HAR ADIPØSE STAMCELLER EN IMMUNSUPPRIMERENDE EFFEKT?

HAR ADIPØSE STAMCELLER EN IMMUNSUPPRIMERENDE EFFEKT? Aalborg Universitet Medicin og MedIS 4. semester 29/5-2013 Vejleder: Simone Elkjær Riis Af: Arvin Nahavandipour Elin Danielsen Lunde Maj Roja Stougaard Andersen Malene Mølbak Andreassen Robert Winther Simone Lund Lauritsen

HAR ADIPØSE STAMCELLER EN IMMUNSUPPRIMERENDE EFFEKT? Normalsider: 39 Appendix antal: 4 Titel: Tema: Har adipøse stamceller en immunsupprimerende effekt? Eksperimentielt projekt kontrol af cellevækst Projektperiode: 24/4 2012 29/5 2012 Projektgruppe: 408 Medlemmer: Stud.med, Arvin Nahavandipour Stud.med. Elin Danielsen Lunde Stud.scient.med Maj Roja Stougaard Andersen Stud.scient.med Malene Mølbak Andreassen Stud.med Robert Winther Stud.med Simone Lund Lauritsen Vejleder: Ph.D- stipendiat Simone Elkjær Riis Arvin Nahavandipour Elin Danielsen Lunde Maj Roja Stougaard Andersen Malene Mølbak Andreassen Robert Winther Simone Lund Lauritsen 2/43

1. Abstract Previous studies have shown an inhibitory effect on dendritic cells (DC) mediated by adipose derived mesenchymal stem cells (ASC). However, it is still unclear how this effect is mediated. This study investi- gates the interactions between ASC s and monocytes/dc s by focusing on both differentiation and maturation of DC s derived from CD14 + monocytes in vitro. Four setups are used to clarify how this immuno- regulatory effect might be mediated, and those are respectively conditioned medium added early or late (spontanious cytokine secretion), co- culture (cell- cell contact) and transwell- insert (cytokine secretion). To investigate the results from the four setups, flow cytometri (FCM) was used to clarify the expression of the markers HLA- DR, CD80, CD83 and CD86. Furthermore quantitative polymerase chain reaction (qpcr) was used to detect whether or not TGF- β- gene- expression was present in ASC. Through the use of FCM, it was demonstrated that the suppressive effect was more prominent in co- culture when cell- to- cell contact was possible, but the effect was still shown through a lesser extent by non- spontan cytokine secretion. The inhibitory effect was detected by downregulation of CD83, CD80, CD86 and HLA- DR using FCM. qpcr did not show an expression of TGF- β in ASC. In conclusion, the results revealed that conditioned medium from ASC had no significant effect, while ASC showed a possible inhibition of monocytes differentiation to DCs through soluble factors and an even stronger inhibitition when cell- to- cell contact was possible. These results indicate that ASC pro- vides a broad clinical potential as in organ transplantation. 3/43

2. Forord Dette projekt, omhandlende adipøse stamcellers effekt på immunsystemet, er udarbejdet af seks stude- rende på fjerde semester på medicin og medicin med industriel specialisering ved Aalborg Universitet i perioden april- maj 2013. Formålet bliver beskrevet som følgende i studieordningen: At udvikle færdig- heder inden for molekylært/cellulært laboratoriearbejde. At videre udvikle akademiske kompetencer indenfor læring, samarbejde og projektstyring. Projektet er foregået som et samarbejde mellem fire projektgrupper, hvorfor vi vil takke disse. Ligeledes takkes vejlederne Romana Maric og Trine Fink samt laborant Brita Holst Jensen. En særlig tak til vores primære vejleder, Simone Riis, som har bistået os i udarbejdningen af dette projekt. 4/43

3. Læsevejledning I dette projekt anvendes medicinske og immunologiske fagtermer, hvorfor det forventes, at læseren har et forudgående kendskab til denne terminologi eller forinden har sat sig ind i dette. I projektet benyttes endvidere forkortelser for hyppigt anvendte termer. Første gang en af disse benyttes, vil denne være skrevet fuldt ud, og forkortelsen vil være angivet i parentes herefter. Efterfølgende vil forkortelsen blive anvendt. Ligeledes vil der i projektet blive benyttet engelske ord, hvor det ikke har været muligt at finde tilsvarende danske synonymer. Når der refereres til mesenchymale stamceller (MSC), er dette ment i betydningen knoglemarvsderiverede MSC. Dette er grundet, at tidligere undersøgelser er baseret på disse. Adipøse stamceller er som bekendt en type MSC og antages at have en sammenlignelig effekt med knoglemarvsderiverede MSC. I teksten er referencerne angivet efter Harvard- modellen. De referencer, der indeholder * henviser til hjemmesider. Samtlige referencer vil kunne findes i litteraturlisten bagerst i rapporten. 5/43

Indholdsfortegnelse 1. Abstract... 3 2. Forord... 4 3. Læsevejledning... 5 4. Introduktion... 8 5. Problem... 10 Problemformulering... 10 Problemstillinger... 10 6. Baggrund... 11 Mesenchymale stamceller... 11 Adipøse stamceller... 11 Dendritiske celler... 12 Celleinteraktioner mellem ASC og DC... 13 Celle- celle kontakt... 13 Opløselige faktorer... 14 Mesenchymale stamcellers påvirkning af dendritiske celler... 15 MSCs påvirkning på differentieringen fra monocytter til umodne DC er... 15 Mesenchymale stamcellers påvirkning af modningen af DC... 16 Mesenchymale stamcellers påvirkning af modne dendritiske celler... 16 Mekanismerne bag MSCs påvirkning af DC... 16 MSC versus ASC... 17 Mesenchymale stamcellers kliniske relevans... 17 Flowcytometri... 19 Antistoffer samt isotyper... 20 qpcr:... 21 Trinene i qpcr... 21 8. Metode... 23 Cellekulturer... 23 Klargøring af ASC, HEK og konditioneret medie samt tilvænning til medie... 24 Dag - 5... 24 Dag - 2... 24 Høst af konditioneret medie... 24 Dag - 1... 24 Høst af celler... 25 CO- kultur... 26 Transwell- insert... 26 Konditioneret medie 1... 27 Konditioneret medie 2... 28 Dag 0... 28 Dag 2 og 5... 29 Dag 6... 29 Dag 7... 30 Flowcytometri... 30 6/43

9. Resultater... 33 Flowcytometri... 33 qpcr... 37 10. Diskussion... 39 11. Konklusion... 41 12. Perspektivering... 42 13. Litteraturliste... 43 Appendix... 47 7/43

