Nr 158 - okt 2013 BIONYT VERDEN BioNyt - Videnskabens Verden nr158, wwwbionytdk 1 VIDENSKABENS Fremtidens diagnosemiddel Spyt DNA-sekvens af 700000 år gammel hest
4 BioNyt - Videnskabens Verden nr158 wwwbionytdk Af Ole Terney Supplerende tekst og video: wwwbionytdk/spyt Nye ultrafølsomme metoder kan afsløre alvorlige sygdomme i en simpel spytprøve Tænk, hvis man kunne undgå blodprøver og blot behøvede spyt til testning for sygdom og helbredstilstand Spyt er let at indsamle, lagre og transportere; mere sikkert for hospitalspersonale at håndtere end blod (ingen risiko for stik-skader, og der er mindre virus-koncentration i spyt end i blod); uden risiko for overførsel af infektion på grund af genbrug af usteriliserede nåle (et problem i u-lande); mindre problemer med bortskaffelse af affald (endnu et problem i u-lande uden autoklavering); kan indsamles af personen selv eller af utrænede personer (en økonomisk fordel); spytprøvetagning er stress-fri; spyt kan let indsamles i vanskelige situationer og fra børn, ældre, folk med nåleskræk, folk med sammenklappede vener, overvægtige personer og patienter, der af religiøse grunde ikke må give blod Spyttest ville kunne gentages igen og igen Hele befolkningsgrupper ville kunne afgive spytprøver til test for en sygdoms samlede forekomst i befolkningen med henblik på større initiativer på sundhedsområdet (ref10708) Man ville nå flere mennesker, og sygdomme ville kunne opdages tidligere (jo tidligere en sygdom opdages, jo større er chancen for succesfuld behandling) Altså ville samfundet kunne spare penge til omfattende behandlinger, og patienter ville kunne undgå bivirkninger og senskader på grund af for sen diagnose Tandlægen Skal tandlægerne inddrages i spytdiagnostik? Folk kommer hyppigere til tandlægen end til deres læge, og spyt ville kunne indsamles under et almindeligt tandeftersyn Men der er ingen tradition for, at tandlægen direkte inddrages i screening for sygdomme På Tandlægeforeningens årskursus i Bella Centeret 2013 blev det diskuteret, om tandlægerne skal inddrages i spytdiagnostik (ref10700) Ikke overraskende var der nogen uenighed Hvis debatten havde foregået blandt læger, ville der nok have været enighed om, at spytdiagnostik skal forbeholdes lægerne Men inddragelse af tand læger kan foregå på mange niveauer Det ville være nemt at inkludere udtagning af en spytprøve som en rutinesag ved kontrol af tænderne Som det er nu, er det imidlertid op til patienterne selv at gå videre med tandlægens iagttagelser Der er nok ingen, der forestiller sig, at tandlægen skal stille en diagnose En fremtidig model, hvor tandlægen videregiver sine observationer og eventuelle indledende målinger til patienten og patientens læge, er nok mere sandsynlig at få gennemført Der foregår forskning om påvisning af sygdomme i spyt ved de odontologiske universitetsafdelinger Selv om der ikke er tradition for, at tandlægen stiller medicinske diagnoser, så forskes der ved nogle universiteters odontologiske afdelinger i spyttest til diagnoser Björn Klinge fra det odontologiske fakultet ved Malmö Högskola forsker i spyttest til sygdomme, der involverer inflammation (ref10725) I et studie blev 500 personer i Skåne bedt om at udfylde et spørgeskema om sygdom og afgive en spytprøve Dette studie viste, at man kunne påvise inflammationsfaktorer i patienter med diabetes, hjerte-kar-sygdomme og visse kræfttyper (ref10706) I Californien har UCLA School of Dentistry i Los Angeles fået 5 millioner dollar til at forske i sammenhænge mellem sygdomme og spyttets indhold af RNA uden for cellerne, (extracellulært RNA) (ref10707) RNA udskilles i mellemrummene mellem celler, hvorved det fungerer som et signal uden for spytkirtlerne (exokrint signal) Dette signalsystem
BioNyt - Videnskabens Verden nr158, wwwbionytdk 5 Biologiske prøver kan tages fra blod og andre kropsvæsker, men allerlettest fra spyt Nye teknologier muliggør de vanskeligere spytanalyser til diagnose-formål - Det kan blive starten på en ny spytindustri med store fordele for patienterne findes i bla maven og hjertet, men også i fingre og tæer samt altså i munden (ref10707) Den førende spyttest-forsker er David T Wong Han var den første, der (i 2004) påviste det extracellulære RNA i spyt (ref10707) Han er redaktør på bogen Salivary Diagnostics, som (ref10724, bogen findes: blev udgivet i 2008 UB2/KUB-NS-Nord) Spyttest i stedet for blodprøve? Standardproceduren til at teste kroppens sundhedstilstand har længe været at bruge blodprøver Det har i mange år været overset, at mundhulen og spyttet også afspejler kroppens sundhedstilstand, men de seneste 10 år er der kommet meget mere fokus på spyt (ref10699)(ref10700) Spyttest - en ny industri Langsom udvikling Spyttest vil utvivlsomt blive en helt ny industri, men hvorfor går det så langsomt? En del af forklaringen på den langsomme udvikling af spytbaseret diagnosticering er, at der har manglet følsomme målemetoder Men der har også manglet viden om spyttets biologi - bla viden om transporten af biomolekyler fra blodet til spyttet (ref10699) Det er vanskeligt at finde pålidelige sammenhænge mellem biomolekylerne i blodet og i spyttet Der er stor viden om sammenhængen mellem blodets indhold af biomolekyler og forskellige sygdomme, - men hvis man ikke kan relatere spyttets indhold af biomolekyler til et tilsvarende mønster i blodet, vil denne viden om sammenhængene mellem biomolekyler i blod og bestemte sygdomme ikke kunne udnyttes ved spyttest Blodet har den diagnostiske fordel, at det gennemløber alle organer i kroppen Blodet må derfor formodes at indeholde biomarkører fra alle organerne Spyttet afspejler i højere grad end blodet kroppens umiddelbare tilstand (men denne døgnvariation i spyttets biokemi er en svær ting at håndtere; og der er stor individuel variation og desuden varierer spytdannelsen med stimuleringen) Eftersom sammensætningen af biomolekyler i spyttet varierer i løbet af døgnet, er sammensætningen af biomolekyler i spyttet på et givent tidspunkt ikke en afspejling af den tilsvarende sammensætning i blodet, fordi der i blodet ikke er de samme døgnvariationer Døgnvariationen i spyt kan derfor vanskeliggøre tolkningen af resultaterne (Desuden Spyt-diagnosticering vil i fremtiden kunne få stor betydning, fordi