OutBreak 1
August 2016 Outbreak Copyright: Lise Junker Nielsen & Allan Haurballe. Foto og illustrationer: Colourbox Kontakt: lisej@bmb.sdu.dk Undervisningsforløbet og tilhørende forsøg udføres på eget ansvar. Der tages forbehold for fejl. 2
Introduktion Hvad sker der når der konstateres syge der er smittet med en ukendt bakterie? Hvordan identificerer man smittekilden, og hvilken bakterie der er årsagen? I dette tværfaglige case studie for Biologi A og Bioteknologi A arbejder vi dels med de bioteknologiske og bioinformatiske teknikker der bruges til at identificere en bakterie, men vi kommer også ind på de etiske og samfundsmæssige aspekter omkring hvordan man håndtere oplysninger til befolkningen og pressen vedr. en potentielt forestående epidemi forårsaget af en ukendt bakterie. Kernestof Biologi B-HTX cellens opbygning og udvalgte celleorganellers overordnede funktion, herunder forskelle på plante-, dyre-, svampe- og bakterieceller virus opbygning og funktionsmåde mikroorganismers vækst og vækstfaktorers betydning for denne et eksempel på anvendelse af biologisk viden i sygdomsforebyggelse og behandling menneskets immunforsvar og eksempler på dets betydning nukleinsyrernes opbygning og funktion, herunder proteinsyntesen Biologi B-STX genetikkens molekylære og cellulære grundlag, herunder proteinsyntesen eksempler på bioteknologiske metoder og deres anvendelse udvalgte dele af menneskets fysiologi eksempler på undersøgelses- og analysemetoder inden for områderne fysiologi, genetik, evolution og økologi. Bioteknologi A - virus og pro- og eukaryote cellers opbygning, funktion og vækst - biokemiske forbindelser med særlig vægt på deres struktur og egenskaber DNA - genetikkens molekylære og cellulære grundlag - immunsystemet, herunder vaccination, seksuelt overførte sygdomme og epidemier - eksperimentelle arbejdsmetoder der anvendes inden for bioteknologi, herunder elektroforese og PCR. 3
Faglige mål Biologi B-HTX gøre rede for eksempler på praktisk anvendelse af biologisk viden, biologiske processer og teknologi i produktion, miljøbeskyttelse samt sygdomsforebyggelse og behandling udføre og efterbehandle biologiske eksperimenter og undersøgelser og foretage fornødne sikkerhedsmæssige foranstaltninger ved omgang med biologisk materiale, apparatur og kemikalier analysere og forklare resultater fra eksperimenter og undersøgelser under hensyntagen til fejlkilder og usikkerhed dokumentere og præsentere eksperimenter og resultater samt diskutere forskellige gengivelsers styrker og svagheder formidle biologisk viden såvel mundtligt som skriftligt Biologi B-STX formulere og analysere biologiske problemstillinger med anvendelse af biologiske fagudtryk, såvel i kendte som i nye sammenhænge gennemføre observationer og undersøgelser og tilrettelægge eksperimenter såvel i laboratoriet som i felten, herunder vurdere risikomomenter ved omgang med biologisk materiale, apparatur og kemikalier analysere og bearbejde data fra eksperimentelt arbejde samt bearbejde og formidle resultater fra biologiske undersøgelser analysere og vurdere artikler med biologisk indhold opsøge og vurdere information vedrørende miljø, sundhed, medicin og bioteknologi vurdere konkrete biologiske problemstillinger og disses betydning på lokalt og globalt plan formulere sig såvel mundtligt som skriftligt om biologisk faglige emner, herunder inddrage etiske/holdningsmæssige forhold have faglig baggrund for stillingtagen og handlen i forbindelse med egne og samfundsmæssige problemstillinger med biologisk indhold. Bioteknologi A - formulere og analysere bioteknologiske problemstillinger under anvendelse af fagsprog, symboler og nomenklatur - beskrive cellers opbygning og redegøre for sammenhæng mellem struktur, egenskaber og funktion - tilrettelægge og gennemføre kvantitative og kvalitative eksperimenter og undersøgelser 4