4. Introduktion Organtransplantationer kan være en livsforlængende eller livsreddende behandling i tilfælde, hvor anden behandling ikke er mulig. De sidste 50 år har der været foretaget et stigende antal transplantationer [WHO*], men proceduren er forbundet med flere komplikationer som eksempelvis afstødningsreaktion [Agger et al, 2011]. Dette forsøges forebygget ved hjælp at immunsuppresive farmaka, hvilket dog ofte er forbundet med uønskede bivirkninger [ProMedicin*]. Forskning [Zhang et al. 2004] har vist, at der er et sammenspil mellem mesenchymale stamceller (MSC) og immunforsvaret. Dette sammenspil er eksempelvis blevet kendt ved MSCs negative påvirkning af dendritiske celler (DC). Disse har en unik position i regulationen af celler i den adaptive del af immunforsvaret, da de blandt andet er de mest potente antigenpræsenterende celler [Agger et al. 2011] og er derfor en vigtig brik i immunforsvarets reaktionsevne. Det overvejes, om denne viden og egenskab kan udnyttes i relation til organtransplantationer i fremtiden for at undgå de immunresponser, der kan opstå ved disse procedurer. Dog er stamceller mest kendt for deres egenskaber, som bruges inden for forskning i regenerativ medicin [Sadler, 2010]. Der findes mange forskellige typer stamceller, hvor adipøst deriverede mesenchymale stamceller (ASC), som navnet indikerer, er en type stamceller, der findes i adipøst væv, og som for den terapeutiske anvendelse, er lettere at skaffe i tilstrækkeligt antal. Denne lette tilgængelighed i form af isolering fra det cellulære affaldsprodukt fra fedtsugninger er medvirkende til at gøre ASC interessante sammenlignet med MSC, der kun findes i sparsommelige mængder samt er mindre tilgængelige. Det antages derfor, at ASC kan være en vigtig brik som immunregulatorer i fremtidens behandlingsmetoder, da de ydermere har vist sig at have en stærkere inhiberende effekt på immunsystemet sammenlignet med MSC [Ivano- va- Todorova et al, 2009]. ASC s unikke egenskaber, herunder plasticitet, differentieringskacitet og evne til selvfornyelse er vigtige indenfor regenerativ medicin, og de senere år har der ydermere været fokus på ASC ers immunsupprimerende karakteristika, hvilket giver disse et interessant aspekt i forhold til behandling ved organtransplantationer [Jiang et al, 2005]. Klinisk er dette en stor fordel inden for immunsuppresiv behandling, da stamceller kan være med til at modvirke afstødning af organet samt graft versus host- effekten (GvH) [Aggarwal, Pittenger, 2001]. I 2002 blev mesenchymale stamceller fra bavianer testet in vivo ved administration af autologe MSC forud for transplantation af en allogen donors hud. MSC hæmmede T- celleproliferationen og derved gik der længere tid før, at bavianen afstødte den allogene hud sammenlignet med en ikke- behandlet kon- 8/43

trol [Bartholomew, et al, 2002]. Mekanismerne bag den immunsupprimerende effekt på T- celler er ikke fuldt ud klarlagt, da mange aspekter er involveret. En del af effekten tænkes at være medieret via dendritiske celler [Ramasamy et al, 2006]. I forlængelse af den immunsupprimerende effekt på T- celle proliferation in vitro, blev DC s rolle i denne suppression videre undersøgt. Studier har vist, at MSC hæmmer alle stadier af DC s livscyklus herunder differentiering, modning [Jiang et al, 2005] samt aktivering [Zhang et al, 2004]. Den molekylære meka- nisme bag den hæmmende differentiering er vist at komme som følge af nedregulering af cyklin D2 og herved blokering af monocytter i G0/G1- fase [Ramasamy et al, 2006]. Både direkte celle- celle kontakt og cytokiner er involveret i den supprimerende effekt på dendritiske celler, men nogle studier har indikeret, at cytokiner påvirker MSC i størst omfang så længe ratio MSC:DC er større end 1:10 [Zhang et al, 2004]. I 2004 blev det demonstreret, at ASC viste samme hæmmende effekt på MLR (mixed lymfocyt reaction) som MSC, men det krævede dog celle- cellekontakt for at udøve fuld inhibitorisk effekt [Puissant et al, 2004]. I 2009 blev ASC s indvirkning på DC er ligeledes undersøgt, og resultatet viste, at ASC havde en større inhiberende effekt på differentiering og modning af DC er end MSC. Det skal dog pointeres, at mekanis- men bag den stærkere inhibitoriske effekt hos ASC ikke kendes. En hypotese er, at denne effekt ses som følge af en højere mængde eller af andre typer opløselige faktorer [Ivanova- Todorova et al, 2009]. Formålet med projektet er at kortlægge de mekanismer, som spiller ind på ASC s påvirkning af CD14 + monocytters differentiering til DC er. Dette forsøges belyst via samarbejde med tre andre grupper, hvor der undersøges, hvorvidt det er intercellulær- kontakt (co- kultur), cytokinpåvirkning (transwell- insert) eller spontan cytokinpåvirkning (konditioneret medie), der skaber den immunsupprimerende effekt. For at kvantificere de forskellige resultater bruges flowcytometri (FCM), hvor de forskellige overflade- markører og cytokiner, der specifikt udtrykkes på monocytter, umodne DC er og modne DC er sammen- lignes. Ligeledes benyttes quantitative polymerase chain reaction (qpcr) for kvantitativ vurdering af udtrykket af transforming growth factor- beta (TGF- β). 9/43

5. Problem Problemformulering Hvilken indflydelse har adipøst deriverede mesenchymale stamceller på differentieringen af monocytter til dendritiske celler? Problemstillinger Er der en observerbar forskel på differentieringen af monocytter i co- kultur med ASC i forhold til de negative kontroller samt i hvilken grad? Optræder der en forskel i forhold til denne differentiering i forsøgene med co- kultur, transwell- insert og konditioneret medie? Stemmer vores resultater overens med tidligere viden? Kan den mulige immunsupprimerende effekt benyttes i et klinisk perspektiv? 10/43

6. Baggrund I dette afsnit gennemgås viden, som vurderes relevant for forståelsen af dette projekt. Mesenchymale stamceller Stamceller er celler, som har evne til at differentiere til et vidt spektrum af modne celler, herunder knogle-, brusk-, adipøse-, muskel- og endothelceller. Ligeledes besidder de evnen til at genskabe sig selv. Disse nævnte karakteristika er unikke for stamceller og er grundlaget for, at der i høj grad forskes i at kunne udnytte stamceller klinisk [Reya et al, 2001]. MSC er multipotente, nonhæmopoietiske progenitorceller, som er i stand til at videredifferentiere sig til en bred vifte af mesenchymale celler [Nauta et al, 2006]. De mesenchymale stamceller (uafhængigt oprindelse) kan isoleres fra de fleste væv, herunder knoglemarven, fedt, lever, amnionvæske, lungerne, skeletmuskulatur samt nyrerne. I denne forbindelse er kriterier omhandlende mesenhymale stamcellers karakteristika som følger: Plastisk adhærens Have ekspression af markørerne CD73 og CD105 Mangle markørerne CD14, CD34 samt CD45 Skal være i stand til at differentiere sig til osteoblaster, adipøse celler eller chondroblaster [Dominici et al, 2006]. Adipøse stamceller Stamceller kan som nævnt isoleres fra forskellige typer væv. ASC er lettere tilgængelige end MSC [Baer, Geiger, 2012], da ASC kan oprenses via fedtsugning, hvor subkutane adipøse depoter tømmes. Foruden dette er det for ASC ydermere gældende, at: Der er mangel på markørerne CD14, CD34, CD4, CD11b, CD14, CD31 samt HLA- DR De er i stand til at differentiere til osteoblaster, adipøse celler og chondroblaster De har ekspression af markørerne CD10, CD13, CD29, CD 44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD166, HLA klasse I [Baer, Geiger, 2012]. 11/43

