PCX. COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, version 2.0. Tilsigtet brug. Oversigt over og forklaring af testen TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK.

COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, version 2.0 PCX TIL IN VITRO-DIAGNOSTIK. Ordreoplysninger COBAS AmpliPrep/ PCX 96 Tests P/N: 03576698 190 COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 Tilsigtet brug COBAS AmpliPrep System PWR 4 Liters P/N: 03309380 123 Wash Reagent COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 US: 83314 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus (HCV) Test, version 2.0 (v2.0) er en kvalitativ in vitro-test til bestemmelse af hepatitis C-virus RNA i humant serum og plasma ved hjælp af COBAS AmpliPrep-instrumentet til prøvebehandling og COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet til amplifikation og detektion. Forekomst af HCV RNA er et tegn på en aktuel HCV-infektion hos patienter med klinisk og/eller biokemisk bevis på en leversygdom. Testen anvender revers transskription af target-rna for at danne komplementær DNA (cdna), amplifikation af target-cdna ved hjælp af PCR (Polymerase Chain Reaction) og nukleinsyrehybridisering til detektion af HCV RNA i humant serum eller plasma. COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 er ikke beregnet til brug ved screening af blod eller blodprodukter for tilstedeværelsen af hepatitis C-virus. Oversigt over og forklaring af testen 170 millioner mennesker i verden er inficeret med hepatitis C-virus, og HCV er blevet betegnet som en virusepidemi med en fem gange større forekomst end HIV-1-infektioner 1. HCV er et enkeltstrenget, positiv sense RNA-virus med et genom, der består af ca. 10.000 nukleotider, som koder for 3.000 aminosyrer 2. Da HCV findes i blodet, kan det bl.a. overføres via blod og blodprodukter. Udbredt indførelse af screening af blod for HCV har sænket risikoen for hepatitis i forbindelse med transfusioner markant. Forekomsten af HCV-infektioner er størst i forbindelse med intravenøst stofmisbrug og i mindre grad i forbindelse med anden perkutan eksponering 4. Den globale forekomst af HCV-infektioner, bestemt ved immunserologi, varierer fra 6% til 28% i Ægypten, 1,8% i USA 1 og 1,1%-1,2% i Frankrig 3. Mellem 75% og 80% af de seropositive patienter er også viræmiske 1,3. P/N: 03789519 190 5/2008, Revision 5.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 1/46

Forekomsten af anti-hcv-antistoffer hos patienter, der er inficeret med HCV, har ført til udviklingen af immunserologiske test, der er specifikke for disse antistoffer 4,5. Implementeringen af disse test har allerede reduceret forekomsten af hepatitis, der opstår efter transfusion, i hele verden. Yderligere test er foretaget ved hjælp af RIBA (Recombinant Immunoblot Assay) for at fortsætte evalueringen af prøver, der er gentagent reaktive i antistof-screening-analysen. Nylige undersøgelser viser, at fortolkningen af denne supplerende test er afhængig af patientens risikostatus. I en bloddonorpopulation med lav risiko, blev f.eks. kun 50% af de RIBA-reaktive prøver bekræftet ved hjælp af en HCV RNA-test 6,7,8. Et positivt RIBA-resultat er således ikke en sand indikator for en aktiv HCV-infektion, idet patienter, der er blevet raske, kan forblive anti-hcv-positive i årevis 5. Herudover har tvivlsomme, supplerende testresultater vist sig hos både nyligt inficerede personer, som er under serokonversion, og hos personer, der er kronisk inficeret med HCV 9,10. Den immunserologiske test kan detektere aktuel og/eller tidligere eksponering over for HCV-infektion, men den kan ikke skelne mellem disse. På nuværende tidspunkt findes der ingen immunologisk analyse til direkte bestemmelse af HCV-antigen. I tilfælde med akutte HCV-infektioner kan enkelte personer desuden være ude af stand til at producere antistoffer mod HCV 11, hvilket gør diagnostik af aktuel HCVinfektion umulig med immunserologiske teknikker. Som alternativ kan detektion af HCV RNA med nukleinsyretest påvise en aktuel infektion. Ved hjælp af nukleinsyretest er det muligt at detektere HCV-viræmi før immunologisk serokonversion 12,13. Da nukleinsyretest kan detektere HCV RNA direkte, dvs. uafhængig af patientens immunologiske status, er en nukleinsyrebaseret test værdifuld ved detektion af HCV RNA hos immunsvækkede patienter 8. Principper for proceduren COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR Hepatitis C Virus (HCV) Test, version 2.0 (v2.0) er en nukleinsyreamplifikationstest til detektion af hepatitis C-virus RNA i humant plasma eller serum. Prøveforberedelsen er automatiseret med COBAS AmpliPrep-instrumentet, og amplifikation samt detektion er automatiseret med COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet. COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 er baseret på fem hovedprocesser: Prøveforberedelse for at isolere HCV RNA, revers transskription af target-rna for at danne komplementær DNA (cdna) 1, PCR-amplifikation 1 af target-cdna ved hjælp af HCV-specifikke komplementære primere, hybridisering af de amplificerede produkter til oligonukleotid-detektionsprober, der er specifikke for målet/målene, samt detektion af de probe-bundne, amplificerede produkter ved kolorimetrisk bestemmelse. Med COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 kan der foretages automatiseret prøveforberedelse efterfulgt af automatiseret revers transskription, PCRamplifikation, hybridisering og detektion af HCV target-rna og HCV-intern kontrol- RNA. Master Mix-reagenset indeholder to primere, der er specifikke for HCV og HCV-intern kontrol-rna. Detektion af amplificeret DNA udføres ved hjælp af targetspecifikke oligonukleotid-prober, der tillader en uafhængig identifikation af HCV-amplikonet og HCV-intern kontrol-amplikonet. Detektionen af det amplificerede HCV-intern kontrol-dna kan udføres, når brugeren vælger det. Valg af target Udvælgelsen af target-rna-sekvensen til HCV afhænger af identifikationen af de regioner i HCV-genomet med den højeste sekvenskonservering blandt de forskellige HCV-genotyper 14-17. Der anvendes forskellige oligonukleotider ved prøveforberedelsen for at opfange HCV RNA og HCV-intern kontrol-rna, som primere i revers transskription og amplifikation af HCV RNA et og HCV-intern kontrol-rna samt til detektion for at opfange det amplikon, der produceres under amplifikationen af revers-transskriberet HCV RNA og HCV-intern kontrol-rna. 2/46 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 5/2008, Revision 5.0

