DNA smeltepunktsbestemmelse

DNA smeltepunktsbestemmelse Troels Linnet Christine Hartmann Mads Topp 29. november 2006 Resumé DNA smeltepunktet bestemmes teoretisk og praktisk til sammenligning. Ved opvarmning forventes et højere smeltepunkt end ved afkøling. Oligonucleotidets tilstand i enten duplex eller monomer form forventes at have betydning for prøvens absorbans. Spektre afmåles med absorbans som funktion af bølgelængde, hvor maxima findes og grafer for absorbans som funktion af temperaturen ved denne bølgelængde plottes, til afmåling af smeltepunkt. Indhold 1 Teori 1 2 Metode 3 3 Databehandling 4 4 Fejlkilder 8 5 Konklusion og diskussion 8 1 Teori Oligonucleotider kan holde partikler sammen i duplexer. Dette kræver at oligonucleotidet er sin egen komplementære. Oligonucleotiderne knytter sig til en partikel og ved at indgå i hybridiseret baseparring med hinanden bringer de derved partiklerne sammen i duplexer. Spm 1: Den totale koncentration af monomer betegnes c T og denne kan dermed defineres som: c T = 2[D] + [M] 1

2 hvor [D] betegner koncentrationen af Duplex og [M] betegner koncentration af monomerer. Spm 2: Prøvens oligonucleotid er netop sin egen komplementære, hvilket også forklarer dens sammenkobling af partikler ved parring af basepar. Ved lav temperatur sidder partiklerne altså sammen i duplexer, hvorefter de adskilles i monomerer når temperaturen øges. Absorbansen afhænger af temperaturen, da det har betydning for absorbansen om stoffet er i duplex eller monomer form.ved smeltepunktet er præcis halvdelen af monomererne i duplexform. Spm 3: I denne øvelse skal smeltepunktstemperaturen bestemmes, dvs det tidspunkt hvor halvdelen af monomerer findes på duplexform. Ved T m kan ligevægtskonstanten udtrykkes ved: K Tm = 1/4c T (1/2c T ) 2 = 1/c T Da [M] = 1/2c T og 2 af disse omdannes til en duplex med [D] = 1/4c T dermed er 2(1/2c T ) = 1/4c T Spm 4: Vi kan ved hjælp af denne formel udlede en anden, så smeltepunktet kan bestemmes rent teoretisk ud fra enthalpi, entropi og total koncentration: Da G = RT lnk = H T S 1 + R S lnk = T m H H ln 1 c T = lnc T 1 T m = S H + R H lnc T Når lys sendes gennem DNA, der indeholder oligonucleotider samt diverse partikler kan absorbansen måles. Absorbansen beskriver hvor meget lys, der optages af prøven. Den er proportionel med koncentrationen samt transmissionen som : A = log T. Hvor A er absorbansen og T er temperaturen i Kelvin.

3 Spm 6: Lambert-Beers lov: A = ǫ c l. Værdien af ǫ 260 afhænger af om molekylerne er i duplex eller monomer form.. Elektronerne i stoffet ekciteres til et højere energiniveau når de absorberer lys. Dermed kræves det, at der er elektroner til stede, der har mulighed for at blive ekciteret. Det kan ikke lade sig gøre i så høj grad når nucleotiderne sidder i duplex form. Her sidder baseparrene tættere sammen og holder dermed hinanden fast. Absorbansen er lavere i duplex form og øges dermed som flere monomerer dannes ved smeltning af stoffet. Spm 5: Ved λ =260 nm er det basedelen af nucleotiden der absorberer lys. Baserne er den eneste del af stoffet, der indeholder dobbeltbindinger og dermed pibindinger. Disse er mere ustabile end sigma-bindinger, har større mulighed for at blive ekciteret og dermed ligge på et højere energiniveau. 2 Metode Opstilling : Kuvette med prøve nedsat i en kobberklods, forbundet med et termodynamisk reservoir for vedligeholdelse af bestemt temperatur. Spektrofotometerlampe udsender lys gennem prøve og måling af gennemtrængt lys samt databehandling udføres på tilknyttet computer. To opløsninger benyttes til prøven. En bufferopløsning bestaænde af 1,00M NaCl, 0,1mM Na 2 EDTA, fosfatbuffer (ph 7) og ultrarent vand samt en stamopløsning med oligonucleotidet 5 -GTGGCCAC-3. Denne har afgasset i 15-20 min inden start. Spm 10: H og S kan findes ud fra tabellen [2]. H og S kan findes for to nabosiddende baser. Værdierne lægges sammen for parrerne gennem nukleotidet. Til slut lægges værdi for start og slut base til: H = 8, 4 8, 5 8, 0 9, 8 8, 0 8, 5 8, 4 + 0, 1 + 0, 1 = 59, 4kcal/mol = 248, 292kJ/mol S = 22, 4 22, 7 19, 9 24, 4 19, 9 22, 7 22, 4 2, 8 2, 8 = 160eu = 668, 8J/(K mol)