En af forskellene mellem ASC og MSC er deres ekspression af CD34- antigen, som ASC er udtrykker. Des- uden har det vist sig, at ASC har en stærkere immunsupprimerende effekt end MSC. Det eksakte grundlag herfor er ukendt, men en mulig årsag kan være, at ASC i højere grad secenerer opløselige faktorer [Ivanova- Todorova et al, 2009]. Dendritiske celler DC, der som de øvrige leukocytter, stammer fra de hæmatopoietiske, pluripotente stamceller i knoglemarven, betragtes som immunsystemets mest potente antigenpræsenterende celler [Lillevang, Møller, 2009; Jiang et al, 2005]. DC udtrykker konstant MHC I og MHC II (HLA- DR), men disse bliver yderligere opreguleret ved stimulering, i modsætning til andre antigenpræsenterende celler, som ikke har MHC med videre, udtrykt før stimulering [Geneser, 2011]. De findes primært i de sekundære lymfoide organer, men også i ikke- lymfoide organer. Med deres plads i det innate immunsystem er de vigtige celler i initieringen af det adaptive immunrespons blandt andet i kraft af deres evne til at stimulere hvilende T- celler. DC kan opdeles i to hovedkategorier: umodne samt modne, og disse har i deres respektive differentieringstrin forskellige egenskaber. Modningen fra umoden til moden DC kan ske, hvis en umoden DC udsættes for et stimulus, eksempelvis LPS [Agger et al, 2011; Zhang et al, 2004]. Umodne DC har et middelhøjt niveau af MHC I og MHC II på deres overflade og er specialisere- de i antigenoptagelse, hvilket sker ved pinocytose [Geneser, 2011]. CD1a er en typisk markør for DC på dette differentieringstrin [Zhang et al, 2004], men nogen egentlig markør herfor er ikke klarlagt [Agger et al, 2011]. De umodne celler findes i lymfe- og blodcirkulation, men også i alle typer væv. [Gyldendals Åbne Encyklopædi - DC*]. Modne DC findes primært i de sekundære lymfoide væv, hvortil de vandrer til efter påvirkning af maturerende signaler og her venter på at præsentere antigen for en T- celle [Garbi, Kreutberg, 2012]. De optager antigen mindre effektivt, men de kan derimod stimulere T- lymfocytter på grund af en kraftig opregulering af MHC I og MHC II og co- stimulatoriske molekyler (CD80 og CD86) [Agger et al, 2011]. Markører specifikke for modne dendritiske celler i forhold til umodne DC er er således CD80, CD86, HLA- DR og CD83, hvorimod de modsat monocytter, ikke udtrykker CD14 +. Derudover bør det nævnes, at DC ydermere udtrykker forskellige receptorer, heriblandt Fc- receptorer [Jiang et al, 2005]. 12/43

I blodet findes hovedsagligt DC er af myeloid oprindelse. Myeloide DC er kan dyrkes fra CD14 + monocytter in vitro ved tilstedeværelse af granulocyt makrofag colony stimulating factor (GM- CSF) og interleu- kin- 4 (IL- 4), hvilket kan udnyttes eksperimentielt [Jiang et al, 2005]. Celleinteraktioner mellem ASC og DC Celler kan interagere med hinanden, men for ovenstående celletyper er det er dog stadig ukendt, hvorledes denne interaktion foregår - der er dog to muligheder: Via direkte celle- celle kontakt Via sekretion og optagelse af ulige opløselige faktorer [Agger et al, 2011]. Celle-celle kontakt Begrebet celle- celle kontakt refererer til direkte interaktioner mellem celler, der etableres i form af forskellige celle- junctions ved hjælp af overflademolekyler. Disse celle- junctions kan være permanente, såsom tight- junctions mellem epitelceller, eller de kan være midlertidige, hvilket er tilfældet for immunceller, som medierer deres respons ud fra ændringer i omgivende mikromiljø eksempelvis ved in- flammation [Cooper, 2000]. ASC besidder flere adhæsionsmolekyler, der er involveret i T- celle interaktioner, herunder vaskulær celle ad- hæsions molecule- 1 (VCAM- 1), intercellular adhæsions molecule- 1 (ICAM- 1), og leukocyte function- associated antigen- 3 (LFA- 3) (se figur 6.1) [Jiang et al, 2005]. Ud- trykning af disse molekyler på ASC kan forklare, at ASC inhiberer T- celler i mixed lymfocyt reaktion (MLR) i stør- re grad, hvor celle- cellekontakt er tilladt (co- cultur) sammenlignet med forhold, hvor kun cytokin- påvirkning var mulig (transwell- insert og konditoneret medie) [Puissant et al, 2004]. Dog har studierne med Eksempelvis TFG- beta secerneret af MSC Eksempelvis IL- 12 secerneret af T- celle Figur 6.1. Illustrationen viser, hvordan en T- celle og en mesenchymal stamcelle (MSC) kan adhærere til hinanden vha. adhæsionsemolekylerne (ICAM- 1 og LFA- 1), og danner et begrænset kontaktområde [Agger et al, 2011]. MSCs påvirkning af DC er vist andre resultater. Ligeledes har konditioneret medie fra MSC vist varierende effekt på DC, men denne var generelt mindre inhiberende end hos co- kultur [Nauta et al, 2006; Zhang et al, 2004]. Mere interessant er, at den inhibitoriske effekt var i samme størrelsesorden, selvom 13/43

cellekontakten var hindret ved hjælp af transwell- insert, hvis ratio MSC:monocyt var 1:10 eller større [Jiang et al, 2005]. Dette indikerer, at cytokinpåvirkning kan have større betydning end celle- celle kontakt i relation til MSCs påvirkning af DC er. Opløselige faktorer Opløselige faktorer er et vidt begreb, der refererer til blandt andet humorale komponenter. Dette er eksempelvis cytokiner, som spiller en væsentlig rolle i den immunologiske cellulære kommunikation [Agger et al, 2011]. Cy- tokiner er intracellulære signalmolekyler, der kan udøve deres virkning gennem autokrin, endokrin eller parakrin stimulation [Cannon, 2000]. Cytokinpåvirkningen kan un- dersøges ved at bruge transwell- inserts, hvor muligheden for celle- celle kontakt fjernes, mens muligheden for cyto- kinpåvirkning bibeholdes. Herved tillades parakrin cyto- kinstimulation via DC til MSC og via MSC til DC (se figur 6.2). Derimod kan der ved brug af konditioneret medie ikke være en påvirkning af MSC fra DC, da mediet høstes uden at være i kontakt med monocytter/dc, men de spontant secernere- de cytokiner fra MSCs medie kan påvirke DC (se figur 6.3). Flere studier har indikeret, at cytokiner har en stor betydning i differentieringen af monocytter samt modningen til DC [Jiang et al, 2005; Nauta et al, 2006]. TGF- β er et cytokin, som har adskillige funktioner. Heriblandt er det i stand til at hæmme cellers aktivering og differentiering og derved muligvis udøve en immunsupprimerende effekt [Puissant et al, 2004]. Det udskilles af flere celletyper, hvor det for DC, leukocytter og makrofager virker både auto- og parakrint [Let- terio, Roberts, 1998]. Tidligere studier har forsøgt at påvise Eksempelvis TFG- beta secerneret af MSC Eksempelvis IL- 12 secerneret af T- celle Figur 6.2 Billedet illustrerer, hvorledes to celletyper kan påvirke hinanden gennem parakrin og autokrin stimulation af cytokiner, men hvor en mikroporøs transwell- membran ikke tillader celle- celle kontakt. Der dannes heller ikke et lukket rum mellem adhæsionsmolekyler, som cytokinudveksling kan begrænses til. DC = dendritisk celle. MSC = mesenchymal stamcelle[agger et al, 2011]. Eksempelvis TFG- beta secerneret af MSC Eksempelvis IL- 12 secerneret af T- celle Figur 6.3 Illustrationen viser, hvordan spontant secer- nerede cytokiner i konditoneret medie fra mesenchymal stamcelle (MSC) kan påvirke dendritisk celle (DC). Det er dog en envejs- påvirkning, da DC ikke kan på- virke MSC til sekretion. ændringer i nævnte cytokins ekspression ved tilstedeværelse af MSC. Resultaterne har været varierende, da et studie ikke har observeret en målbar cytokinkoncentration hverken fra ACS eller MSC [Puissant et 14/43