HCV, v2.0 Dermed er den korrekte udvælgelse af forberedelsesprobe, primere og detektionsprobe afgørende for testens evne til at genfinde og registrere HCVundertyperne. Den 5'-untranslated region område (UTR) af HCV-genomet har vist sig at have maksimal bevarelse af RNA-sekvenser blandt de kendte HCVgenotyper 18,19. COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 benytter en biotinyleret forberedelsesprobe, ST101BP, til at opfange RNA et under prøveforberedelsen. Til revers transskription og PCR-amplifikation definerer primerne KY78 og KY80 en sekvens på 244 nukleotider i det bedst konserverede 5'-UTR-område af HCV-genomet 13. Sekvensen for ST101BP-forberedelsesproben ligger uden for amplifikationsområdet og er placeret i det bedst konserverede område i 5'-UTR-området 19. Forberedelse af prøver COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 anvender automatiseret prøveforberedelse på COBAS AmpliPrep-instrumentet ved hjælp af DNA-probe-capture-teknikker. COBAS AmpliPrep-instrumentet benytter høje temperaturer og et kaotropisk stof til at frigøre HCV RNA fra viruspartikler og til at beskytte RNA mod RNaserne i plasma eller serum. Et kendt antal HCV-intern kontrol-rna-molekyler tilsættes til hver enkelt prøve sammen med lysisreagenset og det biotinylerede forberedelsesprobereagens. Temperaturen sænkes derefter for at muliggøre hybridisering af HCV RNA og HCV-intern kontrol-rna til den biotinylerede forberedelsesprobe, ST101BP. De hybridiserede ST101BP:HCV RNA- og ST101BP:HCV-intern kontrol-rna-komplekser binder sig derefter til streptavidin-coatede magnetiske partikler. COBAS AmpliPrep-instrumentet adskiller de streptavidin-coatede magnetiske partikler med bundet RNA fra resten af reaktionsblandingen og skyller de magnetiske partikler, før de behandlede prøver resuspenderes. Den behandlede prøve, der indeholder de streptavidin-coatede magnetiske partikler med bundet HCV RNA og HCV-intern kontrol-rna, tilsættes til amplifikationsblandingen. Derefter revers-transkriberes, amplificeres og detekteres HCV-target-RNA et og HCV-intern kontrol-rna et på COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet ved hjælp af de amplifikations- og detektionsreagenser, der følger med testkittet. Revers transskription og PCR-amplifikation Revers transskription Der udføres revers transskriptions- og amplifikationsreaktioner med det termostabile rekombinante enzym Thermus thermophilus DNA-polymerase (rtth pol). Ved tilstedeværelsen af mangan (Mn 2+ ) og under passende bufferforhold har rtth pol både revers transkriptase- og DNA-polymerase-aktivitet 1. Dermed kan både revers transskription og PCR-amplifikation foregå samtidig i samme reaktionsblanding. De behandlede prøver tilsættes til amplifikationsblandingen i amplifikationsrørene (A-rør), hvor der foregår både revers transskription og PCR-amplifikation. Downstream- eller anti-senseprimeren (KY78) biotinyleres ved 5'-enden, mens upstream- eller senseprimeren (KY80) ikke biotinyleres. Reaktionsblandingen opvarmes for at lade downstream-primeren binde sig specifikt til HCV-target-RNA et og til HCV-intern kontrol-rna et. Ved tilstedeværelsen af Mn 2+ og overskydende deoxynukleosidtrifosfater (dntp er), herunder deoxyadenosin-, deoxyguanosin-, deoxycytocin-, og deoxyuridin- (i stedet for thymidin) trifosfater, forlænger rtth pol i primerens retning og danner en DNA-streng (cdna), der er komplementær til RNAtarget. Targetamplifikation Efter revers transskription af HCV-target-RNA et og HCV-intern kontrol-rna et opvarmes reaktionsblandingen for at denaturere RNA:cDNA-hybriden og blotlægge primerens targetsekvenser. Når blandingen afkøler, binder upstream-primeren (KY80) sig specifikt til cdna-strengen, rtth pol forlænges i primerens retning, og den anden DNA-streng syntetiseres. Dette afslutter den første PCR-cyklus, der giver en dobbeltstrenget DNA-kopi af targetregionen i HCV RNA et og HCV-intern kontrol-rna et. Reaktionsblandingen opvarmes for at adskille det resulterende dobbeltstrengede DNA og blotlægge primerens targetsekvenser. Når blandingen afkøler, binder primerne KY78 og KY80 sig til target-dna et. Ved tilstedeværelsen af Mn 2+ og overskydende dntp er forlænges rtth pol i primerens retning og langs 5/2008, Revision 5.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 3/46

targetskabelonerne og danner et dobbeltstrenget DNA-molekyle med 244 basepar, kaldet et amplikon. COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet gentager automatisk denne proces et bestemt antal gange, hvor mængden af amplikon-dna fordobles for hver cyklus. Det påkrævede antal cyklusser er forprogrammeret i COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet. Amplifikationen foregår kun i området mellem primerne på HCV-genomet. Hele genomet amplificeres ikke. Intern kontrol-amplifikation I enzymbaserede amplifikationprocesser, som f.eks. PCR kan effektiviteten reduceres af de inhibitorer, der kan forekomme i prøven. Der er tilsat HCV-intern kontrol til COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 for at muliggøre identifikation af behandlede prøver, der indeholder stoffer, som kan påvirke PCRamplifikationen. HCV-intern kontrol er et RNA-plasmid med primerbindingsregioner, der er identiske med dem i HCV-target-DNA-sekvensen, en randomiseret intern sekvens, der har samme længde og basesammensætning som HCVtargetsekvensen, samt en unik probebindingsregion, der adskiller HCV-intern kontrol-amplikonet fra targetamplikonet. Disse funktioner er valgt for at sikre en ensartet amplifikation af HCV-intern kontrol- og HCV-target-RNA et. HCV-intern kontrol-rna et tilføres hver prøve med lysisreagenset og fungerer som en ekstraktions- og amplifikationskontrol for hver enkelt prøve, der behandles. Selektiv amplifikation Selektiv amplifikation af target-nukleinsyren fra prøven opnås i COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 ved hjælp af AmpErase (uracil- N-glycosylase)-enzym og deoxyuridintrifosfat (dutp). AmpErase genkender og katalyserer nedbrydningen af DNA-strenge, der indeholder deoxyuridin 20, men ikke DNA, der indeholder deoxythymidin. Deoxyuridin findes ikke i naturligt forekommende DNA, men findes altid i amplikon som følge af brugen af deoxyuridintrifosfat i stedet for thymidintrifosfat som et af dntp erne i Master Mixreagenset. Derfor er det kun amplikonet, der indeholder deoxyuridin. Deoxyuridin gør forurenende amplikon modtageligt for nedbrydning med AmpErase-enzym før amplifikationen af target-dna et. AmpErase-enzym, der findes i Master Mixreagenset, katalyserer spaltningen af deoxyuridin-holdigt DNA ved deoxyuridinresidues ved at åbne deoxyribosekæden ved positionen C1. Ved opvarmning i den første termiske cyklus ved basisk ph i Master Mix brækker amplikonets DNA-kæde ved positionen for deoxyuridin, og dermed kan DNA et ikke amplificeres. AmpErase-enzym er inaktivt ved temperaturer over 55 C, dvs. i de termiske cyklusser, og derfor ødelægges target-amplikonet ikke. Efter amplifikationen denatureres resterende enzym ved tilsætning af denatureringsopløsningen, hvilket forhindrer nedbrydningen af target-amplikoner. Det er påvist, at AmpErase-enzym i COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 deaktiverer mindst 10 3 kopier af deoxyuridin-holdigt HCV-amplikon pr. PCR. Hybridiseringsreaktion Efter PCR-amplifikationen tilsætter COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet automatisk denatureringsopløsning til A-rørene for at denaturere HCV-amplikonet og HCV-intern kontrol-amplikonet kemisk. Derved dannes enkeltstrenget DNA. Afmålte mængder af denatureret amplikon overføres derefter til detektionskopper (D-kopper). En opløsning af magnetiske detektionspartikler, der er coatede med en oligonukleotid-detektionsprobe, som er specifik for HCV-amplikon (KY150) eller HCV-intern kontrol-amplikon (SK535), tilsættes til de enkelte D-kopper. Det biotinmærkede HCV- og HCV-intern kontrol-amplikon hybridiseres til de targetspecifikke oligonukleotid-detektionsprober, der er bundet til de magnetiske detektionspartikler. Denne hybridisering af amplikonet til den targetspecifikke probe øger den samlede specificitet for testen. 4/46 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 5/2008, Revision 5.0

