Legionella Urine Antigen EIA 96 807600 Enzyme-Immunoassay for in-vitro påvisning af Legionella antigen i urin 1. PÅTÆNKT ANVENDELSE Legionær sygdommen er forårsaget af Legionella pneumophila og er en akut respiratorisk sygdom. Den kan vise sig som en mild influenza-lignende sygdom (såkaldt Pontiac feber) eller kan forårsage pneumonia som, hvis ubehandlet, kan udvise en relativ høj dødelighed (1). Dødeligheden, som i tilfælde af immunokompetente patienter kan nå 20% uden passende behandling, kan reduceres hvis passende antimikrobiel terapi påbegyndes på et tidligt stadium som et resultat af hurtig diagnose. Med hensyn til infektioner i mennesker, påvises arten Legionella pneumophila oftest (80-85%) og skønt sjældnere forekommer yderligere 18 Legionella arter som infektiøse emner for pneumonia. Stammer af Legionella arter isoleret fra patienter tilhører hovedsageligt serogruppe 1, der findes imidlertid 14 andre serogrupper (2). Siden 1979 har påvisningen af specifikke antigener i urin i mange tilfælde været beskrevet som en pålidelig, simpel test (3,4), men indtil nu har dette været begrænset til påvisning af serogruppe 1. Testen præsenteret her påviser specifikt Legionella antigen og erkender alle L. Pneumophila serogrupper med et relativt vidt spektrum af kryds-reaktivitet så vel som andre Legionella arter (5). 2. TEST PRINCIP Stripsene i mikrotiterpladen er koatede med polyklonale kanin antistoffer som reagerer med Legionella pneumophila antigen af alle serogrupper så vel som yderligere Legionella arter. Patient urin tilsættes til brøndene på mikrotiterpladen og ethvert Legionella antigen som er tilstede vil binde sig til det specifikke antistof i den faste fase (solid phase). Efter den første inkubation, vaskes brøndene og et peroxidase-mærket antistof som reagerer med Legionella pneumophila antigen tilsættes som binder sig til de frie bindings steder på antigenet under den anden inkubation. Efter et yderligere vaske trin påvises tilstedeværelsen af bundet peroxidase i en farve reaktion med et substrat. Reaktionen stoppes ved tilsætning af svovlsyre og den optiske densitet (OD) måles med et spektrofotometer ved 450 nm og en reference bølgelængde på 615-690 nm. 3. KITTET INDEHOLDER De leverede reagensmængder er afpasset, så de muliggør 96 test. Alle reagenser er udelukkende beregnet til in vitrodiagnosticering. BESKRIVELSE Mærkning Reagenstype Præsentation R1 Microplate Mikrotiterplade 12 enkelt strips med 8 brønde hver, koatede med kanin anti-legionella IgG, inklusive Mikrotiterplade ramme 1 R2 R3 R5 Concentrated Washing Solution (x500) Legionella Antigen Negative Control Legionella Antigen Positive Control Vaskebuffer Koncentrat (500x) 0.08 M fosfat buffer ph 7.2 Konserveringsmiddel: 0,01% 2-bromo-2-nitro-1,3-propanediol Negativ Kontrol/Kalibrator Human urin, negativ for Legionella antigen Konserveringsmiddel: 0,095% natriumazid Positiv Kontrol (kultur supernatant) Legionella pneumophila antigen Konserveringsmiddel:0,095% natriumazid R6 Conjugate anti-legionella Antistoffer Konjugat Kanin antistoffer mærket med horseradish peroxidase (HRP) i tris buffer med protein stabilisator Konserveringsmiddel: < 1,5% ProClin 300 R9 Chromogen TMB Substrat Opløsning 3,3,5,5 tetramethylbenzidine (TMB) opløsning < 0,05 % i H 2 O Se Advarsler og Forholdsregler R10 Stopping Solution Stopopløsning Svovlsyre < 1N H 2 SO 4 Storage Bag with Opbevaringspose med tørremiddel desiccant Polyetylenpose for opbevaring af resterende mikroplade strips Konserveringsmidler: total koncentration < 0,2% 1 x 6 ml En fortyndet 2 x 1,5 ml 1 x 1,5 ml 1 x 15 ml 2 x 13 ml 1 x 15 ml 1 1
