Opgave 1 Denne opgave omhandler osteoblast differentiering. Osteoblast celler er involveret i opbygning af knoglevæv. Osteoblast celler dannes ud fra såkaldte calvarial celler. For at forstå det molekylære grundlag for osteoblast differentiering ønskes identificeret gener, der er aktive under osteoblast differentiering men inaktive under almindelig proliferativ vækst. Til dette formål er de i Tabel 1 beskrevne komponenter til rådighed. FRCC celler er føtale rotte calvariale celler. Differentieringen af disse celler til osteoblast celler kan kontrolleres in vitro. Det er således muligt in vitro at holde cellerne i en normal proliferativ fase og dernæst inducere dem til at differentiere til osteoblast celler. Proliferative FRCC celler FRCC celler under differentiering til osteoblaster Kit til oprensning af polya mrna poly-dt-a primer 5 AAGCTTTTTTTTTTTTA 3 samling af forskellige 13 nukleotider lange 40 forskellige 13 merer DNA primere revers transkriptase termostabil DNA polymerase nukleotider datp, dctp, dgtp, dttp, [α 32 P]-dCTP urinstofholdig polyacrylamid gel røntgen film Tabel 1: Komponenter der kan anvendes til at identificere gener, der kun er udtrykt under osteoblast differentiering. Den understregede sekvens i poly-dt-a primeren er et HindIII site. [α 32 P]-dCTP er deoxycytosintrifosfat, der er mærket med 32 P i α-positionen. Spm A: Beskriv i tekst og tegning, hvorledes de i Tabel 1 angivne komponenter kan anvendes til at isolere cdna fragmenter der repræsenterer gener, der kun er udtrykt under osteoblast differentiering. 1
Spm B: Beskriv i tekst og tegning en alternativ teknik til isolering af cdna repræsenterende gener, der kun er udtrykt under osteoblast differentiering. Resultatet af forsøget med de i Tabel 1 angivne komponenter er blandt andet identifikation af et 313bp cdna fragment. Dette fragment klones i et plasmid og sekventeres. Spm. C: Design et forsøg, der kan verificere, at dette cdna repræsenterer et gen, der kun er udtrykt under osteoblast differentiering Ud fra nukleotidsekvensen af det 313bp lange cdna fragment ønskes isoleret en fuldlængde cdna klon. Spm D: I tekst og tegning ønskes beskrevet to teknikker til fremskaffelse af den fuldlængde cdna klon, som det 313 bp lange fragment er en del af. Nukleotidsekvensen af fuldlængde cdna og primærstrukturen af det tilhørende protein er vist i Figur 1. Proteinet benævnes AJ18-S. Spm. E: Hvilken transkriptionsfaktorfamilie er det ud fra sekvensen i Figur 1 mest sandsynlig, at AJ18-S proteinet tilhører? 2
Figur 1: Nukleotidsekvensen af det klonede cdna og primærstrukturen af det fra cdnaet translaterede AJ18-S protein. Elleve aminosyresekvenser karakteristiske for en bestemt familie af transkriptionsfaktorer er understregede med fuldt optrukne linjer. Den første af disse sekvenser starter således ved aminosyre 220. For at undersøge om AJ18-S er i stand til at binde DNA og bestemme hvilken nukleotidsekvens, der genkendes af proteinet, ønskes der fremstillet rekombinant fusionsprotein mellem AJ18-S protein og seks histidiner. De seks histidiner skal sidde i den N-terminale del af AJ18-S. 3
bla Den N-terminale del af fusionsproteinet skal således have sekvensen Met-His-His-His-His-His-His- Met-Ala-Val-Asp-Leu-Leu-o.s.v (jævnfør sekvensen i Figur 1). I Figur 2 er vist strukturen af plasmid Express, der skal anvendes til produktion af det rekombinante fusionsprotein. Endvidere er nukleotidsekvensen af to områder af plasmidet vist. Det vides, at ingen af de i Figur 2 viste restriktionsenzymer har genkendelsessites i det DNA fragment, der koder for 6His-AJ18-S proteinfusionen. EcoRI 5' CACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAATTAAC 3' EcoRI HindIII 5' GCCAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGAC 3' HindIII SD P IPTG Ori Figur 2: Struktur af plasmid Express. P IPTG, en IPTG inducerbar promotor; SD, Shine-Dalgarno sekvens; Ori, replikationsorigin; Bla, β-lactamase gen der giver ampicillin resistens. Endvidere er vist nukleotidsekvensen omkring EcoRI og HindIII sitene. Genkendelsessekvenserne for de to enzymer er understregede. Spm. F: Beskriv i tekst og tegning hvorledes du vil generere et DNA fragment, der koder for den ønskede His6-AJ18-S fusion og som kan klones i plasmid Express. Sekvenser og orientering af eventuelt anvendte primere skal angives. 4