spyttest er nemme at tage, og fordi der er udviklet ultrafølsomme metoder, der ikke kræver specialuddannet personale eller avanceret temperaturstyring mangler man undertiden forklaringer: Et studie har feks kuriøst påvist, at amylase-dannelse i spytkirtlerne kan være en markør for søvnmangel (ref10724 s98) ) En anden ulempe ved spytdiagnoser er, at spyttets sammensætning kan være påvirket af måden, som spytprøven tages på En stimulering af spytafgivelsen under prøvetagningen kan både være en fordel og en ulempe (ref10699) Det forventes derfor, at det bliver nødvendigt at måle flere parametre i spyt for at kunne opnå en pålidelig diagnose, end det i dag kræves for blodanalyser (ref10699) Standardisering af spyt-opsamling For at finde sammenhænge mellem spyttets indhold af biomolekyler med det tilsvarende indhold af biomolekyler i blod er det nødvendigt at bruge mere standardiserede metoder til opsamling af spyt (ref10699)(ref10701) Det har ført til Fortsættes på side 7 Salivette-kit Personen skal tygge i 45 sek - 1 minut med bomulds-rullen i tandkødsranden Oracol-kit gnubbes mod gummerne 1 minut
6 BioNyt - Videnskabens Verden nr158 wwwbionytdk Spyttets kulturhistorie Ivan Pavlov blev kendt for et forsøg, hvor hunde begyndte at savle, når de hørte en klokke, som angav, at de snart ville få mad Spytproduktion er tæt forbundet med tanken om mad Ikke desto mindre har forskellige folkeslag yderst forskellig holdning til spyt, fra meget negativ til meget positiv Opdagelsen af, at spyt og nys kan bære smitte var med til at give spyt negative associationer Midt i 1800- tallet, før disse opdagelser, var spytning almindelig, feks hos folk, der tyggede skråtobak Da den tyske læge Robert Koch opdagede, at spyt kunne indeholde tuberkulosebakterier, fik spyt en negativ klang Selv om vi danner ca 1½ liter spyt om dagen, er spytning kun socialt tilladt for sportsstjerner inden for feks baseball, for at signalere maskulinitet, og i andre sportsgrene spyttes for at bede om held (spytte i hænderne, feks) At spytte på nogen er en yderst hånlig handling I Peru, Bolivia, Venezuela og lande langs Andes-bjergkæden fremstilles stadig alkoholiske "chicha"-drikke af maniok-rod, majs og frugter ved at bruge spyt som den fordøjende og fermenterende kilde (Ordet stammer fra spansk - for spyt eller at spytte) Grækerne spytter for at forhindre ulykker, selv under ceremonier i den græskkatolske kirke Når præsten dø- Spytteskål fra ca 1740 ber et barn spytter han tre gange på jorden for at repræsentere den hellige treenighed og afvise djævelen Under græske bryllupper spytter gæsterne på bruden for at ønske held og lykke Det er også almindeligt, at grækere spytter på tøj og hinanden under hilsen for at undgå det onde øje I Somali anvendes spyt som et primitivt helsemiddel mod åbne bylder Mod smertefulde slangebid bruger somalierne i Afrika en blanding af smør og spyt Hos Azandefolket i Sudan og Masai-folket i Østafrika bruges spyt som førstehjælp mod mindre sår, evt blandet med urter Hos Bena-folket i Tanzania bruges spyt til at behandle forbrændinger og Masia-stammen bruger spyt mod insektbid og opsvulmning Wolof-stammen i Afrika tror spyt medbringer en spirituel velsignelse fra spyttets ophavsmand, og en nyfødt smøres ind i spyt fra de, der vil barnet det godt Hos Ashanti-folket i Ghana skal bedstefaderen direkte spytte ind i den nyfødtes mund for at barnet kan blive spirituelt oplyst Siden for 4000 år siden er "betelnød" (en blanding af areca-nød, betel-blade og lime) blevet tygget i Thailand, Indien, Phillipinerne, Taiwan og Indonesien Planten frigiver alkaloider, som let absorberes igennem mundslimhinden og medfører ekstrem stor produktion af rødbrunt spyt Den medfølgende spytten opfattes som en del af det at have en god personlig hygiejne Efter udbruddet af SARS-epidemien i 2003 i Kina, Hong Kong og Taiwan er der blevet indført bøder for at forhindre offentlig spytten I Singapore kan bøden være op til 25000 kr Spyt indgår naturligt i et kys mellem kærester, hvorimod folk er ret så tilbageholdende med at udveksle spyt med fremmede Nogle hundeejere er villige til at acceptere et slik fra deres hund, men ofte ikke fra en hund, der ikke er deres egen Det er ofte tabu at dele en ske, tandbørste eller sugerør, fordi det har rørt ved den anden persons spyt Der kan være psykologiske faktorer som gør, at folk har svært ved at acceptere, at spyt indeholder diagnostisk information om den persons krop, som spyttet kom fra Der synes således at være en psykologisk skelnen mellem spyt, der stadig er i en persons mund, og spyt, som ikke mere er i personen - som om spyttet dermed er blevet fremmed og ikkeselv (ref10724 s104-109)
BioNyt - Videnskabens Verden nr158, wwwbionytdk 7 Der sker i øjeblikket en rivende udvikling af spytdiagnosticering til brug i ulandene, dvs med simple opsamlingsmetoder (ref10705) Fortsat fra side 5 udvikling af kommercielle spytopsamlings-kit De mest udbredte udstyr til spytopsamling er (ref10699) (ref10701) : OraSure wwworasurecom (hvor man med en nylonpind med specialbehandlet bomuldsvat på enden påviser spyttets eventuelle IgG-antistoffer mod HIVog hepatitis-virus (smittepåvisning)) Omni-SAL (hvor et stykke vat placeres under tungen til opsamling af IgG-antistof Når en tilstrækkelig mængde spyt er absorberet i vattet skifter en indikator farve) Salivette (hvor patienten skal tygge i et minut med en vatrulle af bomuld, placeret ved tandkødsranden) (ref10734 s9) Oracol (hvor en pind med et stykke absorberende skumstof på enden er beregnet til at kunne optage 1 ml væske, når der gnides 30 gange på hver af gummerne, som med en tandbørste, i 1 minut) Oracol anvendes i bla England til påvisning af antistoffer mod mæslinger, HIV, hepatitis A og B, fåresyge og røde hunde (ref10735 s8) Både kortvarig spytopsamling på under 1 minut, og langvarig på over 15 minutter, giver upræcise tal for spytproduktion (ref10724 s38) Interessant nok afgiver venstre øre-spytkirtel mere spyt end den højre Dette udligner sig efter 10 min (ref10724 s38) Til brug for diagnose anbefales spytopsamling i 10 minutter (ref10724 s38) (Ofte bruges dog 5 minutter til test for caries-risiko, men 15 minutter hvis man skal vurdere, hvor patientens manglende spytdannelse ligger i forhold til