OPBEVARING Reagenserne er holdbare op til nævnte udløbsdato på de individuelle etiketter når det opbevares ved 2-8 C. Efter åbning af strips skal de anvendes inden 30 dage. For gentagne testninger anbring reagenserne umiddelbart efter brug ved 2-8 C. Mikrotiterplade strips er forseglet separat i en aluminiums pose med et tørremiddel og skal bringes til stuetemperatur før åbning. Placér ubrugte strips i opbevaringsposen med tørremiddelet og opbevar denne ved 2-8 C. Rør ikke den øverste kant eller bunden af brøndene med fingrene. 4. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Indtag ikke reagenserne. Undgå kontakt med øjne og hud. Alle urin prøver, kontroller og materialer anvendt til testen skal behandles som værende potentielt smittefarlige og passende sikkerheds forholdsregler skal tages. Urin kontrollen er blevet autoklaveret og sterilfiltreret, men skal ikke desto mindre behandles som potentilt smittefarlig. Afpipettér ikke med munden. I overensstemmelse med god laboratorie praksis (GLP) brug handsker, kittel og sikkerheds briller. Væsker og ikke-brændbare materialer skal dekontamineres med natriumhypochlorit (koncentration: 3 %, reaktions tid mindst 30 minutter). Spildvæske som indeholder syrer skal neutraliseres før kassation. Brugte mikrotiterplade og alle materialer som kan ikke genbruges skal autoklaveres i 1 time ved 121 C. Substrat Opløsning (R9) er lysfølsomt og må beskyttes mod lys. Testen skal udføres af veluddannede og autoriserede bioanalytikerere. Testning skal udføres under aseptiske og mikrobiologisk kontrollerede betingelser. Informér producenten hvis det originale test kit er beskadiget. ADVARSEL: Nogle af reagenserne indeholder ProClin 300 < 1,5 % For risici og sikkerheds anbefalinger refereres til tabellen i slutningen af indlægssedlen. 5. PRØVE TILBEREDELSE Urin prøver skal indsamles i sterile standard beholdere, opbevares ved stuetemperatur og analyseres inden 24 timer. Alternativt kan prøverne opbevares ved 2-8 C i 14 dage eller nedfryses til 20 C. I tilfælde af at urinprøverne indeholder større partikler skal den klare supernatant anvendes. Frosne urinprøver indeholdende en høj koncentration af salte (fosfater, ureater) kan danne bundfald af større mængder af salte ved optøning. Efter blanding og sedimentering kan den klare supernatant anvendes eller krystallerne skal genopløses ved opvarmning til 37 C. 6. NØDVENDIGE MATERIALER SOM IKKE MEDFØLGER I KITTET Mikropipetter, spektrofotometer (450 nm, reference bølgelængde 615-690 nm), mikrotiterplade vasker(med bund vask) og inkubator (37 C) for mikrotiterplade. 7. ANALYSEPROCEDURE REKONSTITUERING AF REAGENSER Fortynd vaskebuffer koncentratet (R2) med deioniseret eller destilleret vand (1:501, f.eks. 1 ml plus 500 ml). Den tilberedte vaskebuffer er stabil i 2 uge når den opbevares ved 2-8 C. Skulle der opstå krystallisering efter opbevaring ved 2-8 C, kan vaskebuffer koncentratet bringes tilbage til opløsning ved opvarmning til 37 C. Bland bufferen godt før fortynding. Alle andre test komponenter i test kittet er klar til brug. TESTENS GENNEMFØRELSE Protokollen (se pipetterings proceduren) skal følges nøjagtigt. Brug 100 μl Negativ Kontrol (R3), Positiv Kontrol (R5) og prøve i hver brønd. Stripsene forsegles ikke med selvklæbende film. VASKEPROCEDURE Vaske proceduren er kritisk. Utilstrækkelig vask vil resultere i ringe præcision og uspecifikke reaktioner. Vask 5 gange med vaskebuffer. Fjern derfor væsken i brønden og fyld op med 300μl vaskebuffer. Denne vaskeprocedure gentages 5 gange. Bank let pladen tom efter vask. Udfør næste trin straks derefter. Tillad ikke at pladen tørrer ud. 2
AFPIPETTERINGS PROCEDURE Bring alle reagenser til stuetemperatur før brug. Kontroller og blanke skal afpipetteres sidst. Efter afpipettering af kontroller og prøver skal inkubationen af pladen straks påbegyndes. Trin 1 Brønd [µl] A1 B1/C1 D1 E1 Blank - - - - Negativ Kontrol (R3) dobbelt test - 100 µl R3 - - Positiv Kontrol (R5) - - 100 µl R5 - Prøve 1:21 - - - 100 µl Prøve Inkubation 60 ± 2 min., 37 ± 1 C Processor*: 60 ± 2 min., 37 ± 1 C 5 x vask Fortyndet Vaskebuffer (R2) 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl Trin 2 Brønd [µl] Konjugat (R6) 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Inkubation 60 ± 2 min., 37 ± 1 C Processor*: 60 ± 2 min., 37 ± 1 C 5 x vask Fortyndet Vaskebuffer (R2) 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl Trin 3 Brønd [µl] Substrat Opløsning (R9) 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Inkubation 10 ± 1 min., ved stuetemperatur i mørke Processor*: 10 ± 1 min., Ved stuetemperatur i mørke Stopopløsning (R10) 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Mål ekstinktionen straks eller inden 1 minut efter stop ved 450 nm med et spektrofotometer (reference bølgelængde: 615-690 nm). * Hvis en ELISA processor anvendes er validering af testen på brugerens eget ansvar. 8. PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL Alle producerede reagenser fremstilles i henhold til vores kvalitetssikringssystem, lige fra modtagelsen af råmaterialer til markedsføringen af slutproduktet. Hvert parti gennemgår kvalitetskontrol og frigives kun til salg, hvis det opfylder de foruddefinerede kvalitetskriterier. Dokumentation vedrørende produktion og kontrol af hvert parti opbevares hos virksomheden. 9. TOLKNING AF RESULTERNE Urinprøver med en extinction under cut-off værdien anses for at være negative. Bemærk: Et negativt resultat udelukker ikke muligheden for en Legionella infektion. Urinprøver med en extinction lig med eller større end cutoff værdien anses for at være positive for påvisning af Legionella antigen. Positive prøver kan gentages for bekræftelse. Svage positive prøver i omegnen af + 0.200 skal gentages for bekræftelse. Hvis den gentagne prøve er over cut-off værdien igen anses prøven for at være positiv. Urinprøver med en forlængelse ind i gråzonen skal gentages. Hvis OD-værdien igen er i gråzonen så anses prøven for at være positiv. Hvis OD værdien af prøven er under gråzonen så anses prøven for at være negativ. BEREGNING AF CUT-OFF-VÆRDI OG GRÅZONE Den tomme værdi trækkes fra alle udryddelse værdier af de kontroller og prøver. Cut-off værdien beregnes fra gennemsnits-od værdien af de negative kontroller (OD R3 X) + 0,200. Cut-off værdi = (OD R3 X ) + 0,200. Gråzonen er stedfæstet således: OD gennemsnits (OD R3 X ) + 0,100 og OD < gennemsnits (OD R3 X ) + 0,200. [(OD R3 X ) + 0,100] Gråzone < [(OD R3 X ) + 0,200] Eksempel: R3 X = 0,023 Cut-off værdi = 0,223 gråzone = 0,123-0,223 BEREGNING AF DEN KALITATIVE BESTEMMELSE Den positive (R5) og negative (R3) kontrol skal inkluderes i alle test udførelser for evaluering af patient prøverne og overvågning af testens ydeevne. Kendte positive eller negative urinprøver skal inkluderes som yderligere kontroller. Middelværdien af de negative kontroller (blank fratrukket) skal være mindre end 0,100. OD værdien af den positive kontrol skal være større end 0,600. OD værdien for blank skal være mindre end 0,150. Hvis disse betingelser ikke er opnået, er testresultaterne ikke i orden og testen skal gentages. 3
DIAGNOSTISK TOLKNING Resultater over cut-off værdien eller gentaget inde i gråzonen = positiv (Formodet positiv for Legionella antigener i urinen). Dette giver anledning til mistanke om en eksisterende eller overstået Legionella infektion (svage positive prøver skal gentages for bekræftelse, se ovenfor). Resultat < R3 X + 0,200 = negativ (Formodet negativ for Legionella antigener i urinen). Muligheden af en Legionella infektion kan ikke udelukkes, da sensitiviteten af testen ikke er tilstrækkelig til endeligt at genkende alle tilfælde af alle Legionella arter. Variationer kan opstå i antigen sekretionen. Opfølgende prøver skal testes. 10. PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER Denne test blev valideret ved at anvende urinprøver. Andre materialer (f.eks. plasma, serum eller kropsvæsker) som kan indeholde Legionella antigener er ikke blevet testet. Til trods for bred reaktivitet med forskellige Legionella arter er Bio-Rad Legionella Urine Antigen EIA ikke i stand til at påvise alle 39 Legionella arter med ens sensitivitet (6,7). Diagnosen legionellose kan ikke stilles alene på basis af kliniske eller radiologiske beviser. Antigen påvisning, resultaterne af kulturer og serologiske tests sørger for yderligere hjælp for diagnosticeringen tillige med de kliniske fund. Sekretion af Legionella antigen i urin kan variere afhængig af patienten, enhver ledsagende sygdom og behandling. Yderligere kan sekretion variere i en og samme patient over tid, hvilket kræver testning af en sekvens af flere urinprøver. Tidlig behandling med passende antibiotika kan reducere sekretionen af antigen i nogle patienter. Antigen sekretion kan i nogle patienter vedvare over en længere periode. Uanset sensitiviteten og specificiteten af testen skal vi understrege at en positiv antigen påvisning i urin skal sættes i korrelation med de kliniske symptomer. Sammenhæng mellem kliniske symptomer og en positiv antigen test kunne være en tidlig indikator. 