HCV, v2.0 Detektionsreaktion Efter hybridiseringsreaktionen skyller COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet de magnetiske detektionspartikler i D-koppen for at fjerne ubundet materiale og tilsætter derefter avidin/peberrodsperoxidasekonjugat. Avidin/peberrodsperoxidasekonjugatet bindes til det biotin-mærkede amplikon, der er hybridiseret til de targetspecifikke oligonukleotid-detektionsprober, som er bundet til de magnetiske detektionspartikler. COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet fjerner ubundet konjugat ved at skylle de magnetiske detektionspartikler og tilsætter derefter en substratopløsning, som indeholder brintoverilte og 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB), i hver D-kop. Ved tilstedeværelsen af brintoverilte katalyserer den partikelbundne peberrodsperoxidase oxideringen af TMB. Derved dannes et farvekompleks, som COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet måler absorbansen for ved en bølgelængde på 660 nm. Reagenser COBAS AmpliPrep/ PCX 96 test P/N: 03576698 190 COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 Prøveforberedelses- og kontrolreagenser HCV CS1, v2.0 (HCV Bead-reagenskassette, version 2.0) Natriumfosfatbuffer Natriumklorid < 5% opløsning af Dynabeads (paramagnetiske partikler), der er coatede med streptavidin < 0,05% detergent 0,09% natriumazid HCV CS2, v2.0 (HCV-lysisreagenskassette, version 2.0) Tris-HCl buffer 44% guanidinthiocyanat 2,5% dithiothreitol < 10% polyethylenglykol < 0,5% detergent + Xn 44% (w/w) guanidinthiocyanat 2 x 48 test 2 x 48 test Sundhedsskadelig HCV CS3, v2.0 HCV-multireagenskassette, der indeholder: HCV PROBE, v2.0 (HCV-probereagens, version 2.0) Tris-HCl-buffer < 0,001% HCV-specifik oligonukleotid-forberedelsesprobe, ST101BP EDTA 0,09% natriumazid 1 x 96 test 1 x 4,8 ml 5/2008, Revision 5.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 5/46

HCV IC, v2.0 (HCV-intern kontrol, version 2.0) Tris-HCl-buffer < 0,001% aurintricarboxylsyre < 0,001% ikke-smitsomt in vitro-transkriberet RNA (mikrobiel) indeholdende HCV-forberedelsesprobeog HCV-primerbindingssekvenser og en unik detektionsprobebindingsregion < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,09% natriumazid HCV DIL, v2.0 (HCV-prøvediluent, version 2.0) Tris-HCl-buffer < 0,001% aurintricarboxylsyre < 0,005% biotin < 0,005% Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,09% natriumazid 1 x 4,8 ml 1 x 7,2 ml HCV (+) C, v2.0 8 x 0,9 ml (HCV-positiv kontrol, version 2.0) < 0,001% Armored RNA -konstruktion, der indeholder HCV-sekvenser (ikke smitsomt RNA i MS2-bakteriofag) Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med FDA-godkendte test til antistoffer mod HCV, antistoffer mod HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg. HIV-1 RNA, HCV RNA og HBV DNA kan ikke detekteres ved hjælp af PCR-metoder. 0,1% ProClin 300-konserveringsmiddel CAP ( ) C 8 x 0,9 ml [COBAS AmpliPrep Negative Control (humant plasma)] Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med FDA-godkendte test til antistoffer mod HCV, antistoffer mod HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg. HIV-1 RNA, HCV RNA og HBV DNA kan ikke detekteres ved hjælp af PCR-metoder. 0,1% ProClin 300-konserveringsmiddel Amplifikations- og detektionsreagenser HCV MMX, v2.0 8 x 0,7 ml (HCV Master Mix, version 2.0) Bicinbuffer 16% DMSO Glycerol < 0,01% rtth DNA-polymerase (rtth pol, mikrobiel) Kaliumacetat < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,005% KY78- og KY80-primere (KY78 er biotinyleret) < 0,01% AmpErase (uracil-n-glycosylase)-enzym (mikrobiel) 0,05% natriumazid 6/46 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 5/2008, Revision 5.0

HCV, v2.0 HCV Mn 2+, v2.0 (HCV-manganopløsning, version 2.0) < 2% mangan Eddikesyre Amaranth-farve 0,05% natriumazid CX PS1, v2.0 (HCV-probeopløsning 1, version 2.0) MES-buffer < 0,4% opløsning af Dynabeads (paramagnetiske partikler), der er coatede med HCV-specifik oligonukleotid capture-probe KY150 0,09% natriumazid CX4, v2.0 (HCV-probeopløsning 2, version 2.0) Natriumfosfatbuffer < 0,2% emulgator 42,2% natriumthiocyanat + Xn 42,2% (w/w) natriumthiocyanat 8 x 0,1 ml 1 x 100 test 1 x 100 test Sundhedsskadelig IC PS1 (Intern kontrol-probeopløsning 1) MES-buffer < 0,4% opløsning af Dynabeads (paramagnetiske partikler), der er coatede med intern kontrol-specifik oligonukleotid capture-probe SK535 0,09% natriumazid IC4 (Intern kontrol-probeopløsning 2) Natriumfosfatbuffer < 0,2% emulgator 24,9% natriumthiocyanat DN4 (denatureringsopløsning) 1,6% natriumhydroxid EDTA Thymolblå + Xi 1,6% (w/w) natriumhydroxid 1 x 100 test 1 x 100 test 1 x 100 test Lokalirriterende 5/2008, Revision 5.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 7/46

CN4 (avidin/peberrodsperoxidasekonjugat) Tris-HCl-buffer < 0,001% avidin/peberrodsperoxidasekonjugat Bovint serumalbumin (fra pattedyr) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% phenol 1% ProClin 150-konserveringsmiddel SB3 (substrat A) Citratopløsning 0,01% brintoverilte 0,1% ProClin 150-konserveringsmiddel SB (substrat B) 0,1% 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) 40% dimethylformamid (DMF) T 40% (w/w) dimethylformamid (DMF) 3 x 100 test 5 x 75 test 5 x 5 ml Giftig R: 61-20/21-36 Kan skade barnet under graviditeten. Farlig ved indånding og ved hudkontakt. Irriterer øjnene. S: 53-45 Undgå enhver kontakt indhent særlige anvisninger før brug. Ved ulykkestilfælde eller ved ildebefindende er omgående lægebehandling nødvendig; vis etiketten, hvis det er muligt. COBAS AmpliPrep System PWR 4 liter P/N: 03309380 123 Wash Reagent COBAS AmpliPrep-system vaskereagens Tris-HCl-buffer < 2% kaliumacetat < 0,05% detergent 0,3% natriumazid + Xn 0,3% (w/w) natriumazid Sundhedsskadelig COBAS AMPLICOR WB 500 test P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR vaskebuffer US: 83314 WB 2 x 250 test (10X-vaskekoncentrat) < 2% fosfatbuffer < 9% natriumklorid EDTA < 2% detergent 0,5% ProClin 300-konserveringsmiddel 8/46 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 5/2008, Revision 5.0

