I N D L Æ G S S E D D E L

Immucor Transplant Diagnostics, Inc. 5 West Avenue, Stamford, Connecticut 06902; USA Tlf.: +1-203-328-90 eller +1-888-329-0255 (i USA og Canada), Fax: +1-203-328-9599 WWW.IMMUCOR.COM Produktdokumentation og oversættelser kan hentes på: www.immucor.com LIFECODES HLA SSO TYPING KITS til brug med Luminex Til in vitro-diagnostik. INDHOLDSFORTEGNELSE Definition af symboler... 1 Retningslinjer for brug... 5 Reagenser efter katalognummer... 2-3 A. Oprens genomisk DNA... 5 Tilsigtet brug... 4 B. Amplifikation... 5 Oversigt og forklaring... 4 C. Hybridisering... 7 Principper for proceduren... 4 D. Analyse med Luminex-instrumentet... 7 Reagenser... 4 Resultater... 7 A. Identifikation... 4 Kvalitetskontrol... 7 B. Advarsler og forholdsregler... 4 Procedurens begrænsninger... 7 C. Opbevaringsinstruktioner... 4 Fejlfinding... 8 D. Oprensning eller behandling til brug.. 4 Forventede værdier... 8 E. Indikationer for ustabilitet... 4 Specifikke performanceegenskaber... 8 Instrumentkrav... 4 Referencer... 8 Prøvetagning og forberedelse... 4 Begrænset licens... 8 Procedure... 5 Anvendte varemærker... 9 A. Medfølgende materialer... 5 Bilag A... 9 B. Nødvendige, men ikke medfølgende materialer, reagenser og udstyr... 5 I N D L Æ G S S E D D E L Gel-elektroforese... 9 Gel-fortolkning... 9 DEFINITION AF SYMBOLER (Produktetiketter og supplerende dokumenter) Partinummer Katalognummer Temperaturbegrænsninger Øvre temperaturgrænse Udløbsdato Skal beskyttes mod lys Tilstrækkeligt til N tests Må ikke nedfryses Forsigtig! Se brugervejledningen Se brugervejledningen Producent Europæisk repræsentant EC REP Side 1 af 9 LC775IVDDA.17 (02/14)

REAGENSER EFTER KATALOGNUMMER LM-A LIFECODES HLA-A Typing Kit til brug med Luminex Produktnr. 628410- MX-A LIFECODES HLA A Master Mix 628405 870 µl 2-8 C BM-A LIFECODES HLA A Probe Mix 628453 810 µl Tilstrækkeligt til LC-AE LIFECODES HLA-A eres Typing Kit til brug med Luminex Produktnr. 628459 - MX-A LIFECODES HLA A Master Mix 628405 870 µl 2-8 C BM-A LIFECODES HLA A Probe Mix 628453 810 µl BM-AeRES LIFECODES HLA A eres Probe Mix 628455 810 µl DS Fortyndingsopløsning 628515 19,7 ml 18-30 ºC Tilstrækkeligt til LM-B LIFECODES HLA-B Typing Kit til brug med Luminex Produktnr. 628510- MX-B LIFECODES HLA B Master Mix 628556 870 µl 2-8 C BM-B LIFECODES HLA B Probe Mix 628553 810 µl Tilstrækkeligt til LC-BE LIFECODES HLA-B eres Typing Kit til brug med Luminex Produktnr. 628559- MX-B LIFECODES HLA B Master Mix 628556 870 µl BM-B LIFECODES HLA B Probe Mix 628553 810 µl BM-BeRES LIFECODES HLA B eres Probe Mix 628554 810 µl Tilstrækkeligt til DS Fortyndingsopløsning 628515 19,7ml 18-30 ºC LM-C LIFECODES HLA-C Typing Kit til brug med Luminex Produktnr. 628810- MX-C LIFECODES HLA C Master Mix 628803 870 µl 2-8 C BM-C LIFECODES HLA C Probe Mix 628802 810 µl Tilstrækkeligt til Probe Mix-opløsninger er lysfølsomme: Sørg for, at de udsættes for så lidt lys som muligt. FORSIGTIG! Brug ikke komponenter efter udløbsdatoen. Side 2 af 9 LC775IVDDA.17 (02/14)

LM-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Typing Kit til brug med Luminex Produktnr. 628751- MX-DR1 LIFECODES HLA DRB1 Master Mix 628753 870 µl 2-8 C BM-DR1 LIFECODES HLA DRB1 Probe Mix 628752 810 µl Tilstrækkkeligt til LC-DR1E LIFECODES HLA-DRB1 eres Typing Kit til brug med Luminex Produktnr. 628759- MX-DR1 LIFECODES HLA DRB1 Master Mix 628753 870 µl 2-8 C BM-DR1 LIFECODES HLA DRB1 Probe Mix 628752 810 µl BM-DR1eRES LIFECODES HLA DRB1 eres Probe Mix 628755 810 µl 2-8 C DS Fortyndingsopløsning 628515 19,7 ml 18-30 ºC Tilstrækkeligt til LC-DRB3,4,5 LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 Typing Kit til brug med Luminex Produktnr. 629200- MX-DRB3,4,5 LIFECODES HLA DRB 3,4,5 Master Mix 629201 870 µl 2-8 C BM-DRB3,4,5 LIFECODES HLA DRB 3,4,5 Probe Mix 629202 810 µl 2-8ºC DS Fortyndingsopløsning 628515 19,7 ml 18-30ºC Tilstrækkeligt til LM-DQB LIFECODES HLA-DQB Typing Kit til brug med Luminex Produktnr. 628610- MX-DQB LIFECODES HLA DQB Master Mix 628305 870 µl 2-8 C BM-DQB LIFECODES HLA DQB Probe Mix 628304 810 µl Tilstrækkeligt til Probe Mix-opløsninger er lysfølsomme: Sørg for, at de udsættes for så lidt lys som muligt. FORSIGTIG! Brug ikke komponenter efter udløbsdatoen. Side 3 af 9 LC775IVDDA.17 (02/14)

