Bioteknologi A Studentereksamen Af opgaverne 1 og 2 skal begge opgaver besvares. Af opgaverne 3 og 4 skal en og kun en af opgaverne besvares. frs111-btk/a-31052011 Tirsdag den 31. maj 2011 kl. 9.00-14.00
Opgave 1 Osteproduktion I osteproduktion bruges enzymet chymosin, som stammer fra celler i koens mavevæg. Chymosin katalyserer spaltning af bindingen mellem aminosyrerne phenylalanin og methionin i mælkeproteinet casein, se figur 1. Det bevirker, at mælkeproteinerne koagulerer 1, og derved dannes ost. Figur 1. Spaltningen af mælkeprotein katalyseret af chymosin. 1. Angiv hvilken enzymtype chymosin tilhører. 2. Giv forslag til en eksperimentel metode, hvor et enzyms aktivitet kan bestemmes. 1 Klumper sammen 2
Figur 2 viser resultatet af en laboratorieundersøgelse af spaltningen af mælkeprotein, katalyseret af chymosin. Begyndelseshastigheden (V 0 ) er bestemt ved forsøg med forskellige substratkoncentrationer [S]. Temperatur, ph og koncentrationen af chymosin er den samme i alle forsøg. Figur 2. a) Samhørende værdier for substratkoncentration og begyndelseshastigheden V 0 for chymosin og b) begyndelseshastigheden V 0 for chymosin som funktion af substratkoncentration. 3. Bestem V max og K m for chymosin ved hjælp af figur 2. Vedlagte bilag 1 kan benyttes. Opgaven fortsætter næste side. 3
Forskere har fundet et tilsvarende enzym i celler fra kamelens mavevæg, der ligeledes kan bruges i osteproduktion. Ved brug af kamel-chymosin får man mere ost ud af hver liter mælk. Produktionen af enzymet sker ved hjælp af genteknologi. mrna isoleres fra celler i kamelens mavevæg. Ved hjælp af cdna-metoden og gensplejsning er genet for kamel-chymosin blevet indsat i skimmelsvampen Aspergillus niger, se figur 3. Skimmelsvampen kan nu fremstille kamelchymosin. Figur 3. Isolering af mrna, oversættelse til cdna, indsættelse i plasmid og transformation af Aspergillus niger med plasmid. 4. Forklar funktionen af enzymet revers transkriptase i cdna-metoden, vist på figur 3. Genet for kamel-chymosin overføres til skimmelsvampen vha. et plasmid. For at skimmelsvampen kan udtrykke genet, er det nødvendige at indsætte flere DNA-sekvenser sammen med selve genet. Genet og de ekstra gensekvenser kaldes tilsammen et ekspressionssystem. 5. Redegør for hvilke øvrige gensekvenser der er behov for at indsætte i plasmidet sammen med chymosingenet. 4
Opgave 2 Vin, et bioteknologisk produkt Vinproduktion er en af de ældste bioteknologiske processer man kender. Nutidens vinproduktion er en nøje kontrolleret højteknologisk proces, som involverer flere forskellige typer mikroorganismer. Figur 1 viser en oversigt over nogle af vinproduktionens faser. Figur 1. Uddrag af vinproduktionens processer. 1. Angiv væsentlige forskelle mellem bakterier og gærceller. 2. Redegør for gæringsprocessen, der foregår i figur 1, punkt 2. Opgaven fortsætter næste side. 5
Ved produktion af rødvin dannes der foruden ethanol også forskellige organiske syrer. Nogle af disse syrer er uønskede fx. æblesyre (2-hydroxybutandisyre). For at omdanne æblesyre, og dermed højne kvaliteten af vinen, tilsættes mælkesyrebakterier, se figur 1, punkt 3. Bakterierne står for den malolaktiske gæring og omdanner æblesyre til mælkesyre (2-hydroxypropansyre), se figur 2. Figur 2. Udvalgte organiske syrer i vin. 3. Opskriv reaktionsskemaet, hvor æblesyre omdannes til mælkesyre. Ved en titrering af 25,0 ml mælkesyre med 0,100 M NaOH fås nedenstående titrerkurve, se figur 3. Figur 3. Titrering af 25,0 ml mælkesyreopløsning med 0,100 M NaOH. 4. Vis, at den formelle koncentration af mælkesyre er 0,08 M før tilsætningen af natriumhydroxid. Vedlagte bilag 2 kan benyttes. 5. Beregn ph i mælkesyreopløsningen før tilsætning af natriumhydroxid. 6