HCV, v2.0 Advarsler og forholdsregler Denne test er kun beregnet til brug med humant serum eller plasma, der er indsamlet i det antikoagulerende middel EDTA. Det er påvist, at heparin hæmmer PCR, og det må ikke bruges med denne procedure. Brug ikke mundpipette. Der må ikke spises, drikkes eller ryges i laboratoriets arbejdsområder. Anvend egnede beskyttelseshandsker, særligt arbejdstøj og beskyttelsesbriller ved håndtering af prøver og reagenser. Vask hænderne grundigt efter at have håndteret prøver og reagenser. Undgå bakterie- og ribonukleasekontaminering af reagenser, når der fjernes afmålte mængder fra reagensflaskerne. Det anbefales at bruge sterile engangspipetter og RNase-frie pipettespidser. Reagenser fra forskellige lotnumre eller fra forskellige flasker fra det samme lotnummer må ikke blandes sammen. Reagenser (herunder kassetter) fra forskellige kitlot må ikke bruges i samme kørsel. COBAS AmpliPrep-kassetter må ikke åbnes, og flasker må ikke udskiftes, blandes, fjernes eller tilføjes. Ubrugte reagenser og affald skal bortskaffes i overensstemmelse med gældende nationale, regionale og lokale regler. Et kit må ikke anvendes efter udløbsdatoen. Leverandørbrugsanvisninger (MSDS) kan rekvireres hos Roche. Arbejdsgangen i laboratoriet skal være envejs, idet der startes i præamplifikationsområdet og fortsættes i post-amplifikationsområdet (amplifikation/detektion). Præamplifikationsaktiviteterne inkluderer reagens- og prøveforberedelse. Forbrugsartikler og udstyr skal være specielt beregnet til præamplifikationsaktiviteten og må ikke bruges til andre aktiviteter eller flyttes mellem områder. Der skal bæres handsker i hvert enkelt område, og de skal skiftes, før området forlades. Udstyr og forbrugsartikler, der bruges til forberedelse af reagenser, må ikke bruges til prøveeller kontrolhåndteringsaktiviteter eller til pipettering eller behandling af amplificeret DNA eller andre target-dna-kilder. Forbrugsartikler og udstyr til postamplifikation skal altid bibeholdes i post-amplifikationsområdet. Prøver og kontroller skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med forskrifterne for sikkerhed i laboratoriet, f.eks. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 og CLSI-dokument M29-A3 22. Rengør og desinficer alle arbejdsflader grundigt med en nyfremstillet 0,5% opløsning af natriumhypoklorit i deioniseret eller destilleret vand. Bemærk! Almindelig tilgængeligt flydende blegemiddel til husholdningsbrug indeholder typisk natriumhypoklorit med en koncentration på 5,25%. En 1:10 fortynding af blegemidlet giver en 0,5% natriumhypokloritopløsning. 5/2008, Revision 5.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 9/46

FORSIGTIGT! CAP ( ) C og HCV (+) C, v2.0 indeholder negativt humant plasma, der stammer fra humant blod. Udgangsmaterialet er ved hjælp af FDAgodkendte test fundet ikke-reaktivt for tilstedeværelsen af antistof mod HCV, antistof mod HIV-1/2, HIV p24-antigen og hepatitis B-overfladeantigen (HBsAg). Desuden blev der testet poolede donorenheder. Der blev ikke registreret HIV-1 RNA, HCV RNA eller HBV DNA med PCR, og der blev ikke registreret HBV core-antistof med en FDA-godkendt test. Ingen kendte testmetoder kan helt udelukke, at produkter, der stammer humant blod, kan overføre smitstoffer. Derfor skal alt materiale, der stammer fra mennesker, behandles som potentielt smittefarligt. CAP ( ) C og HCV (+) C, v2.0 skal håndteres som smittefarligt materiale i overensstemmelse med forskrifterne for sikkerhed i laboratoriet, f.eks. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 og CLSI-dokument M29-A3 22. Rengør og desinficer alle arbejdsflader grundigt med en nyfremstillet 0,5% opløsning af natriumhypoklorit i deioniseret eller destilleret vand. Opløsningerne i HCV CS1, v2.0, HCV CS3, v2.0, HCV MMX, v2.0, HCV Mn 2+, v2.0, CX PS1, v2.0, IC PS1 og PWR indeholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberinstallationer og danne højeksplosive metalazider. Når natriumazid-holdige opløsninger hældes ud i laboratorievasken, skal afløbet skylles med store mængder vand for at undgå ophobning af azider. Brug beskyttelsesbriller, særligt arbejdstøj og engangshandsker ved håndtering af PWR, HCV CS2, v2.0, HCV MMX, v2.0, DN4, CX4, v2.0, IC4, CN4, SB3, SB og arbejdssubstrat (blandet SB3- og SB-reagens) Undgå, at hud, øjne og slimhinder kommer i kontakt med disse materialer. Ved kontakt skylles straks med store mængder vand. Der kan opstå ætsninger, hvis det ikke behandles. Hvis disse reagenser spildes, skal de fortyndes med vand, før de tørres op. Undgå kontakt mellem hud eller slimhinder og SB eller arbejdssubstratet. Kommer stof på huden, vaskes straks med store mængder vand og sæbe. SB og arbejdssubstratet indeholder dimethylformamid, der er giftigt ved høje orale doser og kan skade barnet under graviditeten. Undgå hudkontakt, indånding af dampe samt indtagelse. Kommer stoffet på huden, vaskes grundigt med vand og sæbe, og læge kontaktes omgående. HCV CS2, v2.0, der indeholder guanidinthiocyanat, eller CX4, v2.0 og IC4, der indeholder natriumthiocyanat, må ikke komme i kontakt med natriumhypokloritopløsning (blegemiddel). Disse blandinger kan udvikle en meget giftig gas. Ved bortskaffelse af brugte COBAS AmpliPrep-SPU er (Specimen Processing Units), der indeholder guanidinthiocyanat, skal enhver kontakt med natriumhypoklorit-opløsning (blegemiddel) undgås. Disse blandinger kan udvikle en meget giftig gas. Krav til opbevaring og håndtering Reagenser og kontroller må ikke nedfryses. HCV CS1, v2.0; HCV CS2, v2.0 og HCV CS3, v2.0 opbevares ved 2-8ºC. Uåbnede kan disse reagenser holde sig til den angivne udløbsdato. Disse reagenser kan efter åbning holde sig i 30 dage ved 2-8 C eller indtil udløbsdatoen afhængig af, hvad der indtræder først. HCV CS1, v2.0, HCV CS2, v2.0 og HCV CS3, v2.0 kan anvendes i højst 6 instrumentcyklusser (16 timer pr. cyklus) enten i forbindelse med igangværende cyklusser på instrumentet eller med opbevaring ved 2-8 C mellem cyklusser, op til højst 96 timer i alt på COBAS AmpliPrep-instrumentet. Reagenser skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. CAP ( ) C og HCV (+) C, v2.0 opbevares ved 2-8ºC. Uåbnet kan disse kontroller holde sig til den angivne udløbsdato. Efter åbning skal evt. ubrugt materiale kasseres. 10/46 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 5/2008, Revision 5.0

