MiSeq i den daglige rutine. MRSA og VRE Isolater. 4. juni 2014 DTU Peder Worning, KMA Hvidovre
Hvorfor Genomsekventere i Rutinen?
Hvad bruger vi DNA-sekvenser til? Typning og bestemmelse af MRSA PCR baserede prøver: nuc: Er det en stafylokok? meca: Er det en MRSA? PVL: Er den PVL positiv? ACME: Er den ACME positiv? spa: Hvilken klon er det? SCCmec: Hvilken cassette har den? MLST, dru, MLVA,... Alle disse resultater kan findes med en komplet genomsekvens. Tilsvarende med VRE, Pneumokokker og Listeria monocygotes.
Hvad får vi ud af det? Alle virulens og resistens gener Søge efter alle typer sekvenser Fremtidssikret søgning. Slægtskabsanalyse SNP-Træer Smitteveje Udbrud
MRSA workflow KMA Hvidovre Modtagelse af prøven Opformering PCR screen Udpladning PCR konfirmation MiSeq Laboratoriet Jesper Boye Nielsen Dag 1 Dag 2 Dag 3 Registrering Opformering DNAoprensning Qubit Library prep Dag 4 Dag 5 PCR cleanup Bioanalyzer Library norm. Library pooling MiSeq Sequencing Dag 6 Dag 7 Dag 8
DNA oprensning og koncentrationsmåling -Oprensning af overnatskultur -Qiagen, DNeasy Blood & Tissue -Koncentrationsmåling af oprenset DNA -Qubit
Library preparation og QC -Library preparation Nextera xt -Library QC Agilent Bioanalyzer High Sensitivity kit -
MiSeq sekventering af MRSA -24 isolater sekventeres samtidigt -300 cycles -150bp Paired End reaktion -24 timer -5 Gb data -Fastq filer
MiSeq Platformen
Det kræver omhu og påpasselighed!
MiSeq Rummet
Bioinformatik
Databehandling! Data på Harddisk linux computer Taste ind i Databasen Dataanalyse Assembly at samle skidtet. Typning spa & MLST Finde gener meca, nuc, PVL,... Lave slægskabstræer Finde Smitteveje Hvorfor have genomerne i en database? Finde isolater Finde specifikke DNA-sekvenser
Computer - Hvad kræves Software!
Vores Linux Computere
Vores pipeline En pipeline er en serie af programmer, der laver databehandling. Vores kommer fra Oxford - skrevet i python. De novo Assembly og SNP-calling. Velvet, VelvetOptimiser, Stampy, Mapcall og MySql database. Tilføjelser: MLST, spa-typning, Blast-søgning Isolatsøgning, sekvensudtræk, oversigtstabel, artsbestemmelse.
Taste ind i databasen: #&? @! Det er kedeligt og tidskrævende: Men det er hele besværet værd
Indtastning til MiSeq
DNA Assembly At samle de 3 millioner bp! Jeg tror jeg har fundet en hjørnebrik
t5973 en giftig type Fejl-typninger med lange spa-typer t5973 en helvedestype på 13 repeats t1376 07-12-21-17-13-13-34-34-33-13 t6497 07-12-21-17-13-13-13-34-34-33-13 t10954 07-12-21-17-13-13-13-13-34-34-33-13 t5973 07-12-21-17-13-13-13-13-13-34-34-33-13 t032 en lang type, 16 repeats t032 26-23-23-13-23-31-29-17-31-29-17-25-17-25-16-28 t379 26-23-23-13-23-31-29-17- 25-17-25-16-28 t910 26-23-23-13-23-31-29-17- 25-16-28 t1214 26-23-23-13-23-31-29-17-31-29- 17-25-16-28
Test: Så meget sekvens skal vi bruge! 50bp paired reads ST22, t1041, dt10a overage 10x: ST22(3%), t1041, t7757, dt10a, dt7f, dt9g overage 20x: ST22(27%), t1041(66%), dt10a, dt7f, dt11g overage 30x: ST22(64%), t1041(83%), dt10a(83%), dt11g overage 50x: ST22(91%), t1041(96%), dt10a(94%), dt7f overage 75x: ST22(100%), t1041(99%), dt10a(100%)
Databehandling: Standard MRSA Diagnostik
MLST typer 3 fejl
Resultater for VRE
Resultater for VRE? V142 er en Staph epidermidis med meca Altså en MRSE og ikke en VRE. V40 er en kombination af to genomer: Et helt S. epidermidis plus 1.5 Mbp fra en Leuconostoc citreum.
Den Store Tabel: ~2725 sekvenser (22. maj 2014)
SNP Træer Enkeltbase Forskelle Mapning mod Reference Genom. Vælg Reference Genomet omhyggeligt. Brug det samme reference genom i hele træet. Undgå dårlige sekvenser (de ender midt i træet). Meget mere nøjsomt end de novo assembly.
Pas på dårlige sekvenser.
Pas på dårlige sekvenser. Se på afstandene
Uden dårlige sekvenser.
Databasen med vores Genomer
Primers til nuc. ~1300 Sekventerede Staph aureus isolater mest MRSA Et udtræk gav 1318 nuc sekvenser, heraf 63 forskellige.
Biocidresistens: qaca genet Af 1004 forskellige MRSA isolater havde 7 qaca/b. 66 MLST og 159 spa-typer. Fra 100 coagulase negative isolater fandtes 5 qaca/b
Tolv qaca sekvenser, 3 forskellige
MRSA Videns Center Established February 2009 Registrates and types MRSA isolates Consults and advices medical personnel Outbreak surveillance and infection follow up Tak for Opmærksomheden