Hurtig karakterisering af bakterier i renseanlæg gennem DNA sekventering spændende resultater og nye perspektiver inden for procesdesign og driftsoptimering Mads Albertsen Poul Larsen, Marta Nierychlo, Søren Michael Karst, Rasmus Hansen Kirkegaard & Per Halkjær Nielsen CENTER FOR MICROBIAL COMMUNITIES Det er bakterierne der renser vandet Kloak system Aalborg Vest Renseanlæg 1
Bakterierne har specialiserede egenskaber Bakterierne har specialiserede egenskaber Accumulibacter Funktion P-fjernelse Selektion Anaerob tank 2
Bakterierne har specialiserede egenskaber Accumulibacter Nitrospira Funktion P-fjernelse Selektion Anaerob tank Funktion N-fjernelse Selektion Aerob tank Lav COD Nogle bakterier skaber problemer! 3
Nogle bakterier skaber problemer! Microthrix Håndtering Tilsæt PAX Nogle bakterier skaber problemer! Microthrix Håndtering Tilsæt PAX Chloroflexi Håndtering Ukendt 4
Hvordan identificerer vi bakterierne? Dyrkning og isolering Få bakterier er nemme at dyrke Ofte ikke de rigtige der bliver dyrket Langsomt og arbejdskrævende Hvordan identificerer vi bakterierne? Dyrkning og isolering Få bakterier er nemme at dyrke Ofte ikke de rigtige der bliver dyrket Langsomt og arbejdskrævende FISH (Fluorescence in situ hybridization) Specifikke genprober tilsættes til aktivt slam og bakterierne kan visualiseres og tælles vha. mikroskopi Ingen dyrkning krævet Langsomt og arbejdskrævende Man finder kun det man leder efter 5
Hvordan identificerer vi bakterierne? Dyrkning og isolering Få bakterier er nemme at dyrke Ofte ikke de rigtige der bliver dyrket Langsomt og arbejdskrævende FISH (Fluorescence in situ hybridization) Specifikke genprober tilsættes til aktivt slam og bakterierne kan visualiseres og tælles vha. mikroskopi Ingen dyrkning krævet Langsomt og arbejdskrævende Man finder kun det man leder efter DNA Sekventering (16S rrna amplicon) Ingen dyrkning krævet Ingen mikroskopi krævet Alle bakterier Hurtigt og billigt (I forhold til de andre teknikker) 16S rrna amplicon sekventering DNA Genom Arvemateriale 6
16S rrna amplicon sekventering DNA Gen Kan kode for et enzyme der f.eks. kan nedbryde fedt. (Bakterier har 3000-5000 gener) Genom Arvemateriale 16S rrna amplicon sekventering DNA Gen Kan kode for et enzyme der f.eks. kan nedbryde fedt. (Bakterier har 3000-5000 gener) Genom Arvemateriale 16S rrna Amplicon sekventering 16S rrna Bruges som et fingeraftryk. Unikt for forskellige bakterier. 7
Pris pr. humant genome (DKK) 20-11-2014 Det er blevet billigt at sekventere DNA! 600.000.000 60.000.000 Det første humane genom færdigt DNA-sekvenserings revolutionen starter 6.000.000 600.000 60.000 6.000 Det magiske 1000$ genom er en realitet Resultatet af 16S rrna amplicon sekventering Liste med hvilke bakterier der er i prøven og deres hyppighed Navn % Accumulibacter Nitrospira Tetrasphaera Chloroflexi Microthrix Thiothrix Nitrotoga Streptococcus Competibacter Defluviicoccus Brachythrix Gordonia B3-65 1000 andre 1 2 10 5 15 1 1 2 0 0 3 5 1 8
Den mikrobielle database for renseanlæg Siden 2006 56 renseanlæg (2-32 prøver) 575 prøver Design Operationel data Mikroskopi FISH 16S rrna amplicon sequencing www.midasfieldguide.org En stor del af bakterierne er de samme! 3 grupper af bakterier Fælles bakterier Tilstede i alle anlæg Altid hyppige 100-120 forskellige bakterier Udgør ca. 70% af biomassen 9