HCV, v2.0 HCV MMX, v2.0 og HCV Mn 2+, v2.0 skal opbevares ved 2-8ºC. Reagenserne kan holde sig til den angivne udløbsdato. Efter åbning skal evt. ubrugt materiale kasseres. Arbejds-Master Mix (forberedes ved at tilsætte HCV Mn 2+, v2.0 til HCV MMX, v2.0) skal opbevares ved 2-8 C og anvendes inden 4 timer efter forberedelsen. CX PS1, v2.0 og CX4, v2.0 opbevares ved 2-8 C. Disse reagenser kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Når først CX PS1, v2.0 og CX4, v2.0 er blevet blandet, kan arbejdsreagenset holde sig i 30 dage ved 2-8 C. Arbejdsreagenset kan anvendes i højst 6 instrumentcyklusser (12 timer pr. cyklus) og skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. IC PS1 og IC4 opbevares ved 2-8 C. Reagenserne kan holde sig til den angivne udløbsdato. Når først IC PS1 og IC4 er blandet, kan arbejdsreagenset holde sig i 30 dage ved 2-8 C. Arbejdsreagenset kan anvendes i højst 6 instrumentcyklusser (12 timer pr. cyklus) og skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. DN4 skal opbevares ved 2-25 C. DN4 kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Efter åbning kan DN4 holde sig i 30 dage ved 2-8 C eller indtil udløbsdatoen afhængig af, hvad der indtræder først. DN4 kan anvendes i højst 6 instrumentcyklusser (12 timer pr. cyklus) og skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. CN4 skal opbevares ved 2-8 C. CN4 kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Efter åbning kan CN4 holde sig i 30 dage ved 2-8 C eller indtil udløbsdatoen afhængig af, hvad der indtræder først. CN4 kan anvendes i højst 6 instrumentcyklusser (12 timer pr. cyklus) og skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentcyklusser. SB3 og SB opbevares ved 2-8 C. Uåbnet kan disse reagenser holde sig indtil den angivne udløbsdato. Der skal forberedes arbejdssubstrat hver dag ved blanding af SB3 med SB. Arbejdssubstrat kan holde sig i 16 timer på COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet. Udsæt ikke SB3, SB eller arbejdssubstrat for metaller, oxideringsmidler eller direkte lys. PWR opbevares ved 2-32 C. PWR kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Efter åbning kan dette reagens holde sig i 30 dage ved 2-32 C eller indtil udløbsdatoen afhængig af, hvad der indtræder først. WB opbevares ved 2-30 C. WB kan holde sig indtil den angivne udløbsdato. Undersøg WB før fortynding, og opvarm til 30-37 C for at opløse evt. bundfald igen, hvis det er nødvendigt. Arbejdsvaskebuffer (1X), der er forberedt ved 1:10 fortynding af WB med destilleret eller deioniseret vand, skal opbevares ved 2-25 C i COBAS AMPLICOR -vaskebufferreservoiret og kan holde sig i 2 uger fra forberedelsesdatoen. Prøveforberedelses- og detektionsreagenser, der ikke er helt opbrugt, skal opbevares ved 2-8 C mellem instrumentkørsler. Kontroller udløbsdatoen på brugte og åbnede reagenser eller arbejdsreagenser før de indsættes i COBAS AmpliPrep-instrumentet eller COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet. 5/2008, Revision 5.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 11/46

Medfølgende materialer COBAS AmpliPrep/COBAS PCX P/N: 03576698 190 AMPLICOR HCV Test, v2.0 Prøveforberedelses- og kontrolreagenser HCV CS1, v2.0 (HCV Bead-reagenskassette, version 2.0) HCV CS2, v2.0 (HCV-lysisreagenskassette, version 2.0) HCV CS3, v2.0 (HCV-multireagenskassette, version 2.0) HCV (+) C, v2.0 (HCV-positiv kontrol, version 2.0) CAP ( ) C [COBAS AmpliPrep Negative Control (Human Plasma)] Amplifikations- og detektionsreagenser HCV MMX, v2.0 (HCV Master Mix, version 2.0) HCV Mn 2+, v2.0 (HCV-manganopløsning, version 2.0) CX PS1, v2.0 (HCV-probeopløsning 1, version 2.0) CX4, v2.0 (HCV-probeopløsning 2, version 2.0) IC PS1 (Intern kontrol-probeopløsning 1) IC4 (Intern kontrol-probeopløsning 2) DN4 (denatureringsopløsning) CN4 (avidin/peberrodsperoxidasekonjugat) SB3 (substrat A) SB (substrat B) COBAS AmpliPrep System PWR P/N: 03309380 123 Wash Reagent COBAS AmpliPrep-system vaskereagens COBAS AMPLICOR Wash Buffer WB P/N: 20759899 123 COBAS AMPLICOR -vaskebuffer ART: 07 5989 9 US: 83314 WB (10X-vaskekoncentrat) 12/46 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 5/2008, Revision 5.0

HCV, v2.0 Nødvendige, men ikke medfølgende materialer Bemærk! Se brugerhåndbogen til COBAS AmpliPrep-instrumentet og brugerhåndbogen til AMPLILINK Software v2.4 Series, hvis AMPLILINK software v2.41 benyttes. Se instrumentmanualen til COBAS AmpliPrep-instrumentet, der er beregnet til brug med COBAS TaqMan -analyseinstrumentet eller COBAS TaqMan 48- analyseinstrumentet, COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet og AMPLILINK Software, Version 3.2 Series og applikationsmanualen til AMPLILINK Software Version 3.2 Series til brug med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet og COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet, hvis AMPLILINK software v3.2 Series benyttes. Præamplifikation Prøve- og kontrolklargøringsområde COBAS AmpliPrep-instrument AMPLILINK-software Brugerhåndbog til AMPLILINK Software, v2.4 Series eller applikationsmanualen til AMPLILINK Software Version 3.2 Series til brug med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet og COBAS AMPLICOR - analyseinstrumentet Metodemanual til COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 Datastation til AMPLILINK-softwaren, med printer Brugerhåndbog til COBAS AmpliPrep-instrumentet eller instrumentmanualen til COBAS AmpliPrep-instrumentet til brug med COBAS TaqMan - analyseinstrumentet eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet, COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet og AMPLILINK Software, Version 3.2 Series Prøvebehandlingsenheder (SPU er) Prøveinput-rør (S-rør) med barkodeclips Rack med output-rør Rack med K-spidser Pipetter med RNase-frie, aerosolbarriere- eller positive displaceringsspidser (kapacitet 1000 µl)* Vortex-mixer Engangshandsker, uden talkum Præamplifikation Reagensklargøringsområde COBAS AMPLICOR -A-ring monteret med 12 A-rør Holder til COBAS AMPLICOR -A-ring Eppendorf Multipette -pipette med 1,25 ml Combitip -reservoir (sterile, enkeltpakket) Pipetter med RNase-frie, aerosolbarriere- eller positive displaceringsspidser (kapacitet 50 µl og 100 µl)* Genlukkelige plastposer Engangshandsker, uden talkum Post-amplifikation Amplifikations-/detektionsområde COBAS AMPLICOR -analyseinstrument, der er tilsluttet datastationen med AMPLILINK-softwaren og en printer** Brugerhåndbog til COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet Metodemanual til COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 5/2008, Revision 5.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 13/46

