Misbrugsanalyser for Cannabis - teori og anvendelse Torben Breindahl Hospitalskemiker, cand. scient., Klinisk Biokemisk Afdeling, Sygehus Vendsyssel Screening og verifikation Klinisk Biokemisk Afdeling, Sygehus Vendsyssel udfører Cannabis-analysen som et "2-trins" system, ligesom det er anbefalet i de fleste internationale retningslinier 1 : - en indledende test udført ved immunkemisk screening (EMIT ) under anvendelse af en tærskelværdi, en såkaldt "cut-off" faktor, 2 som skiller positive fra negative prøver. Denne teknik er pålidelig, hurtig, relativ prisbillig og nem at automatisere og kvalitetskontrollere. Hvis den indledende screening er "negativ", rapporteres dette resultat og yderligere analyser foretages ikke. - hvis den indledende test er positiv, bekræftes resultatet med en anden analyseteknik (verifikation). Her benyttes massespektrometri (MS), der kan betragtes som en referencemetode indenfor alle misbrugsanalyser. 3 Det er komplicerede, ressource-krævende og ofte længerevarende analyser, som kun kan udføres af særligt uddannet personale og med brug af meget dyrt udstyr. Heraf kommer også nødvendigheden af at det kun er de positive prøver som verificeres. Ved verifikationsanalyser anvendes også "cut-off" grænser, som gælder for en enkelt udvalgt kemisk forbindelse (ofte metabolit), der er særlig karakteristisk for stofgruppen. For Cannabis har man valgt nedbrydningsproduktet 11-nor- 9 -tetrahydrocannabinol-9-carboxylsyre (forkortelse: THC-COOH). Er resultatet lavere end "cut-off" grænsen rapporteres "negativ" (se Tabel 1), uanset om stoffet tydeligt kan detekteres / identificeres, hvorved "cut-off" grænsen i praksis virker som en "bagatelgrænse". Bemærk at samme koncept anvendes ved dopinganalyser. Tabel 1: Cut-off værdier for Cannabis misbrugsanalyser Stofklasse Cannabis Screening EMIT Cut-off (ng/ml) Verifikation LC-MS Cut-off (ng/ml) THC-COOH 50 15 Side 1 af 6
Man kan spørge hvorfor "cut-off" grænsen for Cannabis screeningen ikke er overensstemmende med verifikations "cut-off" og svaret er ligetil. Ved den immunkemiske screening anvendes reagenser baseret på antistoffer, der bindes specifikt til Cannabis metabolitter, og da der findes flere metabolitter end THC-COOH i en urinprøve, vil det "respons" man får ved målingen være højere ("krydsreaktion"). Påvisningstider Passiv rygning medfører meget små mængder af cannabinoider og nedbrydningsprodukter i urinen. Disse kan ikke påvises med almindelige metoder og slet ikke med screening ved 50 ng/ml "cut-off". Det kan derfor ikke benyttes som forklaring på positive analyseresultater. Ved rygning afhænger dosis (indtaget mængde aktivt stof) af produktets styrke / art (topskud, harpiks, udtræk), antal og dybde af inhalationer m.m., og der er derfor også store individuelle variationer i hvor længde rygningen kan påvises. Endvidere afhænger påvisningstiden af misbrugets hyppighed, fordi stofferne ophobes i fedtvævet og langsomt frigives. Derfor er prøveresultater for kroniske misbrugere positive i længere tid efter ophør med rygning. Tabel 2 viser vejledende påvisningstider med laboratoriets metoder og anvendelse af de før nævnte "cut-off" værdier (Tabel 1). Tabelværdierne skal benyttes med en del forsigtighed på grund af de individuelle variationer. Tabel 2: Vejledende påvisningstider for Cannabis misbrugsanalyser. Misbrugets karakter / hyppighed Påvisningstid i urin Screening: "cut-off": 50 ng/ml Verifikation: "cut-off": 15 ng/ml Passiv rygning Kan ikke spores 1-2 rygninger 2-3 døgn Oral indtagelse 1-5 døgn Moderat misbrug 5 døgn Svært misbrug 10 døgn Kronisk misbrug > 14 døgn Ekstreme tilfælde 3-4 uger Side 2 af 6
