at tillade indsætning af BPV. Det rekombinante plasmid transficeres i dyreceller ved calciumphosphat-fældning, og foci af transformerede steder udvælges. 5 Værtscellerne er kompetente eller gøres kompetente til transfektion ved forskellige metoder. Der findes flere velkendte metoder til indføring af DNA i dyreceller. Disse omfatter følgende: calciumphosphat-fældning, fusion af de modtagende celler med bakterielle protoplaster indeholdende 10 DNA'en, behandling af de modtagende celler med liposomer indeholdende DNA'en og mikroinjektion af DNA'en direkte i cellerne. De transficerede celler dyrkes ved metoder, der er velkendte i teknikken, jfr. Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, Dowden, Hutchinson og Ross, 15 Inc. (1977). Rekombinante glycoproteiner udtrykt i et af de ovennævnte eukaryotiske ekspressionssystemer isoleres fra cellesuspensioner dannet ved sprængning af værtscelle~et ved kendte mekaniske eller enzymatiske metoder. Proteiner, der er udformet til at blive udskilt fra cellerne, isoleres 20 fra medierne uden sprængning af cellerne. Til rensning af glycoproteiner er det en hjælp først at påføre den cytoplasmiske fraktion på en lentil-lectin-søjle, der specifikt vil binde glycoproteiner. De eluerede glycoproteiner påføres dernæst på en affinitetssøjle indeholdende antistof. 25 Et typisk glycoprotein kan opdeles i tre regioner. Ved aminoterminalenden findes der en hydrofob region, der betegnes som signalsekvensen. Denne sekvens af aminosyrer signalerer transporten af glycoproteinet til cellemembranen. Efter transporten fjernes signalsekvensen ved spaltning. I 30 nedadgående retning fra signalsekvensen findes det extracellulære domæne af det modne glycoprotein. Dette er den immunogene del af glycoproteinet, eftersom det er tilgængeligt for antistoffer. Ved carboxy-terminalenden af glycoproteinet findes den hydrofobe anker-region, der bevirker, at glyco- 35 proteinet bibeholdes i cellemembranen. HRSV F er et typisk glycoprotein derved, at det indeholder en amino-terminal 15 DK 173175 B1
16 DK 173175 B1 signalsekvens og carboxy-terminal ankersekvens, jfr. Collins et al., PNAS fil, 7683-7687 (1984). HRSV G-glycoproteinet er imidlertid usædvanligt, eftersom dets aminoterminale ende fungerer både som en signal- og en anker-region, jfr. Wertz 5 et al., PNAS, 4075-4079 (1985). Et glycoprotein kan udformes til at blive udskilt fra celler i de omgivende medier. Dette udføres ved at forårsage en tidlig terminering af glycoproteinet forud for transkription af anker-regionen, jfr. Lasky et al., Biotech- 10 nology, a, 527-532 (1984). Tidlig terminering kan opnås ved indsætning af et universalt translationelt terminator-oligonucleotid på et passende sted i genets DNA. Disse oligonucleotider er kommercielt tilgængelige. Tidlig terminering kan også opnås ved ændring af aflæsningsrammen, hvorved der 15 dannes en translationel termineringskodon. Det nedenfor beskrevne kimære glycoprotein består af signal- og extracellulære domæner af HRSV F forbundet til det extracellulære domæne af HRSV G og vil blive betegnet som FG. Hovedparten af det extracellulære domæne af G glyco- 20 proteinet er indeholdt i den kodningsregion, der spændes over af DdeI (nucleotid-stilling 302) og FoKI (nucleotidstilling 850)-restriktionsenzymstederne. Denne sekvens koder ikke for signal/ankerregionen af glycoproteinet. Hovedparten af det extracellulære domæne af F-glycoproteinet er indeholdt 25 i kodningsregionen forud for NsiI (nucleotid-stilling 1479)- restriktionsenzynstedet. Denne sekvens koder for signalregionen og hovedparten af den antigene region, men ikke ankerregionen af glycoproteinet. Til indsætning af G-glycoproteinsekvensen i F-glyco- 30 proteinet fordøjes plasmidet G-16 indeholdende HRSV gpg med DdeI og FoKI, og enderne gøres stumpe med Klenow-polymerase. 