Brugerhåndbog til AMPLILINK Software, v2.4 Series eller applikationsmanualen til AMPLILINK Software Version 3.2 Series til brug med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet og COBAS AMPLICOR - analyseinstrumentet Rack med D-kopper Destilleret eller deioniseret vand 5 ml serologiske pipetter Vortex-mixer Engangshandsker, uden talkum * Pipetter må højst afvige 3% fra den angivne volumen. Der skal anvendes RNase-frie, aerosolbarriere- eller positive displaceringsspidser, hvor det er angivet, for at undgå krydskontaminering af prøver og amplikoner. ** Hvis der ikke er nogen datastation til AMPLILINK-softwaren tilsluttet COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet, skal der sluttes en ekstern printer til COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet. Indsamling, transport og opbevaring af prøver Bemærk! Indsamling af prøver Alle prøver og kontroller skal håndteres som potentielt smittefarlige. COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 er kun beregnet til serum- eller plasmaprøver. Blod skal indsamles i serumindsamlingsrør eller i sterile rør med EDTA (lavendelblå top) som antikoagulerende middel. Prøver, der er antikoaguleret med heparin, egner sig ikke til denne test. Fuldblod må højst opbevares ved 2-25 C i 6 timer. Plasma separeres fra fuldblod inden 6 timer efter prøvetagning ved centrifugering ved 1500 x g i 20 minutter ved stuetemperatur. Plasmaet eller serummet overføres til et sterilt polypropylen-rør. Transport af prøver Opbevaring af prøver Transport af fuldblod, serum eller plasma skal overholde nationale, regionale og lokale bestemmelser for transport af ætiologiske stoffer 23. Fuldblod skal transporteres ved 2-25 C og behandles inden for 6 timer efter prøvetagningen. Serum eller plasma skal transporteres ved 2-8 C eller nedfrosset ved -70 C eller koldere. Serum- eller plasmaprøver kan opbevares ved 2-8 C i op til 72 timer eller nedfrosset ved -70 C eller koldere. Det anbefales at opbevare prøverne i afmålte mængder a 750-800 µl i sterile, 1,5 ml polypropylen-rør med skruelåg (f.eks. Sarstedt 72.692.005). Serum- eller plasmaprøver kan nedfryses og optøs op til to gange. Brugsvejledning Bemærk! Se nedenstående for at få en detaljeret brugsvejledning, udskrivning af resultater samt fortolkning af markeringer ("Flags") og fejlmeddelelser: (1) Brugerhåndbogen til COBAS AmpliPrep-instrumentet eller instrumentmanualen til COBAS AmpliPrep-instrumentet til brug med COBAS TaqMan - analyseinstrumentet eller COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet, COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet og AMPLILINK Software, Version 3.2 Series, og (2) brugerhåndbogen til AMPLILINK Software, v2.4 Series eller applikationsmanualen til AMPLILINK Software Version 3.2 Series til brug med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analyseinstrumentet, COBAS TaqMan 48-analyseinstrumentet og COBAS AMPLICOR - analyseinstrumentet. 14/46 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 5/2008, Revision 5.0

HCV, v2.0 Bemærk! Bemærk! Bemærk! Kørselsstørrelse Alle COBAS AmpliPrep-reagenskassetter skal fjernes fra opbevaringen ved 2-8 C og indsættes i COBAS AmpliPrep-instrumentet, mindst 30 minutter før den første prøve skal behandles for at blive tempereret til den omgivende temperatur. Reagenserne må ikke tempereres til den omgivende temperatur uden for instrumentet, da der ellers kan dannes kondens på barkodeetiketterne. Hvis der dannes kondens på barkodeetiketterne, må den ikke tørres af. Serum- og plasmaprøver skal have den omgivende temperatur før brug. Brug pipetter med aerosolbarriere- eller positive displaceringsspidser, når det er angivet. Vær yderst omhyggelig for at undgå kontaminering. Hvert kit indeholder reagenser til otte kørsler af 12 tests, der kan udføres samtidigt eller i op til seks separate instrumentcyklusser. Der skal mindst inkluderes én bestemmelse af hhv. COBAS AmpliPrep-negativ kontrol og HCVpositiv kontrol, version 2.0 i hver kørsel med op til 24 prøver og kontroller (se afsnittet Kvalitetskontrol ). Amplifikationsreagenserne er pakket i engangsflasker med 12 test. Den mest effektive anvendelse af reagenser, prøver og kontroller opnås ved at behandle dem i batches, der kan multipliceres med 12. Arbejdsgang COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 kan udføres i løbet af én dag eller over to dage. Hvis testen skal afsluttes på en enkelt arbejdsdag, skal instruktionerne under Prøve- og kontrolforberedelse og Revers transskription, amplifikation og detektion følges i rækkefølge. Testen kan udføres over 2 dage. Arbejdsgangen for håndtering af behandlede prøver og kontroller ved en arbejdsgang, der går over to dage, er følgende: Bemærk! Behandlede prøver og kontroller kan forblive på COBAS AmpliPrepinstrumentet natten over i op til 20 timer, eller de kan fjernes fra COBAS AmpliPrep-instrumentet og opbevares ved 2-8 C i op til 7 dage i output-rørene. Behandlede prøver og kontroller, der fjernes fra COBAS AmpliPrepinstrumentet på dag 1 og opbevares ved 2-8 C i op til 7 dage: For at udføre forberedelsen af prøver og kontroller, revers transskription og amplifikation første dag og detektion anden dag skal du udføre Opsætning af COBAS AmpliPrepinstrumentet (del A) og Loading af reagenser og betjening af COBAS AmpliPrepinstrumentet (del B) og udføre trin 1 og 2 under Håndtering af behandlede prøver og kontroller (del D) den første dag og opbevare de behandlede prøver og kontroller som angivet under Prøve- og kontrolforberedelse (del D, trin 1). Begynd dag 2 med Reagensforberedelse (del C), temperer de behandlede prøver og kontroller ved stuetemperatur, og fortsæt med Håndtering af behandlede prøver og kontroller (del D, trin 3) til Revers transskription, amplifikation og detektion. Behandlede prøver og kontroller, der opbevares på COBAS AmpliPrepinstrumentet natten over og fjernes på dag 2: For at udføre forberedelsen af prøver og kontroller, revers transskription og amplifikation første dag og detektion anden dag skal du udføre Opsætning af COBAS AmpliPrep-instrumentet (del A) og Loading af reagenser og betjening af COBAS AmpliPrep-instrumentet (del B). Begynd dag 2 med Reagensforberedelse (del C), og fortsæt med Håndtering af behandlede prøver og kontroller (del D) til Revers transskription, amplifikation og detektion. 5/2008, Revision 5.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 15/46