al, 2004], mens andre studier har påvist øget mængde af de immunsupprimerende cytokiner [Jiang et al, 2005; Ivanova- Todorova et al, 2009]. Det overvejes, hvorvidt MSC gennem secernering af TGF- β kan påvirke monocytter samt DC immunsup- rimerende, imens monocytter og DC ligeledes kan secernere cytokiner, der påvirker både dem selv og MSC. Monocytter kan eksempelvis secernere IL- 6, IL- 10 og IL- 12, mens DC især secernerer IL- 10 og IL- 12 [Agger et al, 2011]. IL- 12 er blandt andet vigtig for modningen af DC. Med henblik på at vurdere hvilken type cellekontakt, der medierer ASCs formodede immunsupprimerende virkning, kan der ved hjælp af flowcytometri undersøges for ekspression af relevante overflade- markører. Mesenchymale stamcellers påvirkning af dendritiske celler MSCs påvirkning på differentieringen fra monocytter til umodne DC er Flere studier har vist, at MSC inhiberer differentionen og funktionen af DC [Zhang et al, 2004; Jiang et al, 2005; Ramasamy et al, 2006; Nauta et al, 2006]. I tre studier blev det undersøgt, hvorvidt samt hvordan monocytter ændrede sig, når disse var dyrket med GM- CSF samt IL- 4 med eller uden MSC. Studierne viste, at humane MSC inhiberede differentieringen af DC, når disse var dyrket in vitro [Zhang et al, 2004; Jiang et al, 2005; Ramasamy et al, 2006]. Et af studierne viste ydermere, at i en co- kultur med MSC og monocytter tilsat førnævnte cytokiner, udtrykte størstedelen af monocytterne ikke CD1a, hvilket bety- der, at monocytterne ikke havde differentieret sig til umodne DC, hvilket vil kunne forklares med, at MSC i stor grad inhiberer denne differentiering. I co- kulturen viste det sig dog, at MSC ikke påvirkede CD14- markør [Zhang et al, 2004]. Et andet studie viste ligeledes, at monocytter dyrket med MSC samt cytokiner ikke udtrykte CD1a samt bevarede deres høje niveau af CD14 +. Samme studie viste ydermere, at der var en nedregulation af MHC II antigen ekspressionen samt, at CD80 og CD86 ikke blev opreguleret [Jiang et al, 2005], hvilket også har vist sig gældende for CD40 [Zhang et al, 2004]. Den standsede udvikling af monocytter til DC er ydermere blevet undersøgt i et studie, hvor det blev konkluderet, at det skyldtes en nedregulering af cyclin D2 således, at monocytterne ikke kunne indtræde i cellecyklussens G 1 - fase [Ramasamy et al, 2006]. 15/43

Mesenchymale stamcellers påvirkning af modningen af DC Ligeledes er det blevet undersøgt, hvorvidt MSC påvirker modningen af DC. Her viser et studie, at MSC er kan hindre opreguleringen af CD40, CD86 samt CD83 signifikant samt, at sekretionen af IL- 12 vil være reduceret [Zhang et al, 2004]. Et andet studies resultater viste, at der er en beskeden opregulering af CD14 samt en mindre reduktion af CD83. Sidstnævnte studie viser ydermere, at umodne DC evne til endocytose var signifikant reduceret, hvilket der i studiet påpeges, at der formodentligt skyldes MSC. Studiets data indikerer ligeledes, at umodne DC enten vil konvertere til CD14 + celler (formodentligt makrofager) eller ophøre med udviklingen til modne DC. Slutteligt bliver det i selvsamme studie konkluderet, at den inhibitoriske effekt MSC havde på monocytterne var reversibel [Jiang et al, 2005]. Mesenchymale stamcellers påvirkning af modne dendritiske celler MSCs påvirkning af modne DC er er ligeledes blevet undersøgt. Det viste sig, at DC, der havde været udsat for MSC under differentieringen var blevet dårlige til at fremkalde en T- cellestimulation. Studiet viste, at MSC samt dets supernatant inhiberede frigivelsen af IL- 12 og derved differentieringen af naive T- celler til Th1- celler [Zhang et al, 2004]. De samme konklusioner er blevet draget i et andet studie, hvor der også har kunnes observeres en mindsket sekretion af IL- 12 samt en undertrykkelse af T- celle profila- tionen [Jiang et al, 2005]. Mekanismerne bag MSCs påvirkning af DC Hvorledes den immunsupprimerende effekt opstår, bliver ligeledes diskuteret i de forskellige studier. Nogle resultater viser, at den immunsupprimerende effekt opstår på baggrund af opløselige faktorer. Dette blev konkluderet på baggrund af brugen af transwell- culture system, hvor det kunne konkluderes, at MSC undertrykkede udviklingen af DC i ligeså stor grad, som hvis MSC havde været i co- kultur med monocytterne. Samme studie viste ydermere, at supernatant fra MSC- kultur ligeledes havde en inhibitorisk effekt på modningen af DC, men at denne var mindre markant samt mere variabel. Supernatanten påvirkede ikke differentionen af monocytter til DC [Nauta et al, 2006]. Dette stemmer overens med andre studier, hvor der ligeledes blev undersøgt MSC samt supernatants rolle i forbindelse med den im- munsuppremerende effekt [Zhang et al, 2004]. Andre resultater viser, at den inhibitoriske effekt ligeledes kan komme som følge af cytokinpåvirkning, men nemmere opstår ved celle- celle kontakt - der kan dog opstå fuld inhibitorisk effekt ved ændret ratio. [Jiang et al, 2005]. Dette er der dog uenighed om, da et andet studie mener, at celle- celle kontakt er nødvendigt for, at der vil optræde en fuld inhibitorisk effekt [Puissant et al, 2004]. 16/43

