Human papillomavirus infection vaccine

Human papillomavirus infection vaccine Undersøgelse af mikrobiomet hos patienter, der har udviklet myalgisk encephalomyelitis som mulig bivirkning af HPV-vaccine Kristine Wichmann Madsen Allerød Gymnasium Forskerspirer 2016 SUND

Indholdsfortegnelse Indledning... 3 Problemformulering... 3 Afgrænsning af forskningsprojekt... 3 Statistiske overvejelser... 4 Metode... 5 Afføringsprøver... 5 16S rrna gensekvensering... 5 PCR opformering... 6 Forsøgsdesign... 6 Forsøgspersoner... 6 Udførelse af forsøg... 6 Tidsramme... 7 Budget... 8 Konklusion... 9 Tak... 9 Litteraturliste... 10 Referencer... 10 Bilag 2... 10 Bilag 3... 10 Forsidebillede... 11 Øvrig... 11 Bilag... 12 Bilag 1:... 12 Bilag 2:... 13 Bilag 3:... 14 Bilag 4:... 15

Indledning I Danmark får alle piger mellem 12 og 18 år tilbud om at få HPV-vaccinen, da den kan forebygge mange tilfælde af livmoderhalskræft. På trods af at WHO Global Advisory Committee on Vaccine Safety har udtalt, at der ikke er en sammenhæng mellem HPV-vaccinen og autoimmune sygdomme, har landets fem HPV-skadecentre fået over 2000 henvisninger af kvinder i alderen 12-35 år, som har mistænkt bivirkninger ved HPV-vaccinen. Mange af patienterne rapporterer bivirkninger, der påvirker dem i sådan en grad, at det afholder dem fra arbejde og skole. Deres symptomer er forholdsvis ensartede, og blandt de mest fremtrædende symptomer er hovedpine, mavesmerter, svimmelhed, tab af muskelkraft og udtalt træthed. I forskning foretaget ved synkopecentret på Frederiksberg Hospital, blev 90 % af de undersøgte patienter diagnosticeret med sygdommen myalgisk encephalomyelitis/kronisk trætheds syndrom (ME/CFS)[1]. ME/CFS er en sygdom, der rammer nervesystemet, immunsystemet og hormonsystemet, og desuden har den forbindelse til hjernen, mavetarmflora og mitokondrierne i muskelcellerne.[2] Da ME/CFS patienter eksisterede før vaccinen blev indført, og sygdommen ofte opstår uafhængigt af vaccination i mange tilfælde, er det uklart hvorvidt der er tale om en kausalitet mellem vaccine og symptomer. På trods af dette er det relevant, at undersøge de piger der rapporterer disse alvorlige symptomer med udgangspunkt i kendskab til ME/CFS. Der er relevant at kigge til den forskning, der er fortaget inden for ME/CFS. Forskning indenfor ME/CFS tyder på en mulig sammenhæng mellem tarmens mikrobiota og sygdommen [1]. Kunne der derfor findes nogle fællestræk, som f.eks. sammenfald i tarmflorasammensætningen blandt de piger med alvorlige bivirkninger af HPV-vaccinen? Jeg finder det interessant at undersøge, hvorfor individer reagerer så forskelligt selvom de udsættes for det samme. At nogle unge piger måske kan blive invalideret af en vaccine som HPV er selvfølgelig utrolig alvorligt men også svært at undersøge, da man ikke ved nok om den sygdom, de lider af. Ved at sammenligne tarmfloraen hos patienterne, kan man få en bedre forståelse for om der kunne være fællestræk ifht. sygdommen og de piger, der lider af den. Problemformulering Forskning inden for myalgisk encephalomyelitis peget på at ME/CFS-patienter har en mindre i diversitet af tarmbakterier. Min hypotese er, at man vil se, at tarmbakteriesammensætningen hos HPV-vaccinerede piger med bivirkninger adskiller sig fra den hos raske, når man undersøger for en række bakterier ved brug af 16S rrna sekvensering. Jeg analyserer for Bacteroidaceae, Enterobacteriaceae, Ruminococcaceae, Prevotellaceae og Lachnospiraceae, som er udvalgt på baggrund af tidligere forskning i mikrobiota hos ME/CFS-patienter[3](se bilag 1). Afgrænsning af forskningsprojekt