økonomisk tilskud til tandbehandlinger, fordi nedsat spytdannelse giver større risiko for tandsygdomme) Personen bør ikke spise eller drikke i 1½ time før prøvetagningen Patienten skal starte med at synke alt sit spyt, og må derefter ikke synke under spytopsamlingen, men savle ned i en kop, hvis vægt er kendt på forhånd Personen skal under opsamlingen forholde sig så roligt som muligt og må ikke bevæge mund eller tunge (ved ustimuleret spytopsamling; samme procedure bruges ved stimuleret spytopsamling, men her tygger personen på feks en smagløs paraffinklump) Når tiden er gået, afsluttes der med, at patienten spytter i koppen Den enkelte patient bør altid opsamle spyt på samme tidspunkt af døgnet, for at nedsætte virkningen af døgnvariation Spytdannelsen er højere om vinteren end om sommeren, og spytdannelsen er nedsat ved højere omgivelsestemperatur (ref10724 s38) Under spytopsamling skal personen sidde komfortabelt, have åbne øjne, let fremoverbøjet hoved og have hvilet i 5 minutter (ref10724 s39) Opsamling i 10 min bør give 3-7 ml spyt (ref10751) Da bakterierne i spyttet hurtigt kan nedbryde eventuelle biomarkører, skal prøven straks nedkøles på is (evt flydende nitrogen) for at nedsætte den enzymatiske aktivitet, og bakterierne i spyttet skal fjernes ved filtrering eller centrifugering (ref10724 s71) Lagring bør ske ved 1 Øre-spytkirtlen 2 Underkæbe-spytkirtlen 3 Undertunge-spytkirtlen under -20 C (ref10724s73) Optøning bør ske hurtigt ved at komme prøven i varmt vand i kort tid, fordi langsom optøning ødelægger sårbare biomarkør-proteinmolekyler mere og medfører udfældning af mucinprotein-komplekser (ref10724 s72) Spyt er et blandingsprodukt For at kunne bruge spyt til diagnose vil det være en fordel, at man kan besvare spørgsmål såsom: Hvad danner kirtelcellerne selv? Hvad kommer udefra? Hvordan transporteres stofferne over i spyttet? (Da forskellige stoffer ofte transporteres på forskellig måde, har transportmåden betydning for stoffernes koncentration i spyttet) Øget spytdannelse fortynder stofkoncentrationerne, men hæver også ph (så spyttet bliver mindre surt, hvorved nogle stoffer diffunderer tilbage over cellemembranerne og ud af spyttet) Man skelner mellem kirtelspecifikt spyt og fuldspyt (helspyt) Opsamling af kirtelspecifikt spyt - altså opsamling fra de enkelte kirtler - kan være vanskelig og anvendes mest til undersøgelse af kirtelspecifikke sygdomme Oftest anvendes fuldspyt, der er en blanding af spyt fra hele mundhulen, og altså fra forskellige spytkirtler Biomolekylerne i spyttet er i høj grad dannet af spytkirtlerne selv Men biomolekylerne kan også være kommet fra blodet (ref10699) Omkring 27% af proteinerne i blodet findes også i spyt (ref10734 s10) Afhængig af størrelsen og ladningen af biomolekylerne kan denne transport ske ved passiv diffusion (det gælder feks for elektrisk-neutrale steroider), og ved såkaldt ultrafiltrering (ved indsivning via spalterne mellem cellerne) eller aktiv transport, feks via receptorbinding, idet proteinerne fra blodet kan komme over i spyttet ved at være bundet til et receptor-protein (såkaldt ligand-binding) Bindingen medfører ændring af receptor-molekylets rumlige form, hvorved proteinet kan transporteres aktivt over membranen (ref10699) Spytproduktion og afsondring af spyt Sunde, raske personer afgiver fra 0,5 liter til 1,5 liter spyt pr dag med en hastighed på 0,5 ml/min (ref10699) Mængden af spyt afhænger af fysiologiske og patologiske tilstande samt af lugt- og smagsindtryk (ref10699) Nedsat spytproduktion kan være tegn på sygdom Spytkirtlerne Hos mennesket findes ca 600 mindre spytkirtler, der er spredt rundt i munden under slimhinden, og tilsammen producerer ca 10% af spyttet, samt
8 BioNyt - Videnskabens Verden nr158 wwwbionytdk tre par store spytkirtler, der producerer ca 90% af spyttet: Øre-spytkirtlen (glandula parotis (gl parotidea) Underkæbe-spytkirtlen parotis-kirten, under huden over ramus mandibula) (glandula submandibularis, den submandibulære, ved basis mandibula) (glandula sublingualis, den sublinguale kirtel, under tungen) Undertunge-spytkirtlen (Dertil kommer små bidrag fra bla tandkødet, madrester mellem tænderne, bakterier i eventuelle huller i tænderne, udsivende væske ved inflammation i tandkødet) (ref10734 s4) Fra kirtlerne udsondres en blanding af elektrolytter, proteiner, genetisk materiale, polysaccharider og mange andre molekyler De fleste af disse stoffer kommer ind i spytkirtelsystemet fra de omgivende blodkar-kapillærer, men der dannes også stoffer i selve spytkirtlerne Det primære spyt dannes i de såkaldt sekretoriske endestykker, der består af acinære celler Spyt indeholder proteiner, som spytcellerne har dannet (bla mucin, statherin og prolin-rige proteiner) Desuden indeholder spyt immunoglobulin-a (IgA), der dannes af immunceller IgA er en dimer, altså bestående af to enheder, og disse holdes sammen som et dimerkompleks ved hjælp af et protein (kaldet J-kæden) Spytkirtelcellerne har receptorer, som binder dette IgA-kompleks, indtager det ved endocytose, og transporterer det tværs over cellen indpakket i en vesikel, og til sidst sendes dette immunoglobulin-a ud i spytkanalen (sammen med en del af receptoren, kaldet den sekretoriske komponent) (ref10734 s6) Ud over dette IgA er der i spyt også små mængder af antistoftyperne IgG og IgM Der er sket en kolossal udvikling i følsomme målemetoder, hvormed man faktisk nu kan måle helt ned til enkeltmolekyler Ofte forekommer de interessante biologiske stoffer i meget små mængder i spyt, så interessen for at måle på spyt er først rigtig blevet stimuleret nu, hvor disse teknikker er opfundet Senere i ka tk y k a spyt analal an a en Biomolekyler, som ndes i spyt, og deres funktion i mundhulen Spyttet skal beskytte den øverste del af slimhinden i spiserøret, hvilket er vigtigt for, at maden lader sig synke, og for taleevnen (ref10699) Munden er fuld af bakterier, måske 500 forskellige arter, og spyt indeholder ca 10 mill bakterier pr milliliter (ref10724 s71) En forudsætning for at kunne opretholde en god mundhygiejne er at have en tilstrækkelig spytproduktion, da spyttet indeholder mange beskyttende stoffer Mundhulen oversvømmes hele tiden med spyt, som fjerner madrester og mikroorganismer, og spyt indeholder direkte bakterie-inaktiverende stoffer, bla lysozym mod Gram-positive bakterier Et andet spytprotein er histatin, som modvirker bakterierne ved at neutralisere giftige lipopolysaccharider, som Gram-negative bakterier har i deres cellemembran Desuden hæmmer histatin bakterieenzymer, som skader tænderne (ref10724 s160) Lactoferrin er et jernbindende glycoprotein, som produceres af spytkirtlerne, og som hæmmer bakteriers vækst ved at gøre det sværere for bakterierne at få det jern, som de behøver til deres enzymer (ref10724 s160) Spytmangel medfører galopperende-hurtig karies (huller i tænderne) De såkaldte muciner i spyttet binder sig til bakterier og forhindrer, at bakterierne klæber til tand-emaljen Spyt indeholder i øvrigt calcium og phos-