Prøve- og kontrolforberedelse Del A: Opsætning af COBAS AmpliPrep-instrumentet Udført i: Præamplifikation Prøve- og kontrolforberedelsesområdet A1. Tænd for COBAS AmpliPrep-instrumentet (ON). Bemærk! COBAS AmpliPrep-instrumentet primer automatisk systemet, når det tændes. A2. Tænd datastationen med AMPLILINK-softwaren (ON). Klargør datastationen på følgende måde: a. Log på Windows NT (med AMPLILINK v2.41) eller Windows XP (med AMPLILINK v3.2 Series). b. Dobbeltklik på ikonet for AMPLILINK-softwaren. c. Log på AMPLILINK-softwaren ved at indtaste det tildelte bruger-id og password. A3. Kontroller beholdningen af systemvaskereagens (PWR) på skærmbilledet Status, og udskift det om nødvendigt. A4. Udfør alle de vedligeholdelsesprocedurer, der er angivet på fanen Due. A5. Hvis der bruges frosne prøver, skal prøverne optøs ved stuetemperatur. A6. Fastlæg det antal COBAS AmpliPrep-reagenskassetter, SPU er (Sample Processing Units), prøve-rør (S-rør) og K-spidser, der skal bruges. Der skal bruges én SPU, ét input-s-rør, én K-spids og ét output-s-rør for hver prøve eller kontrol. A7. Placer to HCV CS1, v2.0 på et reagensrack. Placer to HCV CS2, v2.0 og én HCV CS3, v2.0 på et separat reagensrack. A8. Indsæt det reagensrack, der indeholder HCV CS1, v2.0, på rackposition A i COBAS AmpliPrep-instrumentet. A9. Indsæt det reagensrack, der indeholder HCV CS2, v2.0 og HCV CS3, v2.0, på rackposition B, C, D eller E i COBAS AmpliPrep-instrumentet. A10. Placer SPU erne i SPU-racket eller -rackene, og indsæt racket eller rackene i COBAS AmpliPrep-instrumentet. A11. Indsæt det relevante antal fulde racks med output tubes i COBAS AmpliPrepinstrumentet. A12. Indsæt det relevante antal fulde racks med K-spidser på rackposition M, N, O eller P i COBAS AmpliPrep-instrumentet. 16/46 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 5/2008, Revision 5.0

HCV, v2.0 A13. Sæt en clip med barkodemærkat på alle de prøverackpositioner, hvor der skal placeres en prøve (et S-rør). Placer ét input S-rør på hver position, der har en clip med barkodemærkat. A14. Indsæt prøveracket eller -rackene på rackposition F, G eller H i COBAS AmpliPrep-instrumentet, og udskriv et regneark. Tildel og registrer de positioner, der skal bruges til kontroller og prøver, i regnearket. A15. Fjern prøveracket eller -rackene fra COBAS AmpliPrep-instrumentet, og flyt rackene til det Præamplifikation - Prøve- og kontrolforberedelsesområde, der skal bruges til tilføjelse af prøver og kontroller. Del B: Loading af reagenser og betjening af COBAS AmpliPrep-instrumentet Udført i: Præamplifikation Prøve- og kontrolforberedelsesområdet B1. Bland hver prøve og kontrol [CAP ( ) C og HCV (+) C, v2.0] i 3-5 sekunder på en vortex-mixer. Centrifuger prøven og kontrollen kort for at samle væsken i bunden af røret. Undgå at kontaminere handskerne ved håndteringen af prøver og kontroller. B2. Overfør ca. 700 µl, men højst 1,1 ml, af hver prøve og kontrol [CAP ( ) C og HCV (+) C, v2.0] til S-røret med den relevante barkodemærkat ved hjælp af en mikropipette med aerosolbarriere- eller positiv displaceringsspids. Undgå at overføre partikler og/eller fibrinclot fra den oprindelige prøve til input-s-røret. Prøver og kontroller skal overføres til de rørpositioner, der er tildelt og registreret på regnearket under trin A14. B3. Indsæt prøveracket eller -rackene med prøver og kontroller på rackposition F, G eller H i COBAS AmpliPrep-instrumentet. B4. Brug datastationen med AMPLILINK-softwaren til at oprette prøveordren under fanen Sample, og indtast lotnummeret og udløbsdatoen for kontrolkittet under fanen Quality Control. B5. Start COBAS AmpliPrep-instrumentet ved hjælp af AMPLILINK-softwaren. Prøve- og kontrolbehandlingen udføres automatisk af COBAS AmpliPrepinstrumentet. B6. Før du forlader prøve- og kontrolforberedelsesområdet, skal du tage følgende forholdsregler for at undgå kontaminering: Rengør og desinficer alle de arbejdsflader, der er brugt under overførslen af prøver og kontroller, grundigt med en nyfremstillet 0,5% opløsning af natriumhypoklorit i deioniseret eller destilleret vand. Vask hænderne. Skift handsker. Skift arbejdstøj. 5/2008, Revision 5.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 17/46

Del C: Reagensforberedelse Udført i: Præamplifikation Reagensforberedelsesområdet Bemærk! Reagensforberedelsen (del C) skal udføres på dag 2, hvis testen skal udføres over to dage. C1. Fastlæg det relevante antal A-ringe, der skal bruges til testen af prøver og kontroller. Placer A-ringen(e) i A-ring-holderen eller -holderne. C2. Forbered arbejds-master Mix ved at tilsætte 100 µl HCV Mn 2+, v2.0 til ét rør med HCV MMX, v2.0. Det er ikke nødvendigt at måle Master Mix-volumen. Tilsæt 100 µl HCV Mn 2+, v2.0 til hele flasken med HCV MMX, v2.0. Sæt låg på glasset, og bland godt ved at vende glasset 10-15 gange. Arbejds-Master Mix må ikke blandes på vortex-mixer. Den lyserøde farve i HCV Mn 2+, v2.0 bruges som visuel bekræftelse af, at HCV Mn 2+, v2.0 er blevet tilsat til HCV MMX, v2.0. Kasser det resterende HCV Mn 2+, v2.0. Arbejds-Master Mix skal opbevares ved 2-8 C og anvendes højst 4 timer efter forberedelsen. C3. Tilsæt 50 µl arbejds-master Mix i hvert A-rør med en doseringspipette eller en pipette med aerosolbarriere- eller positiv displaceringsspids. Luk ikke A-rørlågene endnu. C4. Placer den eller de A-ring(e), der indeholder arbejds-master Mix, i den genlukkelige plastpose, og luk posen omhyggeligt. Flyt A-ringen eller -ringene til Præamplifikation Prøve- og kontrolforberedelsesområdet. Opbevar den eller de A-ringe, der indeholder arbejds-master Mix, ved 2-8 C i Præamplifikation - Prøve- og kontrolforberedelsesområdet, indtil forberedelsen af prøver og kontroller på COBAS AmpliPrep-instrumentet er fuldført. Arbejds- Master Mix kan holde sig i 4 timer ved 2-8 C i A-rør, der opbevares i tillukket plastpose. Del D: Håndtering af behandlede prøver og kontroller Udført i: Præamplifikation Prøve- og kontrolforberedelsesområdet Bemærk! Behandlede prøver og kontroller kan forblive på COBAS AmpliPrepinstrumentet i op til 20 timer, hvis testen skal udføres over to dage. D1. Når kørslen af prøve- og kontrolforberedelsen på COBAS AmpliPrepinstrumentet er fuldført, skal du fjerne det eller de prøverack, der indeholder de behandlede prøver og kontroller. Når de behandlede prøver og kontroller er fjernet fra COBAS AmpliPrep-instrumentet, kan de opbevares i output-rørene ved 2-8 C i op til 7 dage. Bemærk! Lad output-s-rørene og clipsene med barkodemærkater blive sammen på prøveracket. Du må kun adskille S-rør fra den tilhørende clip ved overførsel af en behandlet prøve eller kontrol til et A-rør. 18/46 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 5/2008, Revision 5.0