Figur 3 viser en Coomassie farvning af SDS-PAGE separeret total celleprotein fra E. coli indeholdende plasmidet, der koder for His6-AJ18-S fusionen før og efter induction med IPTG. Endvidere er vist et western blot af protein isoleret efter IPTG induktion fremkaldt med henholdsvis anti-aj18-s-antistof og anti-histidin-antistof. Figur 3: SDS-PAGE separeret E. coli protein isoleret før (NI) eller efter (I) induktion med IPTG. Western blot af lane (I) fremkaldt med anti-aj18-s-antistof (AJ) eller anti-histidin-antistof (His). Tallene til venstre angiver, hvortil proteiner med den angivne molekylvægt (målt i kda) er migreret. Spm. G: Hvad viser data i Figur 3? Giv en begrundet forklaring på tilstedeværelsen af to dominerende bånd i lane I og i de to western blots. For at bestemme den DNA sekvens som AJ18-S genkender blev komponenterne i Tabel 2 anvendt. De enkelte trin i selve protokollen er beskrevet i Tabel 3. 5
En blanding af TDA primere 5 CGCTCTAGAACTAGTGGATC-N12- ATCGATACCGTCGACCTCGA 3 KS primer 5 TCGAGGTCGACGGTATCGAT 3 SK primer 5 CGCTCTAGAACTAGTGGATC 3 Termoresistens DNA polymerase dntp datp, dctp, dgtp, dttp, [α- 32 P]-dCTP T4 DNA ligase pbluescript kloningsvektor SDS-PAGE geler Nylonmembraner Proteinekstrakt fra E. coli der producerer AJ18- S protein Tabel 2: Komponenter der kan bruges til at bestemme nukleotid-genkendelses-sekvensen for et DNA bindende protein. N, repræsenterer et af de 4 deoxynukleotider der indgår i DNA. TDA primeren består således af en blanding af 4 12 oligonukleotider. [α- 32 P]-dCTP, deoxycytosin-trifosfat mærket med 32 P i α-positionen. 6
1) PCR med primer TDA og primer KS i tilstedeværelse af [α- 32 P]-dCTP (primer TDA fungerer også som template) 2) SDS-PAGE separation af proteinekstrakt fra E. coli der producerer AJ18-S efterfulgt af overførsel til nylonmembran og renaturering af det overførte protein i tilstedeværelse af zinkioner. 3) PCR produktet fra punkt et hybridiseres til membranen fra punkt to. Membranen vaskes og bundet DNA visualiseres ved autoradiografi. 4) Det hybridiserede DNA elueres fra membranen og amplificeres med PCR ved hjælp af primer KS og SK. 5) Det amplificerede DNA fra punkt fire hybridiseres til en nylonmembran fremstillet som angivet i punkt to. Membranen vaskes og bundet DNA visualiseres ved autoradiografi. 6) Punkt fire og fem gentages tre gange. 7) Det DNA der er bundet efter sidste hybridisering elueres fra membranen, PCR amplificeres med primer KS og SK, klones i en Bluescript vektor og nukleotidsekvensen bestemmes. Tabel 3: De enkelte trin i en protokol til bestemmelse af den nukleotidsekvens, der genkendes af AJ18-S proteinet. Spm. H: Beskriv, hvorledes den i Tabel 3 viste protokol kan anvendes til at bestemme den nukleotidsekvens, der genkendes af AJ18-S proteinet. Den identificerede nukleotidsekvens viser sig at have stor homologi til en sekvens kaldet OSE2, som genkendes af transkriptionsfaktor Runx2 (også kaldet Osf2). Runx2 mrna og AJ18-S mrna er tilstede på samme tidspunkt under osteoblast differentieringen. For at undersøge samspillet mellem AJ18-S og Runx2 proteinerne in vivo blev der fremstillet de i Figur 4 viste plasmider. 7