MSC versus ASC Slutteligt skal det nævnes, at der ligeledes har været forsket i, hvorvidt ASC skaber et ændret immuno- regulatorisk udfald sammenlignet med MSC. I 2004 blev det første gang klarlagt, at ASC udtrykker lignende immunosuppressive egenskaber in vitro som MSC [Puissant et al, 2004]. Senere hen er det endvidere vist, at ASC er er bedre til at inhiberere differentieringen af DC er sammenlignet med MSC [Ivano- va- Todorova et al, 2009]. Mesenchymale stamcellers kliniske relevans På baggrund af MSCs immunsuppressive effekt samt evne til at differentiere sig til andet væv, er der potentiale for at anvende disse i klinikken. MSC kan til dels anvendes som et regenerativ medikament, men kan også bruges i kraft af dets evne til at supprimere immunsystemet. Dette projekt lægger som tidligere nævnt vægt på MSCs evne til immunsuppressionen. Da ASC er mere tilgængelige end MSC, er der større indikation for anvendelse af disse i klinikken. Et af de områder, hvor de adipøse stamceller i høj grad kan anvendes er i forbindelse med organtransplantationer, hvor det centrale problem er af- stødning grundet et immunrespons. Dette immunrespons skyldes alloantigener (fremmede antigener). Disse alloantigener stammer fra proteiner i celler, som medfører en genetisk variation imellem donor- væv og recipienten. Disse vævstyper, som danner grundlag for den immunologiske afstødningsreaktion, opdeles i to grupper: MHC - antigener, som opdeles i klasse I og klasse II. MHC I antigener findes på kerneholdige cel- lemembraner, mens MHC II kun findes på visse af immunsystemets celler og herunder særligt de antigenpræsenterende celler. Minorvævstyper - de svage vævstyper, som er peptidfragmenter fra celleproteinsyntese, der er bundet til klasse I antigener. Disse to væsentlige begreber kan illustreres med følgende eksempler af hudtransplantation: Ved transplantation mellem MHC identiske vævstyper, men forskelle i de minorvævstyperne, ses en afstødning efter cirka 18-23 dage. Ved forskelle i minorvævstyperne, men ens MHC- antigener, vil der ses en afstødning efter 10-12 dage. I denne anledning blev der i 2001 lavet et forsøg med bavianer, hvor der rejektionstiden mellem histoinkompatible hudtransplantationer blev testet. I forsøget blev der anvendt seks bavianer, hvoraf fire fik injiceret MSC intravenøst, og de to sidste fungerede som kontrolgruppe ved 17/43

at injicere isotonisk saltvand. Kontrolgruppen havde en transplant overlevelsestid på syv dage. To af dyrerne, der fik injiceret MSC subkutant, oplevede en afstødningsreaktion grundet tekniske fejl. For de resterende fire gjaldt det, at de fik MSC injiceret intravenøst således, at hudtransplantatet overlevede i 11,3 dage. Det kan ud fra forsøget med bavianer konkluderes, at MSC har en immunsupprimerende effekt under afstødningsreaktioner i forbindelse med hudtransplantationer. Dette kan ses i forhold til daglig anvendelse af fludarabine, der er et lægemiddel, som inducerer T- lymfocyt død, hvilket forlænge- de overlevelsestiden af det transplanterede hud til cirka 14 dage. Det samme gælder anvendelsen af cyclosporine, som sammen med anti- CD- 80 antigener forlængede overlevelsestiden af huden til 14 dage [Bartholomew et al, 2002]. Desuden kan der tales om GvH, som er en type reaktion, der udløses ved, at T- celler overføres fra donor til recipient. T- cellerne vil herefter udøve en immuninflammation, der stort set strækker sig over alle kroppens væv. Dette er grundlaget for, at der i forbindelse med knoglemarvstransplantationer kræves stor forlignelighed mellem donor og recipient. Transplantatsimmunitet kan deskriptivt opdeles i immuniteringsfasen og effektorfasen. I immuniserings- fasen aktiveres naive T- celler. Disse vil vandre til thymus og har her forklonet deres T- celle- antigen- receptor, og det samlede spektrum af antigenreceptorer i de eksportede naive T- celler dækker det anti- gene univers. Ved transplantation er der to veje for alloimmunisering: den direkte og den inddirekte. Ved den direkte alloimmunisering vandrer donorderiverede DC fra transplantatet til drænerende værtslymfeknuder, hvor de naive T- CD4 + - celler aktiveres. Herefter vil der fremkomme effektor- T- celler. Disse celler vil med- føre ekspansion og differentering til aktive cytotoksiske T- celler [Abdi et al, 2008]. Ved den inddirekte alloimmunisering sker der en immunreaktion, som udløser et immunrespons, der er identisk med virusantigener i forbindelse med virusinfektion. Det er således recipientens egne DC, som optager antigenerne og præsenterer dem på egne HLA- antigener [Bartholomew et al, 2002]. På baggrund af organtransplantation og ASC evne til at hæmme differentering af monocytter til DC er det interessant se på, hvilken effekten denne mangel på differentiering medfører. Det er her klart, at der ved den direkte stimulering sker en interaktion imellem naive- CD4 + - celler samt DC. En aktiveret CD4 + - celle vil herefter udskille IL- 2, som stimulerer ekspansion af T- celler [Annenberg Learner*]. Baseret på ovenstående kapitel kan det opsummeres, at ASC har flere egenskaber, der er eftertragtede indenfor et bredt spektrum af terapeutisk medicin. De multifaktorielle egenskaber og deres nemme 18/43

tilgængelighed danner grundlaget for dette projekt. Det er fortsat mange uafklarede aspekter omkring ASCs virkning herunder de immunregulerende karakteristika [Ivanova- Todorova et al, 2009]. Flowcytometri For at undersøge cellerne nærmere kan de analyseres ved hjælp af FCM. Dette er en måde, hvor- på der måles fysiske eller kemiske karakteristika på celler eller andre partikler i en væskestrøm [Shapiro, 2003]. FCM er en hyppigt brugt metode i immunfluorescensundersøgelser, hvor immun- cellernes specifikke markører konjugeres med fluorescerende molekyler [Agger et al, 2011]. Målinger foretages ved, at celler og/eller partikler Figur 6.4. Her vises princippet bag flourescerende lys. [In- i en suspension enkeltvis sendes gennem et elek- vitrogen flourescence*]. 1) Viser flourokromets excitation trisk felt eller fokuseret lysstråle, hvilket sker i et ved en given bølgelængde. 2) Viser flourokromets energi- flowcytometer. Sidstnævnte går ud på, at cellen tab, som fører til 3) hvor emission optræder ved en given bølgelængde, hvorved lys udsendes. passerer gennem et måleområde i flowcytometeret, hvor væskestrømmen af celler bliver ramt af laserstråler. Det spredte laserlys bliver samlet af linser. Dikroiske spejle filtrerer og separerer lyset på baggrund af størrelse, granularitet og eventuelt den type fluorescens cellerne er konjugeret med [Agger et al, 2011]. Herefter vil lyspulsene blive omdannet til elektroniske signaler ved hjælp af fotoforstærkere, hvorefter data vil kunne analyseres på en computer [Kielberg et al, 2012]. Fordelen ved FCM er, at det giver mulighed for at analysere hver enkelt celle eller partikel. Herefter kan de kategoriseres i populationer baseret på forskellene i cellernes eller partiklernes variable, hvorved de kan inddeles og analyseres [Robinson, 2004]. En måde, hvorpå FCM kan udføres, er ved at farve for overflademarkører, markører i cytoplasma samt markører i nucleus [Kielberg et al, 2012]. Baseret på FCM og dets data vil det herefter være muligt at vurdere, hvorvidt cellen udtrykker de markører, der blev farvet[robinson, 2004]. De fænotypiske over- flademarkører på immunceller kan udtrykkes ved at farve dem med heterogene fluorokromer. Fluoro- 19/43