Det er vigtigt ikke at skabe mistillid til vaccinen. Med mit forskningsprojekt ønsker jeg at bidrage til at genoprette tilliden til HPV-vaccinen ved at tage patienterne seriøst og undersøge den sygdom, de lider af. Forskning indenfor dette felt er endnu minimal, og jeg kan ikke med mit forskningsprojekt vise om der er en kausal sammenhæng mellem vaccinen og symptomerne. Ved at undersøger hvorvidt patienternes mikrobiom adskiller sig fra en rask kontrolgruppe, kan jeg skabe en bedre forståelse for patofysiologien. Således kan jeg bidrage til udviklingen af bedre behandling af patienterne og til en forebyggelse af bivirkningerne. Jeg kunne også have undersøgt kausaliteten mellem vaccine og symptomer mere direkte ved at undersøge epidemiologisk, hvorvidt pigerne der er blevet syge efter HPV vaccination er blevet udsat for omstændigheder som spæd, som kan have indflydelse på tarmbakteriesammensætningen. Rent praktisk ville en sådan undersøgelse dog være vanskelig. Jeg har valgt ikke at gå denne vej, da der i forvejen er så lidt forskning indenfor feltet, at man risikere at generalisere og skabe større mistillid til vaccinen. I stedet vil jeg undersøge meget specifikt for at finde ud af om bestemte tarmbakterier er fremherskende hos HPV-vaccinerede der har ME/CFS lignende bivirkninger. Statistiske overvejelser Der er mange overvejelser der går forud for bestemmelse af sample size. Det afhænger af hvilken form for statistik, man har med at gøre. I dette tilfælde ønsker jeg at sammenligne gennemsnit for to grupper, da jeg ønsker at sammenligne en gennemsnitlig forekomst for hver af de fem bakterier. Ved beregning af sample size for to kontinuerlige variable, skal man kende standard afvigelsen (s) hos populationen. Standardafvigelsen er et mål for spredningen og beskriver, variationen i tarmbakteriesammensætning hos raske individer. Desuden skal man beslutte hvor stor en forskel man forventer at se (d), baseret på tidligere forskning. Derudover indgår konstanten C som afhænger af variablene α og β. Fejlmarginen er α og beskriver hvor stor en usikkerhed, man vil acceptere ved sin konklusion. I dette forskningsprojekt vil der arbejdes med en tosidig fejlmargin på 0,05, og jeg accepterer således en usikkerhed på 5%. Risikoen for at man ikke ser forskellen, hvis den er der kaldes for β og bestemmes til 0,20. Dette beskrives ved følgende formel: n = 1 + 2C ( s d ) 2 Når α=0,05 og 1-β=0,8 gælder det, at C=7,85. [4] For at beregne min sample size, benyttes resultater fra tidligere forskning indenfor mikrobiomet hos ME/CFS-patienter. I dette forsøg undersøges der for fem forskellige bakterier, men sample size er den samme i alle tilfælde. Til at bestemme sample size vælger jeg at benytte standardafvigelse og forventet forskel hos populationen bakterien Bacteroidaceae (bilag 1). Den forventede forskel er på 0,08 og spredningen er 0,213 og på baggrund af disse værdier beregnes sample size:

n = 1 + 2 7,85 ( 0,213 0,08 ) 2 = 112,39 Altså er det optimale antal patientforsøg 112, hvilket betyder at forskningsprojektet i alt vil omfatte 224 forsøgspersoner. Metode Min empiri i dette forskningsprojekt, er de data, der skal indsamles i løbet af forsøget. Til dette formål vil jeg indsamle afføringsprøver og analysere dem ved hjælp af 16S rrna sekvensering. Jeg vil på baggrund af dette være i stand til at drage nogle konklusioner ift. hvilke tarmbakterier der karakteriserer de patienter, der mistænker bivirkninger af HPVvaccinen. Afføringsprøver Vores afføring indeholder genetisk materiale fra de mange forskellige bakterier der lever i vores tarm. Man kan dermed ved hjælp af gensekvensering identificere de forskellige tarmbakterier og få indblik i tarmens mikrobiom. I dette forsøg indsamles afføringsprøver af forsøgspersoner i hjemmet. Der udtages 15 ml afføring til hver af prøverne, som opbevares ved -80 C indtil analysetidspunkt. Afføringsprøverne destrueres ved forskningsprojektets ophør. 16S rrna gensekvensering En metode som er vidt udbredt til at undersøge fylogeni og taksonomi af prøver taget fra miljøer med komplekse bakteriesammensætninger, er at ekstrahere og sammenligne bestemte former for RNA ved brug at molekylære redskaber. Ved denne metode benyttes 16S ribosomal RNA (16S rrna) til identificering og sammenligning af bakterier fundet i en given prøve. Ribosomer er de organeller der oversætter generne i cellerne ved at omdanne mrnastrengens nukleotidsekvenser til aminosyresekvenser. Generne for ribosomalt RNA har ændret sig meget lidt over de millioner af år, organismer har udviklet sig. De små forskelle der er i rrna et viser os, hvor tæt relaterede forskellige organismer er. Da 16S rrna genet kun består af 1542 nukleotider er det enkelt at kopiere og sekvensere. Efter cellemembranen er blevet brudt, kan man begynde at identificere de bakterier, som man ønsker at undersøge i prøven. I 16S rrna gener er det de nukleotider der findes i henholdsvis starten og slutningen af gensekvensen, som er unikke for en specifik organisme. For at kunne identificere denne organisme i en prøve benytter man sig af primere, der er komplementære til specifikke nukleotidsekvenser og dermed binder sig til dem. Således isoleres 16S rrna i prøven, og disse nukleotidsekvenser opformeres herefter ved brug af PCR. Man er således i stand til at sammenligne 16S rrna-sekvenserne fra prøven med den af andre kendte

bakterier og således bestemme hvilke bakterier, der er tilstede og i hvilken relativ mængde [5]. PCR opformering Polymerase Chain Reaction (PCR) er en metode til opformering af DNA, som foregår ved at bryde hydrogenbindingerne mellem baseparrene ved høj varme og dernæst sænke temperaturen hurtigt. Herefter tilsættes primere og binder sig til hver af de enkelte DNAstrenge, der er splittet af varmen. Primerne har en OH-ende som DNA-polymerasen kan binde sig til, og når temperaturen hæves binder polymerasen sig til OH-gruppen og replicerer DNAstykket i tilstedeværelsen af nukleotider. Ved hvert varmeskift sker der en ny cyklus og mængden af DNA fordobles. Forsøgsdesign Forsøgspersoner I mit forskningsprojekt ønsker jeg, at involvere 112 patienter som har oplevet alvorlige mulige bivirkninger ved HPV-vaccinen og en kontrolgruppe som skal bestå af 112 raske forsøgspersoner. Kontrolgruppen skal, ligesom patientgruppen, være kvinder i alderen 12-35 år, og skal være vaccineret med HPV-vaccinen og uden nogen form for bivirkninger. Patientgruppen rekrutteres ved hjælp af patientregister på Synkopecenteret på Frederiksberg Hospital. Patientgruppen kontaktes på mail og informeres om forsøget og dets formål, som er at undersøge patologien bag de symptomer patienterne rammes af og således nærme sig et behandlingstilbud. For at få fat i en matchende kontrolgruppe, rekrutteres der gennem opslag på sundhed.dk. Alle der responderer på opslaget, vil blive screenet ved en telefonsamtale med en sygeplejerske, for at sikre, at de har forstået forsøgets omfang, opfylder kriterierne og at de ikke lider af nogle kroniske lidelser. Når forsøgspersonerne er godkendt, tilsendes de et brev om fremmødetid samt et brev om deres rettigheder som forsøgspersoner (se bilag 2). Udførelse af forsøg Fase I: I denne fase fokuseres på udvælgelse af velegnede forsøgspersoner. Individer der responderer på opslag på sundhed.dk og på HPV-centrene ved Frederiksberg Hospital og Sjællands Universitetshospital i Roskilde, som ønsker at melde sig som forsøgspersoner screenes ved en telefonsamtale. Alle raske forsøgspersoner skal have modtaget HPV-vaccinen uden bivirkninger, og må ikke lide af andre former for kroniske lidelser. Dette sikres ved telefonsamtalen. Fase II: Forsøgspersonerne møder op til undersøgelse på hospitalet. Her skal forsøgspersonerne afgive informeret samtykke. Den forsøgsansvarlige sygeplejerske giver mundtlig information om projektet og forsøgspersonerne får herefter lidt betænkningstid inden de skal afgive deres samtykke (bilag 2).