TILSIGTET BRUG DNA-typebestemmelse af HLA-alleler, klasse I og II. OVERSIGT OG FORKLARING DNA-baseret HLA-typebestemmelse ved hjælp af PCR-amplificeret DNA er en almindelig laboratorieprocedure. PCR-amplifikation af DNA anvendes som metode til at berige en udvalgt DNA-region. Ved HLA-typebestemmelse anvendes en efterfølgende analyse til at bestemme egenskaberne i det amplificerede DNA. Flere analysetyper, f.eks. SSP (1), direkte SSOP (2), RFLP (3) og revers SSOP dot blot-teknologier (4), har været anvendt ved HLA-typebestemmelse. Som ved SSOP- og revers dot blot-metoderne anvender LIFECODES HLA-SSO Typing kits sekvensspecifikke oligonukleotider (SSO'er) til at identificere, hvilke HLA-alleler der er til stede i en PCR-amplificeret prøve. Det er de anvendte SSO'er, og ikke metoderne, der bestemmer evnen til at skelne mellem de forskellige alleler, der er til stede i PCR-amplifikationen. Mens revers dot blot- og SSOP-metoderne anvender enzymmærkning og kolorimetriske substrater, der kræver en efterfølgende fremkaldelse, er LIFECODES-analysen et homogent multiplex-system. Dvs. at alle SSO'er analyseres samtidigt, og hele analysen foregår i en enkelt reaktionsbeholder med tilsætning af et enkelt reagens. PRINCIPPER FOR PROCEDUREN Proceduren ved LIFECODES HLA-SSO-typebestemmelsen er baseret på hybridiseringen af et mærket enkeltstrenget PCR-produkt til SSO-prober. Amplificeringen af DNA med PCR anvender typisk ækvimolære mængder af både fremadrettet og revers primer for at danne et dobbeltstrenget DNA-produkt. Hvis mængden af én primer imidlertid er relativt større end den anden, danner reaktionen noget enkeltstrenget DNA-produkt ud over det dobbeltstrengede produkt. Under de første cyklusser i LIFECODES-amplifikationen dannes dobbeltstrenget DNA. Når den begrænsende primer er opbrugt, bruger den resterende primer det dobbeltstrengede produkt som en skabelon for dannelsen af enkeltstrenget DNA. Denne metode danner både dobbeltstrengede og enkeltstrengede produkter, som begge efter denaturering deltager i hybridiseringsreaktionen. De forskellige prober kan svare til en sekvens i det amplificerede DNA, der er unik for en allel eller en gruppe af alleler. Disse prober er med andre ord designet, så hver probe har præference for at hybridisere sig til en komplementær region, der muligvis er eller ikke er til stede i det amplificerede DNA. Desuden hybridiseres det amplificerede DNA til én elle flere konsensusprober, der svarer til sekvenser, som er til stede i alle alleler på et locus. SSO-typebestemmelsen kan påvirkes af den biologiske materialetype, oprensningsmetoden, samt mængden og integriteten af genomisk DNA. Det opnåede signal for konsensusproben eller -proberne kan derfor fungere som en indikator for, om amplifikationen og hybridiseringen lykkedes. Signalet, der blev opnået med konsensusproben, kan også bruges til at normalisere signalet fra de allelspecifikke prober og korrigere for variationer i mængden af amplificeret produkt i hybridiseringsreaktionen. Analysen af de resultater, der blev genereret fra SSO-typebestemmelsen, kan bruges til at bestemme forekomsten eller fraværet af bestemte DNA-sekvenser i amplificeret DNA og identificere de mulige alleler i prøven. Til LIFECODES HLA-SSO-typebestemmelsesproceduren kobles prober til Luminex-mikrosfærer, der er udviklet til brug med Luminex-instrumentet. Op til 100 forskellige populationer af Luminex-mikrosfærer kan blandes og analyseres med Luminex-instrumentet, da de enkelte populationer af mikrosfærer kan genkendes ved hjælp af deres unikke fluorescenssignatur eller farve. Forskellige SSO-prober kan kobles til hver mikrosfærefarve. En blanding af flere prober kan derfor skelnes fra hinanden i kraft af deres tilknytning til bestemte mikrosfærefarver. Luminex-instrumentet kan også kvantificere de relative mængder af mærket PCR-produkt, som hybridiserer til hver Luminex-mikrosfære. Det relative signal, der opnås med SSO-proberne i LIFECODES-analysen, kan derfor, som med andre SSOP-metoder, bruges til at fastlægge probernes positive eller negative reaktivitet med den amplificerede DNA-prøve (se afsnittet Resultater). Dette giver således de nødvendige oplysninger til at bestemme prøvens HLA-fænotype. REAGENSER A. Identifikation Se tabellerne i afsnittet REAGENSER EFTER KATALOGNUMMER for at få en komplet liste over produkter og katalognumre. B. Advarsler eller forholdsregler 1. Til in vitro-diagnostik. 