550 bp-fragmentet isoleres dernæst ved agarosegel-elektroforese. Plasmidet pgpf-4 indeholdende HRSV gpf-genet fordøjes med NsiI. Enderne gøres stumpe med T4-DNA-polymerase og 35 dephosphoryleres med bakteriel alkalisk phosphatase. 550 bp-fragmentet fra G-16 ligateres derpå i pgpf-4-plasmidet
17 DK 173175 B1 og transformeres i E. coli HB101. /.1 af klonerne, pgpfg-1, der isoleres fra transformationen, verificeres som havende de korrekte forbindelser ved hjælp af Maxim-Gilbert-sekvensbestemmelse. 5 Når det er korrekt anbragt i en eukaryotisk ekspressionsvektor, er det ovenfor beskrevne FG-gen udformet til at udtrykke et kimært glycoprotein, der vil transporteres til cellens overflade og sekreteres i medierne. De ovennævnte restriktions-enzymsteder vælges, efter- 10 som de tillader ekspressionen af en stor andel af de relevante regioner af F- og G-glycoproteinerne. Andre dele af glycoproteinerne kan imidlertid udtrykkes ved udvælgelse af andre restriktionsenzymsteder i F- og G-kodningssekvenserne til fusion af disse gener. Eksempelvis kan restriktionsen- 15 zymerne Alul, HincII eller Hinfl anvendes til spaltning ved 5'-enden af gpg-genet. Restriktionsenzymerne HphI, MboII eller XhoII kan anvendes til spaltning ved 3'-enden af gpggenet. Enzymerne kan anvendes i enhver kombination af to, idet ft enzym hidrører fra hver gruppe, til dannelse af 20 immunogene proteinfragmenter. For gpf-genet kan HinfIII, HincII, AvaII, SspI eller Hphi-restriktionsenzymerne anvendes i stedet for NsiI. Linker-oligonucleotider kan tilsættes til korrektion af aflæsningsrammen i forbindelsesregionerne. To oligonucleotider, der vil korrigere de to mulige ram- 25 meændringer, er SalI-forbindelsesstykkerne GGTCGACC og CGGTCGACCG CCAGCTGG GCCAGCTGGC der er kommercielt tilgængelige. Når der ønskes en ankerregion i glycoproteinet, tilsættes et linker-oligonucleotid 30 også ved den anden forbindelse til at tillade syntese af gpf-ankerregionen. Alternative strategier kan udformes til ekspression af et FG-fusionsprotein ved indsætning eller deletion af forskellige sekvenser. Hovedkriteriet for proteinet er bibeholdelsen af en signalsekvens og de immunolo- 35 gisk betydningsfulde regioner af de to glycoproteiner. Indsætning af FG-gen i CHO-, BPV- eller baculovirus-
ekspressionsvektorer er allerede beskrevet. Det kimære FG-glycoprotein frembyder fordele i forhold til ekspressionen af de individuelle glycoproteiner. Eftersom FG er et enkelt protein, kræver det halvdelen af 5 arbejdet og reagenserne til rensning sammenlignet med de særskilte F- og G-glycoproteiner. Det kimære FG-glycoprotein sekreteres også i medierne til lettelse af rensningen. F- glycoproteinet kan udformes som et sekreteret glycoprotein ved afskæring forud for anker-regionsekvenserne. HRSV G- 10 glycoproteinet indeholder imidlertid en signal/anker-region ved dets amino-terminale ende. Afskæring af dette glycoprotein vil derfor ikke tilvejebringe en sekreteret form. Signal/anker-regionen kan erstattes med en signalregion fra et