- foretage risiko- og sikkerhedsvurderinger i forhold til anvendt apparatur, kemikalier og biologisk materiale - opsamle, efterbehandle og vurdere resultater fra eksperimenter og undersøgelser under hensyntagen til fejlkilder, usikkerhed og biologisk variation - dokumentere og formidle eksperimenter og undersøgelser både mundtligt og skriftligt - indsamle, vurdere og anvende information fra kilder, der omhandler biologiske, kemiske og bioteknologiske emner og problemstillinger - analysere og diskutere bioteknologiske problemstillinger i et samfundsmæssigt, miljømæssigt og etisk perspektiv. Inden camp Eleverne skal have kendskab til: Genteknologi Mikroorganismer og immunforsvaret DNA s opbygning cellens opbygning(eukaryoter vs. prokaryoter) Gensplejsning Mikroorganismers vækst DNA analyse herunder Immunforsvarets opbygning og virkemåde o PCR Antibiotika o Elektroforese o Sekventering (evt. samarbejde med engelsk, se filmen Outbreak) Case: Ankomst til location eleverne får at vide hvem de er (Kommunikationschefen) I er et team af forskere (molekylærbiologer, farmaceuter, biomedicinere, biologer), der arbejder på Center for Sygdomskontrol og Forebyggelse (CSF) ved Syddansk Universitet. Jeres arbejde er at hjælpe med at spore epidemier, at overvåge nye sygdomme og udvikle midler (medicin) mod sygdommene. I er blevet kaldt til Danfoss Universe og er nu klar til briefing. Tidsplan for forløbet Dag 1 Tid Aktivitet 9.30-10.00 Modtagelse af eleverne 10.00-10.15 Introduktion af os 10.15-10.30 Introduktion til historien - Briefing 10.30 11.00 Sagsmappe - Læsning af artikler og journaler 11.00 11.20 Oplæg om bakterier 11.20-12.30 Dissektion af høns 5
12.30-13.00 Frokost 13.00-13.20 Introduktion til forsøg og sikkerhed i lab 13.20-13.40 PCR 13.40-14.40 Videoer og pressemeddelelse 14.40-15.30 Smittespredningsøvelse(Kan udelades, alt efter behov) -Video med Bibi Larsen 15.30-16.00 Skæring med restriktionsenzymer 16.00-16.30 Loading af geler 16.30-17.30 Bioinformatisk øvelse 17.30-18.00 Analyse af gel Dag 2 Tid Aktivitet 830-8.45 Opsummering 08.45-9.30 Sekventeringsresultat og søgning i database - Udlevering af artikel fra Sverige 1984 9.30-9.45 Nyhedsindslag fra sygehuset interview med Raffan 9.45-10.45 Forberedelse til pressemødet 10.45-11.30 Pressemøde Alle dokumenter, powerpoints, vejledninger, videoer mm. kan hentes fra www.tinyurl.com/sciencefuture Selve forløbet Briefing (Kommunikationschefen) For 2 dage siden rapporterer lægevagten i indsæt selv by, at de i stigende grad bliver kontaktet af mennesker med influenzalignende symptomer. Man har valgt at isolere de smittede på byens hospital, da man vurderede at symptomerne var kraftigere end man normalt ser ved influenzainfektioner. Man frygter at det er en ukendt bakterie der er på spil og derfor er CSF blevet tilkaldt. PPP Briefing med Status, Opgaver og Hvad ved vi samt journalerne for de 8 indlagte. 6