Spytkanal Blodkar BioNyt - Videnskabens Verden nr158, wwwbionytdk 9 Reabsorption Udførselsrør Spytdannelsen stimuleres både af det sympatiske nervesignalsystem [transmitter-stof: noradrenalin] og af det parasympatiske nervesignalsystem [transmitter-stof: acetylcholin] En stimulus fører til, at cellens endop l a s m a t i s k e reticulum frigiver frit Ca ++ Den Spytdannelse Spytrørcelle Spytdannelse pludselige frigivelse af calcium medfører, at porte for kalium-ioner (K + ) åbnes, så kalium-ionerne farer ud af cellen (cellen har indre overskud af K + på grund af natrium/kalium-pumpens ATP-energikrævende pumpeaktivitet) Cellens tab af de positive kalium-ioner (K + ) ud af cellens "bagdør" medfører et tilsvarende tab af de negative chlor-ioner (Cl - ) ind til spytkanalen (lumen) Derved opstår en elektrisk-negativ ubalance i spytkanalen, som medfører, at (de positive) natrium-ioner (Na + ) siver ud i spytkanal-lumen - via mellemrummene mellem cellerne [paracellulært] ) Da der nu er mange natrium-ioner og chlor-ioner i spytkanalen er der dermed blevet skabt et osmotisk overtryk her, som får vand (H 2 O) til at diffundere ud i spytkanalen - dels ud af cellerne [transcellulært] og dels via mellemrum mellem cellerne Derved er der dannet primær spyt (med visse ligheder til blodvæske) [Senere i spytkanalens forgrenede gange reabsorberes 98% Spytrør Indskudsstykke Spytkanal Spytdannelse Acinære celler (Sekretoriske spytkirtel-endeceller) af natrium-ionerne og 76% af chlor-ionerne, dog kun henholdsvis ca 69% og 60% under tygge-stimulering)] Den sekretoriske spytkirtel-endecelle vender i øvrigt tilbage til udgangspunktet ved at igangsætte transportsystemer, som reetablerer de oprindelige ion-gradienter fra før cellen blev stimuleret til at lave spyt De reetablerende transportsystemer er: Den ATP-krævende pumpe: 1: Den energikrævende, ATP-drevne 3Na + /2K + -pumpe De ikke-atp-krævende svingdørs-transportsystemer: 2: Co-transporteren Na + /K + /2Cl - 3: (Na + ) ind i cellen /(H + ) ud i spytkanal-lumen 4: (Cl - ) ind i cellen /(HCO 3- ) ud i lumen (dette Cl - /HCO 3 - system kræver carbon-anhydrase-enzymets omdannelse af CO 2 og H 2 O til HCO 3 - og H + ) phat, som er hoved-byggesten for tandemaljens calcium-hydroxy apatit (ref10724 s32) Hvis spyt kun var vand, ville vores tænder være opløst og væk i 20-årsalderen, har Frank Oppenheim fra Boston Universitets oral-biologiske afdeling sagt (ref10724 s109) Desuden indeholder spyt bikarbonat og andre ioner med buffer-evne, som neutraliserer syrer (bla den mælke syre, der dannes af mundbakterier), og spyt beskytter derved tandemaljen mod demineralisering Ustimuleret spyt har et ph på ca 6,8 Spyt fremkaldt ved stimulering har et let basisk ph-tal på ca 7,4 (fordi bikarbonat-koncentrationen øges ved stimuleringen) (ref10724 s32) Hvis spyttets ph feks er 6,2 (surt) har personen risiko for at få huller i tænderne I dette tilfælde vil tyggegummi være fordelagtigt, fordi spytstimuleringen altså øger ph-tallet Når et stof transporteres fra det forholdsvis ph-neutrale blod til det ofte mere sure spyt, vil der ske en ionisering af stoffet i spyttilstanden, og da disse ladede stoffer har sværere ved at transporteres over cellemembraner, kan de ikke komme tilbage igen De
10 BioNyt - Videnskabens Verden nr158 wwwbionytdk ophobes derfor i spyttet Ved øget sekretionshastighed får spyttet dog som nævnt højere ph (dvs det bliver mindre surt) Koncentrationen af stofferne bliver også mindre, når der er høj sekretionshastighed Spytmangel Nogle mennesker føler, at de har mundtørhed, selv om deres spytdannelse er normal Omvendt har nogle mennesker objektiv-målbart nedsat spytdannelse uden, at de oplever mundtørhed (ref10724 s30) Spytmanglen kan dog medføre revner i tungen Spytmangel er oftest en bivirkning af medicin (beta-blokkere, beroligende midler og antipsykotisk medicin), som har den bivirkning, at de nedsætter nervesignalerne til spytkirtlerne (ref10724 s30) Sjögrens syndrom En meget mindre gruppe patienter med spytmangel er mennesker med autoimmun reaktion mod spytkirtlerne Det kaldes Sjögren's syndrom og findes hos 0,6% af befolkningen, og er 9 gange hyppigere hos kvinder end hos mænd Det skønnes, at 2-4 millioner mennesker i USA har Sjögren's syndrom, der giver mundtørhed i en grad, så tør mad ikke kan spises og tale i længere tid bliver vanskelig (ref10724 s189-197) Lindring kan opnås ved øget luftfugtighed under søvn, nedsat forbrug af alkohol, kaffe og krydderier, samt hyppig mundskylning Radioaktiv terapi mod hoved- og halsregionen (som behandling af kræftsygdom) kan medføre nedsat spytdannelse, i hvert fald ved de behandlingsprocedurer, der anvendtes tidligere Omkring 6-10% af en hel befolkning lider af mundtørhed, men for aldersgruppen over 50 år er andelen 25%, og for aldersgruppen over 80 år har 40% mundtørhed, men det skyldes som nævnt bivirkninger af medicin (ref10724 s31) Årsagen er, at disse lægemidler ikke er helt specifikke, så midler mod feks højt blodtryk vil bla også virke på spytkirtlernes nervecelle-receptorer Som tommelfingerregel gælder, at hvis der indtages mere end 4 lægemidler dagligt, vil mundtørhed være en sandsynlig bivirkning (ref10724 s30) Over 1000 lægemidler har mundtørhed som en mulig bivirkning (ref10724 s64) Det gælder feks alle lægemidler, som binder acetylcholin Diagnoser Ni grupper af proteiner udgør omkring 98% af proteinerne i spyttet Resten (omkring 2%) består af over 1200 forskellige proteiner (ref10699) Man har i spyt påvist