fremmed glycoprotein, men herved vil der indføres fremmede 15 proteinsekvenser i den potentielle vaccine. HRSV F- og G-glycoproteinerne er blevet udtrykt under anvendelse af et vaccinia-virus-ekspressionssystem, og disse rekombinante vira er blevet anvendt som vacciner ved beskyttelse af bomuldsrotter ("cotton rats") mod HRSV-infektion, 20 jfr. Olmsted et al., PNAS $2, 7462-7466 (1986). Vacciniavirus, der udtrykker F-glycoproteinet, er signifikant mere immunugent og tilvejebringer bedre beskyttelse end vacciniavirus, der udtrykker G-glycoproteinet, jfr. Olmsted et al., se ovenfor. Vaccination med begge vira synes ikke at have 25 en additiv effekt i forhold til F alene, jfr. Olmsted et al., se ovenfor. I modsætning hertil synes det sekreterede FG-glycoprotein at være mere immunogent og at tilvejebringe bedre beskyttelse end en sekreteret form af F-glycoproteinet. Vaccination af bomuldsrotter med FG-proteinet giver også en 30 højere procentdel af neutraliserende antistof som defineret ved ELISA til neutralisationsforholdet. t forsøg er udformet til sammenligning af immunogeniteten af FG og afskåret F (Ft). Eftersom de rekombinante glycoproteiner ikke kan detekteres i ConA (et lectin, der 35 binder glycoproteiner)-rensede ekstrakter ved hjælp af Commasie-blue-farvning af proteiner, der er elektroforesebe- 18
handlet i SDS-PAGE-geler (formodentlig mindre end 1% af proteinet), anvendes der en indirekte metode til bestemmelse af ækvivalente mængder af glycoproteinerne. Densitometeraflæsninger af autoradiogrammer indeholdende 35S-methionin- 5 mærket protein, der er blevet elektroforesebehandlet på en SDS-PAGE-gel, anvendes til bestemmelse af den relative mængde af FG og Ft i prøverne (FG og Ft indeholder det samme antal methioniner). Disse samme prøver undersøges dernæst ved hjælp af ELISA, og det findes, at ækvivalente mængder af FG 10 reagerer 3 gange bedre end Ft ved den anvendte ELISA-analyse. Mængden af FG eller Ft i prøverne fremstillet til vaccination bestemmes dernæst ved hjælp af ELISA og equaliseres i overensstemmelse med det ovennævnte forhold. Grupperne ved den anvendte undersøgelse er FG, Ft (høj dosis), Ft (lav dosis) 15 og gp50 (negativ kontrol). Bomuldsrotterne vaccineres tre gange i Freund's adjuvans, idet der anvendes 500 pg totalt protein pr. dosis. Mængden af specifikt glycoprotein i FGgruppen er ækvivalent med lavdosis-ft-gruppen. Højdosis-Ftgruppen modtager 3 gange mere specifikt glycoprotein. En 20 sammenfatning af de fra denne undersøgelse opnåede data er angivet i det følgende: 19 25 30 LUNGE TITER ELISA-TITER NEUTRAL TITER ELLMEITML Gruppe (pfu/gm lunge) (50% ende pt) (50% ende pt) Forhold FG <55 1300 850 1,53 Ft høj 2,0 x 10 2 1400 285 4,91 Ft lav 6,1 x 10 3 1000 206 4,85 gp50 2,7 x 10 5 <100 40 ND (ikke bestemt) Den ovenfor omtalte undersøgelse viser effektiviteten af det kimære FG-glycoprotein under anvendelse af rå præparater af FG i Freunds's adjuvans. Til påvisning af effektiviteten af FG til at inducere høje titere af neutralise- 35 rende antistof og beskyttelse af bomuldsrotter mod RSV-påvirkning, foretages der en undersøgelse under anvendelse af
