Cisgen byg med bedre fosfatudnyttelse Seniorforsker Inger Bæksted Holme Aarhus Universitet, Science and Technology, Institut for Molekylærbiologi og Genetik, Afgrødegenetik og Bioteknologi
Hypotese Det er muligt at forstærke en egenskab hos en plante ved at indsætte ekstra eksemplarer af det gen, som styrer egenskaben Mål At hæve fytaseaktiviteten i bygkernerne ved at indsætte ekstra kopier af et bygfytasegen, således at der vil frigives mere biotilgængelig fosfat ved fodring
Fosfat, fytinsyre og fytaser P P H5 H4 P H6 H3 H1 H2 Fytinsyre Myo-Inositol-(1,2,3,4,5,6)-hexakisphosphate P P P 70-80% af fosfat-reserven i bygkernen er bundet i fytinsyre. Fytaser er enzymer, der nedbryder fytinsyre, således at der frigøres biotilgængeligt fosfat..
Fosfat, fytinsyre og fytaser Under kerneudviklingen dannes fytaser, som oplagres i aleuronlaget, hvor også fytinsyre oplagres Disse fytaser aktiveres under fordøjelsen og biotilgængelig fosfat frigøres: Fytase enzyme H2O + + H2PO4 -
Udnyttelse of fosfat hos grise Gødning 50% Deponering 30% For at forhindre fosfatmangel bliver kornbaseret foder tilsat ekstra fosfat og /eller fytase enzym Urin 20% fremstillet fra mikroorganismer From: Poulsen, 1996
Fytaser i bygkernen Plant Physiology 2011, 156: 1087-1100 Fytaser benævnt purple acid phosphatases (PAP fytaser) udgør størstedelen af de fytaser, der syntetiseres i bygkerner To typer af PAP fytaser i byg: PAPhy_a, PAPhy_b a-typen syntetiseres hovedsagelig under kerneudviklingen b-typen syntetiseres hovedsagelig under frøspiringen
Indsættelse af ekstra kopier af PAPhy_a genet Metode 1) Isolation af det genomiske PAPhy_a gen inkl. promoter og terminator 2) Indsættelse af det genomiske gen i Agrobakterium vektorer 3) Agrobacterium transformation af byg 4) Identifikation and karakterisering af cisgene planter
Genomisk PAPhy_a gen Promoter Gen Terminator 2708 bp 2266 bp 878 bp Exon Intron Indsættelse i Agrobakterium vektor LB Hygromycin resistens gen RB LB PAPhy_a RB Antibiotikum resistens gen (Tetracycline) Antibiotikum resistens gen (Kanamycin)
Agrobakterium infektion og overførsel af T-DNA T-DNA med fytasegen Agrobakterie T-DNA med selektionsgen Transformeret plantecelle Udspaltninger i næste generation
Transformation af umodne embryoer fra bygsorten Golden Promise
Analyse af transformanter PCR-opformering af: en DNA-sekvens af hygromycin resistens genet en DNA-sekvens i promoteren og en DNA-sekvens i terminatoren af PAPhy_a en DNA-sekvens af kanamycin resistens genet i vektor-backbone en DNA-sekvens af tetracyclin resistens genet i vektor-backbone LB Hygromycin resistens gen RB LB PAPhy_a RB Antibiotikum resistens gen (Tetracyclin) Antibiotikum resistens gen (Kanamycin)
FTU/kg mel Fytase aktivitet i formalede kerner fra 23 transformanter 8000 6000 4000 2000 0 T 0 -lines Planter uden rester fra vektorstrukturen Planter med rester fra vektorstrukturen
Udspaltning af fytasegenet og selektionsgenet i afkom fra fem transformanter Observeret udspaltning Transformanter Antal afkom H + F + a H + F - H - F + H - F - Plante 01 50 34 14 0 2 Plante 02 29 28 0 0 1 Plante 03 25 17 3 5 0 Plante 05 40 24 9 5 2 Plante 07 56 41 13 2 0 a: F=fytase gen; H= hygromycin resistens gene. Udspaltning af fytase genet: Plante03 F + /F - 22/3 1-2 gener (?) Plante05 F + /F - 29/11 1 gen Plante07 F + /F - 43/13 1 gen
FTU/kg mel Fytase aktivitet målt i formalede kerner fra Plante05 og Plante07 selektionsgen-frie planter 4000 Plante05 Plante07 3000 2000 1000 0 1 2 3 1 2 3 Fytase aktivitet i kerner fra planter 1. uden ekstra fytase kopier 2. med en ekstra fytase kopi (hemizygoter) 3. med to ekstra fytase kopier (homozygoter)
Undersøgelse af flankerende DNA sekvenser af det indsatte PAPhy_a gen LB PAPhy_a RB Kanamycin resistens gen LB PAPhy_a RB Sekvens-rester af vektor-backbone Sekvens-rester af vektor-backbone Der er ingen flankerende vektor-backbone sekvenser BLASTn af de flankerende sekvenser viser, at de indsatte PAPhy_a gener ikke er indsat i kodende sekvenser Det indsatte PAPhy_a i Plante05 og Plante07 er indsat på henholdsvis den lange og den korte arm af kromosome 3H. Indsættelse af PAPhy_a genet har forårsaget mindre deletioner på 22-26 bp
Dyrkning af Plante07 i semifield Semifield på Flakkebjerg Overdækket område, hvor planterne dyrkes i store potter på et membran dækket gulv. Planterne drypvandes. Gødes som i marken. Herudover eksponeres planterne til de samme klimabetingelser som en almindelig mark.
Dyrkning af Plante07 i semifield 4000 Semifield Drivhus 3000 2000 1000 0 1 2 1 2 Fytase aktivitet i kerner fra planter 1. uden ekstra fytase kopier 2. med to ekstra fytase kopier (homozygoter) Planter dyrket i semifield viste lavere fytase aktivitet. Den relative forøgelse af fytase aktiviteten i cisgene planter var dog næsten den samme (2,8 for drivhus og 2,6 for semifield).
Konklusion Vi har udviklet to cisgene byglinier med 2,7 gange højere fytaseaktivitet i kernerne Byglinierne indeholder en ekstra kopi af fytase genet Dette bekræftiger hypotesen om, at det er muligt at forstærke en egenskab hos en plante ved at indsætte ekstra eksemplarer af det gen, som styrer egenskaben Forøgelsen i fytase aktiviteten svarer til den aktivitet (1500 FTU/kg mel), der normalt tilføres foder via mikrobiel fytase og som hæver biotilgængeligheden af fosfat i fodret fra 30 til 60% Opformering af cisgen byg i marken Fodringsforsøg Videre undersøgelser
Tak for opmærksomheden