Sagsmappe Der udleveres en sagsmappe til alle grupperne (den er stemplet fortrolig ). I mappen ligger der: Journaler på de otte smittede. Information om de 4 bakterier der ses som oplagte kandidater efter opdyrkelse fra nogle af patienterne: o Streptococcus pneumonia o Bacillus anthracis o Legionella pneumophila o Staphylococcus aureus Artikler om tidligere forekomster af disse sygdomme i Danmark. Holdene skal herefter læse i deres sagsmappe og alle kan diskutere lidt om, hvilken bakterie de tror der er tale om. Deres teori og begrundelse afrapporteres til Kommunikationschefen. Oplæg om bakterier (kan udelades) (Der lægges i mellemtiden døde høns ud og området spærres af med gul/sorte bånd) I slutningen af oplægget modtager kommunikationschefen en opringning omkring et fund af døde høns i området, som muligvis har forbindelse til sygdomsudbruddet. Dissektions af høns Eleverne ifører sig nu beskyttelsesdragter, handsker og maske og henter de døde høns. Hønsene dissekeres og eleverne identificerer de forskellige organer. Til hjælp med identificeringen bruges oversigt fra Københavns Zoo. Ved afslutningen af dissektionen udtages en prøve fra lungevævet på hønsene til dyrkning af bakterier. (Denne prøve smides ud, da den blot er pro forma. På forhånd skal der forberedes tre plader med E. coli som mærkes patient 1, patient 2 og høne) 7
PCR Før der laves PCR gives der en kort introduktion til hele forsøget og princippet bag DNA fingerprinting, samt sikkerhed i laboratoriet. Herefter køres der koloni PCR på kolonier fra hver af de tre forberedte plader med E. coli. Protokol 1.1: Koloni PCR (Polymerase Chain Reaction) Generelt om metoden Denne type PCR adskiller sig kun fra normal PCR ved, at man ikke oprenser DNA, før det bruges som template. Koloni PCR bruges kun analytisk, da det som senere beskrevet kræver, at der bruges en Taqpolymerase for at få nok opformering og denne har en højere tilbøjelighed til at indføre mutationer. Ved koloni PCR ødelægges cellen og DNA blotlægges ved kogning. DNA er ekstremt stabil og selvom det kromosomale DNA delvist nedbrydes af denne hårde behandling er risikoen for brud netop imellem de to primeres bindingssteder meget lille. Om PCR PCR er en metode til at opformere DNA til så store mængder, at de kan ses på gel eller anvendes i videre klonings eller analyse forsøg. PCR består af en cyklus af gentagende reaktioner hvorved 1 stykke DNA bliver til 2, 2 til 4, 4 til 8 osv. Typisk udføres 30 cykler (10 9 stykker DNA per oprindelig template). I reaktionsblandingen skal være: 1) et template stykke DNA, som ønskes opformeret og som indeholder strækninger, der er komplementære til primerne 2) en buffer der sikrer optimal ph og salinitet, 3) nukleotider (d-atp, d-gtp, d-ctp og d-ttp), 4) primere, som er små stykker DNA, der flankerer det stykke man ønsker at opformere, samt 5) DNA polymerase. Om de anvendte reaktionsbetingelser Vores PCR reaktion indeholder følgende delreaktioner: Den første delreaktion er at bryde hydrogenbindingerne imellem de to template strenge (94 C). Herefter køles hurtigt til 52 C (denne temperatur afhænger af primerens beskaffenhed), hvorved primere binder til template. Herefter øges temperaturen til 72 C som er optimum for den anvendte DNApolymerase som katalyserer polymerisering af nukleotider med template streng som skabelon for 8
sekvensen. Denne cyklus af denaturering, re-naturering med primer og elongering gentages indtil der er nok DNA eller primere er brugt op. Om polymerasen Den anvendte polymerase er en Taq-DNA-polymerase oprindeligt isoleret fra den termostabile bakterie Thermus aquaticus. Denne polymerase anvendes pga. dens effektivitet og termostabilitet, men mangler 3 til 5 exonuklease korrekturlæsnings aktivitet og er således mere tilbøjelig til at indføre uønskede mutationer. Dette er ikke et problem når det amplificerede DNA ikke skal klones ind i en ny organisme, men blot analyseres. Om