mere rensede præparater af FG sammensat i et adjuvans, der er acceptabelt til human anvendelse (alun). FG renses til 50%'s homogenitet under anvendelse af en totrinsmetode, der involverer kationbytning og monoklonale antistof-affinitets- 5 søjler. Ft-glycoproteinet renses til 50%'s homogenitet ved lentil-lectin-chromatografi, efterfulgt af monoclonalt antistof-affinitetschromatografi. Bomuldsrotter vaccineres to gange med disse glycoproteiner adsorberet i alun (2,5 mg pr. dosis). Ln gruppe rotter vaccineres intranasalt med 10 levende RSV som en positiv kontrol. hl gruppe rotter vaccineres med alun-adjuvanset som en negativ kontrol. Rotter fra hver gruppe afprøves for serum og neutraliserende antistof. Rotterne udsættes for RSV, og lungerne analyseres for viruset. 15 Gruppe Serum antistof Neut. antistof 20 Antal in- ficeret total Gennemsnitlig lungetiter hos inficerede rotter 20 25 25 Etg FG + alun 19500 2834 0/7 5 Etg FG + alun 19200 2027 0/6 1 Etg FG + alun 12000 4096 3/7 3,5 x 10 2 25 Etg FG + CFA 21500 5029 1/7 1,0 x 10 2 25 Etg FT + alun 13500 263 2/7 3,0 x 10 2 5 Etg FT + alun 13000 194 4/7 6,7 x 10 2 alun-indhold <500 10 7/7 9,7 x 104 RSV I.N. 7100 217 1/7 50 Konventioner, der anvendes til at repræsentere plas- 30 mider og fragmenter i de følgende skemaer nr. 1-6, skal være synonyme med konventionelle cirkulære fremstillinger af plasmider og deres fragmenter. I modsætning til de cirkulære figurer repræsenterer de enkeltlinjede figurer i skemaerne både cirkulær og lineær dobbeltstrenget DNA med initiering 35 eller transkription forekommende fra venstre til højre (5' til 3'). Stjerner (*) repræsenterer brodannelse af nucleotider til fuldstændiggørelse af den cirkulære form af plas-
miderne. Fragmenter har ikke nogen stjernemarkeringer, eftersom de er lineære stykker af dobbeltstrenget DNA. Endonuclease-restriktionssteder er angivet over linjen. Gen-markører er angivet under linjen. Linjestykker angivet under 5 diagrammerne, der repræsenterer plasmidet eller fragmenter, anvendes til at angive antallet af basepar mellem to punkter på DNA'en. Den relative afstand mellem markører angiver ikke faktiske afstande, men skal blot indikere deres relative positioner på den illustrerede DNA-sekvens. 10 Opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende udførelseseksempler. Eksempel i WB. e n I- e CO I en Iffil. 15 Til opnåelse af maksimal ekspression af F-glycoproteinet skal de G-C-nucleotider, der anvendes til at indsætte cdna'en i plasmidet pbr322, fjernes fra 5'-enden (i forhold til den oprindelige mrna) af cdna'en. Til bekvem indsætning af gpfg-cdna'en i den foretrukne ekspressionsvektor for 20 CHO-celler, psvcow7 (beskrevet nedenfor), er det nødvendigt at tilføre et BamHI-sted i opadgående retning fra proteinkodningssekvensen. Til opnåelse af dette indsættes cdna'en af F-glycoprotein i puc12 (PL Pharmacia Labs, Piscataway, NJ). Metoder til syntese af cdna-klonen F5-25, der indeholder 25 hele sekvensen for F-glycoproteinet, er blevet beskrevet, jfr. Collins et al., Nucleotide sequence of the gene encoding the fusion (F) glycoprotein of human respiratory syncytial virus, jfr. J. Virol., fil, 7683-7687 (december 1984). 30 A. Konstruktion af tgpf2 - Skema 1 cdna'en af F-glycoproteinet flankeres af PstI-steder (skema 1), men der findes imidlertid også indre PstI-steder. Plasmidet pf5-25 fordøjes derfor partielt med Pst/ og fragment 1 (1,9 kb) isoleret fra en gel. Fragment 1 ligateres 35 til plasmidet puc12 (Bethesda Res. Labs., Rockville, MD), der er blevet fordøjet med PstI. Et plasmid med 5'-enden af 21