Det er videnskabeligt eftervist at størstedelen af Cannabis-misbrugere har negative urinprøver ved 50 ng/ml "cut-off" efter 10 dage uden rygning ved moderat eller førstegangs misbrug er en påvisningstid på 3-4 dage almindelig ved 50 ng/ml "cut-off" Udskillelsen af Cannabis Urinkoncentrationer af Cannabis nedbrydningsprodukter afhænger af individuelle og generelle faktorer såsom væskeindtagelse, stofskifte, fysisk aktivitetsniveau, ernæring (fødemidler) m.m. Hvis man vil benytte den fundne værdi for THC-COOH (verifikationsanalyse ved LC-MS) til vurdering af stofmisbruget ophør skal man: sammenligne flere forskellige resultater for samme individ med mindst 3 dages interval normalisere eller korrigere THC-COOH resultatet for urinprøvens fortyndingsgrad (styrke) ved at dividere med creatinin koncentrationen. Dette stof udskilles dagligt i nogenlunde samme mængde for en person og er derfor en god markør for hvor "stærk" urinen er. Høj creatinin værdi viser stærk urin og dermed også højere koncentration af metabolitter end ved lav creatinin værdi. Creatinin måles i millimol pr. liter (mmol/l). Eksempel: En urinprøve er målt positiv ved immunkemisk screening. Ved verifikation findes 125 ng/ml THC-COOH i prøven og en U-creatinin værdi på 10,2 mmol/l. Den creatinin-korrigerede værdi er derfor: THC - COOH ( ng / ml) Creatinin ( mmol / L) = 125 ( ng / ml) 10. 2 ( mmol / L ) = 12.25 ( ng / ml) ( mmol / L) afrund til 12 ( ng / ml) ( mmol / L) Den optimale procedure er at teste med intervaller på mindst 3 dage for at undgå at små, naturlige, "dag-til-dag", variationer i kurven får betydning ved tolkning af resultatet. Det er vist at disse små udsving kan få en prøve til at skifte frem og tilbage mellem "positiv" og "negativ", hvis ikke 3-dages reglen overholdes. Side 3 af 6
Kontrollerede studier af Cannabis udskillelsen har vist at man kan anvende visse "standardregler": Patienten kan betragtes som "clean" efter 2 negative prøver med 3 dages mellemrum ved 50 ng/ml "cut-off". Bliver prøven igen positiv er der med meget stor sandsynlighed tale om genoptaget misbrug Hvis den creatinin-korrigerede THC-COOH koncentration (se beregning) stiger mere end 50 % i prøver udtaget med 3-dages interval, så indikerer det med al tydelighed genoptaget Cannabis misbrug indenfor perioden. 4 Det vil sige at det nye tal divideret med det foregående er over 1.5. Klinisk Biokemisk Afdeling er altid behjælpelig med bistand og tolkning af de kvantitative svar i forbindelse med de ovennævnte regler. Fejlkilder og "sløring" En af de vigtigste fejlkilder er fortyndede prøver eller anden form for sløring af en mulig positiv urinprøve. Klinisk Biokemisk Afdeling benytter retningslinier og acceptgrænser for prøvens phværdi (surhedsgrad), creatinin-indhold og i visse tilfælde også massefylde. Prøven afvises hvis værdierne ligger udenfor faste grænser. Alligevel kan man ikke udelukke at visse patienter forsøger at snyde med urinprøven og at det ind i mellem lykkes. Rekvirenterne opfordres derfor til høj kontrol under hele prøvetagningen og indførelse af faste procedurer. Prøvetagningen er og bliver det svageste punkt under hele testningen. En anden fejlkilde er "falske" negative prøver, det vil sige prøver hvor den indledende screening er negativ, selvom den indeholder rester af misbrugsstoffer, vel at mærke over "cut-off" grænsen. Ved brug af immunkemiske metoder er dette altid en teoretisk mulighed og man kan på ingen måde udelukke at det kan ske. Det skal dog siges at metoden, der benyttes på Klinisk Biokemisk Afdeling er særdeles anerkendt på internationalt plan og har været anvendt af mange laboratorier i lang tid. Hvis screeningen er "falsk" positiv vil dette i næsten alle tilfælde afsløres under verifikationsanalysen med mindre der er tale om kontaminering, afsmitning eller f.eks. ombytning af prøver under udtagning eller analyse. Der er altid en risiko for at disse fejl kan forekomme, selvom den er minimal. Side 4 af 6
Svar på ofte stillede spørgsmål Patienten indrømmer misbrug af Cannabis. Hvorfor er prøven negativ? Når prøven er negativ er det oftest fordi den indledende screening er negativ, hvilket vil sige at THC nedbrydningsprodukternes "respons" ikke overstiger 50 ng/ml. Prøven er måske udtaget på et sådant tidspunkt, at koncentrationen har nået maksimum ("toppet") og nu er på vej ned. Bemærk at en negativ prøve betyder at Cannabis nedbrydningsprodukter er under 50 ng/ml, ikke at de er "0". Patienten får medicin af forskellig slags. Kan det have indflydelse på resultatet? Medicin kan godt tænkes at påvirke udskillelsen af Cannabis, men ikke selve analyseresultatets kvalitet ved verifikationen. En positiv prøve verificeret med LC-MS vil være meget sikker. Patientens prøve er positiv. Hvornår skal vi indsende en prøve igen? Der bør normalt gå mindst 3 dage inden en ny prøve indsendes for at sikre at små udsving ikke får negativ indflydelse på vurderingen af udskillelseskurven for en misbruger, der er stoppet. Den creatinin-korrigerede værdi for THC-COOH er steget. Betyder det at patienten har genoptaget misbruget? Kun hvis værdien er steget mere end 50 % (ved 3 dages prøvetagningsinterval), det vil sige hvis det nye tal divideret med det foregående er over 1,5. I så fald er det indikation for nyt misbrug. Kan man sige at patienten er under påvirkning af Cannabis når prøven er positiv? Nej, analysens resultat viser kun om der er fundet Cannabis nedbrydningsprodukter over en vis tærskelværdi, ikke om personen er under indflydelse. Hvis dette var formålet skulle man benytte blodprøver og vurderingen heraf ville også være usikker. Generelt kan man sige at urin-koncentrationer ikke afspejler blodkoncentrationer, så konklusioner omkring rusvirkning er ikke mulig. Desuden måler man en Cannabis metabolit (THC-COOH) som ikke er farmakologisk aktiv. Når man kan screene med lavere "cut-off" hvorfor vælger laboratoriet så ikke den mest følsomme metode? At vælge en meget følsom metode giver kun mening i forhold til en "nul-tolerance" politik og vil ikke kunne anvendes på rette måde ved behandling af stofmisbrugere. Prøverne vil være "positive" i for lang tid (da kurven for udskillelse flader helt ud og kun falder langsomt). Hvis det gælder analyser i forhold til særlige erhverv (arbejdspladsscreeninger) kan det bedre retfærdiggøres f.eks. at anvende 20 ng/ml "cut-off". Rekvirenten har selv udført screening med "urin-sticks". Er der overensstemmelse med dette resultat og laboratoriets? Nej, ofte har "urin-sticks" lavere "cut-off" og derfor kan man ikke forvente overensstemmende resultater fra disse "sticks" og laboratoriets EMIT-screening. Der opfordres til at alle positive prøver verificeres uanset hvilken immunkemisk metode, der er anvendt. Afvigelser fra denne regel kunne f.eks. være at patienten indrømmer misbruget ved konfrontation med