Knoldbægersvamp (Sclerotinia sclerotiorum) i raps Biologi, bekæmpelse og tidlig detektion i marken

Speciale Nikolaj Østergård Wagner 20106968 Knoldbægersvamp (Sclerotinia sclerotiorum) i raps Biologi, bekæmpelse og tidlig detektion i marken Sclerotinia stem rot (Sclerotinia sclerotiorum) in oilseed rape Biology, control and early detection in the field Vejledere: Bent Jørgen Nielsen & Annemarie Fejer Justesen Kandidatuddannelsen i Agribiologi - Institut for Agroøkologi, Science and Technology Aarhus Universitet Afleveret d. 21. september 2015

Abstract Sclerotinia stem rot in oilseed rape (Brassica napus) is caused by the pathogenic fungi Sclerotinia sclerotiorum. Some years the disease causes significant yield losses in oilseed rape. Part one of this thesis addresses the biology and epidemiology of this pathogen. The disease evolves when sclerotia from previous attacks germinates to form apothecia (the fruit body of the fungi). These apothecia release ascospores which are carried by the wind to the petals of nearby oilseed plants. The plant may get infected when the petals fall and stick to the plant stem or leafaxils. After the infection the fungi starts to spread within the plant and may eventually kill it. New sclerotia forms inside the stem of the plant. The sclerotia is the primary survival structure of S. sclerotiorum and this is able to survive for several years in the soil. A literature review showed that temperature and humidity in particular have a great influence on the formation of apothecia, the release of spores and the infection of the plant. Several forecasting models have been developed in order to predict the risk of attacks. However, none of these have proven to be reliable in practice. An infection of S. sclerotiorum requires a source of external nutrients for the fungi. In oilseed rape the petals may provide the nutrients necessary to the fungi. This is why several studies investigate the relation between petals infected with S. sclerotiorum and subsequent attacks in the field. In a Swedish study by Almquist & Wallenhammar (2015) 7 % of the plants in a field trial showed symptoms of attack by S. sclerotiorum even though the pathogen was not detected on petals at any time during the flowering. Furthermore, the conditions for spore release and infection were not in place during flowering. However, a Polymerace Chain Reaction (PCR) test of the lower leaves revealed that the pathogen was present on the leaf before flowering, indicating that infection took place without the presence of the petals. Therefore, the aim of the second part of this thesis is to examine and discuss if early detection of S. sclerotiorum by PCR is a useful tool for forecasting models. In order to test this petals and lower leaves from two oilseed rape fields near Flakkebjerg in western Zealand. Sampling took place twice. The first time during early flowering and the second time during late flowering. The possible presence of ascospores on the petals were studied on a Potato Dextrose Agar (PDA) disc. DNA extracted from the lower leaves was tested for the presence of S. sclerotiorum using a q-pcr assay. S. sclerotiorum was not detected on the early flowering leaves. 21.7 and 11.7 % of the late flowering leaves from field A and B respectively were infected. Sclerotia from S. sclerotiorum were found on nearly all agar plates related to early as well as late flowering. Climate data showed that precipitation was frequent during flowering. Despite this fact only 1.3 and 4.7 % of the plants from field A and B respectively showed symptoms of infection before harvest. This indicates that the conditions for infection were not fulfilled. The PCR test needs further elaboration regarding which part of the plant should be sampled and how to treat them before the analysis. Furthermore, the sensitivity of the method should be evaluated and a threshold for the proportion of leaves infected should be established. Side 1 af 67

Resumé Storknoldet knoldbægersvamp i raps (Brassica napus) forårsages af svampen Sclerotinia sclerotiorum. Sygdommen kan i nogle år medføre betydelige udbyttetab i raps. Dette speciale har i første del til formål at beskrive knoldbægersvamp i raps med fokus på biologi og empidemiologi. Sygdommen opstår ved, at sklerotier fra tidligere angreb spirer i jorden og danner apothecier (svampens frugtlegeme). Her dannes svampens ascosporer, som frigives og med vinden spredes til kronbladene på nærtliggende rapsplanter. Når kronbladene falder af og lander på planten, kan denne inficeres. Efter infektionen vokser svampen inde i planten, hvilket kan medføre, at den dør. Nye sklerotier kan dannes inde i rapsens hule stængel. Sklerotiet er svampens primære overlevelsesstruktur og kan overleve i flere år i jorden. En gennemgang af litteraturen viste, at temperaturen og særligt fugtigheden har stor betydning for fremspiringen af apothecier, frigivelse af sporer og endelig for infektionen af planten. Der er udviklet flere varslingsmodeller, der har til formål at forudsige risikoen for angreb. Ingen af disse har dog vist sig at være tilstrækkelige i praksis. Hvis en infektion af S. sclerotiorum skal finde sted, kræver det ekstern næring. I rapsmarken forsyner de afblomstrede kronblade svampen med den nødvendige nærring. Derfor fokuserer flere studier på sammenhængen mellem forekomsten af S. sclerotiorum på kronbladene og risikoen for angreb. I et svensk forsøg af Almquist og Wallenhammar (2015) var 7 % af planterne i en mark angrebet, selvom der ikke blev observeret S. sclerotiorum på kronbladene på noget tidspunkt i blomstringsperioden. Endvidere var betingelserne for sporefrigivelse og infektion ikke til stede under blomstringsperioden. Derimod afslørede en Polymerace Chain Reaction (PCR) test af de nedre løvblade, at der var inokulum i marken inden blomstring. Dette indikerer, at infektionen var sket uden tilstedeværelsen af kronbladene. Målet med andel del af dette speciale er derfor at undersøge og diskutere, om tidlig detektion af S. sclerotiorum ved brug af PCR på nedre løvblade er brugbart i varslingsmodeller. I efterprøvningen af denne PCR-metode blev der indsamlet kronblade og løvblade fra to rapsmarker beliggende ved Flakkebjerg i det vestlige Sjælland. Disse blev indsamlet to gange. Første gang i starten af rapsens blomstring og anden gang i slutningen. Forekomsten af ascosporer på kronbladene blev undersøgt ved en Potato Dextrose Agar (PDA) agartest og DNA ekstraheret fra løvbladene blev undersøgt med et q-pcr assay for tilstedeværelsen af S. sclerotiorum. Der er ikke detekteret sikre angreb på løvbladene fra tidlig blomstring, mens henholdsvis 21,7 og 11,7 % var inficeret fra mark A og B i slutningen af blomstringen. Stort set alle agarplader var inficeret med S. sclerotiorum på begge prøvetagningstidspunkter. Klimadata viste, at der gennem blomstringsperioden var hyppigt nedbør. Trods dette var kun 1,3 og 4,7 % af planterne i mark A og B angrebet af knoldbægersvamp. Dette tyder på, at forholdene for, at infektionen kunne finde sted, ikke var til stede i marken. PCR-testen kræver mere udvikling med hensyn til, hvilke dele af planten, der skal udtages, samt hvordan disse dele skal behandles, inden de analyseres. Derudover skal metodens sensitivitet evalueres og der skal etableres en skadestærskel for andelen af inficerede blade. Side 2 af 67

Forord Dette speciale er den afsluttende opgave på kandidatuddannelsen Agrobiologi på Aarhus Universitet og er udarbejdet i perioden april til september 2015. Specialet tæller 30 ects point og er derfor primært et litteraturstudie, men der indgår også feltarbejde i dette projekt. Specialet omhandler svampesygdommen knoldbægersvamp som i nogle år kan medføre store udbyttetab i dansk landbrug. Det har været spændende at have mulighed for at gå så meget i dybden med et relativt lille område inden for jordbrugsforskningen og få et indblik i hvor komplekst plantepatologi kan være. Der skal lyde en stor tak til mine vejledere Bent Jørgen Nielsen og Annemarie Fejer Justesen, som har været gode til at komme med konstruktiv vejledning og kritik gennem hele forløbet. Derudover skal der lyde en stor tak til Mathilde Schiøtt Dige som med stor tålmodighed har hjulpet mig igennem den del af laboratoriearbejdet som omhandlede PCR og til Hans-Peter Madsen som har hjulpet og vejledt mig i forbindelse med indsamling af kronblade og løvblade samt med bedømmelse af sygdom i marken. Også tak til Anne Pia Larsen som har hjulpet med at forberede agarplader og mikroskopering af disse. Aarhus, 21. september 2015 Nikolaj Østergård Wagner Billeder på forsiden er fotograferet af N. Ø. Wagner. Side 3 af 67