22 DK 173175 B1 gpf-genet stødende op til XbaI-stedet i puc12 udvælges og betegnes pgpf2 (4,6 kb). Denne orientering verificeres ved spaltning med NsiI og HindIII, der danner et fragment på ca. 400 bp. 5 B. Konstruktion af pgpf3 _og pgpf4 - Skema ^, Til fjernelse af G-C-nucleotiderne fra 5'-enden af cdna'en åbnes pgpf2 med XbaI, og enderne behandles med bakteriel alkalisk phosphatase til dannelse af fragment 3. 10 Fragment 3 fordøjes derpå med Salt, der afskærer et lille stykke mellem Xba/- og PstI-stederne, og behandles med Klenow-enzym til afglatning af enderne. Efter behandling med Klenow-enzym fordøjes fragment 3 med Lambda-exonuclease, der kræver et 5'-phosphat og efterlader et 3'-overhæng. På 15 grund af fjernelsen af 5'-phosphatet på den ende, der befinder sig i opadgående retning fra gpf, vil exonucleasen fordøje i nedadgående retning mod gpf-sekvensen. Exonucleasen gives tilstrækkelig tid til fjernelse af nucleotider udover G/C-hale-regionen ind i leder-sekvensen. En syntetisk sekvens 20 indeholdende de første 15 baser af ledersekvensen hybridiseres til fragment 4, og de manglende baser udfyldes med Klenow-enzym, og enderne ligateres med T4-ligase, hvorved der fås pgpf3 (4,6 kb), der transformeres i E. coli, og sekvensen verificeres. 25 Til fjernelse af G-C-nucleotiderne fra 3'-enden af cdna åbnes pgpf3 med HindIII og behandles med exonucleasen Bal 31 i et tilstrækkeligt tidsrum til fordøjelse gennem G- C-nucleotiderne. Enderne gøres stumpe med Klenow-enzym, og cdna-klonen befries for vektor-dna'en ved digestion med 30 BamHI. cdna-fragmentet isoleres fra en gel og ligateres til plasmid puc12, der er blevet fordøjet med BamHI og Hincil (HincII er foreneligt med stumpe ender) til dannelse af pgpf4. Plasmidet transformeres i E. coli, og en passende klon, der er tilstrækkeligt fordøjet med Ba131, identificeres 35 ved sekvensbestemmelse. Alternativt kan G-C-nucleotiderne fjernes ved fordøjelse med et restriktionsenzym, der har et
unikt sted i opadgående retning fra G-C-nucleotiderne. For gpf vil en sådant enzym være HaeII. Eftersom HaeIII spalter i opadgående retning fra F-genets normale translations-terminations-signal, vil et universelt translations-termina- 5 tioms-oligonucleotid (New England Biolabs) ligateres på F- cdna'en efter fordøjelse med HaeIII. DNA'en vil dernæst fordøjes med BamHI og behandles som beskrevet ovenfor til dannelse af pgpf-4. 10 Eksempel 2 23 Klon G2B-16 indeholdende hele kodningsregionen for HRSV-G-glycoproteinet er blevet beskrevet, jfr. Wertz et 15 al., Nucleotide sequence of the G protein gene of human respiratory syncytial virus reveals an unusual type of viral membrane protein, PNAS,.112., 4075-4079 (1985). Klon G2B-16 indeholdende G-glycoprotein-cDNA'en fordøjes med DdeI og FoKI, og enderne gøres stumpe med E. coli-dna-polymerase 20 (Klenow-fragment). DNA'en elektroforesebehandles derpå i en 1,5%'s agarose-gel. 550 bp-fragmentet (fragment 4) indeholdende den relevante region af G-genet udskæres fra gelen, og DNA'en renses fra agarosen. 25 B. Indsætning af G-cDNA-fragmentet i HRSV-F-4ycoproteingenet Plasmidet pgpf4 (Skema 2) fordøjes med Nsil. Enderne gøres stumpe med T4 DNA-polymerase og dephosphoryleres dernæst med bakteriel alkalisk phosphatase. 550 bp-fragmentet 30 af G-cDNA'en ligateres derpå i plasmid pgpf4 til dannelse af det kimære FG-gen (pgpfg-1). Plasmidet transformeres i E. coli HB101. Kloner isoleres og udvælges for korrekt orientering af G-cDNA'en i F-genet ved fordøjelse med Hinfl, der vil danne forbindelsesfragmenter på 875 bp og 186 bp. Den 35 ukorrekte orientering af G-fragmentet vil give forbindelsesfragmenter på 650 bp og 400 bp ved Hinfl-fordøjelse. Forbin-