kromer er molekyler, der udsender lys af en bestemt bølgelængde, når disse bestråles, hvorved det exciteres for herefter at resultere i emission (se figur 6.4) [Biotech Academy*]. Det er flere måder at mærke et ønsket antistof med fluorokromer - eksempelvis den direkte metode, hvor der konjugeres antistoffer med fluorescens, som derefter kan bindes til en specifik receptor. Såle- des kan en bestemt celletype kvantificeres på baggrund af deres unikke overflademarkører (se figur 6.5). Figur 6.5 1) En heterogen cellepopulation (hvor en eller flere celletyper er konjugeret med fluorescerende antistoffer) suges ned i maskinen. 2) Cellerne passerer et måleområde, hvor de bliver bestrålet af en laser. Det spredte laserlys samt fluorescen- sen bliver samlet af linser. 3) Dikroiske spejle separerer det heterogene lys og sender det til detektorer: 4) Forward Scatter (FCS) måler cellestørrelse. 5) Side Scatter (SSC) måler granularitet 6) Detektorer der måler orange og grønn fluorescens. 7) Detektorer digitaliserede elektroniske signalere, og sender dem til en computer for lagring og opsamling. 8) Den opsamlede data kananalyseress på flere måter. 9) Diagrammet viser hvordan cellerne bliver kvantificeret ud fra cellestørrelse (X- aksen, FSC) og cellegranularitet (Y- aksen, SSC). [Agger et al, 2011] 10) Dotplot, hvor FITC- fluorekrom (grøn fluorescerende, kortere bølgelængde højere energi) konjugeres antistof mod CD3, og dermed illustrerer T- hjælpeceller. fpe- fluorkrom (orange fluorkrom) konjugeres med antistoffer mod CD19- markør på B- celler. PE- fluorescerende lys har længere bølgelængde og lavere energi end FITC- fluorescerende lys [Nerliens Meszansky*] (Figuren er modificeret fra Agger, 2010). Antistoffer samt isotyper Der findes både mono- og polyklonale antistoffer. Polyklonale antistoffer binder på forskellige specifikke epitoper af samme antigen, mens monoklonale antistoffer kun binder sig på én specifik epitop [Biome- dical Instrumentation Center*]. Et problem med binding af antistoffer er, at der ofte opstår uspecifikke bindinger, eksempelvis på Fc- receptoren. Grundet dette skal der anvendes kontroller af samme Ig- isotyper, men hvor den variable del ikke er intakt. Ved hjælp af isotyperne kan det vurderes, hvor stor mængde af antistofferne, der er bundet specifikt samt hvor stor del, der har indgået uspecifikke bindinger [Kielberg et al, 2001]. 20/43

De fluoroscerende antistoffer findes i forskellige udgaver. De exciteres og emmiteres ved forskellig bøl- gelængder (se figur 6.6). Som nævnt findes der forskellige udgaver: 1 Enkelt fluorescerende antistoffer, som direkte exciteres og emmiteres og derved udsender fluorescerende lys. 2 Tandemskonjugerede antistoffer, som omhandler, at første fluorochrom videresender sin energi fra emissionen til andet flourokrom, som exciteres og slutteligt selv vil skabe emission med læn- gere bølgelængde, lavere energi samt anden farve [Life Technologies*]. Figur 6.6. Her ses farvespektret over de forskellige bølgelængder illustreret. nm = nanometer. qpcr: Ligesom flowcytometri er nyttig til at kvantificere de forskellige overflademarkører, der er specifikke for cellerne, kan quantitative polymerase chain reaction (qpcr) bruges til at undersøge kvantitativt, hvor meget af et specifikt protein, der udtrykkes af cellerne. Denne metode bygger på oprensning af mrna fra de celler, der ønskes undersøgt, og der laves reverstransskription således, at cdna dannes, hvorpå der kan laves qpcr. qpcr opdeles i flere trin, hvilket i det følgende gennemgås. Trinene i qpcr Først tilsættes den mængde template, som skal mængdeundersøges for udtrykkelse af det givne gen samt de andre komponenter, som er angivet ovenfor. Der kan nu påbegyndes denatureringstrinnet, hvor hele qpcr- blandingen varmes op til cirka 90-95 C, og polymerasen aktiveres. Hermed vil den dob- beltstrengede cdna- streng åbnes, da hydrogenbindingerne mellem de to strenge denatureres ved denne temperatur. Herefter indstilles temperaturen til cirka 60 C - også kaldet annealing temperaturen. Når denne temperatur nås, vil primerne påhæfte sig cdna, da de er designet til at passe på specifikke nukleotidkombina- 21/43

tioner. Disse er nødvendige for, at DNA- polymerasen kan opbygge den komplementære streng, da de fungerer som startsted. Ved to- trins PCR finder elongering ligeledes sted herunder. Under elongerin- gen vil deoxyribonukleotider, som er byggestenene, opbygge den komplentærestreng fra 3 mod 5 enden af den komplementære streng til cdna ved hjælp af DNA- polymerasen. Der benyttes en varme sta- bil Taq- polymerase, som har aktivitet fra 5 mod 3 - enden. Efter dette trin er en cyklus overstået, og dette kan gentages efter ønske. Der benyttes SYBR- Green, et molekyle, som ved binding flourocerer grønt. SYBR- Green binder sig til dobbelstrenget DNA. Efter hver cyklus registreres mængden af fluroscense, som er lig med mængden af dobbeltstrenget DNA [LifeTechnologies qpcr*]. 22/43

8. Metode Nedenfor ses en oversigt over forsøgsdagene samt et kort overblik over deres indhold. Dag - 5 Dag - 2 Dag - 1 Dag 0 Dag 2 Dag 5 Dag 6 Dag 7 Dag 16 Tilvænne stamceller og HEK- celler RP10- medie (RP10:α- MEM = 50/50) Tilsæwe 100 % RP10 yl ASC og HEK- celler ASC/HEK- celler bliver talt og sået ud Oprensning af PBMC fra fuldblod Monocyt oprensning ved adhærens Afvask af lymfocywer Tilsætning af RP10 medium + cytokiner + co- cultur etablere Tilsætning af RP10 medium + cytokiner Tilsætning af RP10 medium + cytokiner Modning - ylsætning af LPS Høst af celler + flowcytomey PCR Cellekulturer ASC er tidligere i Laboratoriet for Stamcelleforskning blevet isoleret fra det cellulære affaldsprodukt, som fås ved fedtsugninger og blev til dette projekt udleveret i en T75- flaske (Greiner Bio- One Gmbh, kat. nr.: 658 175). ASC anvendt i dette forsøg var af type ASC- 21 isoleret fra abdomen og hofteregionen på en 52- årig mand med BMI 28. Donoren var endvidere ikke- ryger og benyttede ikke medicin. ASC var GFP (green flouroscense protein)- transfekterede. Transfektionen med GFP gør det muligt at udnytte cellernes grøntflouroscerende egenskab under den senere flowcytometri Som kontrolceller anvendtes Human Embryon Kidney- 293- celler (HEK) oprenset af Frank Graham i 1970 erne (eksperimentnummer 293) ligeledes udleveret i en T75- flaske til dette projekt. Disse celler blev valgt som kontrolceller, da de er humant deriverede, ikke er stamceller og ligeledes er de GFP-