Indhold Indhold... 4 1 Indledning... 6 1.1 Formål... 6 1.2 Materiale og metode... 7 Del 1... 8 2 Rapsdyrkning i Danmark... 8 3 Sclerotinias biologi og spredning... 9 3.1 Navngivning... 9 3.2 Værtsplanter... 10 3.3 Sygdomscyklus... 11 3.4 Infektion... 13 3.5 Symptomer i marken... 17 3.6 Overlevelse af sklerotier i jorden... 18 3.7 Apotheciedannelse... 20 4 Bekæmpelse af knoldbægersvamp... 24 4.1 Kemisk bekæmpelse... 24 4.2 Biologisk bekæmpelse... 26 4.3 Resistens... 27 5 Metoder til brug i planteværn... 28 5.1 Sklerotie depot... 28 5.2 Kronbladtest... 29 5.3 Sporefælder... 34 5.4 Risiko pointsystem... 34 5.5 Skleropro... 36 Del 2... 37 6 Materiale og metode... 37 6.1 Indsamling af kronblade og løvblade... 37 6.2 Agartest af kronblade... 38 6.3 PCR-test af løvblade... 39 6.4 Bedømmelse af angreb... 42 6.5 Klimadata... 43 7 Resultater... 43 8 Diskussion... 46 Side 4 af 67

8.1 Agartest af kronblade... 47 8.2 PCR-test af løvblade... 49 9 Konklusion og perspektivering... 51 10 Referencer... 54 11 Bilag 1... 60 12 Bilag 2... 66 Side 5 af 67

1 Indledning Vinterraps dyrkes i et stort omfang i Danmark og afgrøden er en vigtig kilde til vegetabilsk olie i fødevarer og foder til husdyrproduktionen. Siden starten af 1950erne er storknoldet knoldbægersvamp, som forårsages af Ascomyceten Sclerotinia sclerotiorum, blevet et stadigt større problem i Europa. Det er sket i takt med, at dyrkningen af raps (Brassica napus) er blevet mere udbredt (Rimmer et al., 2007). I nogle høstår trues udbyttet i både vår- og vinterraps således af knoldbægersvamp. S. sclerotiorum er ikke kun et problem i raps, men kan også være en yderst skadelig svampesygdom i flere afgrøder rundt om i verden og ligger til grund for mere end 60 forskellige sygdomsbetegnelser i en lang række afgrøder (Purdy 1979). S. sclerotiorum har blandt andet stor negativ betydning for afgrøder som gulerødder, solsikke og salat (Rimmer et al., 2007, Willets og Wong, 1980), og i det vestlige Europa er den især et problem i raps som sygdommen knoldbægersvamp. Forekomsten af knoldbægersvamp varierer imidlertid meget fra år til år (Rogers et al., 2009). Den store variation i forekomsten af angreb kombineret med høje omkostninger på bekæmpelse medfører således, at en bekæmpelse sjældent er økonomisk rentabel (Nielsen 2004). I en spørgeundersøgelse lavet af Jensen (2010) sprøjtede 40 procent af de adspurgte, som dyrkede vinterraps i Danmark, mod svampesygdommen, hvert år under blomstring. 23 procent af de adspurgte sprøjtede hvert andet år. Forklaringen var, at landmændene ønskede et stabilt årligt udbytte. Der har gennem tiden været afprøvet flere modeller med henblik på at forudsige forekomsten af angreb og dermed behovet for bekæmpelse, men ingen af modellerne har vist sig at være tilstrækkelige til brug for bekæmpelse af knoldbægersvamp. Det er en generel antagelse at svampen hovedsageligt inficerer raps gennem kronbladene. Og netop kronbladene er ofte i fokus i undersøgelser, der ser på sammenhængen mellem smitte af kronblade og senere angreb i marken (Turkington og Morrall, 1991; Wallenhammar et al., 2008). Almquist og Wallenhammar (2015) har i et enkelt forsøg imidlertid fundet knoldbægersvamp på nedre løvblade i raps, før rapsen begyndte at afblomstre. Selvom betingelserne for sporefrigivelse i dette studie ikke var til stede under blomstring, blev 7 % af rapsplanterne alligevel angrebet af knoldbægersvamp, hvorfor det antages, at smitten er sket før blomstring. Dette stemmer dog ikke overens med den generelle antagelse om smitte gennem kronbladene. Det er derfor interessant at undersøge, om det er muligt at detektere svampen på løvbladene, før kronbladene falder af, og på den måde muligvis blive klogere på svampens evne til at inficere raps. 1.1 Formål Dette speciale har til formål at beskrive forekomsten af knoldbægersvamp (Sclerotinia sclerotiorum) i raps, herunder svampens biologi og epidemiologi. Derudover undersøges og diskuteres, hvorvidt tidlig detektion i marken ved brug af metoden Polymerase Chain Reaction (PCR) på nedre løvblade er et brugbart værktøj til brug i varslingsmodeller. Dette gøres for at undersøge, om det er muligt for svampen at smitte rapsplanten før eller i tidlig blomstring, som foreslået af Wallenhammer et al., (2015). En efterprøvning af dette vil gøre os Side 6 af 67

klogere på svampens biologi og epidemiologi, og dette kan eventuelt bidrage til mere pålidelige varslingsmodeller i fremtiden. Opsummeret er formålet med opgaven at: - Beskrive knoldbægersvamp S. sclerotiorum i raps med fokus på biologi og epidemiologi. - Undersøge og diskutere om tidlig detektion ved brug af PCR på nedre løvblade er brugbart i varslingsmodeller. Specialet er delt ind i en litteraturdel og en eksperimentel del. I litteraturdelen vil der være en gennemgang af svampens biologi, herunder sygdomscyklus og hvad der har betydning for svampens overlevelse og infektion i marken. Dette er vigtigt i forhold til at kunne forstå og diskutere de planteværnsmodeller, der gennemgås efterfølgende. Her vurderes modellernes fordele og begrænsninger med hensyn til bestemmelse af risikoen for infektion i marken. Dette vil lede op til specialets anden del, hvor det undersøges, om PCR-test af nedre løvblade kan gøre os klogere på svampens biologi og eventuelt bidrage til mere pålidelige varslingsmodeller. I den eksperimentelle del indgår to målemetoder; PCR og agartest. PCR er en metode, der kan anvendes til at identificere en given organisme ved hjælp af opformering af en specifik Deoxyribonukleinsyre-sekvens (DNA). Den mere traditionelle agartest indebærer, at man placerer kronbladene på en agarplade, som er et vækstmedie, hvorpå svampe kan gro. Efter noget tid kan tilstedeværelsen af en svamp bestemmes på baggrund af den vækst, der er på pladen, da forskellige svampe har forskellige kendetegn i svampevæksten. I anden del undersøges det, om PCR på nedre løvblade kan være et brugbart værktøj til tidlig detektion af knoldbægersvamp i marken, som foreslået af Almquist og Wallenhammar (2015). PCR-teknologien er relevant, da den relativt hurtigt kan give et resultat sammenlignet med en traditionel agartest, som tager flere dage. I dette forsøg benyttes sidstnævnte også til at undersøge, om der er ascosporer på kronbladene. Samtidig bliver det muligt at afprøve begge metoder med henblik på risikobedømmelse. Der foretages således kun PCR på løvbladene, mens agartesten kun udføres på kronbladene. 1.2 Materiale og metode Specialets litteraturdel, der omhandler svampens biologi og epidemiologi, udføres som et litteraturstudie. Der lægges i denne del vægt på de aspekter af svampens egenskaber, der har betydning for dens indflydelse på primært dansk jordbrug, herunder overlevelse og spiring af sklerotier i marken, og smitte af raps. Den eksperimentelle del af opgaven indebærer præsentation af egne data genereret fra planteprøver indsamlet i maj 2015 og en efterfølgende bedømmelse af forekomsten af knoldbægersvamp i juli. Data fra forsøget præsenteres i en tabel, og resultaterne diskuteres i forhold til relevant litteratur. Side 7 af 67