2. Der skal angives separate pipetter til præ-pcr-håndtering samt til post-pcr-håndtering. 3. Biologisk farligt materiale: Alle biologiske og blod skal håndteres som potentielt smittefarligt materiale. Der skal træffes generelle sikkerhedsforanstaltninger ved håndtering. 4. Fortyndingsopløsning, Probe mix-opløsninger, TAQ-polymerase og R-Phycoerythrin-streptavidinkonjugat indeholder farlige stoffer. Undgå kontakt med hud og øjne, og bortskaffelse af alle brugte materialer skal ske i overensstemmelse med de lokale bestemmelser. Se sikkerhedsdatabladet for at få yderligere oplysninger. 5. Resultaterne fra disse kit må ikke bruges som det eneste grundlag for en klinisk beslutning vedrørende patienten. C. Opbevaringsinstruktioner 1. Se mærkaten på pakken med kitkomponenterne for at få oplysninger om de korrekte opbevaringstemperaturer. 2. Probe mix-opløsninger og R-Phycoerythrin-streptavidinkonjugat er lysfølsomme, SKAL BESKYTTES MOD LYS. MÅ IKKE NEDFRYSES. 3. Brug ikke komponenter efter udløbsdatoen. D. Oprensning eller nødvendig behandling til brug Se "Prøvetagning og forberedelse" E. Indikationer for ustabilitet 1. Hvis der er udfældet salt fra opløsningen under transport/opbevaring, skal det opløses helt før brug på vortex-mixer ved stuetemperatur (18 til 30 C). 2. Undgå at anvende R-Phycoerythrin-streptavidinkonjugat, der har været nedfrosset under transport eller opbevaring. INSTRUMENTKRAV 1. Luminex-instrumentet og XY-platform (produktnummer 888300, 888310) 2. Thermocykler udstyret med et opvarmet låg og justerbare rampetider, et minimalt termisk interval på 2 C til 100 C og en nøjagtighed på mindst +/- 0,5 C. Forholdene for thermocyklerne skal muligvis ændres for at optimere profilerne. Der kan rekvireres en thermocykler-profil ved at kontakte teknisk service på tlf. +1 (203) 328-90 eller +1 (888) 329-0255. PRØVETAGNING OG FORBEREDELSE a. Humant DNA kan oprenses fra fuldblod, buffy coats og kindskrab under anvendelse af en valideret metode, der opfylder nedenstående kriterier. b. DNA, der er ekstraheret fra blod opbevaret i EDTA og ACD (syre-citrat-dextrose), er blevet testet og har vist sig at give forventet performance i denne analyse. DNA, der er ekstraheret fra blod opbevaret i heparin, må ikke bruges i denne analyse. Andre konserveringsmidler er ikke blevet testet.. c. Det isolerede DNA skal være i 10 mm TRIS, ph 8,0-9,0 eller i nukleasefrit vand. Hvis et chelaterende middel som f.eks. EDTA er til stede, må slutkoncentrationen i det chelaterende middel ikke overstige 0,5 mm. d. Tilstedeværelsen af alkohol, opløsningsmidler eller salte kan påvirke DNA-amplifikationen negativt. Side 4 af 9 LC775IVDDA.17 (02/14)

e. DNA-slutkoncentrationen skal være 10 200 ng/µl. f. Absorbansmålinger af DNA-prøven ved 260 og 280 nm skal give forholdet 1,65 til 2,0. g. DNA'et kan bruges straks efter isoleringen eller opbevares ved 20 C i op til 1 år. Gentagne nedfrysninger/optøninger skal undgås, da dette kan nedbryde DNA'et. PROCEDURE A. Medfølgende materialer (se tabellerne i afsnittet REAGENSER EFTER KATALOGNUMMER forat få specifikke oplysninger) Korrekt Master Mix (MX) Korrekt Probe Mix/Mix er (BM) Fortyndingsopløsning (DS) Grænsetabel(ler), Probe Hit-diagrammer B. Nødvendige, men ikke medfølgende materialer, reagenser og udstyr (som angivet på listen eller tilsvarende) R-Phycoerythrin-streptavidinkonjugat (SA-PE), 1 mg/ml (Lifecodes, kat. nr. 628511) Luminex Sheath-væske (1x eller 20x, Lifecodes, kat. nr. 628005 eller 628025) Rekombinant Taq-polymerase Vortex-mixer Nukleasefrit vand (Lifecodes, kat. nr. 757003, 20 ml) PCR-rør og låg (AB Gene 0,2 ml Thermo Strip, nr. AB0451/G) Thermocykler (PCR) 96 brøndplader (Costar nr. 69) Microseal -film (Bio-Rad. nr. MSA-01) eller tape (Costar nr. 6524) Thermocykler (se Instrumentkrav på side 3) Sonikator (Fisher Scientific, nr. FS15 eller FS20) Mikrocentrifuge Barrierefilterspidser Luminex-kalibreringsperler (Cal 1, Cal 2, Con 1 og Con 2, Lifecodes, hhv. kat. nr. 628006, 628007, 628008 og 628009) Pipetter, multikanal-pipetter og -spidser (1-20 µl, 20-200 µl, 1000 µl) Regnearkssoftware til visning af kommaseparerede fildata (.csv) Varmeblok (Fisher Scientific Standard Heatblock, nr. 13259-030) 70 % isopropanol eller 20% blegemiddel RETNINGSLINJER FOR BRUG BEMÆRKNINGER: Probe mix-opløsninger og SA-PE er lysfølsomme: Skal beskyttes mod lys og må ikke nedfryses. Perler opvarmes ved 55-60 C i mindst 5-10 minutter for at opløse komponenterne i probe-blandingen grundigt. Soniker kortvarigt (ca. 15 sek.), og bland derefter probe mix-opløsningen på vortex-mixer i ca. 15 sekunder for at opløse perler. Udvis meget forsigtighed ved afmålingen, og brug kalibrerede pipetter. I modsat fald kan det føre til tab af reagens og fejl i prøven. Alle temperaturer skal holdes nøjagtigt. Udsving på kun +/- 0,5 C kan påvirke resultaterne. Under hybridiseringen må ne ikke være i fortyndet tilstand ved 56 C i mere end 5 minutter (se afsnittet Resultater). Det anbefales at analysere de amplificerede så hurtigt som muligt. Hvis ne ikke kan køres på Luminex-instrumentet den samme dag, kan det amplificerede produkt opbevares i op til 3 dage ved 2-8 C før brug Ved opbevaring i længere tid skal ne opbevares ved 20 ºC i op til en uge, indtil de kan analyseres. Det amplificerede produkt må kun nedfryses/optøs én gang. Flere nedfrysninger/optøninger medfører nedbrydning af de amplificerede og dårlige analyseresultater. A. Oprens genomisk DNA ved hjælp af valgt metode. Slutkoncentrationen skal være 10 200 ng/µl. Juster om nødvendigt med nukleasefrit vand. Sørg for, at alle har tilsvarende koncentrationer. B. DNA-amplifikation (PCR) 1. Lad Master Mix (MX) blive opvarmet til stuetemperatur (18 til 30 C). 2. Bland forsigtigt reagenserne på vortex-mixer i ca. 10 sekunder. Dette sikrer, at saltene opløses. Centrifuger kortvarigt (5-10 sekunder) i mikrocentrifuge for at bringe indholdet til bunden af røret. 3. Forbered ved hjælp af tabel 1 nedenfor komponenterne til amplifikation til n+1 reaktioner med den angivne mængde af hver komponent pr. reaktion (bortset fra DNA). Tilsæt nukleasefrit vand for at opnå en slutvolumen på µl pr. reaktion. Bland forsigtigt på vortex-mixer, stop, og anbring opløsningerne på is. 4. Afpipetter den rette mængde genomisk DNA (100 til 300 ng) i PCR-rørene. 5. Afmål amplifikationsblandingen i PCR-rørene indeholdende genomisk DNA (den samlede mængde master mix og genomisk DNA skal være µl for hver eaktion). 6. Sæt låg på rørene for at undgå fordampning under PCR. 7. Anbring ne i thermocykleren, og kør programmet. Se tabel 2. Tabel 1. Reaktionskomponenter til amplifikation Komponent Mængde pr. PCReaktion LIFECODES Master Mix 15 µl Genomisk DNA 10-200 ng/µl I alt ~200 ng Taq-polymerase 0,5 µl (2,5 U) Nukleasefrit vand Til slutvolumen µl Bemærk! Se produktets gel-elektroforese (bilag A) for at kontrollere, at prøveamplifikationen er korrekt. Tabel 2. Thermocykler-tilstande til amplifikation 95 C i 5 min. Antal cyklusser: 1 95 C i 30 sek. 60 C i 45 sek. 72 C i 45 sek. Antal cyklusser: 8 95 C i 30 sek. 63 C i 45 sek. 72 C i 45 sek. Antal cyklusser: 32 72 C i 15 min. Antal cyklusser: 1 Side 5 af 9 LC775IVDDA.17 (02/14)

C. Hybridisering Kontroller, at hybridiseringsbufferkomponenterne i LIFECODES probe mix-opløsningen er opløst, og at perler er grundigt opslæmmet. Tænd for Luminex-instrumentet og XY-platformen, og lad dem varme op i 30 minutter. 1. Probe mix-opløsningen opvarmes i en varmeblok ved 55-60 C i mindst 5-10 minutter for at opløse komponenterne i probeblandingen grundigt. 2. Soniker kortvarigt (ca. 15 sek.), og bland derefter probe mix-opløsningen på vortex-mixer i ca. 15 sekunder for at opslæmme perler. 3. Afmål 5 µl af det locus-specifikke PCR-produkt i en thermocykler 96 brøndplade (Costar nr. 69). 4. Afmål 15 µl korrekt probe mix i hver brønd. Der skal anvendes to brønde pr. prøve til eres-kittet, en til eres probe mix og en til standard probe mix. eres probe mix og standard probe mix behøver ikke at blive udført i samme kørsel. Begge probe mix - opløsninger skal anvendes for at opnå eres-resultater. Ved afmåling af probe mix til mere end 10 brønde skal probe mix blandes forsigtigt på vortex-mixer efter hvert sæt på ti. Forsegl pladen med polyethylentape (Costar nr. 6524). 