transfekterede. Begge celletyper blev dyrket i mediet α- MEM (100%, 89 %) (Gibco/Invitrogen, kat.nr.: 32561) samt gentamycin (0,5 %) (cas.nr.: 1403-66- 3). Monocytter blev isoleret fra fuldblod fra raske donorer ved Aalborg Universitet dog anvendtes blod fra samme donor til hvert forsøgsopsæt. Disse celler blev på alle stadier dyrket i RP- 10- medie, bestående af RPMI 1640 med 25mM HEPES uden glutamin (Invitrogen/Life Technologies, kat.nr.: 42401018) + 1 % Penicillin/Streptomycin (P:10,000 μl/ml, S:10,000 μl/ml) (Sigma- Aldrich/Invitrogen, kat.nr.: P433) samt FCS (10 %) (Kia Sygehus Nord Lotte Hat- ting) og glutamin (1 %) (cas.nr.: 56-85- 9). Alle cellekulturer blev dyrket i en inkubator (ESCO- cellculture 170b) ved 37 C samt 5 % CO 2 og humidifi- ceret luft. Under arbejdet med cellerne uden for inkubatoren benyttedes en LAF- bænk (Holten Lamin Air model 1,5). Klargøring af ASC, HEK og konditioneret medie samt tilvænning til medie Dag -5 Fem dage før, at diverse testkulturer skulle opstartes, skulle ASC og HEK- celler tilvænnes DCs medie. Grunden til, at ASC og HEK- celler skulle tilvænnes RP- 10, og ikke omvendt, er, at monocytterne ikke tri- ves i α- MEM. Derfor blev der foretaget en gradvis koncentrationsændring således, at ASC samt HEK- cellerne kunne tilvænne sig RP- 10. Dette blev gjort ved at lave en 50/50- blanding af RP- 10 og α- MEM, som blev tilsat T75- flaskerne indeholdende ASC og HEK- celler efter først at have fjernet deres α- MEM (se appendix 3a). Dag -2 Tre dage senere blev der igen foretaget medieskift ved ASC samt HEK- celler - denne gang til 100% RP- 10 medie. Høst af konditioneret medie Dag -1 Dagen før test af kulturerne skulle etableres, blev der høstet konditionerede medie fra ASC og HEK- cellerne. Mediet blev centrifugeret i 10 minutter ved 1400 rpm (Hettlich- zentrifugen universal 32OR), og 24/43

herefter sterilfiltreret med sterilfiltre (Q.max syringe filter, kat. nr.: CAPS2502100S). Mediet blev opbe- varet i inkubator. Høst af celler Herefter blev cellerne i kulturflasken aftrypsineret. Dette blev gjort ved først at foretage to skylninger med s- PBS (Gibco/invitrogen, cas.nr.: 7647145) og efterfølgende tilsætning af trypsin (cas.nr.: 20-08- 2009)/EDTA (cas.nr.: 6381926). Herefter blev cellerne inkuberet i fem minutter, hvorefter cellerne løsnedes. RP- 10 blev tilsat og blev sammen med cellerne suget fra T75- flaske. Herefter blev trypsin/edta, RP- 10 samt celler centrifugeret i 3 minutter, 25 C, 1200 rpm. Herefter blev supernatant hældt fra ASC samt HEK- celler. Der blev tilsat yderligere RP- 10 til HEK- cellerne samt til ASC. En mængde RP- 10 indeholdende celler blev tilsat trypanblåt (0,2%) (cas.nr.: 72-57- 1) og blev talt ved hjælp af et tæl- lekammer med henblik på at vurdere antal levende celler inden efterfølgende inaktivering. Inaktivering Med henblik på at inaktivere ASC og HEK- cellerne blev disse bestrålet med gammastråling i 2x7,5 minutter ved 40 Gy for at hindre videre celledeling. Udsåning af ASC/HEK celler Cellerne i co- kultur blev udsået i 6- brøndsbakker (Corning, kat. nr.: 3506). Baseret på tidligere forsøg blev det bestemt, at forholdet mellem ASC/HEK- celler og monocytter skulle være 1:10. Der blev taget udgangspunkt i, at der skulle tilsættes 8*10 6 monocytter i brøndene, men det forventedes, at kun 10 % ville adhærere svarende til 800.000 monocytter. Som før nævnt skulle forholdet være 1:10, svarende til, at der skulle være henholdsvis 80.000 ASC er og HEK- celler. Der ønskedes samlet 4 ml RP- 10 inklusiv cellesuspension i hver brønd, hvoraf 42,1 μl af de 4 ml udgjordes af cellesuspensionen for at kunne opnå ønskede koncentration (se appendix 3b). Udsåning af ASC/HEK- celler blev gjort således, at brønd 1+2 indeholdte ASC, brønd 3+4 HEK- celler, imens brønd 5+6 var tom (se figur 8.1). Figur 8.1. Brønd 1 og 2 indeholder biologiske replikater af adipøst deriverede mesenchymale stamceller (ASC), brønd 3 og 4 indeholder biologiske replikater af human embryonic kidney celler (HEK), brønd 5 og 6 var foreløbig tomme. 25/43

Monocyt og ASC/HEK- celle forholdet var gældende for alle fire forsøgsopstillinger, dog blev forsøgene udført med forskellige metoder, hvilket i det følgende gennemgås. CO-kultur Co- kulturen bestod af monocytter med ASC eller HEK- celler i hver sin separate brønd samt en brønd kun indeholdende monocytter (se figur 8.2). Formålet med denne forsøgsopstilling var at undersøge en potentiel immunregulerende effekt på differentiering, hvor intercellulær celle- celle kontakt var mulig. Brønden med monocytter alene var kontrol, således, at det kunne undersøges, hvordan disse opførte sig spontant. Figur 8.2. Dette viser en illustration over opsætning, hvor monocytter dyrkes i co- kultur med enten adipøst deriverede mesenchymale stamceller (ASC) eller human embryonic kidney cells (HEK) samt ren monocytkultur. Transwell-insert På samme måde som i co- kultur opsætningen udsåedes ASC, HEK- celler samt monocytter ligeledes i transwell- insert. Monocytter og ASC/HEK- celler blev adskilt af en mikroporøs membran, som hindrede celle- celle kontakt, men tillod en celle- celle interaktion ved, at et mikromiljø etableredes af opløselige faktorer fra begge celletyper. Der var igen to brønde kun med monocytter, der fungerede som kontrol for deres mulige spontane reaktioner (se figur 8.3) [Corning*]. Formålet med dette forsøgsopsæt var at undersøge den immunregulerende effekt uden celle- celle kontakt, men hvor påvirkning af substanser mellem de to celletyper fortsat var mulig, da de kunne passere 26/43

den microporøse transwell- membran [Puissant et al, 2004]. Figur 8.3. Dette viser en illustration over transwell- opsættet med monocytter og adipøst deriverede mesenchymale stamceller (ASC) eller human embryonic kidney cells (HEK) samt ren monocytkultur som kontrol. Konditioneret medie 1 Forsøgsopsættet med konditioneret medie 1 blev sat i gang på dag 0 - samme dag monocytterne blev oprenset og skulle dyrkes. Konditoneret medie var det cellefrie medie, hvor ASC eller HEK- cellerne blev dyrket i et stykke tid, hvilket i dette forsøg var svarende til cirka 24 timer. Mediet ville dermed indeholde en række opløselige faktorer som ASC eller HEK- cellerne havde udskilt. Som gældende for ovenstående blev der i dette forsøg ligeledes dyrket i et sæt separate brønde kun med monocytter (se figur 8.4). Formålet med metoden var at undersøge, hvorvidt de opløselige faktorer var tilstrækkelige i forhold til at hæmme differentiering af monocytter til DC eller om celleinteraktion er nødvendig for dette [Puissant et al, 2004]. 27/43