vores primere De anvendte primere har sekvensen: Forward primer = 341F: 5 -TACGGGAGGCAGCAG-3 Reverse primer= 907R: 5 -CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3 Disse primere binder ca. hhv. 341 bp og 907 bp inde i 16S, og giver dermed et PCR fragment på ca. 585 bp. Om vores template DNA I denne øvelse anvender DNA fra forskellige bakterier dyrket fra de inficerede patienter og høns, som blot er varmet i PCR-maskinen. Det vil sige at vores DNA er blotlagt, men ikke oprenset. Protokol (bemærk at protokollen er pr bakteriekoloni, hvert hold laver 3 PCR reaktioner) 1. En lille mængde koloni overføres fra plade til bunden af et mærket PCR-rør med en pipettespids. 2. Herefter tilsættes til PCR-røret 33 μl destilleret og sterilt vand 5 µl 10x DreamTaq buffer 5 µl dntp mix, 2 mm each (nukleotider) 2 μl 10 μm Forlæns Primer (341F) 2 μl 10 μm Revers Primer (907R) 1 μl DreamTaq DNA polymerase 3. Indholdet blandes ved at pipettere forsigtigt op og ned. 4. Rørene placeres i PCR maskinen (bemærk at røret sættes i det rigtige hul i blokken (her det lille)) 5. PCR maskinen startes med følgende indstillinger (udføres af Laboratorie chef) 9
1. Start 94 C 5 min 2. Denaturing 94 C 1 min 3. Annealing 52 C 30 sek 4. Elongering 72 C 1 min 5. GOTO 2 rep. 29x 6. Slut 72 C 5 min 7. Hold 4 C 6. Efter endt kørsel kan PCR produkt opbevares ved 4ºC i kortere tid og -20ºC i længere tid Pressemeddelelse Mens PCR reaktionen kører har kommunikationschefen pludselige opdaget at pressen har fået nys om sagen. Eleverne ser videoen med nyhedsindslaget fra hospitalet og herefter videobeskeden fra Raffan som pressen har opsnappet. Det er nu elevernes opgave at udforme en pressemeddelelse, således at de får beroliget befolkningen og undgår panik. Ting pressemeddelelsen bør indeholde: - Omfanget af smitten (for at vise det ikke er en epidemi endnu) - Hvor udbruddet har fundet sted (For at folk ved det indtil videre er et begrænset område) - Hvilke symptomer der er tale om - Anbefaling om at søge EGEN læge 10
- Anbefaling om at holde en god hygiejne specielt efter kontakt med dyr - En tidshorisont for hvornår vi har svar (uden at være for specifik) Ting som pressemeddelelsen IKKE skal indeholde: - Specifikke detaljer om patienter - Specifikke detaljer om hvilke bakterier vi mistænker Smittespredningsøvelse(Kan udelades, alt efter behov) Indledning: I denne øvelse vil se på hvordan smitte spredes og hvordan smitte opspores Formål: At vise hvorledes en sygdom via smitte kan spredes inden for en gruppe af personer med f.eks. intime kontakter. Materialer: Reagensglas, fortyndet NaOH 0,1 M, ph-indikator (phenolphtalein), stopure Fremgangsmåde: Et antal reagensglas svarende til elever på holdet fyldes knapt halvt med vand og nummereres fortløbende, dog påfyldes et af reagensglas med fortyndet NaOH, men kun læreren ved, hvilket nummer dette glas har. Alle tager nu et reagensglas og skal i løbet af de følgende 5 min gennemføre 4 intime kontakter med andre i gruppen. De intime kontakter starter samtidig med at et stopur startes. I vedlagte skema noteres, med hvem man har haft kontakt (nr på glas) og på hvilket tidspunkt (tid på fælles-stopur). De intime kontakter gennemføres ved at man blander kropsvæsker, d.v.s. reagensglassenes indhold blandes, den ene person hælder sit reagensglas indhold i den andens og fordeles derefter på de to glas igen. Når alle har haft deres 4 kontakter undersøges alles smittestatus ved at dryppe en dråbe phenolphtalein i bægerglassene og notere farven. Gruppen samles og udveksler oplysninger vedrørende kontakter og tidspunkter, og alle data indføres i skema. Resultater: glas nr. 1.partner Nr. tid 2.partner Nr. tid 3.partner Nr. tid 4.partner Nr. tid Smitte status (slut) Bearbejdning: Resultat skemaet analyseres og det indkredses hvem der kan var smittet ved start. 11