Ved forskning i den malolaktiske gæring, se figur 1, punkt 3, har man udviklet bakteriestammer, der kan vokse ved koncentrationer af ethanol, der er højere end 10 vol.%. Figur 3 viser målinger fra en vinproduktion, hvor man har anvendt de nye stammer af mælkesyrebakterier. Figur 4. Udviklingen i indholdet af ethanol, æblesyre, bakterier og gærceller under vinproduktionen. 6. Diskuter de forbedringer af vinproduktionen de nye mælkesyrestammer har medført. Inddrag figur 4. 7
Opgave 3 Lipider og carnitin transport defekt Lipider er livsnødvendige som næringsstoffer og indgår blandt andet i opbygning af cellemembraner. Triglycerider er hovedsageligt energigivende. Figur 1 viser et udsnit af fedtfordøjelsen i tarmen. 1. Forklar processerne a) og b) i figur 1. Figur 1. Udsnit af fedtfordøjelsen i tarmkanalen. Når celler nedbryder fedtsyrer, medvirker stoffet carnitin, se figur 2. Cellerne optager carnitin fra blodet. Carnitin transporteres gennem cellemembranen af særlige carnitintransportører. Figur 2. Carnitin. 2. Argumenter for at carnitin findes i to stereoisomere former. 3. Forklar hvorfor carnitin skal transporteres gennem cellemembranen vha. en transportør. Inddrag figur 2. Personer med mangel på carnitintransportører i cellemembranerne har nedsat evne til at producere energi ved fedtforbrænding. Sygdommen kaldes Carnitin Transport Defekt (CTD). 8
Personer med CTD udskiller carnitin gennem nyrerne, og har derfor et lavt indhold af carnitin i blodet. Man kan diagnosticere CTD ved at måle indholdet af carnitin i serum 2 fra en blodprøve. Carnitin danner ved tilsætning af et reagens en farvet forbindelse, der absorberer lys ved 412 nm. For at kunne bestemme koncentrationen af carnitin i en blodprøve udarbejdes først en standardkurve. Figur 3. Samhørende værdier for carnitinkoncentration og absorbans ved 412 nm. Kuvettebredde 1 cm. Normalværdierne for carnitin i blodet ligger mellem 24-64 μmol/l og hvis indholdet af carnitin i blodet er under 11 μmol/l, har man CTD. Man har taget en blodprøve på en patient. Prøvens serum testes for carnitin og viser en absorbans på 0,47. 4. Bestem koncentrationen af carnitin i blodprøven. Begrund på baggrund heraf om patienten er rask eller har CTD. Opgaven fortsætter næste side. 2 Blodserum er den flydende del af koaguleret blod 9
Sygdommen er arvelig og kan være dødelig. På Færøerne har 1 ud af 1300 personer CTD. I andre populationer er det 1 ud af 100.000, der har sygdommen. I en færøsk familie bestemmes blodets indhold af carnitin. Resultaterne vises i figur 4. Numrene henviser til personerne i figur 5. Figur 4. Målinger af blodets indhold af Carnitin fra en færøsk familie. Numrene I-2, II-4, III-4, III-5, IV-2 og IV-4 henviser til personerne i figur 5. Figur 5. Stamtræ for familie hvor sygdommen CTD optræder. 5. Redegør for mulige arvegange for Carnitin Transport Defekt med udgangspunkt i figur 4 og 5, idet du angiver mulige genotyper for I-1, I-2, II-3, IV-3 og IV-4. 10
Opgave 4 Bionedbrydelig emballage I industrien bruges kartofler til fremstilling af emballager som kan nedbrydes i naturen. Stivelsesbaseret emballage kan erstatte traditionelle emballager af plastik, som er fremstillet på grundlag af olie. Phosphoryleret stivelse udvinder man blandt andet fra kartofler og majs. Jo større mængde phosphat, der er bundet til stivelsen, des mere anvendelig er den til fremstilling af bionedbrydeligt emballage. Figur 2 viser et udsnit af et phosphoryleret stivelsesmolekyle. Figur 1. Kartofler. Figur 2. Udsnit af phosphoryleret stivelses-molekyle. 1. Beskriv den kemiske opbygning af phosphoryleret stivelse. Inddrag figur 2. Opgaven fortsætter næste side. 11