11. YDEEVNE 300 urinprøver fra raske personer og 176 urinprøver fra personer med en mistænkelig urinrørs infektion blev testet. 475 prøver var negative i Legionella urine antigen test. En af personerne med en mistænkelig urinrørs infektion var svagt positiv. Fordeling af extinctions værdier af negative prøver Absorbans 0,001-0,099 0,100-0,199 0,200-0,299 Cut-off Antal prøver (n=476) 449 26 1 0,225 46 urinprøver fra patienter med Legionella bekræftet af kulturer blev testet med Legionella Urine Antigen EIA test. Alle 46 urinprøver udviste et positiv resultat. Tabellen nedenfor Viser fordelingen af absorbance værdien af alle 46 prøver. Fordeling af extinctions værdierne af positive prøver (kultur positive) Absorbans 0,001-0,199 0,200-0,499 0,500-0,999 1,000-1,999 > 2,000 Cut-off Antal prøver (n=46) 0 0 1 2 43 0,225 Specificitet af Legionella Urine Antigen EIA: 99.8% [IC 95% = 98.8% - 100.0%]* Sensitivitet af Legionella Urine Antigen EIA: 100.0% [IC 95% = 92.3% - 100.0%]* * [IC95%] = 95 % konfidensinterval Bemærk: Det forventedes at den absolutte sensitivitet af Legionella Urine Antigen EIA i patienter med sikker legionellose ville være 50-70% (CDC Publication (8) viser 55,9% med sammenlignelige tests). Det Europæiske Multicenter Studie fra den Europæiske Arbejds Gruppe på Legionella Infektioner EWGLI (5) viste en sensitivitet på 94,6% for Legionella pneumophila serogruppe 1 og en sensitivitet på 86% inklusive prøver fra serogruppe 2, 3, 4, 6, 10. 4
12. LITERATURE 1. Frazer, D.W. et al. (1977). N. Engl. J. Med. 297, 1189-1197. 2. Robert Koch Institut (1996). Epidemiologisches Bulletin 35. 3. Edelstein, P.H. et al. (1993). Legionnaires disease - state-of-the-art clinical article. Clin. Infect. Dis. 16, 741-749. 4. Tang, P.W. et al. (1986). Broad-Spectrum Enyzme-Llinked Immunosorbent Assay for Detection of Legionella Soluble Antigens. J. Clin. Microbiol. 24, 556-558. 5. Harrison, T. et al. (1998). A multicenter evaluation of the Biotest Legionella urinary antigen EIA. Clin. Microbiol. Infect. 4, 359-365. 6. Okada, C. et al. (2002). Cross-Reactivity and Sensitivity of Two Legionella Urinary Antigen Kits, Biotest EIA and Binax NOW, to Extracted Antigens from Various Serogroups of L. pneumophila and Other Legionella Species. Microbiol. Immunol. 46, 51-54. 7. Horn, J. et al. (2002). Comparison of non-serogroup 1 detection by Biotest and Binax Legionella urinary antigen enzyme immunoassays. In: Marre, R. et al. (eds.). Legionella, ASM Press, 207-210. 8. Plouffe, J.F. et al. (1995). Clin. Infect. Dis. 20, 1286-1291. 9. DIN EN ISO 980 Graphic symbols for use in the labeling of medical devices. 13. FEJLFINDING 1. Negativ Kontrol (R3) højere end kriterier for validitet, 0,100 OD: a. Substrat Opløsning (R9) blevet blå p.g.a. oxidering eller kontaminering. b. Vaske fejl: Udfør 5x vask/vaske trin. Hvis der anvendes manuel vaske udstyr, udfør 7x vask/vaske trin. Brug Bio- Rad Vaskebuffer (R2) som er indeholdt i kittet. c. Inkubations fejlt: Temperaturen for høj, inkubations tiden blev overskredet eller pladen blev ikke inkuberet direkte efter afslutningen af pipetteringen. d. Bølgelængde fejl: Måling uden reference filter vil øge OD værdierne med ca. + 0,120 OD. e. Kontamination med låget af Positiv Kontrol (R5). 2. Gul farvning i alle brønde: a. Vaskebuffer (R2) kontamination; Fremstil ny Vaskebuffer (R2). b. Konjugat (R6) kontamination; Gentag test med reagenser fra uåbnede flasker. Brug reagenser under mindre bakterielle betingelser. 3. Middelværdi af Positiv Kontrol (R5) 0,600 OD: a. Overskridelse af udløbstiden. b. Temperaturen for lav eller fald under inkubations tiden. c. Vaske fejl: For intensiv vask eller mekanisk kontakt af manifold og solid phase i brønden. d. Kontamination af Positiv Kontrol (R5) eller 2b. 5
6
Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 01/2012 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 881078 www.bio-rad.com 7