biomarkører for bla inflammationssygdom (Creaktiv protein, CRP), hjerte-kar-sygdomme (hjerte-troponin), brystkræftmarkører (HER2-proteinet mv), oral cancer (interleukiner, tumor-nekrosefaktor-alfa og andre immunproteiner) (ref10701) Foruden Sjögrens syndrom (autoimmun kirtelgigt) er også andre sygdomme associeret med unormal spytfunktion: Bla Prader-Willi syndrom (fejl på kromosom-15) samt stressrelaterede sygdomme (ref10699) HIV-smitte Den amerikanske sundhedsstyrelse FDA har godkendt spyttest til påvisning af HIV I en rapport fra EU omtales, at spyttest for HIV har høj sensitivitet (96,2% - 100% i forskellige studier) og endnu højere specificitet (99,6% - 100%) (ref10735 s4) I testen påvises HIV-specifikt IgGantistof i spyttet Infektionen skyldes HIV-virus (human-immundefekt-virus), som angriber de såkaldte CD4-celler, som har en central rolle i immunforsvaret HIV-infektion vil uden behandling udvikle sig til AIDS (som kendetegnes ved en række følgesygdomme, som skyldes nedbrud af immunforsvaret) I de første 3 måneder efter HIVsmitte er viruskoncentrationen i kroppen (og dermed smittefaren) størst I de første 1-4 uger kan HIVantistof ikke måles i blodet, men det vil være muligt at måle HIV-antigen (dvs HIV-virusprotein) i en blodprøve Ved hjælp af en PCR-test kan man også påvise RNA (og kopi- DNA) fra HIV Derfor kan man nu teste personer, når de henvender sig, og de skal ikke mere vente i feks 3 måneder Et sikkert negativt svar kan gives efter 4 uger (ref10734 s10) Det er lettere at få folk til at acceptere en spyttest for HIV end en blodtest Brugen af spyttest for HIV muliggør hjemmetest (hvilket dog kan være etisk problematisk) 87% af antistofferne i spyt er af typen IgA (ref10734 s10) Niveauet af HIV-specifik IgA i spyt falder i takt med, at den smittede person udvikler symptomer, og IgA-tallet i spyt kan derfor bruges til at følge personens sygdom (ref10734 kilde 11) IgA fra spyt kan også påvise HIV-infektion i spædbørn (ref10734 s11) Desuden kan HIV-test fra helspyt bruges til at overvåge antistof-responset hos HIV-smittede personer ved at måle på tilstedeværelse af IgGantistof, der er HIV-specifikt (påvist med ELISA-test og efterfølgende bekræftet med Western-blot test) Kræft-påvisning i spyt Kræft skal helst påvises tidligt Man vil typisk påvise kræft ved en biopsi (udtagning af en vævsprøve), men denne metode kan ikke bruges til screening af en befolkning En spyttest ville derimod være velegnet Bugspytkirtel-kræft Pankreas-kræft (dvs bugspytkirtelkræft) blev i 2010 påvist med 90% (høj) følsomhed og 95% (høj) specificitet ved at screene spyt for fire mrna-biomarkører, der er specifikke for denne kræftform (ref10701) Brystkræft Kvinder med brystkræft har forhøjet niveau af en brystkræft-markør HER2/neu i både spyt og blod (ref10701) Desuden er brystkræft-markøren CA15-3 forøget, og tumor-re-
BioNyt - Videnskabens Verden nr158, wwwbionytdk 11 Øre-spytkirtlens udførselsgang Glandula parotidea accessoria pressor-protein-p53 er nedsat i spyt hos kvinder med brystkræft (ref10701) Studier tyder på, at brystkræft hos kvinder kan findes ved at påvise et højt niveau af to kræft-biomarkører (dels den omtalte CA15-3 og dels "erb"), men specificiteten kan være så lav som 70% (ref10734kilde 12) Dog kan spyttest for tumor-markører være med i en pulje af test, som tilsammen kan udgøre en diagnostisk test, Øre-spytkirtlen Underkæbe-spytkirtlen og evt skal man lade et computerprogram om at give diagnosen ud fra delresultaterne Oral cancer Kræft i mundhulen ledsages af ændringer i biomarkører i spyt (øget transferrin, øget cyclin-d1, nedsat mængde maspin) foruden af specifikke mrna er (hvor spyt-måling faktisk er bedre end blod-måling) (ref10701) Oral cancer har en dårlig prognose, idet 50-60% dør inden 5 år Ved cancer er dannelsen af proteinet p53 ofte nedsat p53 er et tumor-hæmmende protein, som syntetiseres af celler, der udsættes for DNA-skadelig stress (feks stress på grund af solpåvirkning) Hvis mutationerne inaktiverer p53-produktionen, øges risikoen for kræft Dannelse af det inaktive p53- protein kan medføre, at kroppen laver antistoffer mod dette protein Sådanne p53-antistoffer findes i blodet hos patienter med forskellige kræftformer p53-påvisning i spyt kan feks bruges til diagnose af oral kræft (ref10734kilde 11) Hvis spyt indeholder meget af det forsvarspeptid, der kaldes defensin-1, er dette også en indikator for oral cancer (ref10734kilde 11) Hormon-måling Påvisning af hormoner i spyt kan bruges til diagnoser for kirtelsygdomme, psykologiske diagnoser, fertilitetsundersøgelser, doping/ sportsmedicin og adfærdsstudier Man kan i spyt måle testosteron, progesteron og estriol - samt cortisol, der dog diffunderer langsomt over cellemembranerne; cortisol-hormonet øger dannelsen af glucose under stress, men udviser stor døgnvariation En bedre måling af stress opnås ved spyt-måling af hormonet chromogranin-a, som er et peptid, der udskilles samtidig med katekolaminer, som er akutte stressparametre (ref10734 s15) En sygdom, der medfører overpro-
12 BioNyt - Videnskabens Verden nr158 wwwbionytdk duktion af cortisol (Cushing syndrom), kan påvises med spyttest, der dog skal bekræftes ved en urintest (ref10734 s15) Tilstanden kan bla skyldes hypothalamus-tumor, der medfører overproduktion af CRH (corticotropin), der på sin side fører til øget udskillelse af ACTH (adrenocorticotropisk hormon), som i sidste ende fører til øget udskillelse af cortisol fra binyrebarken Ved medfødt mangel på cortisol (adrenal hyperplasi) mangler et enzym til at omdanne steroidhormonet 17alfahydroxyprogesteron til cortisol Diagnosen kan stilles ved en spyttest, der påviser ophobning af 17alfa-hydroxyprogesteron (ref10734 s15) Diagnose af fertilitetsproblemer kan tænkes at være mulig ved spyttest for kønshormoner Hormonerne for den kvindelige cyklus kan nemlig måles i spyt (progesteron og estradiol) Ligeledes kan testosteron måles i spyt hos mænd Hvis der måles under 0,2 nanomol testosteron pr liter i spyt er det tegn på hypogonadisme (ref10734 s15) Spyttest kan i øvrigt dokumentere doping med testosteron (nemlig påvisning af unormalt højt testosteron-tal i forhold til kroppens epitestosteron) (ref10734 s15) Det er vanskeligt at lave spytmåling for