5. Hybridiser ne under følgende inkubationsforhold: Tabel 3. Thermocykler-tilstande til hybridisering 97 C i 5 minutter 47 C i 30 minutter 56 C i 10 minutter 56 C HOLD 6. Forbered en 1:200 fortyndingsopløsning/sa-pe-blanding, mens ne hybridiseres. Kombiner 170 µl fortyndingsopløsning (DS) og 0,85 µl 1mg/ml SA-PE pr. prøve. Det anbefales at fremstille nok fortyndingsopløsning til n+1 for at indregne eventuelt spild ved pipettering. (Se tabel 4) 7. Fortyndingsopløsningen/SA-PE-blandingen skal opbevares mørkt ved stuetemperatur. SA-PE er lysfølsom! Fortyndingsopløsningen kan opvarmes ved 45 C i 5 minutter og blandes på vortex-mixer ved ankomst for at sikre, at alle komponenter er opløst. Fortyndingsopløsningen skal have opnået stuetemperatur (18-30 C), før blandingen fremstilles. Forbered blandingen før brug, og bortskaf eventuelt overskydende materiale. Antal Fortyndingsopløsning SA-PE (DS) Tabel 4. Forberedelse af fortyndingsopløsningsmængder 1 170 µl 0,85 µl 5 8 µl 4,25 µl 10 1700 µl 8,5 µl 20 3400 µl 17 µl 80 µl 42,5 µl Bemærk! HYBRIDISERINGSPROGRAMMET MÅ IKKE ANNULLERES FØR BAKKEN FJERNES FRA THERMOCYKLEREN! 8. Ved 56 C hold-programmet, mens bakken er i thermocykleren, fortyndes hver prøve med 170 µl af den forberedte fortyndingsopløsning/sa-pe-blanding. Det er kritisk, at alle fortyndes inden 5 minutter (efter HOLD-trinnet på 10 minutter ved 56 C) 9. Fjern prøvebakken fra thermocykleren, og anbring den i Luminex-instrumentet. D. Analyse af ved hjælp af Luminex-instrumentet* Analyser straks ne på Luminex-instrumentet for at opnå de bedste resultater. Prøverne kan aflæses op til 30 minutter, efter de er fortyndet. Hvis ne ikke aflæses straks, skal de beskyttes mod lys. 1. Tænd for Luminex-instrumentet fra 30 minutter til 4 timer, før ne analyseres. 2. Opret en batchkørsel, som ne analyseres efter, før de analyseres på Luminex-instrumentet. a) Vælg Create a New Batch i menuen File. Hvis der analyseres for HLA-DRB1, tilføjes f.eks. Batch for HLA-DRB. Batchskabelonen hentes og kaldes i dette tilfælde HLA-DRB. Bemærk, at skabelonversionerne er partinummerspecifikke og svarer til partinumrene på de aktuelle kit. Følg den trinvise vejledning på skærmen for oprettelse af batches. Når batchen navngives, må der ikke medtages kommaer i navnet, da oplysninger efter et komma mistes ved eksport af dataene. Se brugermanualen til Luminex for at få yderligere oplysninger om oprettelse af batches og multibatches. b) Klik på skub ud-ikonet for at skubbe pladeholderen ud. Anbring 96-brønds thermocykler-pladen med ne i XYP-varmeblokken på pladeholderen. c) Klik på ikonet Retract. Prøverne er nu klar til at blive analyseret. Der skal foretages en priming, før kørslen startes. d) Når ne er kørt igennem instrumentet, skal der udføres et rengøringstrin med 70 % isopropanol eller 20 % alm. blegemiddel efterfulgt af to vasketrin. Der kan slukkes for instrumentet på dette tidspunkt, hvis det ikke skal bruges mere i løbet af dagen. 3. Når batchen er fuldført, eksporteres dataene som kommaseparerede fildata (.csv). Disse filer navngives 'OUTPUT.CSV' og gemmes i en mappe med det batchnavn, der er indtastet i Luminex. IS Dataene er herefter tilgængelige for oprettelse af typebestemmelsesopgaver som beskrevet nedenfor. *Se brugermanualen til Luminex IS for at få oplysninger om procedurer til instrumentets betjening, herunder den daglige opstart, kalibrering, vedligeholdelse og nedlukning. Side 6 af 9 LC775IVDDA.17 (02/14)

RESULTATER Prøvetypebestemmelsen kan udføres på følgende måde: De genererede CSV-filer kan åbnes og data behandles med et almindeligt regnearksprogram, f.eks. Microsoft Excel, Lotus 123, Corel Quattro Pro eller lignende software. Analysen består af følgende trin: 1) Kontroller, at Number of Events (antal hændelser) for hver SSO i hver prøve er mindst 60. Disse oplysninger findes i afsnittet DataType: Count i CSV-filen. 2) Kontroller, at værdierne for konsensusproberne for hver prøve er over deres minimale gennemsnitlige fluorescensintensitet eller MFI (Median Fluorescent Intensity). Minimumsgrænserne er partispecifikke og kan findes i grænsetabellen. Forsigtig! For at opnå pålidelige resultater skal Luminex-instrumentet have indhentet tilstrækkelige data. Der skal indsamles mindst 60 hændelser for hver SSO. 3) Fratræk værdien Background Control for hver probe fra de prøveværdier, der danner det datasæt, der er korrigeret for baggrundsværdier. Værdierne Background Control findes i grænsetabellen og er partispecifikke. Baggrundsværdierne er gennemsnitlige MFI-værdier for hver perle, som kompenserer for den baggrundsstøj, der er forårsaget af variationer i perler. 