Areal i hektar Afgrænsning Grundet specialets omfang er det eksperimentelle arbejde holdt på et begrænset niveau. Dette er sket ved kun at have to indsamlingstidspunkter og ved at reducere mængden af indsamlet materiale. Derudover er der kun udført PCR på løvbladene. En PCR-test af kronbladene havde imidlertid også kunnet være relevant, da dette ville muliggøre en direkte sammenligning af PCR test af henholdsvis kronblade og løvblade. Et andet forsøg har set på sammenhængen mellem agar-test og PCR-test af kronbladene, hvor agar-testen viste sig mere følsom (Wallenhammar et al., 2008). I dette projekt benyttes agar-testen derfor primært som en kontrol for inokulum i marken, da denne metode er mindre arbejdskrævende. Del 1 2 Rapsdyrkning i Danmark Raps er en betydningsfuld afgrøde i verden og en af de vigtigere kilder til vegetabilsk olie. Også i Danmark dyrkes raps hovedsageligt til produktionen af olie, som udvindes ved, at rapsfrøene presses. Restproduktet herfra kaldes rapskager, og dette proteinholdige produkt er et betydningsfuldt fodersupplement i den danske husdyrproduktion (Bosselmann et al., 2015). Raps har været dyrket i Danmark i mange år, men arealet har svinget meget gennem årene, som det ses på figur 1. I 1960erne lå arealet med raps i Danmark mellem 10.000 og 27.000 hektar. Siden er arealet steget, og især i begyndelsen af 80erne blev raps en meget udbredt afgrøde. I 1991 toppede rapsarealet med ca. 281.000 hektar raps i Danmark (Faostat 2015). Rapsdyrkning i Danmark 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0 1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010 2020 Årstal Figur 1. Arealet af dyrket raps i Danmark (hektar). (Baseret på data fra Faostat (2015)). Side 8 af 67

Siden er dyrkningen af raps i Danmark faldet. I 2014 blev der ca. dyrket 166.000 hektar, hvor hvede og byg til sammenligning dækker henholdsvis 661.000 og 602.000 hektar. Langt størstedelen af den raps, der dyrkes i Danmark er vinterraps, og vårraps udgør således under 1 procent af det samlede areal med raps (Danmarks statistik 2015). Tilbagegangen for dyrkningen af raps skyldes formentlig ikke problemer med knoldbægersvamp, men snarere at markedet for raps har ændret sig. Ikke desto mindre kunne en bedre varsling for knoldbægersvamp eventuelt gøre dyrkningen af denne afgrøde mere interessant. I sæsonen 2012/2013 var forbruget af importeret rapskager større end mængden af dansk producerede rapskager i foderblandinger herhjemme (Bosselmann et al., 2015). Dette tyder på, at der er et potentiale for en større dyrkning af vinterraps i Danmark på marker, hvor raps kun sjældent indgår i sædskiftet. 3 Sclerotinias biologi og spredning I dette afsnit beskrives S. sclerotiorum, med fokus på sygdomscyklus, samt hvilke faktorer der har indvirkning på svampens overlevelse og smitte i marken. Det er nødvendigt at kende til dette for at kunne vurdere, hvad der er vigtigt i forhold til bekæmpelse og varsling af angreb. 3.1 Navngivning Sclerotinia sclerotiorum er en svamp, der blev beskrevet første gang i 1837 af Madame M.A. Libert, som gav den navnet Peziza sclerotiorum. Senere beskrev Fuckel slægten Sclerotinia, og for at ære Madame Libert omdøbte han Peziza sclerotiorum til Sclerotinia libertiana. Wakefield påviste imidlertid, at dette navn ikke var i overensstemmelse med de internationale retningslinjer for navngivning, hvorfor den igen blev omdøbt til Sclerotinia sclerotiorum (Lib) Masse, da G. E. Masse brugte dette navn i 1895. Purdy (1979) påpegede efterfølgende, at de Bary allerede brugte navnet i 1884, hvorfor det rigtige navn til svampen måtte være Sclerotinia sclerotiorum (lib) de Bary (Purdy 1979). Det rette navn for S. sclerotiorum har været genstand for en del forvirring gennem tiden, da der ikke har været enighed om, hvordan slægten Sclerotinia skulle afgrænses og dermed navngives (Kohn 1979). Et af de navne, som også er blevet benyttet i litteraturen, er Whetzelinia sclerotiorum, som blev foreslået af Korf og Dumont (1972). Purdy (1979) påpegede imidlertid, at navnet S. sclerotiorum (lib.) de Bary, er meget implementeret i litteraturen og så derfor ingen grund til at ændre på navnet. Der blev efterfølgende fremsat en anmodning til International Association of Plant Taxonomist (IAPT) om at bevare Sclerotinia Sclerotiorum. Denne anmodning blev accepteret, og der kunne således ses bort fra navnet Whetzelinia (Kohn 1979). Side 9 af 67

Taksonomi: Sclerotinia Sclerotiorum (lib.) de Bary. Rige: Svamp (Fungi) Række: Sæksvampe (Ascomycota) Klasse: Skivesvamp (Discomycetes) Orden: Helotiales Familie: Knoldskivefamilien (Sclerotiniaceae) Slægt: Sclerotinia (Bolton et al., 2006) 3.2 Værtsplanter I forbindelse med plantesygdomme kan det være vigtigt at vide hvilke planter, der er modtagelige for den pågældende sygdom, da andre værtsplanter kan bidrage til, at sygdomstrykket bliver opretholdt. Dette gælder både for afgrøder, men også ukrudt som måtte være vært for sygdommen. Boland og Hall (1994) har rapporteret, at S. sclerotiorum kan smitte over 400 forskellige plantearter rundt om i verden. Lang de fleste af disse tilhører underklassen af tokimbladede planter, men også visse enkimbladede. Boland og Hall (1994) gør dog opmærksom på, at de værtsplanter, der indgår i opgørelsen, ikke nødvendigvis er fuldt op af Kochs postulat. Kochs postulat er en metode til at påvise om en organisme er vært for et givet patogen. Metoden kræver, at den mikroorganisme, som forårsager en given sygdom, skal være til stede i alle individer, der har sygdommen, og fraværende i raske individer. Organismen skal derefter kunne isoleres og overføres til et raskt individ, som derefter skal få sygdommen (Madigan et al., 2008). Der henvises ofte til listen fra Boland og Hall (1994) i forbindelse med S. sclerotiorums mange værtsplanter (Bolton et al., 2006; Twengström et al., 1998a; Hegedus et al., 2005; Rogers et al., 2009), men det kan imidlertid diskuteres, hvor mange af disse arter, der i virkeligheden også ville agere som vært for svampen. På listen findes eksempelvis både hvede, havre, rug og byg som værtsplanter, men det har dog ikke været muligt at finde artikler, der beretter om angreb af S. sclerotiorum på disse afgrøder. Kohli et al., (1995) siger derimod, at S. sclerotiorum ikke angriber kornafgrøder. Der skal dog ikke sås tvivl om, at mange planter kan angribes af svampen. Selvom S. sclerotiorum i Danmark især anses for at være et problem i raps, er der andre planter, der er modtagelige for svampen. Af andre landbrugsafgrøder som også dyrkes i Danmark kan eksempelvis nævnes hestebønner (Guimarães og Stotz, 2004) og ærter (Twengström et al., 1998a). Twengström et al., (1998a) fandt dog ikke, at ærter i sædskiftet gav anledning til opformering af knoldbægersvamp. Knoldbægersvamp er også almindeligt i kartofler, men udgør ikke noget stort eller stigende problem. Det kan dog i nogle år være ret udbredt (Bødker 2015). Et eksempel på, hvordan ukrudt spillede en rolle i forhold til angreb, er rapporteret fra England, hvor et angreb af knoldbægersvamp i raps blev koblet til en høj population af bjørneklo (Heracleum Side 10 af 67