kortison, hypofyse-hormoner, proteinhormoner og DHEA (dehydroepiandrosteron) Det skyldes, at medens de ovenfor-nævnte hormoner er fedtopløselige og nemme at transportere over spytkirtelcellerne, fordi de er ukonjugerede stoffer, er de sidstnævnte (kortison, hypofyse-hormoner, proteinhormoner og DHEA) konjugerede stoffer, dvs bundet covalent til et En spyttest for HIV er godkendt i USA En EU-rapport roser denne test for stor følsomhed og specificitet, dog ikke altid 100% højpolært molekyle, og derfor vandopløselige, dvs mindre fedtopløselige Insulin kan (modsat andre hormoner) transporteres aktivt over spytkirtel-cellemembranerne (ref10734 s13, kilde12) Tobak og narkotika Når man indtager medicin eller ryger en cigaret vil dette efter ganske kort tid kunne spores i spyttet Udsættelse for passiv rygning, samt brug og misbrug, kan altså derved afsløres De fleste medikamenter er enten svagt basiske eller svagt sure De basiske stoffer har tendens til at ophobes i spyttet, fordi de ioniseres i det lidt sure spyt, og derfor ikke kan diffundere tilbage i cellerne igen Kokain på fri base-form kan påvises i spyt, og ved også at måle nedbrydningsproduktet BZE kan tidspunktet for kokain-indtagelsen afsløres Nedbrydningsproduktet BZE kan påvises i op til 10 dage med en grænseværdi på 1 ng/ml (ref10734 s17) Nikotin er et basisk alkaloid, som Sy lis-spyttest Det kan i nogle lande være vanskeligt at få kontakt til befolkningsgrupper, der har risiko for at blive smittet med syfilis Her kan spyttest være praktisk Den spyttest for syfilis, som man har til rådighed, kan bruges til epidemiologiske studier, men har ikke følsomhed nok til at være brugbar til diagnose eller screening, og kan ikke skelne mellem aktiv infektion og tidligere/behandlet infektion (ref10735 s7) Testen påviser antistoffer mod syfilisbakterien (TRFIA-test = Time Resolved Fluorescence Immuno Assay for IgG-antistoffer mod Treponema) Elektronmikroskopisk foto af syfilis-bakterien findes i spyttet allerede 2-5 minutter efter, at man har været udsat for passiv rygning Man måler dog på nedbrydningsproduktet cotinin, fordi det har en halveringstid på 20 timer (hvorimod nikotin-koncentrationen halveres på 3-6 timer) Hvis det er tandlægens opgave at få folk til at stoppe med at ryge kan en spyttest altså afsløre, om de rent faktisk er stoppet Desuden kan testen påvise passiv rygning (Passiv rygning i hjemmet har størst skadelig virkning (ref10734 s19) ) Nye analysemetoder muliggør udbredelse af spytdiagnostik Antallet af videnskabelige publikationer om afprøvning af forskellige metoder baseret på spytmålinger, (ref10699) (ref10700) er steget voldsomt (ref10701) Følsomme analysemetoder er meget afgørende, fordi koncentrationen af de biomolekyler, man ønsker at måle i spyt, er 100 gange, ja endog undertiden 1000-3000 gange, lavere end koncentrationen af disse biomolekyler i blod (ref10699) En spytprøve fra munden kan tages med en vatpind, og vatpinden kan sendes til lægen Viser prøven tegn på sygdom, kan lægen indkalde patienten til en mere detaljeret udredning Opgaven bliver i fremtiden at kunne bruge spyttest til nærmere indkredsning af sygdommens art Med spyttest vil man kunne nå flere mennesker, og opnå tidligere diagnose og derfor bedre udsigt til helbredelse og i tillæg opnå samfundsbesparelser I over 30 år har læger udnyttet test af spyt for forskellige sygdomme, men disse test var ikke særlig følsomme, og blev primært anvendt til at påvise steroidhormoner og antistoffer i spyttet I fremtiden kan spyt derimod komme til at spille en helt ny, stor rolle
BioNyt - Videnskabens Verden nr158, wwwbionytdk 13 ELISA-test Supplerende tekst og video: wwwbionytdk/elisa Test af spyt har traditionelt været udført med ELISAmetoden (enzymkoblet immuno-sorbent-analyse) ELISAteknik bruges ved mange diagnostiske tests, bla graviditets-test En ELISA-test bygger på reaktionen mellem et relevant målprotein og et specifikt antistof, der er mærket på en sådan måde, at målprotein/antistof-komplekset kan påvises Dette dannede målprotein/ antistof-kompleks indfanges af et andet specifikt antistof, som er fasthæftet til et bæremateriale (immobiliseret til en plastoverflade eller til magnetiske kugler), hvorved det bliver lettere at bortvaske de ikke-bundne stoffer Antistoffet kan være mærket med et enzym (feks peroxidase) Mængden af enzymaktivitet (feks altså peroxidase-aktiviteten) vil så svare til mængden af målproteinmolekyler Derefter tilsættes en væske, der skifter farve eller bliver fluorescerende, hvis det aktive enzym er til stede Farvereaktionen kan ske ved, at enzymet omdanner det ikke-farvede eller ikkefluorescerende substrat til et farvet eller fluorescerende produkt, som kan måles Jo mere farve, der dannes, jo mere er der af det pågældende målprotein i prøven Farveintensiteten måles i et fotometer ELISA-testen udføres på små plastikplader med 96 brønde (små fordybninger i pladen) til de enkelte prøver En sådan analyseplade muliggør automatisering af analysen ELISA-testene har givet en sensitivitet på 96% [det vil sige at 96% af de-rentfaktisk-positive som forventet var positive i testen] og en specificitet på 99,9% [dvs at 99,9% af de-rentfaktisk-negative som forventet var negative ifølge testen] (ref10734 s8) Man har videreudviklet en ELISA-test til spyt Den kaldes GAC-ELISA (IgGantibody-capture-ELISA) I visse studier er opnået sensitiviteter på 98-100% og specificiteter på 97,7-100% (ref10734 s9) Trin 4: Substrat tilsættes og giver signal via enzym Trin 3: Antistof (kemisk bundet til enzym) tilsættes Bindes via antistofdelen til målstoffet Trin 2: Prøve (med målstof) tilsættes, og fanges af antistof på pladen Trin 1: Antistof bundet til en plade Substrat afgiver signal Substrat for enzymet Kemisk binding Målstof ENZYM ANTISTOF nr2 ANTISTOF på plade Kemisk binding Specifik binding Fig: Sandwich-princippet i ELISA-testen (Bemærk at figuren skal læses nedefra; fra trin 1 til trin 4) Antistoffer binder målstoffet (trin 1-2) Et enzym fremkalder et signal, som registreres (trin 3-4) I denne version af en ELISA-test er et antistof bundet til en testbrønd-væg (Vist nederst på tegningen) En prøve tilsættes, og hvis målstoffet findes i prøven, bindes målstoffet til antistoffet (alt andet vaskes væk) Målstoffet bindes derefter til et antistof/enzym-kompleks, som ved substrat-tilsætning fremkalder et fluorescens-signal)