4) For hver prøve divideres de baggrundskorrigerede data for hver probe med den baggrundskorrigerede værdi for den tilsvarende konsensusprobe, der genererer det normaliserede datasæt. MFI (probe) MFI (kontrolblank for probe) MFI (konsensus) MFI (kontrolblank for konsensus) 5) Noter den normaliserede værdi i grænsetabelregnearket for hver probe. 6) Når alle værdierne er tildelt, kan probe hit-mønsteret (dvs. kombinationen af alle positive og negative tildelinger for en given prøve) sammenlignes med de(n) aktuelle probe hit-tabel(ler). Forsigtig! Der findes en separat grænsetabel for hvert locus og for hvert probe mix. Disse grænsetabeller er partispecifikke. Kontroller, at partinummeret i grænsetabellen svarer til partinummeret på typebestemmelseskittet. Hvis en normaliseret værdi for en bestemt probe er over den maksimale grænse for en negativ tildeling og under minimumsværdien for en positiv tildeling, skal prøven betragtes som ubestemt for den pågældende probe. Prøven skal typebestemmes, hvor værdien antages at være negativ og igen, hvor værdien antages at være positiv. Se afsnittet FORVENTEDE VÆRDIER for at få yderligere oplysninger om grænseværdier. KVALITETSKONTROL Det anbefales at køre en negativ og en positiv kontrol med hver test, som fx. henholdsvist en vandblindprøve og en tidligere bestemt prøve. Consensus sekvens-specifikke oligonucleotid (SSO) prober, angivet i tærskeltabellen, hybridiserer til deres respektive lokusspecifikke alleler. Værdier, der opnås med Consensus SSO'er fra positive kontroller, bør overstige tærskelværdien for SSO'en, som angivet i tærskeltabellens arbejdsskema. Værdier, der opnås med Consensus SSO'er fra vandblind, skal overstige tærskelværdien for SSO'en, som angivet i tærskeltabellens arbejdsskema. LIFECODES probe mix -opløsning(er) indeholder en eller flere Consensus SSO prober, der er identificeret i arbejdsskemaerne til typebestemmelser. Consensus-proberne hybridiseres til alle alleler og fungerer som interne kontroller for at bekræfte amplifikation og for at bekræfte at der forekom hybridiseringer. Hvis minimumsværdien ikke opnås for disse SSO'er, kan prøven muligvis ikke frembringe den korrekte bestemmelse, og prøvetesten bør gentages. Analysen skal køres som anbefalet i indlægssedlen, og skal udføres med enhver anden kvalitetskontrolsprocedure, der er i overensstemmelse med gældende retningslinjer eller akkrediteringskrav. PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER De beskrevne PCR-forhold og analyseforhold kræver nøje kontrollerede forhold. Afvigelser fra disse parametre kan medføre produktfejl. Alle instrumenter skal kalibreres i overensstemmelse med producentens anbefalinger og betjenes inden for producentens foreskrevne parametre. 1) Perler skal forvarmes og opslæmmes grundigt før brug. Dette sikrer, at hybridiseringsbufferkomponenterne er i opløsningen. 2) Inkubationerne ved 47 C og 56 C kræver en stor nøjagtighed (+/- 0,5 C). Der skal anvendes en thermocykler. Temperaturen skal kontrolleres i brøndene i 96-brønds thermocykler-pladen ved hjælp af et termoelement (f.eks. BioRad, model VPT-0300 eller tilsvarende). Temperaturen i og omkring brøndene må ikke variere mere end +/- 0,5 C. 3) Tiden ved 56 C er kritisk og må ikke vare mere end i alt 15 minutter. Dette inkluderer inkubationen på 10 minutter plus højst 5 minutter til fortynding af alle ne med fortyndingsopløsning/sa-pe-blanding. 4) Når ne er fortyndet, kan de holde sig ved stuetemperatur i op til 2 timer (beskyttet mod lys). Da det kan tage op til 1,5 timer at køre en fuld 96-brøndplade igennem Luminex-instrumentet, skal analysen senest startes 30 minutter efter fortyndingen for at sikre, at den sidste prøve er analyseret inden 2-timersgrænsen. 5) Komponenter fra forskellige kits og partier må ikke blandes. På grund af HLA-typebestemmelsens indviklede beskaffenhed skal kvalificeret personale gennemse fortolkningen af data og typebestemmelsen. Side 7 af 9 LC775IVDDA.17 (02/14)