delsesregionerne af en på korrekt måde orienteret klon verificeres derpå som værende korrekt ved Maxam-Gilbert-sekvensbestemmelse. Ifølge det ovenstående eksempel vil der dannes et 5 gen, der koder for et kimært glycoprotein indeholdende signal- og immunogen-regionen af F-glycoproteinet forbundet til den immunogene region af G-glycoproteinet. Eftersom den anden forbindelse (G til F) bevirker et rammeskift og translations-termination, vil der ikke være nogen anker-region 10 til stede i glycoproteinet. Eksempel 3 Anvendelse af DNA-oligonucleotid-forbindelsesled til regulering af aflæsningsrammen af et kimært HRSV-FG-glvcopro- 15 tein - Skema 4 Såfremt restriktionsenzymer, der er forskellige fra de, der er angivet i eksempel 2, anvendes til forbindelse af F- og G-generne, kan der forekomme et rammeskift ved den første forbindelse mellem F og G, hvilket fører til tidlig 20 translationel terminering af glycoproteinet. Dette kan undgås ved anvendelse af oligonucleotid-forbindelsesled, der vil gendanne den korrekte aflæsningsramme. 24 A. Fremstilling af HRSV-G-glvcoprotein-genqt 25 Klon-plasmid G2B-16 indeholdende G-glycoproteincDNA'en fordøjes med HphI, og enderne gøres stumpe med T4- DNA-polymerase. SalI-forbindelsesledet CGGTCGACCG GCCAGCTGGC 30 (New England Biolabs) ligateres til enderne af DNA'en. DNA'en fordøjes med Sall og elektroforesebehandles i en 1,5%'s agarosegel. 410 bp-fragmentet (fragment 5) indeholdende den relevante region af G-genet udskæres fra gelen, og DNA'en renses fra agarosen. 35
25 aenet Plasmidet pgpf4 fordøjes med NsiI, og enderne gøres stumpe med T4-DNA-polymerase. SalI-forbindelsesledet, der 5 er angivet ovenfor, ligateres til enderne af pgpf4-dna'en. DNA'en fordøjes med Sall og elektroforesebehandles i en 1%'s agarosegel. 4,4 kb-fragmentet udskæres fra gelen, og DNA'en renses fra agarosen. 4,4 kb-pgpf4-dna-fragmentet og 410 bp-g-fragmentet ligateres sammen til dannelse af pgpfg- 10 2 og transformeres i E. coli HB101. Kloner isoleres og udvælges for den korrekte orientering af G-cDNA'en i F-genet ved fordøjelse med Hinfl, der vil danne forbindelses-fragmenter på 768 bp og 220 bp. Den ukorrekte orientering af tifragmentet vil give forbindelsesfragmenter på 555 bp og 430 15 bp ved Hinfl-fordøjelse. Forbindelses-regionerne af denne klon verificeres derpå som korrekte ved Maxam-Gilbert-sekvensbestemmelse. Ifølge det ovenstående eksempel vil der dannes et gen, der koder for et kimært FG-glycoprotein svarende til 20 det i eksempel 2 beskrevne. Det kimære glycoprotein, der dannes ifølge dette eksempel, vil indeholde mindre af de immunogene regioner af G-glycoproteinet end det kimære glycoprotein, der dannes ifølge eksempel 2. Kimære glycoproteiner indeholdende andre regioner af de to glycoproteiner 25 kan dannes som beskrevet i eksempel 2 og 3 under anvendelse af de enzymer, der er opregnet i nærværende beskrivelse. Eksempel 4 - I f e - 30 der_ oder for kimære FG-glycoproteiner med fqjskellig længde - Skema 5 Gener, der koder for kimære FG-glycoproteiner indeholdende forskellige regioner af F- og G-glycoproteiner, kan dannes under anvendelse af en kombination af restrik- 35 tionsenzymer og oligonucleotider. Denne procedure tillader F - og G-glycoproteinerne at blive forbundet på ethvert ønsket