14 BioNyt - Videnskabens Verden nr158 wwwbionytdk Af Ole Terney Supplerende tekst og video: wwwbionytdk/pcr PCR metoden PCR-teknologien I 1980 erne blev der opfundet en PCR-teknologi (polymerase chain reaction), som var meget mere følsom end ELISA Det grundlæggende princip ved PCR er beskrevet udførligt i BioNyt nr 72 (ref10702) PCR-teknikken bygger på opformering af det bestemte område af det genetiske materiale, DNA, som man ønsker at påvise i en biologisk prøve (DNA-området kan feks indeholde en basesekvens, der kendetegner en genetisk sygdom, eller som stammer fra et virus eller en parasit) Kopieringen af dette DNA går lynhurtigt ved hjælp af PCR-metoden: På få timer kan man få rigeligt med DNA til nærmere undersøgelser Ved PCR-metoden kræves meget lidt DNA som udgangspunkt, fordi opformeringen af det valgte DNAstykke er så præcis Dette er basis for metodens anvendelighed For at undgå forurening med andre DNAsekvenser, er det imidlertid nødvendigt, at processen forløber afskærmet fra omgivende forureningskilder PCR i korte træk: Trin 1: Kraftig opvarmning til ca 95 C i 1-2 minutter (Det dobbeltstrengede DNA adskilles derved) Trin 2: Temperaturen sænkes langsomt til 55 C i 2 minutter (Der tilføres to PCR-primere, som er fremstillet til specifikt at binde til det stykke DNA, der skal kopieres, målsekvensen ) Der er to primere, fordi de bindes til hver af de to strenge i DNA, se figuren overfor Trin 3: Temperaturen hæves til 72 C (DNA-syntesen sættes i gang med enzymet DNA-polymerase, der kan tåle denne høje temperatur DNApolymerase-enzymet kan kun påsætte deoxyribonukleotider på enden af PCR-primeren Derfor starter kopieringen kun ved målsekvensen) Ved at gentage processen 20-40 gange, dannes flere og flere målsekvenser, som efterfølgende kan bestemmes DNA-polymeraseenzymet, der bruges ved PCR-metoden, har to vigtige begrænsninger: Enzymet kan ikke selv starte DNA-syntesen (men skal have en primer-ende; 3 OH), og enzymet kræver en skabelon i form af den anden DNA-streng Disse to krav sikrer, at man kan opformere målsekvensen på en specifik måde (ref10702) PCR-metoden stiller særlige krav til analyseudstyr og uddannelse af personalet Metoden er omstændelig at udføre på grund af de gentagne temperaturskift, og der er risiko for opformering af ikke-relevant nukleinsyre PCR-metoden er af disse grunde ikke blevet udbredt uden for specialiserede laboratorier Gammel PCR-maskine Traditionel PCR-maskine Moderne PCR-maskine (G-STORM GS4 thermal cycler)
BioNyt - Videnskabens Verden nr158, wwwbionytdk 15 Målområde (Det interessante område) 95 o C Den høje temperatur medfører at DNAstrengene går fra hinanden (denaturering) Denatureringstrinnet 55 o C Den lave temperatur medfører, at DNAprimerne danner basepar med den komplementære DNA-skabelon (annealing) DNAstrenge fungerer som skabelon for nydannelse af DNA-strenge Annealingstrinnet 72 o C Ved denne temperatur forlænger polymerase-enzym primerne under dannelse af nye DNA-strenge i begge retninger Nydannelse af DNA-strenge Syntesetrinnet Princippet i PCR-metoden Resultat: Voldsom opformering af DNA-området
Af Ole Terney Supplerende tekst og video: wwwbionytdk/rca RCA Rolling Circle Ampli cation PCR-teknologiens a øser: RCA-metoden PCR-metoden kræver som nævnt, at temperaturen styres, og hele tiden veksler mellem 95 C / 55 C / 72 C Det kan ganske vist automatiseres, men kræver laboratorieudstyr RCA-metodens opdagelse RCA-metoden blev opfundet i begyndelsen af 1990 erne I første omgang var det en ny metode til opformering af DNA og forstærkning af signalet til bla diagnoser (ref10703) Metoden opformerer DNA'et ved at lade et DNA-polymerase-enzym aflæse cirkulært DNA igen og igen under nydannelse af DNA undervejs Fordele ved RCA-metoden RCA-metoden har et helt afgørende træk: Den kan foregå ved omgivelsestemperatur (isotermisk) Dette muliggør analyse uden opvarmning - og kan dermed udføres uden elektricitet (ref10703) Det giver RCAmetoden et stort potentiale på steder i verden uden elektricitet (ref10705) RCA-metoden er (sammenlignet med PCR) desuden mere enkel at udføre, meget følsom og specifik og kan påvise ikke blot DNA og RNA (som PCR-metoden er begrænset til), men kan også påvise proteiner og andre biomarkører (ref10708) I princippet kan der ved hjælp af RCAmetoden hurtigt og simpelt stilles en diagnose på mange livstruende sygdomme - blot med en lille blodprøve eller en lille spytprøve Mål-DNA RCA-metoden til opformering af DNA bygger altså på, at man på forhånd kender base sekvensen for det stykke DNA ("mål-dna'et", target- DNA), som man vil påvise og opformere til et signal-niveau, hvis det eventuelt findes i prøven En ringformet hjælpeprobe er ofte nødvendig i RCA-metoden Der anvendes typisk en hjælpeprobe, der kan danne en DNA-ring Hjælpeproben har i enderne DNA-områder, som er komplementære med mål-dna'et Hybridisering mellem den ringformede hjælpe probe og mål-dna'et (target-dna) Da hjælpeprobens ender er komplementære med mål-dna'et, hybridiserer de til mål-dna'et Det sker, når hjælpeproben opdager mål- DNA'et Derefter er det opgaven at gøre dette til et synligt signal DNA-polymerasen RCA-metoden medfører nydannelse af DNA, som er en kopi af mål-dna'et Til nydannelse af DNA kræves et DNA-polymerase-enzym (som navnet siger laver enzymet en polymer af DNAmolekyleenheder) RCA-primeren DNA-polymeraseenzymet kræver (et oligonukleotid af deoxyribonukleo tider) en RCA-primer, som enzymet kan starte på Polymeraseenzymet kan nemlig ikke starte sin DNA-syntese på enkeltstrenget DNA Enzymets funktion i RCA DNA-polymerase-enzymet starter i enden på primeren, og nydanner derefter DNA, som er komplementært med den ringformede DNAstreng DNA-polymerase-enzymet aflæser altså det ringformede DNA i omgang efter omgang, cirkel efter cirkel, rundt og rundt (Hvis der kun er én type primer tilstede danner enzymet en lang tandem af forbundne kopier af det cirkulære DNA Dvs gentagne DNA-sekvensstykker, som perler på en snor) Aflæsningen af DNA-cirklen kommer til at ligne situationen, hvor man ruller en ledning af en tromle - blot med den forskel, at ledningen dannes undervejs Dannelsen af RCA-produktet Under tilstedeværelse af de 4 deoxyribonukleotider, som er byggesten for DNA, ruller den ene kopi efter den anden af det cirkulære DNA, medens det allerede dannede DNA undervejs løsnes fra dobbelt-dnastrengen Produktet ruller af det cirkulære DNA, deraf navnet RCA, rolling circle amplification, eller i korthed RCA-metoden Amplifikation betyder (signal)forstærkning Signalet forstærkes, fordi der sker en opformering af DNA'et En dansk oversættelse kunne være rullecirkel-forstærkning, rullecirkel-opformering, rullecirkel-amplifikation, rotationscirkel-amplifikation eller lignende)