FEJLFINDING PROBLEM MULIG ÅRSAG LØSNING Lave resultater af perlemåling Probe mix er ikke helt opslæmmet Forvarm, soniker og bland probe mix-opløsningen på vortex-mixer, og gentag analysen. Instrumentet fungerer ikke korrekt Forkert kalibrering Kalibrer instrumentet (se brugermanualen til Luminex IS). Prøvestrømmen er blokeret Fjern og soniker nålen. Foretag en tilbageskylning. Kontakt Immucor Transplant Diagnostics, Inc. hvis problemet fortsætter. +1-(888) 329-0255 Fejl i CON-grænse Prøven blev ikke amplificeret eller blev amplificeret dårligt* Lav DNA-mængde Kontroller DNA-koncentrationen og -renheden. Flere SSO-fejl, eller prøven giver ikke en HLAtypebestemmelse Saltene i Master Mix er ikke opløst Amplifikationsforholdene er ikke inden for de angivne parametre Lav MFI-værdi (Median Fluorescent Intensity) Allelspecifik amplifikation DNA-prøven er kontamineret DNA'et er delvist nedbrudt Opvarm Master Mix ved 37 C i 5 minutter, bland forsigtigt på vortex-mixer og centrifuger kortvarigt. Dårlig Taq-polymerase Brug kun rekombinant Taq. Prøv Lifecodes nr. 167075. Amplifikationsforholdene er ikke inden for de angivne parametre Der er sket en fordampning under hybridiseringen. * PCR-amplifikationen kan kontrolleres ved gel-elektroforese (se bilag A). Kør thermocykler-profilen på thermocykleren for at kontrollere, om parametrene er inden for de angivne parametre. Opvarm fortyndingsopløsningen ved 45 C i 5 minutter før brug, og bland på vortex-mixer. Opbevar opløsningen ved stuetemperatur. Udskift R-Phycoerythrin-streptavidinkonjugatet. Kør thermo cykler-profilen på thermo cykleren for at kontrollere, om parametrene er inden for de angivne parametre. Isoler DNA fra blodprøven igen. Hvis der ikke bruges en hel plade, kan én række stå tom på hver side af de, der skal analyseres, så pladen bedre kan forsegles. FORVENTEDE VÆRDIER Værdierne kan normalt bestemmes som positive eller negative. I sjældne tilfælde, kan værdierne ikke bestemmes. En ubestemt værdi repræsenterer et interval, hvor der hverken er observeret positive eller negative værdier. Hvis en prøve indeholder ubestemte værdier for en bestemt SSO-probe, skal prøven typebestemmes, hvor proben antages at være negativ og igen, hvor proben antages at være positiv. Der kan opstå 3 situationer: 1. Ét af valgene (dvs. positiv eller negativ) giver et match. 2. Begge valg giver matches. Prøven kan analyseres igen, eller allelerne, der opnås fra begge typebestemmelser, kan rapporteres. 3. Ingen af valgene giver et match. I dette tilfælde er der sandsynligvis andre prober, som er tildelt forkert. Denne prøve skal analyseres igen og muligvis amplificeres igen. Hvis der er mere end to ubestemte prober, skal prøven analyseres igen. Hvis et probe hit-mønster ikke giver en HLA-type, skal prøven amplificeres og analyseres igen. Det er måske også nødvendigt at genisolere DNA fra prøven samt amplificere og analysere prøven igen. Som angivet i afsnittet Procedurens begrænsninger er det vigtigt at følge protokollen nøje. Enhver afvigelse kan medføre fejl i typebestemmelsen af prøven. SPECIFIKKE EGENSKABER FOR PERFORMANCE Når LIFECODES HLA SSO Typing Kits anvendes ifølge den procedure, der beskrives i produktets indlægsseddel, kan klasse I og klasse II HLA-typer i DNAne fastlægges. HLA A eres Kit viser 98,46 % overensstemmelse (95,24 % nedre grænse ved 95 % konfidensinterval) og HLA B eres, DRB1 eres og DRB 3, 4, 5 Kits viser 100 % overensstemmelse (97,72 % nedre grænse ved 95 % konfidensinterval) for 130 evaluerede ved sammenligning med resultater, der blev opnået med bidirektionel sekventering. HLA A, B, C og DQB Kits viste 100 % overensstemmelse (92,9 % nedre grænse ved 95 % konfidensinterval) og DRB Kits viste 98 % overensstemmelse (89,4 % nedre grænse ved 95 % konfidensinterval) for evaluerede ved sammenligning med resultater, der blev opnået med Pel-Freez SSP UniTray-metoden. HLA DRB1 Kits viste 98 % overensstemmelse (91,1 % nedre grænse ved 95 % konfidensinterval) for 60 evaluerede ved sammenligning med resultater, der blev opnået med LIFECODES HLA DRB Kit.. REFERENCER 1. Olerup, O., et al. (1992) Tissue Antigens 39:225 2. Saiki, RK., et al. (1986) Nature 324: 163 