Derudover udspørges de om tilstedeværelse af symptomer, vaccinationsstatus, højde, vægt, alder og hvorvidt de har fået antibiotika 1 i måneden op til prøven. Dernæst får forsøgspersonerne udleveret et opsamlingssæt og en grundig vejledning i, hvordan det gøres (se bilag 3). Der sættes 10 minutter af til hver forsøgsperson. Fase III: Når afføringsprøverne er blevet indsamlet og indsendt til laboratoriet skal bakterierne identificeres. De trin der er involveret i processen ses af nedenstående tabel [4]: Trin Procedure 1. DNA ekstraheres fra en 100 mg afføringsprøve ved brug af ekstraktionskittet PowerSoil-htp DNA isolation kit ifølge producentens instruktioner. 2. 16S rrna-gener opformeres ved brug af primerne 515F og 806R, der genkender den hypervariable region V4 på 16S rrna-genet. 3. PCR opformering forgår ved brug af 2.5X HotMasterMix, 10-100 ng DNA-skabelon og 0,05 µm af hver primer. PCR opformering: 1. Start med denaturation ved 94 C (3 min) 2. 25 cyklusser af: 45 sek denaturation: 94 C 60 sek annealing: 50 C 90 sek extention: 72 C 4. Afsluttende extention ved 72 C (10 min) 4. Sekvensering af arvematerialet udføres i samarbejde med DTU på maskinen Illumina MiSeq 2x250 bp. Fase IV: Statistisk behandling af data. Her skal resultaterne af prøverne sammenlignes. For hver forsøgsperson laves et diagram over fordelingen af de forskellige bakterier i procent (bilag 1). Frekvensen af de forskellige bakterier bliver opgjort, og tilsammen udgør de 100%. Gennemsnittet for andelen af hver bakterie findes for henholdsvis kontrolgruppen og patientgruppen og det undersøges, hvorvidt der er en statistisk signifikant forskel på de to grupper. Tidsramme Forløb Inklusionsfase Informationssamtaler samt indlevering af afføringsprøver En måned Tre uger Varighed 1 Hvis forsøgspersonerne har fået antibiotika kort forinden prøvetagningen, skal de ekskluderes fra forsøget, da brugen af antibiotika har stor indvirkning på voksne menneskers mikrobiota.