mantegazzianum L.) og vild kørvel (Anthriscus sylvestris L.). Disse planter befandt sig i en skov, som lå op ad en mark med raps. Angreb af knoldbægersvamp var begrænset til det hjørne af marken, som lå op ad skoven. Her var der en stor forekomst af førnævnte planter, hvoraf mange var angrebet af S. sclerotiorum og havde sklerotier på og i stænglen (Hims 1979). 3.3 Sygdomscyklus Dette afsnit beskriver svampens sygdomscyklus i raps. Viden om et patogens sygdomscyklus kan være af stor betydning, når man som producent ønsker at bekæmpe denne eller minimere risikoen for angreb. For S. sclerotiorum er det primære inokulum i marken oftest sklerotier fra tidligere værtsplanter. Sklerotierne kan i foråret spire karpogenisk, hvilket vil sige, at de danner et frugtlegeme kaldet apothecie. Figur 2 herunder viser et billede af apothecier i marken. Apothecier frigiver aktivt ascosporer, som så kan inficere de nye værtsplanter. Sklerotierne kan også spire med mycelium, der kan inficere planter nær jordoverfladen (Willets og Wong, 1980). Figur 2. Apothecier i bunden af en mark. (Foto: Cecilia Lerenius, Jordbruksverket, Sverige). Ascosporerne spredes som regel med vinden over korte afstande og kan inficere kronbladene på raps enten før eller efter disse er afblomstrede (Rimmer et al., 2007). Ascosporerne har brug for en næringskilde for at kunne inficere rapsplanten. Netop kronbladene kan forsyne sporerne med den nødvendige næring, og hvis disse klæber til stængel og blade, kan svampen inficere selve planten (Gladders et al., 2008). Når planten er smittet breder svampen sig som mycelium i planten. Med tiden dannes der nye sklerotier i rapsen hule stængel, og i Side 11 af 67

nogle tilfælde også på ydersiden af planten (Willets og Wong, 1980, Gladders et al., 2008). På figur 3 herunder ses en illustration af knoldbægersvampens sygdomscyklus. Figur 3. S. sclerotiorums sygdomscyklus i raps (Rimmer et al., 2007). Da ascosporerne anses for at være den primære smittekilde hos knoldbægersvamp, betragtes svampen mest som monocyklisk. Dette betyder, at svampen kun gennemlever én livscyklus i marken i løbet af en vækstsæson (West et al., 2008). Der kan dog undertiden forekomme sekundær smitte i marken, da mycelievækst kan fungere som smittevej mellem tætstående planter. Dette er dog hovedsageligt kun et problem i tilfælde af udbredt lejesæd (Rimmer et al., 2007). Generelt for svampesygdomme er det sådan, at der frigives sporer, når forholdene er gunstige, og tidspunktet er ofte synkroniseret til et bestemt vækststadie i værtsplanten (West et al., 2008). Dette stemmer fint overens med ovennævnte kilder, som peger på at S. sclerotiorums ascosporer i første omgang smitter kronbladene i raps (Rimmer et al., 2007; Gladders et al., 2008 og Willets og Wong 1980), hvorfor sporefrigivelsen ofte falder sammen med, at rapsen blomstrer. Clarkson et al., (2003) fandt i et forsøg, at 50 % af ascosporerne fra S. sclerotiorum var spiredygtige efter 15 uger ved en relativ luftfugtighed på ca. 75 %. Dette kan således tyde på, at sporefrigivelsen i rapsmarkerne kan finde sted før blomstringen og under de rigtige forhold bevare levedygtigheden indtil og efter blomstring og eventuelt inficere kronbladene, efterhånden som de falder af og klæber til rapsplanten. Forudsætningen herfor er imidlertid, at sporerne er i stand til at blive på planten uden at blive skyllet af. Jamaux et al., (1995) fandt at ascosporer fra S. sclerotiorum Side 12 af 67

havde svært ved at klæbe til bladoverfladen på raps sammenlignet med kronbladene. Denne observation kan betyde, at den reelle periode, hvori sporer kan lande på rapsplanten og afvente tilstedeværelse af eksempelvis et kronblad, bliver reduceret i forhold til de 15 uger, som er angivet af Clarkson et al., (2003). 3.4 Infektion Apothecierne dannes ofte under et tæt løvdække af værtsplanten, da det er med til at bevare det fugtige miljø, som dannelsen og frigivelsen af sporer behøver. Det gør desuden, at smitten mest sker over korte afstande (Willets og Wong, 1980). Først når sporerne er frigivet, kan infektionen af værtsplanten finde sted. Dette afsnit beskriver og vurderer nogle af mekanismerne bag infektionen, som de er anført i litteraturen, samt hvilke faktorer, der har betydning for infektionen. Dette er vigtigt i forhold til at diskutere, hvordan og hvornår svampen kan angribe rapsplanten. Infektionsmekanismer S. sclerotiorum er en nekrotrof svamp og trives derfor i dødt plantevæv. I et review af Sharma et al., (2015) beskrives det, hvordan S. sclerotiorum dræber plantecellerne ved udskillelse af oxalsyre, forud for svampens fremrykning i værtsplanten. På denne måde er det muligt for svampen at inficere raske planter, selvom den er afhængig af dødt plantemateriale. Vigtigheden af oxalsyre for S. sclerotiorum blev også påvist af Godoy et al., (1990), hvor muterede isolater, der ikke udskilte oxalsyre, ikke var patogene over for bønner, mens isolater, der udskilte oxalsyre, var patogene. Dannelsen af ascosporer er som nævnt en vigtig og måske den eneste reelle primære smittekilde i marken. Når sporerne lander på værtsplanten, kan de spire med en spirehyfe, som derefter kan trænge ind i planten, enten ved at presse sig vej gennem cuticula (som er det vokslag, der dannes af de yderste planteceller) gennem andre åbninger eller gennem i forvejen skadet plantevæv. Guimarães og Stotz (2004) fandt, at hestebønner inficeret med en vild type af S. sclerotiorum havde nedsat lukkefunktion af stomata (spalteåbningerne hvorigennem planten ånder), mens dette ikke var helt så udbredt i de tilfælde, hvor hestebønnen var inficeret med en muteret type af S. sclerotiorum med en markant reduceret udskillelse af oxalsyre. Den nedsatte lukkefunktion af stomata mentes at have stor betydning for sekundær infektion af S. sclerotiorum, da det kunne observeres, at hyfer voksede inde fra det inficerede blad og ud gennem stomata. Ifølge Hegedus og Rimmer (2005) sker selve infektionen oftest ved penetrering af cuticula og i mindre grad gennem stomata, hvilket også blev anerkendt af Guimarães og Stotz (2004). Dette kunne tyde på, at infektion af rapsplanter primært sker gennem cuticula og ikke gennem stomata. Hegedus og Rimmer (2005) påpeger, at ascosporer sjældent kan inficere rask plantevæv direkte, men at infektion af stængel er afhængig af, at ascosporerne først inficerer aldrende og dødt plantevæv som eksempelvis afblomstrede kronblade. Infektionshyfen fra svampen er nemlig først i stand til at inficere Side 13 af 67