Skæring og gelelektroforese Protokol 1.2: Skæring af DNA med restriktionsenzymet MboI Generelt om metoden Restriktionsenzymer findes naturligt i bakterier og arkebakterier som et værn imod fremmed DNA, der trænger ind i cellen. Mange hundrede af sådanne enzymer er nu karakteriserede og findes som kommercielle enzymer til kontrolleret skæring af DNA dobbeltstrenge. Restriktionsenzymer genkender en ganske specifik DNA sekvens og skærer så specifikt sukker-fosfat bindingen i hver streng. Der findes forskellige typer restriktionsenzymer og MboI er en type II enzym. Denne type enzym er monomert, genkender korte palindromiske sekvenser og skærer uden brug af energi fra ATP. Enzymet stammer oprindeligt fra bakterien Moraxella Bovis. Protokol (hvert hold laver 3 skæringer) 1. Fortynd MboI 1:7 ved at tilsætte 28 µl (4x7 µl) sterilt og demineraliseret vand til røret med enzym (vigtigt at enzym holdes koldt (<0ºC) indtil brug) 2. Pr skæringsreaktion blandes nu i 1 eppendorfrør 8 µl MboI fortynding 10 µl PCR produkt (som skal skæres) 2 µl Fastdigest 10x buffer 3. Indholdet blandes ved at pipettere forsigtigt op og ned. 4. Inkuberes 5 minutter ved 37 ºC (i termoblok) 5. Der tilsættes 4 µl Uview dye til skæringsreaktionen 6. Skæringsblandingen testes direkte på gel (protokol 1.3) 12
Protokol 1.3: DNA gel elektroforese Generelt om metoden Ved DNA gelelektroforese udnyttes det, at sukker-fosfat rygraden i DNA molekyler er negativt ladet. Den DNA bærende matrice er en agarosegel, hvis lange uforgrenede kulhydratkæder danner en solid og alligevel porøs vandig gel. DNA et loades i små kamre i den ene ende af gelen. For at lette overførsel af DNA til gel, tilsættes en buffer der indeholder et farvestof, som gør prøven synlig samt glycerol, der gør prøven tungere end vand, således at DNA et synker ned i kammeret. Gelen, der ligger i et elektroforesekar dækket af TAE buffer, påføres en spænding med -polen i samme ende som DNA et påsættes og + polen i den modsatte ende (vigtigt). DNA ets negative ladninger vil nu trække DNA et imod + med en hastighed som afhænger af DNA ets størrelse og sekundære struktur. Således separeres DNA af forskellige størrelser relativt til hinanden. Der tilsættes typisk også en DNA-markør i et tomt kammer, for at kunne bestemme DNA ets størrelse nærmere. For at visualisere DNA et er gelen tilsat et fluorescerende stof som tillader at man, ved hjælp af UV-lys, kan se DNA båndene efter separation. Protokol 1. Der placeres en 3% agarosegel i et elektroforesekar med TBE buffer (Tris/boric acid/edta), således at gelen er dækket. 2. Der overføres forsigtigt 10 µl DNA markør i den 1. brønd (laboratorie chef) 3. Herefter overføres de 3 skårne DNA-prøver (20 µl) i en noteret rækkefølge 4. Der overføres forsigtigt 5 µl DNA markør i den 5. brønd 5. Det sættes spænding over karret 6. Efter 60 minutter er DNA-båndene separerede og gelen kan undersøges i UV-lys Kemikalieliste (ud over kits) (NB: R og S sætninger i parentes) TRIS, tris(hydroxymethyl)aminomethan (HOCH 2 ) 3 CNH 2 (R36, R37, R38, S26, S36) EDTA, ethylenediaminetetraethansyre [CH 2 N(CH 2 CO 2 H) 2 ] 2 (R36, S26) Sukrose (C 12 H 22 O 11 ) Agarose 13