Databehandling og sammenskrivning af resultater Seks måneder efter igangsættelse af forskningsprojekt Budget Nedenstående budgetskabelon tager udgangspunkt i mine beregninger af sample size. Udgiftspost Noter Beløb Løn til sygeplejerske 10 minutter sættes af til hver af de 224 forsøgspersoner. Sygeplejerskens timeløn: 250 kr/timen. Løn til laborant Løn til statistiker Sekvensering I alt Der samarbejdes med en laborant ved DTU, som forventes at kunne udføre analyse af prøverne på 10 arbejdstimer. Laborantens timeløn: 250 kr/timen. Statistisk behandling af data forventes at tage 3 timer. Statistikerens timeløn: 400 kr/timen. Sekvensering af 16S rrna på maskinen Illumina MiSeq 2x250 bp. Sekventeringen koster 180 kr/prøve. (37 timer)*(250 kr/timen) = 9.250 kr (10 timer)*(250 kr/timen)= 2.500 kr (3 timer)*(400 kr/timen)= 1.200 kr (180 kr/prøve)*(224 prøver)= 40.320 kr 53.270 kr Som det fremkommer af ovenstående budget, skal jeg bruge 53.270 kr. for at kunne gennemføre mit forskningsprojekt optimalt. I denne konkurrence bliver jeg dog kun bevilliget 20.000 kr. til udførelsen af mit projekt. Med 20.000 kr. til rådighed er det kun muligt at udføre forsøget på ca. 80 forsøgspersoner (se bilag 4). Altså en patientgruppe på 40 personer og en kontrolgruppe på 40 personer. For at kunne udføre mit projekt, vil jeg forsøge at søge 33.270 kr. gennem fonde til udførelsen af mit projekt. Disse penge vil Louise Brinth, forsker ved Synkopecenteret på Frederiksberg Hospital hjælpe mig med at søge. Hun vil formidle kontakt til patientforeningen MEforeningen, som har erfaring med at søge fondsmidler til forskning i ME/CFS. Et tænkeligt sted at søge midler er hos lægemiddelstyrelsen, da folketinget har afsat 7 mio. kr. til udførelse af forskningsprojekter indenfor bivirkninger ved HPV-vaccinen i årene 2016-2018.[6] Hvis ikke det lykkes mig at få bevilliget pengene til mit forskningsprojekt, vil jeg udføre mit projekt med 80 forsøgspersoner. Det vil selvfølgelig have konsekvenser for sandsynligheden for at få klare resultater. Jeg vælger dog at udføre projektet, selv hvis jeg kun har 20.000 kr. tilgængelig, da jeg mener at min forskning alligevel kan være relevant og fungere som pilotforsøg for fremtidig forskning.

Konklusion Med dette forskningsprojekt kan jeg være med til at kaste lys over et ellers forholdsvis uberørt forskningsområde. Hvis man på baggrund af denne undersøgelse kan se, at patienter der har rapporteret bivirkninger ved HPV-vaccinen mikrobielt adskiller sig fra den raske kontrolgruppe, kan det give håb for behandlingsmuligheder for de kvinder der er ramt af symptomerne. Hvis denne patientgruppe har en anderledes og evt. mindre divers tarmbakteriesammensætning, kan man begynde at udvikle behandling, som kan forøge livskvaliteten hos patienterne og i sidste ende kurere sygdommen. Man har tidligere haft held med at behandle folk med forskellige lidelser med fæcestransplantationer. I en fæcestransplantation overføres afføring fra et raskt individ, som ændrer bakteriesammensætningen. Desuden kan positive forskningsresultaterne fra dette forsøg give basis for en mere målrettet undersøgelse af en kausal sammenhæng mellem vaccinen og symptomerne. Man kan f.eks. gå epidemiologisk til værks og begynde et større forskningsprojekt, hvor man belyser hvorvidt disse forskelle i mikrobiota er årsag til udviklingen af symptomerne eller blot er en del af de symptomer, som patienterne har til fælles. Det er kun en lille del af ME/CFS-tilfælde der er forbundet med HPV-vaccinen. Langt den største del af tilfældene synes at udløses af virusinfektioner som Epstein-Barr, Enterovirus og Borrelia.[7][8] Det kan således tænkes, at symptomerne ikke er en direkte virkning af vaccinen, men at patienterne i forvejen har været disponeret for sygdommen, og at vaccinen bliver en udløsende faktor.[9] Hvis man er i stand til at identificere de personer, der er i risiko for at udvikle ME/CFS, kan man undtage dem fra vaccinen og dermed genoprette tilliden til HPV- vaccinen og gøre brugen af den mere sikker. Tak Først og fremmest tak til forsker Louise Schouborg Brinth og overlæge Jesper Mehlsen, ved Synkopecenteret på Frederiksberg Hospital for deres hjælp og vilje til at dele ud af deres erfaring. Derudover skylder jeg Tine Rask Licht, leder af afdeling for fødevaremikrobiologi hos DTU, en stor tak. Hun var til stor hjælp i forhold til at indskærpe mit fokus og løbende hjælpe mig med problemer der opstod undervejs. Derudover ønsker jeg at takke mine forældre for deres støtte - især min mor for at give mig indblik i en hverdag som ME/CFS-patient og bruge sin sparsomme energi på at hjælpe mig. Jeg skylder desuden en tak til Louise Lundbæk og Line Bach fra Allerød Gymnasium for vejledning og råd.