En stor del af bakterierne er de samme! 3 grupper af bakterier Fælles bakterier Tilstede i alle anlæg Altid hyppige 100-120 forskellige bakterier Udgør ca. 70% af biomassen Transiente bakterier Tilstede i nogle anlæg Nogle gange hyppige 20-30 bakterier Udgør 0-30 % af biomassen Fx. nogle trade En stor del af bakterierne er de samme! 3 grupper af bakterier Fælles bakterier Tilstede i alle anlæg Altid hyppige 100-120 forskellige bakterier Udgør ca. 70% af biomassen Transiente bakterier Tilstede i nogle anlæg Nogle gange hyppige 20-30 bakterier Udgør 0-30 % af biomassen Fx. nogle trade Lavfrekvente bakterier Tilstede i nogle eller alle anlæg Aldrig hyppige 2000-3000 bakterier Udgør < 10% af biomassen F.eks. bakterier fra indløbet 10
Vi kan spørge dataene om alt! Hvad er de største forskelle mellem prøverne? Bag hvert punkt er en lang liste med bakterier 11
Hvad er de største forskelle mellem prøverne? Punkter tæt på hinanden = Ens bakteriesammensætning Bag hvert punkt er en lang liste med bakterier Hvad er de største forskelle mellem prøverne? Punkter tæt på hinanden = Ens bakteriesammensætning Bag hvert punkt er en lang liste med bakterier Punkter langt fra hinanden = Forskellig bakteriesammensætning 12
Renseanlægene er ens men også unikke! Spørgsmål Hvad er de største forskelle mellem prøverne? Du er hvad du spiser! Spørgsmål Hvad er de største forskelle mellem prøverne? Industri Blandet Husholdning 13
Hvilke bakterier ændrer sig mest? Tetrasphaera Spørgsmål Hvad er de største forskelle mellem prøverne? Competibacter Defluviicoccus Caldilinea Microthrix Industri Blandet Husholdning Trichococcus Spørg om alt! Spørgsmål Hvad er de største forskelle mellem prøverne? Spørgsmål Hvad gør Aalborg Vest renseanlæg unikt? 14
Spørg om alt! Spørgsmål Hvad er de største forskelle mellem prøverne? Spørgsmål Hvad gør Aalborg Vest renseanlæg unikt? Spørg om alt! Spørgsmål Hvad er de største forskelle mellem prøverne? Brachythrix OTU_186 Sphingopyxis Microthrix Spørgsmål Hvad gør Aalborg Vest renseanlæg unikt? 15
Hvad kan det bruges til? Source tracking! Hvad jeg gerne vil spørge dataene om Hvilke bakterier korrelerer med problemer? 16
Tidsserier Fredericia centralrenseanlæg 2006-2014 Reduktion og stabilisering af udledning fra DONG 17
Vi kan se forskel på prøver fra samme uge June 6 th July 30 th Competibacter June 10 th Streptococcus TM7 DONG udledning 30% reduceret Ingen June 25 th Hvilke bakterier ændrer sig? Hyppighed (%) DONG udledning 30% reduceret Ingen 18
Opsummering 16S rrna amplicon sekventering Billig og hurtig (ca. 1000 kr / 3 dage pr. prøve) Komplet artssammensætning Anvendelsesområder (Nu) Alt hvad der har været lavet med FISH Nitrospira (NOB) Microthrix (Tråd) Accumulibacter (PAO) (Sygdomsfremkaldende bakterier, etc ) Troubleshooting Hvornår begyndte mikrobiologien at ændre sig? Hvilke ændringer har en effekt på bakterierne? Design? Styring? Indløb (effekt af nye industrier)? Er det mikrobiologien der har ændret sig eller er problemet andre steder? Fremtiden Lige om lidt (0-2 år) Indikator-bakterier (Bundfældningsegenskaber, Afvanding) Forbyggende kontrollering af Microthrix (Tråd) Styring af SS om vinteren (NOB) Snart (2-4 år) Optimeret opstartsfase af renseanlæg Operationel viden om effekten af design på bakterierne Operationel viden om effekten af styring på bakterierne Fremtiden (5 år) Online måling af bakterierne på renseanlægget 19
Fremtiden Fremtiden (5 år) Online måling af bakterierne på renseanlægget Fremtiden Fremtiden (5 år) Online måling af bakterierne på renseanlægget 20
Biobank for renseanlæg (og rådnetanke) Uden historiske data er det svært at fortolke dataene! Biobank for renseanlæg (og rådnetanke) Uden historiske data er det svært at fortolke dataene! 3 x 2 ml prøver hver 14. dag Opbevares i fryser (-18 C) 1 box (15x15 cm) kan rumme prøver for 2 år! 21
Tak www.midasfieldguide.org phn@bio.aau.dk (Per H. Nielsen) ma@bio.aau.dk (Mads Albertsen) (Også for rådnetanke) 50+ danske renseanlæg 22