3. Maeda, M., et al. (1989) Tissue Antigens 34: 290 4. Bugawan, TL., et al. (1990) Immunogenetics 32: 231 BEGRÆNSET LICENS Dette produkt leveres ikke med Taq-polymerase og omfatter ikke en licens under patenterne i andre lande, der ejes af F. Hoffmann-La Roche Ltd. og Roche Molecular Systems, Inc. til at udføre den PCR-proces (Polymerase Chain Reaction), der er beskrevet i nævnte patenter. Yderligere oplysninger om kravet om køb af licenser i det aktuelle land kan fås ved at kontakte F. Hoffmann-La Roche Ltd. eller Roche Molecular Systems, Inc. Køb af dette produkt omfatter en begrænset licens, der ikke kan overdrages, under US-patentet 5,981,180 eller tilsvarende patent i andre lande tilhørende Luminex Corporation, til at udføre multiplex-analyse af kliniske til HLA-typebestemmelse. Side 8 af 9 LC775IVDDA.17 (02/14)

Producent: Immucor Transplant Diagnostics, Inc., 5 West Avenue, Stamford, CT 06902. Tlf.: +1-203-328-90, +1-888-329-0255 Fax: +1-203-328-9599 Autoriseret repræsentant: Emergo Europe, Molenstraat 15, 2513 BH, The Hague, The Netherlands. Tlf.: (31) (0) 70 345 8570, Fax: (31) (0) 70 346 7299 Teknisk service i Europa: Tlf.: +32/3 385 4791 Dette dokument blev sidst revideret og udgivet: Rev. 17, 2014-02-10 ANVENDTE VAREMÆRKER AB Gene AB Gene House Costar Corning Incorporated Microseal Bio-Rad Laboratories, Inc. Luminex Luminex Corporation IDNA Agarose QIAAmp GelStar Cambrex Bio Science Qiagen Inc. Cambrex Bio Science BILAG A Gel-elektroforese PCR-reaktionerne, der udføres i LIFECODES HLA-SSO Typing Kits, er udviklet til at danne både dobbelt- og enkeltstrengede produkter, som er de overvejende produkter, der hybridiseres til SSO'erne. Af hensyn til kvalitetssikring eller for at foretage fejlfinding i et forsøg kan det være nødvendigt at foretage gelelektroforese for at undersøge PCR-reaktionen for tilstedeværelse af amplificeret DNA. Nødvendige materialer (som angivet på listen eller tilsvarende) Electrophoresis Grade Agarose (Cambrex IDNA Agarose nr. 170) Elektroforeseapparat/strømforsyning 1X gelbuffer (40xTAE, Promega No. V4281) GelStar Nucleic Acid Gel Stain (Cambrex nr. 535) UV-transilluminator (ChromatoVUE, UVP Inc., model TM36) Fotografisk billedsystem Den relative vandring af det enkeltstrengede produkt afhænger af gelkoncentrationen og det anvendte buffersystem. Omtrentlige vandringer for hver amplifikation vises på listen nedenfor for kørt i en 2 % agarosegel i 1X TAE-buffer. HLA-A HLA-B HLA-C Elektroforeseforhold 1. Tag GelStar Nucleic Acid Stain (Cambrex nr. 535) ud af fryseren til optøning. Opbevar den mørkt. 2. Gelen, der bruges til denne procedure, skal være 2 %, dvs. til et gelkar på 200 ml skal der bruges 4 g agarose til 200 ml 1X TAE (fortyndes fra 40X TAE). Tilsæt 10 µl GelStar Nucleic Acid Stain til den smeltede agarose. Sørg for, at der er tilstrækkelig plads til, at DNA'et kan vandre 3-5 cm, når gelen hældes op. FORSIGTIG! GelStar er et potentielt karcinogen. BEMÆRK! Det er muligt at køre geler med 20 µl af 10 mg/ml ethidiumbromid i stedet for GelStar Nucleic Acid Stain. Produktets båndintensitet vil være mindre i geler, der indeholder ethidiumbromid end i geler, der indeholder GelStar. FORSIGTIG! Ethidiumbromid er et kendt karcinogen. 3. Opbevar gelen mørkt, og lad den størkne. 4. Tilsæt en blanding af 2,5 µl af hvert PCR-produkt og 2,5 µl 2X loadingbuffer med synligt farvestof, pr. prøve, pr. amplifikation. Lad gelen vandre i mørke ved ca. 160 V i 45 minutter, eller indtil ne har vandret længe nok til, at der kan observeres bånd for enkelt- og dobbeltstrenget produkt (bromphenolblåt bånd eller anden synlig markør, der vandrer 3-5 cm fra brøndene). 5. Tag et foto ved hjælp af UV-transilluminatoren med et gult GelStar -fotofilter (Cambrex nr. 536). FORSIGTIG! Anvend beskyttelsesudstyr ved håndtering af GelStar Nucleic Acid Stain eller ethidiumbromid og ved fotografering af gelen med UVtransilluminatoren. 6. Gel-analyse HLA- DRB1 HLA- DRB3,4,5 HLA-DQB Dobbeltstreng(e) (bp) ~420 ~370, ~340 ~476, ~447 ~280 ~280 ~260, ~160 Enkeltstreng(e) (bp) ~240 ~200 ~2, ~200 ~180 ~180 ~170, ~100 Gel-fortolkning Brønd Amplifikation Ikke-amplifikation Dobbeltstrenget DNA Enkeltstrenget DNA Primerbånd ---- (lys) -------- (mindre lys) Side 9 af 9 LC775IVDDA.17 (02/14)