værtsplanten, når svampen er velernæret, hvorfor der er behov for ekstern næring, før denne proces finder sted (Lumsden 1979). Disse antagelser støttes også af Jamaux et al., (1995), som fandt, at ascosporer fra S. sclerotiorum havde svært ved at hæfte til overfladen på et rapsblad, sammenlignet med et løvblad. Ydermere fandt de, at sporerne ikke var i stand til at inficere løvbladene i dette forsøg. Undersøgelser foretaget på salat viser også, at en kilde til næring er nødvendig, før en infektion finder sted (Newton og Sequeira, 1972), hvilket underbygger teorien om, at ekstern næring er nødvendig for selve infektionen. Undersøgelser som de, der er nævnt her, viser sandsynligvis en del af forklaringen på, hvorfor det i beskrivelsen af knoldbægersvampens sygdomscyklus ofte nævnes, at infektion af kronbladene er nødvendigt, for at planten kan angribes (Gladders et al., 2008; Leino 2006 og Rimmer et al., 2007). Ovennævnte information vedrørende S. sclerotiorums inficering af planter tyder således på, at svampen ikke umiddelbart er i stand til at inficere rapsplantens blade og stilk direkte, men at den først spirer ved tilstedeværelsen af ekstern næring som eksempelvis et kronblad kan bidrage med. Det betyder, at infektion af rapsplanten ikke umiddelbart kan finde sted før begyndende afblomstring, medmindre der er andet dødt organisk materiale til stede på planten, som kan bidrage med næring. Det ses på figur 4 herunder, hvordan faldende kronblade klistrer sig fast på rapsplanten, hvorefter de potentielt kan medvirke til en infektion. Figur 4. Afblomstrede kronblade, der klistrer til rapsplanten (Foto: N. Ø. Wagner) Side 14 af 67

Almquist og Wallenhammar (2015) fandt imidlertid angreb af knoldbægersvamp i vårraps, selvom der ikke blev fundet ascosporer på kronbladene på noget tidspunkt i blomstringsperioden. I tabel 1 herunder ses resultatet af en kronblad- og løvbladtest på forskellige tidspunkter i blomstringsperioden i to forskellige forsøgsmarker. Det ses, at der i mark D ikke blev fundet knoldbægersvamp på kronbladene på noget tidspunkt under blomstringen. Til gengæld blev svampen identificeret i løvbladene. Tabel 1. Forsøgsresultater fra Almquist og Wallenhammar (2015). Tabellen viser forekomsten af S. sclerotiorum i procent på kronblade (Petals) og løvblade (Leaf) på to forskellige placeringer (Field experiment D og E) til forskellige tidspunkter gennem blomstringsperioden i året 2010. Leaf level angiver hvilket løvblad, der er blevet udtaget. Leaf level 7 er det nederste løvblad. Hvis der ikke var nok blade på dette niveau, er det angivet som n.s. Endvidere var betingelserne for frigivelse af sporer og infektion heller ikke til stede under blomstringen, men derimod før og efter blomstringen. På figur 5 fremgår det, hvordan en analyse af luftbårne inokulum viste, at sporefrigivelsen i forsøgsmark D skete før blomstringen, hvilket tydede på, at rapsen er blevet smittet uden tilstedeværelsen af kronblade. Dette strider imod, hvordan flere i litteraturen anfører, at svampen inficerer rapsen, som er den smittevej, der ofte er illustreret i svampens sygdomscyklus, som det eksempelvis ses på figur 3. Side 15 af 67

Figur 5. Figuren viser nedbør (søjler), temperaturen (sammenhængende linje), relative luftfugtighed (stiplede linje) og forekomsten af sporer i luften (sorte prikker) i mark D i foråret 2010 (Almquist og Wallenhammar 2015). Spørgsmålet om S. sclerotiorums evne til at inficere løvblade direkte og nødvendigheden af kronbladene som indirekte smittekilde vil blive undersøgt og diskuteret i denne rapports anden del. I det følgende gennemgås betydningen af klimatiske forhold, såsom temperatur, nedbør og luftfugtighed, for infektionen. Temperatur Mikroklimaet er vigtigt for infektionen, og derfor spiller temperaturen også en rolle for infektionen af planten. Abawi og Grogan (1975) viste, at den optimale temperatur for infektion i bønner var 25 grader, men at infektioner også fandt sted ved både lavere og højere temperaturer. I et studie lavet på salat var den optimale temperatur 16 27 grader, og det nævnes også, at infektion af raps er blevet observeret ved 8 grader (Koch et al., 2007). I modellen SkleroPro lavet af Koch et al., (2007) blev en temperatur på 7-11 grader således sat som en nedre grænse for, hvornår der sker angreb af knoldbægersvamp. Disse studier indikerer, at infektionen kan finde sted over et relativt stort spænd af temperaturer, og at temperaturerne omkring rapsens blomstring ikke umiddelbart udgør en begrænsende faktor. Derimod kan mængden af nedbør og dermed fugtigheden være meget forskellig fra år til år. Betydningen af disse faktorer diskuteres i det følgende afsnit. Side 16 af 67

Nedbør og luftfugtighed Foruden temperaturen er fugtigheden også essentiel for, at en infektion kan finde sted. På baggrund af et forsøg i et klimakammer blev en nedre grænse for luftfugtigheden på 80 86% fastsat i en tysk varslingsmodel, Skleropro, som nævnt før (Koch et al., 2007). Denne model vil også blive diskuteret senere i denne opgave i afsnittene 5.5 Metoder til brug i planteværn. Behovet for et fugtigt miljø blev også anerkendt af Abawi og Grogan (1975), som ydermere konkluderede, at der var behov for direkte våde forhold ca. 48 til 72 timer før en infektion af bønneplanter gennem ascosporer var muligt. Dette blev konkluderet på bagrund af forsøg lavet i tågekamre, fugtige bokse samt markforsøg. Fugtigheden og måske også forekomsten af vand på planten synes derfor at have en afgørende betydning for infektionen i marken. For at infektionen finder sted, kræver det som nævnt tilstedeværelsen af kronblade, der klæber fast til planten, hvilket kan være tilfældet under fugtige forhold. For meget regn har imidlertid vist sig at kunne reducere angrebet af knoldbægersvamp i de tilfælde, hvor meget nedbør har medført, at kronbladene er blevet skyllet af rapsplanten (Gladders et al., 2008). 3.5 Symptomer i marken De første tegn på, at der er knoldbægersvamp i marken, varierer afhængig af, om der er tale om infektion startet gennem mycilievækst eller infektion, der er sket ved ascosporer. Når infektionen i marken primært forårsages af mycelievækst, kan det ofte forekomme meget sporadisk i marken. Ved mycelieinfektion ses ofte en aflang væskefyldt læsion ved stængelbasis. Denne udvider sig hurtigt, og med tiden bliver området lyst og nekrotisk. Der dannes med tiden områder med synligt hvidt mycelie. Efterhånden som stænglen bliver helt dækket af vatlignende mycelie, visner planten og tørrer ud (Sharma et al., 2015). Det skal dog understreges, at primærinfektion gennem mycelie ikke synes at være af betydning, da der i litteraturen stort set kun er fokus på den infektion, der finder sted gennem kronbladene. Eksempelvis opfatter både Rimmer et al., (2007) og Leino (2006) således infektionen gennem kronblade som hovedkilden. Når angrebet skyldes infektion af ascosporer, er angrebet mere jævnt fordelt i marken (Sharma et al., 2015). Her ses symptomerne ofte i bladhjørnerne ved stænglen, hvor inficerede kronblade kan ligge, når rapsen afblomstrer. Infektionen ses også her som hvid til grå læsion langs stænglen. I nogle tilfælde kan der dannes mørke ringe i området som tegn på trinvis vækst. Eksempler på en inficerede rapsplanter ses på figur 6. Angreb kan i nogle tilfælde medføre nødmodning af frøene og at planten går i leje (Rimmer et al., 2007). Infektioner på blade viser sig som regel ved, at der er et hul i bladet (Sharma et al., 2015). Et af de tydeligste tegn på angreb af knoldbægersvamp er dannelsen af nye sklerotier inde i den hule stængel af rapsplanten (Leino 2006; Rimmer et al., 2007). Dannelsen af sklerotier inde i stænglen er også en vigtig måde, hvorpå den kan skelnes fra gråskimmel. Gråskimmel er almindelig, men kun et problem under meget fugtige forhold, hvor den kan angribe i forvejen beskadiget væv. Gråskimlen danner i modsætning til knoldbægersvamp primært flade sklerotier på ydersiden af stænglen. Sklerotier på ydersiden af stænglen ses kun under meget våde forhold hos knoldbægersvamp, hvor sklerotierne også er mere runde i modsætning til dem fra gråskimmel (Leino 2006). Side 17 af 67