resultatet fra en screening. Det er naturligvis op til rekvirenten at anvende en sådan fremgangsmetode. Bemærk at mange "urin-sticks" markedsføres som "fejlfrie" og i stand til at måle "ned til 0". Dette er selvfølgelig ikke muligt - ingen analyse er 100 % fri for mulige fejl ("falske" positive eller "falske" negative) og alle metoder vil have en nedre detektionsgrænse. Bed derfor om at få oplyst "cut-off" for produktet og rekvirer en metodevalidering (reference til litteraturen). Kan man bestille en verifikationsanalyse i stedet for screeningen? Ja, men det giver kun mening i særlige tilfælde. I praksis bør man acceptere tærskelværdien ("cut-off": 50 ng/ml) fra screeningen og kun verificere resultatet hvis screeningen er positiv. Side 5 af 6
Kan man bestille en verifikation uden at få kvantitativt svar? Nej, det følger automatisk med analysen. Kan man udtage prøven på et for tidligt tidspunkt? Ja, da der er tale om urinprøvning, skal stofferne først cirkulere i blodet og udskilles i urinen for at de kan detekteres. Misbrugsstofferne kan normalt måles 6-8 timer efter indtagelse. Kan man benytte andet end urinprøver til screening? Ja, men det tilbydes ikke for øjeblikket. Der er metoder til spytprøver som bestemmer spor af THC i slimhinder og spyt fra rygning af Cannabis. Her vil stofferne kunne spores hurtigere end i urin, men ikke i så lang tid. Spytanalyser er under afprøvning i Europa og benyttes mere eller mindre rutinemæssigt i andre lande ved politiets test af trafikanter. Blodprøver benyttes ikke ved hospitalslaboratorier, kun ved retskemiske analyser. I udlandet benyttes også specielle plastre ("pads") til opsamling af sved over en periode. Disse kan analyseres og give et billede af længere tids stofmisbrug. Kan Cannabis benyttes som lægemiddel? Ja, men det er ikke godkendt og registreret som almindeligt lægemiddel af Sundhedsstyrelsen i Danmark. Dog gives speciel udleveringstilladelse af THC-holdige tabletter (Marinol) ved smertebehandling af sclerosepatienter. I udlandet anvendes det til bl.a. også til lindring af bivirkninger hos cancer-patienter i kemoterapi. Tabletterne indeholde syntetisk THC (op til 10 mg pr. tablet) og vil kunne medføre positive urinprøver. Kan man tilsætte stoffer for at sløre tilstedeværelsen af Cannabis-metabolitter i urinprøver? Ja, men det vil højst sandsynligt blive opdaget af laboratoriet under analyserne, idet prøvens ph, creatinin, udseende og evt. massefylde kontrolleres. Man kan dog ikke udelukke fænomenet, som kun kan begrænses ved høj kontrol under prøvetagningen. Mange af de sløringsprodukter der sælges på Internettet har ingen effekt på Cannabis analyser. Referencer / fodnoter 1 Se f.eks.: UK Laboratory Guidelines for Legally Defensible Workplace Drug Testing (Ver. 1.0, March, 2001) 2 Opgives i "ng/ml" er en koncentrationsenhed, som betyder nanogram pr. milliliter (1 ng = 0,000000001 gram) 3 Analysemetoden er publiceret: Torben Breindahl, Kirsten Andreasen. Determination of 11-nor- 9 - tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid in urine using high-performance liquid chromatography and electrospray ionization mass spectrometry, Journal of Chromatography B, 1999, 732, 155-164. 4 Nyere undersøgelser viser, at man kan anvende et endnu skrappere kriterium (Huestis), hvori den creatinin-korrigerede THC-COOH værdi skal falde mindst 50% mellem hver prøvetagning efter ophørt misbrug. Anvendelsen af denne regel giver dog flere "falske" positive forudsigelser. Side 6 af 6