Stivelse fra kartofler har en relativ høj phosphoryleringsgrad 3. Det viser sig, at kartoffelplanten indeholder enzymet GWD, Glucan Water Dikinase, der katalyserer phosphoryleringen. Man har isoleret GWD-enzymet. For at bestemme aminosyrerækkefølgen af GWD, er det nødvendigt at nedbryde GWD til kortere peptidkæder ved hjælp af en specifik protease. Man har bestemt længden af disse peptidkæder ved hjælp af en såkaldt SDS-gelelektroforese Resultatet kan ses i figur 3. 4. Figur 3. SDS-gelelektroforese. Bane 1: Størrelsesmarkør, Bane 2-5: Prøver af GWD-opløsningen 0, 5, 15 og 60 minutter efter tilsætning af protease. Størrelsen af peptiderne er angivet i enheden kda (kilodalton). 1 Dalton = 1 unit (atommasseenhed) 2. Forklar hvorfor det er nødvendigt at behandle peptidkæderne med SDS for at kunne adskille dem efter størrelse. 3. Analyser resultaterne vist i figur 3. 3 Mængde af phosphat bundet til et stivelsesmolekyle 4 Det særlige ved SDS-gelelektroforese er, at man inden elektroforesen denaturerer peptiderne ved hjælp af et sæbelignende stof SDS. Det negativt ladede SDS binder sig regelmæssigt langs med det udfoldede peptid. Peptiderne kan derefter adskilles efter størrelse og sammenlignes med en størrelsesmarkør. 12
Efterfølgende analyse af aminosyresekvensen har vist rækkefølgen af de første syv aminosyrer i den stivelsesbindende del af enzymet. Figur 4. De 7 første aminosyrer af den stivelsesbindende del af GWD. 4. Angiv en mulig RNA-sekvens for aminosyrerækkefølgen vist i figur 4. For at kunne fremstille bioemballage ud fra planter med en lavere phosphoryleringsgrad end kartofler, benyttes en kemisk phosphoryleringsproces. Denne proces er meget energikrævende og ikke særlig miljøvenlig. Der forskes derfor i følgende bioteknologiske muligheder: a) Enzymatisk phosphorylering af stivelsen ved hjælp af GWD oprenset fra kartofler. b) Enzymatisk phosphorylering af stivelsen ved hjælp af kartoffel-gwd produceret af gensplejsede mikroorganismer. c) Transformation af andre plantearter med GWD-gen fra kartoffel. 5. Diskuter hvilken af de tre nævnte bioteknologiske metoder der vil være mest velegnet til at få produceret stivelse med en høj phosphoryleringsgrad. 13
Kilder: Opgave 1: http://www.kt.dtu.dk/om_instituttet/nyheder.aspx?guid=%7bdb104451-33b4-4ba7-9070-e94c5065eb0e%7d http://www.foodoflife.dk/artikler/tema/tema2010_biotek/ost_kamel.aspx Opgave 2: figur 5 Omtegnet efter Prahl Biolab A/S, http://www.fornaesvingaard.dk/malolaktiskgaering.html Opgave 3: http://www.sst.dk/~/media/sundhed%20og%20forebyggelse/boernesundhed/ctd_info_5mar10.ashx http://www.chm.bris.ac.uk/motm/carnitine/carnitine.htm http://edoc.unibas.ch/320/1/dissb_7322.pdf Opgave 4: Biochemical Journal 385/2005, s. 355-361. Foto: Per Schriver. 14
Undervisningsministeriet
Studentereksamen 2011 Bioteknologi A 31. maj 2011 Bilag 1 Ark nr. af i alt ark. Navn: Klasse: Skole: a) Samhørende værdier for substratkoncentration og begyndelseshastigheden V 0 for chymosin og b) begyndelseshastigheden V 0 for chymosin som funktion af substratkoncentration.
Studentereksamen 2011 Bioteknologi A 31. maj 2011 Bilag 2 Ark nr. af i alt ark. Navn: Klasse: Skole: Titrering af 25,0 ml mælkesyreopløsning med 0,100 M NaOH.