Figur 6. Symptomer på rapsplanten ses som hvidt mycelium på stænglen. Billedet til venstre viser en angrebet plante, der er nødmodnet. Midt for ses sklerotie på ydersiden af stænglen. Til højre ses sklerotie inde i stænglen (Foto: N. Ø Wagner). 3.6 Overlevelse af sklerotier i jorden Selvom S. sclerotiorum til en hvis grad kan overleve i marken som mycelie og ascosporer (Willets og Wong, 1980), anses dannelsen af sklerotier for at være svampens primære overlevelsesmekanisme (Coley-Smith og Cooke, 1971). Forekomsten af knoldbægersvamp i sædskiftet er derfor påvirket af sklerotiernes levedygtighed. Tørre somre samt vinterperioder har vist sig ikke at reducere sklerotiernes levedygtighed væsentligt, mens fugtige somre med høje temperaturer i højere grad fremmer nedbrydningen af sklerotier (Willets og Wong, 1980). Smith (1972) undersøgte effekten af tørring på sklerotiers nedbrydning. Sklerotier fra bl.a. S. sclerotiorum, blev først tørret og derefter rehydreret, ved at de blev lagt på havejord fugtet til markkapacitet og indkuberet ved 16-22 grader celsius. Sklerotierne lækkede næringsstoffer og blev derfor lettere koloniseret af mikroorganismer, som forårsagede en forrådnelse af sklerotiet. Efter 3 uger var 84 % af sklerotierne fra S. sclerotiorum gået i forrådnelse, mens dette ikke var tilfældet for sklerotier, der ikke var blevet tørret på forhånd. Effekt af jorddybde Den øgede kolonisering af mikroorganismer som følge af tørring og rehydrering af sklerotier, kan være forklaringen på, hvorfor sklerotier, der befinder sig på jordoverfladen, af nogen menes at blive nedbrudt hurtigere end sklerotier i jordmatricen (Sharma et al., 2015), da jordoverfladen har et mere svingende miljø med hensyn til temperatur og fugtighed. Dette kunne betyde, at mange af de sklerotier, der måtte dannes i en rapsmark i løbet af en sæson, risikerer at gå til efter kort tid, såfremt stænglerne går i stykker under høst og Side 18 af 67

sklerotierne efterlades på jorden, hvor de er udsat for tørring og fugt. Hvis der derimod hurtigt foretages en jordbearbejdning efter høst, vil mange sklerotier blive begravet i jorden og dermed være beskyttet mod de svingende miljøforhold, som fremmer nedbrydningen af dem. Denne teori stemmer imidlertid ikke overens med et forsøg lavet af Merriman et al., (1979) der genfandt flere levedygtige sklerotier, når disse var på jordoverfladen i forhold til når de var begravet i 4 cm dybde. Ligeledes fandt Cook et al., (1975) en mindre grad af nedbrydning af sklerotier fra jordoverfladen sammenlignet med sklerotier begravet i 5 cm dybde. I modsætning til disse observationer genfandt Mitchell og Wheeler (1990) i et forsøg færrest sklerotier på jordoverfladen og i 1 cm dybde, mens der næsten blev fundet ligeså mange sklerotier, som oprindeligt lagt ud i 4-6 cm dybde. Disse forskellige forsøg tyder på, at effekten af den dybde, som sklerotierne befinder sig i, ikke er entydig. Det kan tænkes, at forklaringen ligger i, at det i forsøgene er andre faktorer end netop dybden, der påvirker resultatet. I det følgende diskuteres, om resultaterne af to af forsøgene (Mitchell og Wheeler, 1990; Cook et al., 1975) er koblet til spiringen af sklerotierne. Effekt af spiring I forsøget af Mitchell og Wheeler (1990) var det sklerotierne i de øverste centimeter af jorden, der dannede flest apothecier, hvilket kunne tyde på at apotheciedannelsen fremmer nedbrydningen af sklerotiet. Denne teori underbygges af, at det i forsøget af Cook et al., (1975) var sklerotier placeret på jordoverfladen, som stort set ikke spirede, mens dem i 5 centimeters dybde gjorde. Det tyder altså på, at nedbrydningen af sklerotier i de to forsøg er relateret til om sklerotiet spirer eller ej. Dette støttes af Williams og Western (1965), som konkluderede, at apotheciedannelse gjorde sklerotiet mere udsat for angreb af andre organismer. De påpeger dog, at sklerotierne på trods af dette er i stand til at danne apothecier mere end én sæson. I forsøget af Mitchell og Wheeler (1990) blev der ikke fundet apothecier fra sklerotier på jordoverfladen i forsøgets andet år, hvilket tyder på, at de fleste allerede var nedbrudt på dette tidspunkt. Alt dette tyder på, at jorddybden i sig selv ikke er afgørende for sklerotiernes overlevelse. Forskellige dybder kunne derimod give forskellige betingelser for at sklerotiet spirer og derigennem have indirekte betydning for sklerotiets overlevelse. At sklerotier dybere i jorden kan overleve i længere tid er også blevet indikeret af Almquist og Wallanhammar (2015). De fandt angreb af knoldbægersvamp i en mark, hvor der ikke har været dyrket en afgrøde, som er vært for svampen, i over 11 år. Det indikerer, at sklerotier kan overleve mange år i jorden. På baggrund af disse modstridende observationer peger noget således på, at det ikke er helt entydigt, hvilken effekt jordbearbejdning har på overlevelsen af sklerotier, i forhold til om pløjning fremmer nedbrydning som følge af, at sklerotierne begraves i dybere jordlag. Dette bliver yderligere kompliceret af, at flere studier tyder på, at S. sclerotiorum er i stand til at danne sekundære sklerotier i jorden (Coley-Smith og Cooke, 1971; Mitchell og Wheeler, 1990; Cook et al., 1975 og Side 19 af 67