4 Vi kan nu finde et estimeret smeltepunkt ud fra vores tidligere udledte formel: 1 T m = Spm 7: R H lnc T + S H = 0, 003045 T m = 328, 44K = 55, 29 C Vores stamopløsning består af en 50 µ M koncentration monomer. Vores prøves totale koncentration skal ved forsøget være 28,0 µ M. Det totale volumen er 1 ml. Ved beregning findes mængden af bufferopløsning og stamopløsning der skal blandes for at opnå den rette koncentration: c T V tot = c stam V stam V stam = c T V tot = 28, 0 1 = 0, 56ml c stam 50 V buffer = 1ml - 0,56 ml = 0,44 ml Vandbadet indstilles til 20 C ved start. Et spektrum af en tom kuvette optages for at sikre at der ikke er usikkerheder på målingerne. Derefter optages et spektrum af kuvetten med ren bufferopløsning. Dette bruges som reference og skal subtraheres fra de senere målte spektre. Kuvetten rengøres og målinger af DNA og buffer blandingen med den rette koncentration kan nu påbegyndes. Alle opløsninger overføres til kuvetten vha pipette. Kuvetten vendes for at blande opløsningen, ydersiden af kuvetten tøres af med linsepapir og luftbobler i opløsningen sikres fjernet. Spektrum af opløsningen måles nu med intervaller på 5 C op til 70 C. Omkring smeltepunktet er intervallerne tættere, da der her forventes at kunne ses et spring i spektret i form af kraftigere forøgelse af absorbansen. Prøven køles ned og måles på med samme intervaller. Hastighed ved nedkøling sættes lidt op ved tilsætning af is i vandbadet. 3 Databehandling Spektret blev først målt med absorbans som funktion af bølgelængden. Grafen for referencespektret/buffer blev subtrahteret de målte spektre for prøven, da vores smeltpunktsanalyse kun omhandler DNA et. Grafen er desuden zoomet ind på området omkring 260 nm, da det er et maksimum. Som man kan se er der højest absorbans omkring λ = 260 nm (257 helt præcist). Dermed er det denne bølgelængde der er mest fordelagtig at bruge. Derefter blev bølgelængden sat fast og et plot af absorbansen som funktion af temperaturen blev sat op. Som det ses på plottet er absorbansen højere ved samme temperaturer under afkøling end ved opvarmning. Det antyder tilstedeværelsen af flere monomerer, da denaturering forekommer nemmere end gendannelse af duplex.

5 Figur 1: Zoom af absorptions spektre for at finde bølgelængde for maksimale absorption som giver 257 nm Figur 2: Vores måleserie med sammenhørende værdier af absorption som funktion af temperatur ved 257 nm Vores måling sættes nu i samme plot som de opgivne data lagt ud på hjemmesiden. Der ses en lighed mellem spektret for 35 µm og vores spektrum. Se Figur 3.

6 Figur 3: Sammenligning af alle måleserier med sammenhørende værdier af absorption som funktion af temperatur For at finde smeltepunktet eksperimentelt skal vi nu ind og undersøge graferne med hensyn til maximal stigning af absorbansen. Dette gøres ved at differentiere temperatur-absorbans graferne, se Figur 4, 5 og 6. Figur 4: Smeltepunkt temperatur for en 8µm og 12µm opløsning Maxima for det givne spektrum ved en koncentration på 28 µ M kan ses at være 60 C Vi kan ved vores egen måling nu lokalisere et maxima, der svarer til smeltepunktstemperaturen, se Figur 7. Denne ses at være lig 57 C ved opvarmning. Vores eksperimentelle måling af smeltepunktet ved opvarmning stemmer altså fint overens med vores beregning, der giver en temperatur på 55,29 C