TATA p6ose2-luc o o o o o o luciferase prunx2 P CMV Runx2 paj18-s P CMV AJ18 psv-β-gal P SV lacz Figur 4: Strukturen af den relevante del af plasmiderne p6ose2-luc, prunx2, paj18-s og psv-β-gal. O, angiver én OSE2 sekvens; TATA, TATA box; P CMV, konstitutiv promotor fra cytomegalovirus; P SV, konstitutiv promotor fra Simian virus. En konstant mængde p6ose2-luc, prunx2 og psv-β-gal blev transficeret i en fibroblast cellelinje C3H10T1/2 sammen med stigende mængder (0,05 1μg) paj18-s plasmid. Luciferase og β-galaktosidase aktiviteterne blev bestemt 48 timer efter transfektion. Resultaterne er vist i Figur 5. 8
Figur 5: Resultaterne af transfektion af C3H10T1/2 cellelinjen med p6ose2-luc, prunx2, psv-β-gal og stigende mængde (0,05 1μg) paj18-s plasmid. +/- angiver, hvorvidt der er transficeret med plasmid eller ej. Relative luciferase activity betyder, at aktiviteterne er normaliserede til den aktivitet, der opnås efter transfektion med p6oseluc og psv-β-gal efter korrektion for transfektionseffektivitet ud fra β-galaktosidaseaktiviteterne. Spm I: Hvad viser Figur 5 om AJ18-S og Runx2 proteinernes aktivitet? 9
Opgave 2 gc1qr er betegnelsen for et protein, der findes i alle mammale celler. Proteinet interagerer med en lang række forskellige proteiner. Der er isoleret både en human cdna klon og en human genom klon for gc1qr. Spm. A: Beskriv hvorledes du experimentelt kan fastlægge intron-exon strukturen af gc1qr genet. Spm. B: Beskriv i tekst og tegning en metode der kan anvendes til at isolere cdna kloner, der koder for protein, der kan interagere med det humane gc1qr protein. Sekvensen af 1374 nukleotider opstrøms for ATG kodon i gc1qr genet blev analyseret ved hjælp af et computerprogram for at finde potentielle TATA boxe og bindingssites for transkriptionsfaktorer. Resultatet af analysen er vist i Figur 1. 10
G1A2 Figur 1: Computeranalyse af nukleotidsekvensen af 1374 nukleotider opstrøms for ATG kodon i gc1qr genet. Positionen af potentielle TATA boxe og transkriptionsfaktorbindingssites er angivet. De første to kodons er angivet med fed skrift. Lokalisering af den komplementære sekvens til primer G1A2 brugt til primerekstension analyse og DNA sekventering er angivet. 11
For at undersøge hvilke promotorelementer der er af betydning for promotor-aktivitet, blev der udført primerekstension analyse med den i Figur 1 viste primer G1A2. Resultatet af analysen er vist i Figur 2. G A T C P Figur 2: Primer ekstension analyse på human gc1qr mrna. G,A,T,C angiver resultatet af en sekvensreaktion på en human gc1qr genom klon med primer G1A2. P, angiver resultatet af primerekstension analyse på human gc1qr mrna med primer G1A2. Spm. C: Diskuter ud fra data i Figur 2 hvilke af de i Figur 1 forudsagte promotorelementer, der kan have betydning for gc1qr promotoraktivitet? For at karakterisere promotoren yderligere blev der fremstillet de i Figur 3 viste promotorfusioner. Plasmiderne blev co-transficeret med en vektor til korrektion for transfektionseffektivitet i en human cellelinje. De resulterende luciferase aktiviteter er vist i Figur 3. 12
Figur 3: Strukturen af promotor-luciferase fusioner samt de tilhørende luciferase aktiviteter opnået 48 timer efter transfektion af en human cellelinje. Luciferaseaktiviteterne er normaliserede til den aktivitet, der opnås efter transfektion med den anvendte luciferase vektor uden noget gc1qr promotor fragment (Basic). Fuldt optrukne linjer angiver det DNA fragment, der er tilstede i den enkelte fusioner. Pile angiver orienteringen af det indsatte promotor fragment. D.v.s., at promotorfragmentet i ERES1 er i modsat orientering i forhold til promotorfragmentet i ERES2. Alle resultater er normaliserede til samme transfektionseffektivitet. Spm. D: Hvad viser data i Figur 3 omkring aktiviteten af gc1qr promotoren? Spm. E: Begrund ud fra ovenstående analyser om du mener, der er noget specielt ved gc1qr promotoren. 13