Williams og Western, 1965). De sekundære sklerotier dannes i jorden under meget fugtige forhold (et vandniveau over markkapacitet), men det er uvist, hvor længe denne proces kan finde sted (Williams og Western, 1965). Om det er det, der førte til, at der formentlig stadig var spiredygtige sklerotier i forsøget af Almquist og Wallenhammar (2015) vides ikke, men kan ikke udelukkes. Og dette ville i så fald gøre effekten af værtsfrie år i sædskiftet mere usikker med hensyn til at mindske inokulum i marken og dermed forbygge kraftige angreb af knoldbægersvamp. Omvendt kan værtsfrie år kombineret med reduceret jordbearbejdning betyde, at relativt flere sklerotier nedbrydes som følge af svingende miljøforhold samt apotheciedannelse, såfremt det er disse forhold, der fremmer nedbrydningen af sklerotier mest. På samme måde kan sklerotier, der er begravet i jorden som følge af pløjning, ligeledes bringes op til overfladen ved pløjning forud for såning af en kornafgrøde. Således kan disse sklerotier også blive udsat for forhold, der kan fremme nedbrydning. 3.7 Apotheciedannelse I de tilfælde hvor et sklerotie spirer med et svampelegeme, en lille stilk med et rundt hoved på kaldet apotecium, er der tale om en karpogenisk spiring. Det er denne udvikling, som giver anledning til frigivelsen af ascosporerne og som spiller en stor rolle ved infektion af marken. Det tager cirka to til tre uger fra det første tegn på karpogenisk spiring til frigivelsen af ascosporer finder sted (Willets og Wong, 1980). Lidt længere spiringstid blev observeret under kontrollerede forhold af Clarkson et al., (2003), hvor apothecierne var dannet efter 3-5 uger ved 15-22 grader, dækket af en halv centimeter fugtig kompost med 12 timers henholdsvis mørke og lys. Inden sklerotiet spirer, kræver det et fugtigt miljø i én til to uger. Sklerotiet skal helst være placeret i de øverste centimeter i jorden (Sharma et al., 2015), hvilket ofte vil være tilfældet, hvis der dyrkes raps efter raps, og der kun er harvet inden såning. Apotheciet dannes ved, at der gror celler ud fra sklerotiet, som efterhånden danner et stilklignende svampelegeme, kaldet excipulum, der vokser opad indtil cirka 1 centimeters højde over jordoverfladen. Når den udsættes for ultraviolet lys, begynder dannelsen af selve hovedet, hymeniet, hvori der dannes sporesække, også kaldet asci. Det er i disse sporesække, at de seksuelle sporer, ascosporerne, dannes. Under strengen af ascospore er der en vacuole, som øger det hydrostatiske tryk inde i sporesækken. Dette tryk opbygges indtil sporesækkene brister og ascosporerne frigives (Sharma et al., 2015). S. sclerotiorum er homothallisk, hvilket vil sige, at den er selvfertil, og at de seksuelle ascospore er identiske (Bolton et al., 2006). Af samme grund danner svampen ikke aseksuelle konidiesporer (Hegedus et al., 2005). Mikrokonidier kan dog ses på myceliet, men disse spirer ikke og deres rolle er endnu ukendt (Bolton et al., 2006). Et sklerotie kan danne indtil flere apothecier. Hao et al., (2003) fandt, at antallet af apothecier, som et sklerotie var i stand til at danne, afhang af størrelsen på sklerotiet og af at meget små fragmenter af et sklerotie kun var i stand til at spire med mycelie. Selvom dannelsen af apothecier gør sklerotiet mere udsat for nedbrydning, kan det samme sklerotie danne apothecier flere år i træk (Williams og Western, 1965). Side 20 af 67

Sporefrigivelse Clarkson et al., (2003) undersøgte effekten af lys og luftfugtighed på frigivelsen af ascosporer hos S. sclerotiorum. Deres undersøgelse viste, at apothecier under en relativ luftfugtighed på 90-95 % hyppigt frigav sporer i eksperimentets varighed på 7 dage, hvilket tyder på, at apothecierne kan være aktive i endog længere tid. Frigivelsen af sporer aftog signifikant ved en luftfugtighed på 65-75 % efter 36 timer og frem, hvilket tyder på, at apotheciets virkningstid er påvirket af luftfugtigheden. Newton og Sequeira (1972) undersøgte frigivelsen af ascosporer under forskellige temperaturer. Ved 8, 12 og 16 grader var der en jævn frigivelse af sporer, som aftog efter 2 til 3 dage. Den mest optimale temperatur var 22 grader og sporefrigivelsen var stort set jævn over 7 dage. Ved 4 grader faldt frigivelsen af sporer til næsten ingen inden for kun en time, men apotheciet forblev i god stand selv efter 30 dage ved denne temperatur og genoptog sporefrigivelsen, når temperaturen blev hævet til 22 grader. Det er ikke oplyst, hvilke luftfugtigheder, der er anvendt i dette forsøg, men de må formodes at være relativt høje, så dette ikke var en begrænsende faktor. Undersøgelsen tyder på, at apothecierne under de rigtige forhold kan have en lang levetid i marken ved lave temperaturer og øge frigivelsen af sporer, når temperaturen stiger. De ovennævnte temperaturer og luftfugtighed stemmer overens med en temperatur på 7-11 grader og en luftfugtighed på 80-86 %, som Koch et al., (2007) anvendte som minimumskriterier for infektion gennem ascosporer. I Koch et al., (2007) anvendes imidlertid klimadata, som er målt 2 meter over jordens overflade, som så bruges til at beregne henholdsvis temperatur og luftfugtighed i markens løvtag, hvorimod undersøgelsen af Clarkson et al., (2003) er sket under kontrollerede forhold. Det kan imidlertid være kompliceret at beregne den relative luftfugtighed nede i markens løvtag, da forhold som jordens fugtighed og løvtagets tæthed har stor betydning herfor. En fugtig jord kombineret med tæt løvtag, kan nemlig medføre en høj luftfugtighed (Bom og Boland, 2000). Ascosporerne spredes som regel over korte afstande med luften (Willets og Wong, 1980). Ben-Yephet og Bitton (1985) undersøgte ved brug af plader med et selektivt vækstmedie afstanden, hvormed levedygtige ascosporer fra S. sclerotiorum spredtes med vinden, og fandt at de fleste landede på pladerne inden for de første 100 meter, men at nogle også blev fundet 400 meter væk. At de fleste sporer kun transporteres over en kortere afstand stemmer også overens med Hims (1979), der fandt angreb i marken som følge af inficering gennem ascosporer fra en nærliggende skov. Angrebet var dog begrænset til kun at være i den del af marken, der lå tættest på skoven. Disse forhold gør, at der ved dyrkningen af raps på marker, hvor der ikke før har været dyrket raps, kan ske smitte fra nabomarker, hvor raps hyppigt bliver dyrket. Dette kan i sidste ende have betydning for beslutningen om, hvorvidt knoldbægersvamp skal bekæmpes eller ej. Vigtigheden af inokulum i nabomarker påpeges også af Turner et al., (2002), som siger, at en gradvis aftagende eller tiltagende smitte henover marken ofte er tegn på smitte fra eksempelvis en nabomark. Side 21 af 67

Vernalisering af sklerotie Sklerotierne spirer som regel først efter en hvileperiode, hvor sklerotierne gennemgår en slags vernalisering, der er en proces, som modner sklerotiet, hvorefter det kan spire. Lave temperaturer synes at have størst betydning for denne proces (Sharma et al., 2015). Der kan imidlertid skelnes mellem to typer af hvileperioder, hvor den ene er relateret til sklerotiets iboende egenskaber og den anden skyldes, at miljøet ikke er gunstigt nok til, at sklerotiet kan spire. Hvile forårsaget af iboende egenskaber kan godt brydes uden at sklerotiet spirer, hvilket kan være tilfældet, hvis ikke de miljømæssige forhold er optimale (Coley-Smith og Cooke, 1971). Den første form for hvile refereres der også til som den rigtige hvile (Amen 1968). Begge former for hvile skal imidlertid brydes før sklerotiet kan spire. Behovet for eksempelvis kulde for at kunne spire kan dog variere, eftersom undersøgelser har vist, at nogle isolater af S. sclerotiorum har brug for mere kulde end andre isolater (Bolton et al., 2006; Coley-Smith og Cooke, 1971). Dette tyder på, at svampen har tilpasset sig de klimatiske forhold, den befinder sig i. Eksempelvis har nogle sklerotier fra tropiske områder ikke nødvendigvis behøvet en periode med kulde for at kunne spire (Bolton et al., 2006). Temperaturens betydning for apothesiedannelse Når sklerotiet er modent og klar til at spire, kræver det blot de rette betingelser for, at sklerotiet spirer. Jordens temperatur har vist sig at have en betydning for karpogenisk spiring, omend betydningen synes at være mindre end jordens fugtighed. Det er blevet rapporteret, at en konstant temperatur på 11 grader celsius gav anledning til dannelsen af flest apothecier, men at også 15 grader celsius viste sig at give gode forhold for dette (Abawi og Grogan, 1979). Hao et al., (2003) fandt også, at temperaturer mellem 10 og 20 grader celsius gav de mest optimale forhold for karpogenisk spiring, mens dette var meget begrænset ved 5 grader og ikke fandt sted ved 25 grader celsius. Dette gælder dog for isolater indsamlet i Californien og Huang og Kozub (1991) fandt imidlertid, at den optimale temperatur for karpogenisk spiring varierede afhængig af isolaternes geografiske og klimatiske ophav. Endvidere konkluderede de, at nogle isolater også dannede apothecier ved 25 grader celsius. Men i denne undersøgelse viste det sig også, at en temperatur på 10 grader var favorabel for isolater som bl.a. havde deres oprindelse i Canada, som klimatisk minder mere om forholdene i Danmark end eksempelvis Californien. Den optimale temperatur synes på baggrund af ovennævnte kilder at være 10 til 15 grader, men op til 20 grader celsius giver også gode forhold for karpogenisk spiring. Selvom Hao et al., (2003) fandt at den optimale temperatur var mellem 10 og 20 grader, spirede sklerotierne også mellem 5 og 10 grader. Isolater fra marker i Danmark må ligeledes forventes at kunne spire ved disse temperaturer. På figur 7 herunder ses jordtemperaturen for jorden i Slagelse kommune for 2015. Det fremgår, at forholdene for, at sklerotierne kan spire, opnås i løbet af april måned, mens at forholdene er optimale fra begyndelsen af maj, hvilket falder sammen med blomstringen i rapsen, som fandt sted fra start maj til slut maj. De viste temperaturer er målt i 10 cm dybde. Temperaturen i de øverste centimeter i jorden, som er den dybde som sklerotierne oftest spirer fra, må forventes at svinge mere end grafen antyder. Side 22 af 67