PCR-metodens a øser Mikrochip RCA-princippet Indfangning (hybridisering) Hul lukkes ( ligering ) Ny DNA dannes og mål-dna'et skubbes af Fluorescerende signalsekvens Signal fra det opformerede DNA Opformering af DNA Hvis DNA-polymerasen katalyserer syntese af det cirkelformede DNA feks 1000 omgange, bliver der dannet 1000 delprodukter Disse delprodukter har alle information om mål-dna-sekvensen og signalsekvensen Kobling til en fast overflade Man lader ofte RCA-primeren være koblet til en fast overflade Derved hænger hele tandem-sekvensen fast til denne overflade (immobilisering) På denne måde kan man synliggøre et enkelt mål-dna i en vævsprøve, fordi det lange stykke af nydannet DNA hænger fast på den faste overflade, og her afgiver et signal Signalet Hjælpeproben kan indeholde en signalsekvens, der senere kan bruges til at synliggøre slutproduktet På DNA-polymerasens vej bliver denne hjælpeprobes signalsekvens aflæst Hver runde giver et delprodukt, som dels indeholder information om mål-dna-sekvensen, dels signal-sekvensen Synliggørelse af den afrullede streng af kopi-dna kan ske ved, at en af de fire deoxyribonukleotider var mærket med et fluorescerende molekyle Den oprindelige mål-dna streng skubbes bort Ligering (sammenføjning) DNA-polymeraseenzym (forlænger DNA-strengen) Synliggørelsen kan også ske efter at overskydende reagens er vasket væk - nemlig ved at tilsætte fluorescensmærkede oligonukleotider, som hybridiserer med det nye DNA (dvs binder sig specifikt hertil) (ref10713) Fremgang for RCA-analysen Vadim V Demidov opsummerede i 2005, hvordan ti-året 1995-2005 var gået med hensyn til analyser inden for DNA-diagnostik (ref10708) I 2005 var PCR stadig den dominerende analysemetode ved DNA-diagnostik Men PCR var ved at blive indhentet af de metoder, som ikke kræver opvarmning i løbet af analyseprocessen - og især RCA-metoden var blevet mere og mere populær I 2005 arbejdede flere biotek-firmaer på at udvikle en kommerciel diagnoseanalyse baseret på RCA-princippet (ref10708) (bla Quiagen og Hamilton Thorne Biosciences fra USA, Amersham Biosciences fra UK, Olink Bioscience fra Sverige og Biokit fra Spanien) RCA-metoden er senere blevet modificeret på utallige måder (ref10703) (ref10705)
18 BioNyt - Videnskabens Verden nr158 wwwbionytdk Minikugler Minikugle-metode kombineret med RCA-metoden: I 2009 beskrev T Konry og kollegaer en kombination af dels minikugle-analyser til at indfange de stoffer, der skal analyseres, og dels et RCA-baseret system til at opnå stærkt øget følsomhed af analysen (ref10714) Minikugler kan på overfladen bære monoklonale antistoffer til at indfange proteiner som feks interleukin-8 (IL- 8) Man bringer minikuglerne sammen med det protein, der skal bestemmes (i eksemplet her er proteinet altså interleukin-8) Med endnu et antistof får man interleukin-8 til at sidde i sandwich mellem de to antistoffer Derefter udføres RCAanalyse til opformering af signalet Trin A: En minikugle belagt med antistoffer mod feks signalstoffet interleukin-8 indfanger dette stof Trin B: Der sker en avidin/biotinhjulpet binding til en indfangningsprobe, der ved hybridbinding er koblet til en hjælpeprobe Det store molekyle avidin og det lille molekyle biotin bindes meget stærkt til hinanden Til biokemiske analyser bruges denne avidin/biotin-binding meget ofte Avidin kan binde sig til flere biotin-molekyler Trin C: Hjælpeproben (også kaldet padlock probe, "låse-dna-stykke") indfanger mål-dna'et, fordi hjælpeproben har en sekvens, så hver ende hybridiserer til kendte områder i det DNA-målområde, der skal påvises Trin D: Hjælpeproben bringer derved DNA-enderne sammen, så de kan lukkes med et enzym for at opnå en cirkeldannelse Hullet lukkes af dette enzym, en DNA-ligase Trin E: Der er nu tilvejebragt et Minikugle bundet til monoklonalt antistof (mab) Interleukin-8 Biotin-bundet mab Avidin Biotin-bundet indfangnings-probe Hjælpe-probe Mål-genet Signal-probe grundlag for en RCA-amplifikation med det ringformede DNA som udgangspunkt (ref10714) Trin F: Signalprober genkender og hybridiserer til dele af den dannede DNA-streng Tilstedeværelsen af DNA-stykket er dermed bekræftet ud fra signalet fra signalproberne Feks ved at hybridisere med fluorescensmærkede signalprober Med denne type analyse kunne man måle helt ned til 1 pm mål- DNA og 10 fm interleukin-8 i samme analyse (ref10714) RCA-patenter Udviklingen af RCA blev hæmmet af patentsituationen (ref10708) Patenter kan både fremme og hæmme udviklingen Det første patent inden for et nyt felt er ofte formuleret meget bredt for at sætte sig på hele feltet Al efterfølgende udvikling kommer i voldsom afhængighed af det første patent, og der betales licenser for kommerciel udnyttelse Dette skete med RCA-metoden Den første patentansøgning havde J I Auerbach som opfinder og titlen Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules Den blev i 1994 til US-patent nr 5354668 (ref10708) I 1990 erne kom mange andre patentansøgninger Situationen blev kompleks med gensidig afhængighed mellem de forskellige patenter (ref10708) En sådan situation kan føre til store stridigheder om rettighederne Et patent giver kun en geografisk afgrænset ret Et US-patent gælder således kun i USA (Danmark kan være dækket af et nationalt patent eller af et europæisk "EP-patent") Det kræver et stort arbejde at afklare, i hvilke lande der findes et gyldigt patent på en teknologi Videreudvikling af RCA-test RCA-teknologien kan bruges sammen med mange forskellige målemetoder Den omfattende udvikling af RCA-teknologien siden starten i 1990 erne opsummeres af danske forskere i en artikel med ikke mindre end 206 referencer (ref10718) RCA-metoden er blevet kombine-