HCV, v2.0 D2. Når prøverne er fjernet fra COBAS AmpliPrep-instrumentet, skal du gøre følgende: a. Kontroller, om der er markeringer ( flag ) eller fejlmeddelelser. Prøver med markeringer og kommentarer skal fortolkes på følgende måde: Flag Bemærkning Handling Den volumen, der blev registreret i input-s-røret, er enten for stor eller for lav. Prøven er ikke blevet behandlet, og input-srøret (angivet med gennemsigtig hætte på input-røret) blev returneret to prøveracket. Den ikke-behandlede prøve må ikke S SampleInputMissing amplificeres. Afhjælp problemet, og behandl prøven igen, hvis den har været på COBAS AmpliPrep-instrumentet i mindre end 3 timer. Hvis den har været der i mere end 3 timer, skal der anvendes en ny afmålt mængde af den oprindelige prøve. Der er registreret en utilstrækkelig volumen reagens. Amplificer ikke prøver med en R -markering. Er det en behandlet prøve (angivet med grå hætte på output-røret), skal der anvendes ICIQSReagent Missing en ny afmålt mængde af den oprindelige prøve. Er det en ikke- LysisReagentMissing behandlet prøve (angivet med gennemsigtig hætte på input-røret), R ProbeReagentMissing skal prøven behandles igen, hvis prøven har været på COBAS SpecimenDiluentMissing AmpliPrep-instrumentet i mindre end 3 timer. Hvis den har været der i mere end 3 timer, skal der anvendes en ny afmålt mængde af den oprindelige prøve. InstrumentTempOutOfRange Instrument- eller inkubatortemperaturerne er uden for ReagentTempOutOfRange det godkendte interval. Amplificer ikke prøver med en I Incubation60OutOfRange I -markering. Kontakt den lokale Roche-forhandler. Behandl Incubations37OutOfRange en ny afmålt mængde af den oprindelige prøve med nye reagenser. IncubationTargetReleaseOutOfRange Testkittet har overskredet udløbsdatoen. Fortsæt ikke kørslen. E TestKitExpired Udskift det kit, hvor udløbsdatoen er overskredet, med et kit, hvor udløbsdatoen ikke er overskredet, før prøven behandles. b. Sammenlign output-rørene for de behandlede prøver med output-rørene for de behandlede kontroller: Behandlede prøver og kontroller skal have en sammenlignelig volumen i output-rørene. Behandlede prøver og kontroller skal have en sammenlignelig beadkoncentration i output-rørene. Behandlede prøver, der har en volumen og bead-koncentration, der svarer til kontrollernes, kan fortsætte til amplifikationen. Behandlede prøver eller kontroller, der har en lav output-volumen eller en reduceret bead-koncentration, skal behandles igen på COBAS AmpliPrep-instrumentet. I tilfælde af at den lave output-volumen eller reducerede bead-koncentration gentages i den genbehandlede prøve, skal der tages en ny prøve fra patienten og testen gentages. Bemærk! Hvis de behandlede prøver og kontroller har været opbevaret ved 2-8ºC før amplifikationen, skal de tempereres ved stuetemperatur i mindst 10 minutter, før der fortsættes til trin D3. 5/2008, Revision 5.0 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 19/46

D3. Output-S-røret med den behandlede prøve og den behandlede kontrol blandes i ca. 5 sekunder på vortex-mixer for at resuspendere de magnetiske partikler, der indeholder det bundne RNA, før blandingen tilsættes til A-røret. D4. Tilsæt 50 µl af den grundigt blandede behandlede prøve eller kontrol til det relevante A-rør, der indeholder arbejds-master Mix, ved hjælp af en pipette med aerosolbarriere- eller positiv displaceringsspids på følgende måde: Placer pipettespidsen med den behandlede prøve eller kontrol ca. halvvejs inde i arbejds-master Mix et, midt i A-røret, og afpipetter opløsningen ved at trykke stemplet ned til den første stopposition med så meget kraft, at opløsningerne blandes. Sug opløsningen tilbage i spidsen. Afpipetter opløsningen ved at trykke stemplet ned til den anden stopposition. Sæt låg på A-røret. D5. Gentag trin D3 og D4 for hver behandlet prøve og kontrol, indtil de alle er blevet overført til A-rør. Brug en ny spids for hver behandlet prøve eller behandlet kontrol. D6. Registrer positionerne for de behandlede prøver og kontroller i A-ringen eller - ringene på A-ring-kortet. Amplifikationen skal startes senest 45 minutter efter, at de behandlede prøver og kontroller er tilsat A-rørene med arbejds-master Mix. Flyt A-rørene med arbejds-master Mix og de behandlede prøver og kontroller til amplifikations-/detektionsområdet. Bemærk! Eventuelt resterende behandlet prøve eller kontrol kan opbevares ved 2-8 C i op til 7 dage efter tidspunktet for forberedelsen. Revers transskription, amplifikation og detektion Bemærk! Del E: For at amplificere tidligere behandlede prøver og kontroller skal trinnene i afsnittet Reagensforberedelse (del C) først udføres. Temperer de tidligere nedkølede behandlede prøver og kontroller ved stuetemperatur i mindst 10 minutter, og fortsæt med Håndtering af behandlede prøver og kontroller, del D, trin 3. Opsætning af COBAS AMPLICOR -analyseinstrumentet Udført i: Post-amplifikation Amplifikations-/detektionsområde E1. Udfør den daglige instrumentvedligeholdelse, herunder: Aftør initialiseringspunktet med en fnugfri, fugtig klud, og tør det. Aftør spidsen på D-kop-håndteringsenheden med en fnugfri, fugtig klud, og tør den. Kontroller vaskebufferreservoiret, og fyld det om nødvendigt. Forbered arbejdsvaskebufferen (1X) på følgende måde. Undersøg WB, og opvarm ved 30-37 C for at opløse evt. bundfald igen, hvis det er nødvendigt. Tilsæt 1 del WB til 9 dele destilleret eller deioniseret vand. Bland grundigt. Sørg for, at der altid er mindst 3-4 liter arbejdsvaskebuffer (1X) i analyseinstrumentets vaskebufferreservoir. Tøm affaldsbeholderen. Prim systemet. 20/46 COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR HCV Test, v2.0 5/2008, Revision 5.0