7 Figur 5: Smeltepunkt temperatur for en 15µm og 20µm opløsning Figur 6: Smeltepunkt temperatur for en 28µm og 35µm opløsning Figur 7: Smeltepunkt temperatur for vores 28µm opløsning ved opvarming Opløsning T op /C T ned /C 8 µ M 56 34 12 µm 57 34 15 µm 58 34 20 µm 60 36 28 µm 60 36 35 µm 62 36 Vores 28 µm 57 - Tabel 1: Smelte punkts temperaturer for de forskellige opløsninger ved opvarmning og nedkøling

8 Spm 9 Vores egen måling af smeltepunktet ved 28 µm på 57 C ligger tæt op ad det givne spektrums smeltepunkt på 60 C ved opvarmning. Idet computeren ophørte med at virke kunne vi ikke finde maxima ved nedkøling og der er dermed ikke data nok til sammenligning her. 4 Fejlkilder Som altid hører der en masse fejlkilder til et forsøg. Ved vores var den der gjorde det største udslag temperaturen. Først skulle der indstilles en temperatur med et termometer, der ikke var så præcist, da det varierede med 0,1 C. Det var desuden nødvendigt at tage termometeret op af kuvetten for at måle spektret. Grunden til dette var, at termometeret ikke skulle forstyrre lyset der gik igennem prøven. Da spektret på computeren kun bliver opdateret hvert 3,5. s (med integration time lig 35 ms og average lig 100) skulle der ventes lidt inden vi kunne gemme spektret. I dette tidsrum kunne der nå at ske ændringer. En anden mulig fejlkilde der som regel er, når man arbejder i laboratorie er urent udstyr. Derudover kan upræcision i buffer og nukleotid blandingen med hensyn til udtagning af korrekt volumen gøre en forskel. En mindre fejlkilde kan være at blandingen i kuvetten ikke er homogent, men med så lavt et volumen er det usandsynligt. Målinger af spektre kan blive forstyrret af udefrakommende lys eller rystelser fra ledninger og bord, men er dog også en lille fejlkilde. Kuvetten kunne muligvis have været brugt til et andet forsøg og selvom den er renset med ethanol kan der stadig være noget tilbage. Termometeret blev ikke renset inden, da dette virkede som en unødvendighed. Dermed kunne der have siddet noget tilbage fra et tidligere forsøg (Hvis der sad Na + ioner tilbage fra NaCl ville det medvirke til at smeltepunktet lå højere end det egentlig var.) 5 Konklusion og diskussion Spm 11: Ved hjælp af det opgivne link [1] findes T m,opv til at være 54 C, H til at være 67, 5 kcal mol og S til at være 176, 2 cal Kmol. De beregninger der ligger til grund for de tal fra hjemmesiden er beskrevet af Breslauer [4] hvor de har brugt tal offentliggjort af Sugimoto [5]. Dem vi selv har bestemt er T m,opv til at være 55,28 C, T m,afk til 33 C (Denne værdi nåede vi ikke at bestemme eksperimentielt, men udfra data på hjemmesiden). At temperaturen ved afkøling er lavere end ved opvarmning stemmer overens med tallene fundet på hjemmesiden. Dette kan forklares ved at DNA ved genopbygning kræver

9 mere præcise placeringer i forhold til hvordan baseparrene ligger, i modsætning til andre molekyler, der ikke kræver nogen bestemt opsætning i deres krystalisering. Der er plads til flere tilfældigheder ved almindelige molekyler, hvorimod baseparrene skal placeres rigtigt overfor hinanden. Vores H blev udregnet til at være 59, 4 kcal mol og S til at være 160 cal Kmol. Dermed ser vi at vores S er 12% og vores H 9, 1% lavere end den værdi vi fik fra hjemmesiden [1]. Der henvises til fejlkilderne. Litteratur [1] http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html. [2] H.T. Allawi and J. SantaLucia. Termodynamics and nmr of internal g-t mismatches in dna. Biochemistry, 36:Table 1, 1997. [3] Jr. Ignacio Tinoco, Kenneth Sauer, and Joseph D. Puglisi. Physical Chemistry - Principles and Apllications in Biological Sciences. Prentice- Hall, Inc., 2002. [4] Breslauer K.J., Frank R., Blocker H., and Marky L.A. Predicting dna duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A, 83:3746 50, 1986. [5] Sugimoto N., Nakano S., Yoneyama M., and Honda K. Improved thermodynamic parameters and helix initiation factor to predict stability of dna duplexes. Nucl. Acids Res, 24:4501 4505, 1996.