Figur 7. Jordtemperaturen målt i 10 cm dybde i Slagelse kommune 2015 (Landbrugsinfo 2015). Betydning af jordens fugtighed på apothesiedannelsen Jordens fugtighed menes at være en af de vigtigste faktorer vedrørende karpogenisk spiring, og kontinuerlig fugtighed er nødvendig, før dette finder sted (Abawi og Grogan, 1979). Sklerotiet fra S. sclerotiorum optager hurtigt vand, når det sænkes ned i vand, men tørrer også relativt hurtigt ud. Hao et al., (2003) fandt, at et udtørret sklerotie kunne opnå 80 % vandmætning efter cirka tre timer i vand, men også at et fuldt hydreret sklerotie mistede halvdelen af sit vandindhold efter seks til syv timers tørring i luften ved stuetemperatur (23 grader celcius). Jordtypen synes også at have betydning i denne sammenhæng, da forskellige jordtyper kræver mere eller mindre nedbør for at give gode forhold for dannelsen af apothecier, da de har forskellige vandkapaciteter. En sandjord tørrer hurtigere ud, hvorfor det må forventes at mere hyppig nedbør her er nødvendigt for at opretholde et fugtigt miljø. Hao et al., (2003) så imidlertid ingen forskel på to forskellige jordtyper, hvor en jordtype med henholdsvis 67 og 15 % sand og ler blev sammenlignet med en jord med henholdsvis 19 og 30 % sand og ler. I modsætning hertil fandt Twengström et al., (1998b) en højere forekomst af apothecier i en lerblandet sandjord sammenlignet med en lerjord ved et vandingsniveau på 5 mm/dag. Det modsatte var tilfældet ved et vandingsniveau på 2 mm/dag, hvor det største antal apothecier var at finde i lerjorden. Forklaringen er, at ved et lavt vandingsniveau på sandjorden var fugtigheden for lav til dannelsen af apothecier og et højt vandingsniveau medførte en for høj fugtighed på lerjorden. I samme forsøg viste hyppig vanding at give bedre forhold for dannelsen af apothecier, da daglig vanding gav flere apothecier sammenlignet Side 23 af 67

med vanding en til to gange i ugen. Det til trods for, at den samlede mængde vand, der blev tilført, var den samme. Med et lerindhold på kun 4,9 % indeholdt den lerblandede sandjord i dette forsøg også meget mindre ler end nogen af de jorder, som Hao et al., (2003) anvendte, hvilket måske kan forklare de forskellige konklusioner. I overensstemmelse med Twengström et al., (1998b) fandt Hao et al., (2003) også begrænset eller ingen apotheciedannelse i en vandmættet jord. Den optimale fugtighed for karpogenisk spiring synes derfor at afhænge af jordtypen, samt hyppigheden for nedbør i marken. Jorden skal generelt være meget fugtig uden at være helt vandmættet. 4 Bekæmpelse af knoldbægersvamp I dette afsnit beskrives, hvordan knoldbægersvamp kan bekæmpes i landbruget, samt hvilke dyrkningsrelaterede tiltag, der kan hjælpe til at forebygge angreb af knoldbægersvamp. 4.1 Kemisk bekæmpelse Bekæmpelse af knoldbægersvamp med fungicider er en meget anvendt metode i det konventionelle landbrug i Danmark. Sprøjtning mod sygdommen skønnes kun at være rentabel ved et infektionsniveau på over 20 procent angrebne planter. Den nuværende anbefaling er at sprøjte ved fuld blomstring, når de første kronblade begynder at falde af, da kronbladene, som tidligere nævnt, menes at udgøre en vigtig kilde til næring for infektionen. Når der sprøjtes mod svampeangreb i marken, skal man dog også medregne en udbyttereduktion på grund af køreskade (Nielsen 2004; Landbrugsrådgivning 2005). Der findes flere forskellige sprøjtemidler til bekæmpelse af knoldbægersvamp, heriblandt Amistar(Azoxystrobin), Folicur(Tebuconazol), Cantus(Boscalid) og Contans(Coniothyrium minitans). Sidstnævnte er et mikrobiologisk middel, der skal indarbejdes i jorden, inden rapsen sås. Denne vil blive beskrevet i næste afsnit. De andre midler skal, som nævnt ovenfor, anvendes under fuld blomstring når de første kronblade begynder at falde af (Jensen et al., 2013). Årsagen hertil er, at de fleste sprøjtemidler kun har begrænset kurativ effekt, hvilket vil sige, at de mest beskytter planten mod angreb (Turner et al., 2002). I tabel 2 ses resultatet fra 4 forsøg med svampebekæmpelse i vinterraps, fra oversigten over landsforsøgene 2014. 3 af forsøgene har kraftige angreb af knoldbægersvamp (45 % angrebne planter). Det første forsøgsled er den ubehandlede og der er der opnået et udbytte på 45,9 hkg/ha. De forskellige behandlinger i marken ses i de resterende 15 forsøgsled. Det største merudbytte, der er opnået som følge af svampebekæmpelse er i forsøgsled 12, med ekstra 8,6 hkg/ha. Også i de andre forsøgsled er der opnået et betydeligt merudbytte som følge af svampebekæmpelse. Angrebene af knoldbægersvamp var dog også mere udbredt i dette år sammenlignet med tidligere år, og et angrebsniveau på 45 procent af planterne må dog også siges at være højt. I 50 forsøg fra 2008 til 2014 var der i gennemsnit 2 procent planter med Side 24 af 67

knoldbægersvamp, hvilket også betød at nettomerudbyttet af svampebekæmpelse var lavere (1,3 hkg/ha) (Nielsen 2014). Tabel 2. Tabellen viser effekten af svampebekæmpelse i fire forsøg fra Landsforsøgene 2014. I første kolonne ses de forskellige behandlinger (1-16). Nettomerudbyttet af disse fremgår af sidste kolonne (Nielsen 2014). Dette tyder på, at der i nogle situationer kan være stor positiv effekt af at bekæmpe svampe i rapsen. På figur 8 herunder ses det opnåede bruttomerudbytte i 110 landsforsøg i perioden 1998 til 2014. Side 25 af 67