Bioinformatisk øvelse Imens gelen kører laves en bioinformatisk øvelse hvor sekvenserne for mulige bakterier udleveres og eleverne skal herefter skære disse teoretisk og finde ud af hvilke skæringsmønstre de formodede kandidater har. (Svarark ligger sammen med de andre dokumenter) De 4 bakterie der er mistænkt for at stå bag sygdomsudbruddet er: Streptococcus pneumoniae Bacillus anthracis Legionella pneumophila Staphylococcus aureus Informationer og materialer 1. I får udleveret et link til word dokument med sekvenserne der koder for 16S RNAet, da det er et stykke DNA fra dette gen vi opformerer med vores PCR. http://tinyurl.com/outbreak-camp 2. Kopier indholdet over i et word dokument på jeres egen PC, så i kan arbejde videre med det. 3. Alternativt kan I arbejde med de originale sekvenser (så i kan øve jer på hvordan det virkeligt er!) 4. De originale sekvenser for de fire bakterier er hentet fra https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ bemærk at hvis i selv downloader, skal i downloade complete sequence. Søg for eksempel på Streptococcus pneumoniae 16S complete Opgaven 1. Find det teoretiske PCR produkt i word-sekvensen ved at finde primer sekvenserne med funktionen find i word. (NB pga. linjeskift kan i måske kun finde 6-7 baser i en linje, men så må i tjekke om resten passer (alternativt kan i aligne sekvenser i programmet align http://www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html, men bemærk at dette program kun fungerer godt med mindre sekvenser (som dem i word dokumentet.) 2. Primer sekvenserne (fra 5 - til 3 ) er: Forward primer = 341F : 5 -TACGGGAGGCAGCAG-3 Revers primer = 907R: 5 -CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3 Husk at revers primeren er baglæns så den sekvens I skal finde er den omvendt komplementære sekvens. Skær den teoretiske sekvens med MboI ved at finde skæringssekvenserne(gatc), enten i word igen eller med skærings værktøjet NEBCUTTER 2 (google det) 14
Analyse af gelelektroforese Resultaterne sammenlignes med de teoretiske skæringsmønstre fra den bioinformatiske øvelse. Det viser sig at DNA mønsteret ikke passer med nogen af de formodede bakterier. Der sendes nu en prøve til sekventering. (Der sendes ikke reelt prøver til sekventering, men der arbejdes med en teoretisk sekvens som passer med BLAST søgningen) Sekventering Resultatet fra sekventeringen udleveres og eleverne introduceres til hvordan man laver en BLAST søgning. Alle grupper laver BLAST søgning og vi samles herefter og snakker om resultatet. BLAST søgningen viser at der er tale om Chlamydophila psitacci, som forårsager papegøjesyge. Det undersøges også om den sekvens der er kommet retur passer med det skæringsmønster eleverne har set på gelen. Herefter udleveres en fiktiv artikel fra Sverige om et udbrud med netop en muteret papegøjesyge, som vi også har at gøre med, og som derfor bør gøre os urolige. Heldigvis er der godt nyt fra hospitalet i nyhedsindslaget med Raffan som er i bedring. Måske kan de antistoffer han danner oprenses og bruges til at kurere de andre patienter. Pressemøde Det er nu tid til at indkalde til pressemøde for at indvie befolkningen i de fund der er gjort. De forskellige hold rapporterer på forskellige dele af øvelsen, og kan justeres efter antallet af hold. En oversigt over emner og dertilhørende baggrundsmateriale kan findes i samlingen af dokumenter. Efter camp Vi skal sikre at alle elever har forstået hvad der foregik og hvorfor på campen. Eleverne kunne eventuelt, i grupper på 2-3 skrive en avisartikel i samarbejde med dansk. Her ville de beskrive de begivenheder de har oplevet på campen. Sygdomsudbrud, døde høns, de forskellige forsøg osv. 15