Litteraturliste Referencer [1] L. Brinth, K. Pors, A.G. Hoppe, I. Badreldin, J. Mehlsen Is Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis a Relevant Diagnosis in Patients with Suspected Side Effects to Human Papilloma Virus Vaccine? International Journal of Vaccines and Vaccination, (4) (2015) [2] http://me-foreningen.dk/om-me/ Om ME Ukendt, me-foreningen.dk, besøgt 17/8/2016 [3] L. Giloteaux, J.K. Goodrich, W.A. Walters, S.M. Levine, R.E. Ley, M.R. Hanson Reduced diversity and altered composition of the gut microbiome in individuals with myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome Microbiome, 4 (1) (2016), p. 1 [4] P. Kadam, S. Bahlerao Sample size calculation International Journal of Ayurveda Research, 1 (1) (2010), p. 55-57 [5] http://www.microbeworld.org/careers/tools-of-the-trade/genetic-tools-andtechniques/16s-rrna 16S rrna Ukendt, microbeworld.org, besøgt 1/10/2016 [6] https://laegemiddelstyrelsen.dk/da/bivirkninger/bivirkninger-ved-medicin/hpvvaccination/pulje-til-forskning Forskning i mulige bivirkninger ved HPV-vaccination H. Harder, laegemiddelstyrelsen.dk, besøgt 28/10/2016 [7] J. Treib, M.T. Grauer, A. Haass, J. Langenbach, G. Holzer, R. Woessner Chronic fatigue syndrome in patients with Lyme borreliosis European Neurology, 43 (2) (2000), p. 107-109 [8] J.K.S. Chia The role of enterovirus in chronic fatigue syndrome Journal of clinical pathology, 58 (11) (2005), p. 1126 1132 [9] http://patient.info/health/chronic-fatigue-syndromemyalgic-encephalomyelitis-me Chronic fatigue syndrome/myalgic Encephalomyelitis (ME) T. Kenny, patient.info, besøgt 15/9/2016 Bilag 2 De videnskabsetiske komiteer for region hovedstaden Forsøgspersonersrettigheder i et sundhedsvidenskabligt forskningsprojekt 2014 Bilag 3 Region Syddanmark Medicinsk Center

Patientvejledning Afføringsprøve Sygehus Sønderjylland, udarbejdet i 1997, revideret i 2016 Forsidebillede https://commonfund.nih.gov/sites/default/files/hmp%20ibd%20image.jpg A Novel Approach to Gene Sequencing Reveals Hidden Depths in Microbial Diversity commonfund.nih.gov, besøgt: 25/10/2016 Øvrig M. Frémont, D. Coomans, S. Massart, K.D. Mielier High-throughput 16S rrna gene sequencing reveals alterations of intestinal microbiota in myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome patients Anaerobe, 22 (8) (2013), p. 50-56 S.E. Lakhan, A. Kirchgessner Gut inflammation in chronic fatigue syndrome Nutrition and Metabolism, 7 (1) (2010), p. 79 K. Donegan, R. Beau-Lejdstrom, B. King, S. Seabroke, A. Thomson, P. Bryan Bivalent human papillomavirus vaccine and the risk of fatigue syndromes in girls in the UK Vaccine, 31 (43) (2013), p. 4961 4967 L. Tomljenovic, S. Colafrancesco, C. Perricone, Y. Shoenfeld Postural Orthostatic Tachycardia With Chronic Fatigue After HPV Vaccination as Part of the Autoimmune/Auto-inflammatory Syndrome Induced by Adjuvants -Case Report and Literature Review Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports, 2 (1) (2014), p. 1 L.J. Jara, E. Izquierdo, G. Medina Is the immune neuroendocrine system the connection between epipharyngitis and chronic fatigue syndrome induced by HPV vaccine? Immunologic Research, () (2016), p. 1-3 C. Shepherd Is CFS Linked to Vaccinations? International Journal of Vaccines and Vaccination,? (?) (2009) J.M. Janda, S.L. Abbott 16S rrna Gene Sequencing for Bacterial Identification in the Diagnostic Laboratory: Pluses, Perils, and Pitfalls Journal of Clinical Microbiology, 45 (9) (2007), p. 2761 2764 T.J. Borody, A. Nowak, S. Finlayson The GI microbiome and its role in Chronic Fatigue Syndrome: A summary of bacteriotherapy Journal of the Australasian College of Nutritional and Environmental Medicine, 31 (3) (2012), p. 3-8

Bilag Bilag 1: Udvælgelse af bakterier der undersøges for i dette projekt blev besluttet på baggrund af forskning lavet ved Cornell University på 48 ME/CFS-patienter og 39 kontroller. Af nedenstående graf kan gruppens resultater læses, og jeg har her fundet inspiration til min undersøgelse. Af illustrationen fremgår det, at det kan være interessant at kigge på bestemte bakteriefamilier, da forekomsten af disse hos ME/CFS-patiener adskiller sig fra kontrolgruppen. De bakteriefamilier hvor ME/CFS-patienterne adskiller sig mest fra den raske kontrolgruppe er Bacteroidaceae, Enterobacteriaceae, Ruminococcaceae, Prevotellaceae og Lachnospiraceae. I mit forskningsprojekt undersøger jeg derfor netop disse bakteriefamilier for at se, om den samme forskel kan ses hos de HPV-vaccinebivirkningsramte i et forsøg med 224 forsøgspersoner.

Bilag 2:

Bilag 3:

Bilag 4: Udregning af budget ved 80 forsøgspersoner: Udgiftspost Noter Beløb Løn til sygeplejerske 10 minutter sættes af til hver af de 80 forsøgspersoner. Sygeplejersken får en timeløn på 250 kr/timen. Løn til laborant Løn til statistiker Sekvensering I alt Der samarbejdes med en laborant ved DTU, som forventes at kunne udføre analyse af prøverne på 5 arbejdstimer. Laboranten har primere, PCR-mix og PowerSoil-htp DNA isolation kit til rådighed. Laboranten får en timeløn på 250 kr/timen. Statistisk behandling af data forventes at tage 2 timer. Statistikeren får en timeløn på 400 kr/timen. Sekvensering af 16S rrna på maskinen Illumina MiSeq 2x250 bp. Sekvenseringen koster 180 kr/prøve. (13 timer)*(250 kr/timen) = 3.250 kr (5 timer)*(250 kr/timen)= 1.250 kr (1,5 timer)*(400 kr/timen)= 800 kr (180 kr/prøve)*(80 prøver)= 14.400 kr 19.500 kr