Figur 8.4. Dette viser en illustration over opsætningen med konditioneret medie for adipøst deriverede mesenchymale stamceller (ASC) og human embryonic kidney cells (HEK) samt ren monocytkultur. Ilustrationen er gældende for både forsøgsopsættet konditioneret medie 1 og konditioneret medie 2, hvor forskellen i de to forsøg er tilsætningstidspunktet for det konditionerede medie. Konditioneret medie 2 I det sidste forsøgsopsæt, konditioneret medie 2, blev det konditionerede medie fra ASC samt HEK- cellerne først tilsat til monocyt kulturerne på dag 6. Formålet med først at tilsætte mediet på dag 6 var at undersøge, hvorvidt de opløselige faktorer var tilstrækkelige i forhold til at hæmme modning af dendritiske celler eller om celleinteraktion var nødven- dig for dette. Opsætningen i dette forsøg var magen til konditioneret medie 1 (se figur 8.4). Som tidligere nævnt var forsøgene et samarbejde mellem fire grupper - kun co- kultur forsøget gennem- gås yderligere i det følgende, men princippet bag dem alle er det samme. Undersøgelse af immunsupprimerende effekt Dag 0 Oprensning af PBMC Fuldblod á 6 rør indeholdende heparinkugler blev overført til seks centrifugerør. Der blev fortyndet med RPMI 1640 og derefter lymfoprep (Medinor, kat.nr.: 1114547) i de samme rør. Herefter centrifugeredes rørene i 20 min, 180 xg, 18-20 C, bremse 0. 28/43

Supernatanten blev suget fra, efterfulgt af 20 minutters centrifugering, 380xg, 18-20 C, bremse 0. Her- efter høstedes interfase PBMC med kanyle (Misawa, kat.nr.: 137727-10014), og to interfaser samledes i ét TPP- rør med PBS (cas.nr: 7647145)/EDTA (cas.nr: 60-00- 4). Efterfølgende blev der foretaget vask ved centrifugering i 10 min, 300xg, 4 C, bremse 0, hvorefter supernatanten blev hældt fra, og der blev tilsat PBS til to TPP- rør med PBMC, som overførtes til det tredje TPP- rør med PBMC, som derudover også blev tilsat PBS/EDTA, således der samlet var ét rør med PBMC samt PBS/EDTA. Dette rør blev centrifugeret i 10 minutter, 300xg, 4 C, bremse 2 efter tilsætning af PBS+EDTA. Efter tredje vask med centrifugering i 10 min, 200xg, 4 C, bremse 2, frahældtes supernatant og tilsattes RP- 10. Med henblik på derefter at tælle antal monocytter blev methylviolet (cas.nr.: 8004-87- 3) tilsat til tilsvarende mængde cellesuspension, hvorefter cellerne taltes i tællekammer. Baseret på antallet af talte celler, blev cellesuspension fortyndet for at opnå den ønskede koncentration af celler (se appendix 3d). Herefter blev det eksisterende medie fjernet med cellerne sået ud dagen før, og cellesuspension svarende til 8 millioner celler per brønd blev sået ud i hver af de seks brønde. Med henblik på monocytadhærens blev bakken inkuberet i 1½ time. Derefter blev mediet fjernet, og brøndene blev skyllet to gange med cytokinfrit RPMI 1640 + 1 % pen/strep. Herefter tilsattes RP- 10 medie samt cytokinerne IL- 4 (stock 100μg/ml) (Peprotech, kat.nr.: #200-04) og GM- CSF (stock. 100μg/ml) (Peprotech, kat.nr.:# 300-03) med henblik på fremme differentiering mod DC er (se appendix 3e). Herefter blev brøndene inkuberet. Slutkoncentration af cytokiner i hver brønd var 60 ng/ml GM- CSF og 100 ng/ml IL- 4. Dag 2 og 5 Der blev tilsat RP10- medium inklusiv GM- CSF samt IL- 4 (se appendix 3f), så koncentrationen på dag 2 for GM- CSF var 360 ng/ml og koncentrationen for Il- 4 var var 600 ng/ml. På dag 5 halveredes koncentratio- nerne (se appendix 3g). Dag 6 Den sjette dag blev modningen af DC erne i alle 6 brønde stimuleret ved at tilsætte LPS til mediet, så slut koncentrationen var 10 ng/ml (se appendix 3h). 29/43

Dag 7 På dag syv blev cellerne høstet, og de biologiske replikater poolet således, at suspensionen fra henholdsvis brønd 1+2, 3+4 samt 5+6 blev overført til tre TPP- rør. Via spulning med RPMI 1640 blev semi- adhærente celler løsnet og derefter overført til førnævnte rør efterfulgt af centrifugering i 10 minutter, 300xg, 22 C, bremse 2. Herefter blev supernatant frahældt, og cellerne blev resuspenderet i PBS + 0,5 % BSA +0,01% sodium azid (cas. nr.: 26628-22- 8). Herefter blev cellerne testet med FCM. Flowcytometri Cellesuspensionerne i de tre rør repræsenterede de tre grupper blev overført til 8 forskellige FACS- rør grundet FCM, hvortil antistoffer samt isotypekontroller for markører blev tilsat. En oversigt over disse ses nedenfor: ANTISTOFFER CD80- PE- Cy5 HLA- DR- APC- H7 CD86- PE CD83- APC CD14- FITC ISOTYPER PE- Cy5 isotype APC- H7 isotype PE isotype APC isotype FITC isotype Tilsætningen foregik således, at 4 rør indeholdt ét antistof, imens de andre 4 indeholdt isotypen for antistoffet (se figur 8.5). 30/43

Figur 8.5. Her illustreres, hvorledes de tre rør indeholdende henholdsvis hhv. ASC+monocytter, HEK+monocytter samt monocyt- kontrol blev fordelt ud på i alt otte rør, som indeholder hhv. antistoffer eller isotyper. ASC = adipøst deriverede stamceller. HEK = human embryonic kidney cells. Ab = antistoffer. Iso = isotyper Efter dette blev rørene inkuberet i 30 minutter ved 4 C under sølvpapir, efterfulgt af tilførsel af PBS + 0,5% BSA + 0,01% sodium azid (cas.nr.: 26628-22- 8) samt centrifugering i 5 minutter, 300 xg, 20 C, bremse 2. Herefter frahældtes supernatant, og cellerne blev resuspenderet i PBS + 0,5% BSA + 0,01% sodium azid (cas.nr.: 26628-22- 8). Centrifugering i 5 minutter, 300xg, 20 grader C, bremse 2 og resu- spension af pellet i PBS (kat.nr.: 70011-051). FACS- rørene blev enkeltvis kørt igennem flowcytometeret (BDFFACSCANTO; software FACS DIVA), hvorved de fluroscenskonjugerede antistoffer, som havde bundet til deres antigener, blev registreret. Inten- siteten afgøres af antal bunde antistoffer således, at des flere bundne antistoffer des kraftigere vil flouroscencen lyse. Skematisk oversigt over de førnævnte konjugerede antistoffer ses nedenfor: Antistof Emissions bølgelængde Farve CD86- PE 578nm Orange HLA- DR- APC- H7 767nm Rød CD80- PE- CY5 667nm Rød CD83- APC 660nm Rød GFP (HEK + ASC) 509 Grøn Disse blev registret i flowcytometeret og analyseret i softwareprogrammet FlowJo (TreeStar, version 10.06). 31/43

For både ASC og HEK- celler blev det undersøgt, hvorvidt disse udtrykte genet for TGF- β. cdna, lavet fra mrna isoleret fra hver celletype, blev udleveret, og efterfølgende blev der foretaget en 100 x fortynding af cdna i miliq- vand. Herefter blev der lavet mastermix bestående af: Supermix Forward primer Revers primer MiliQ- vand. Mastermix blev blandet med henholdsvis cdna fra ASC er eller HEK- celler efterfulgt af 12 x pipetteblan- ding. To tekniske replikater af hver prøve blev overført til en PCR brøndplade. Endeligt lukkedes brønd- pladen omhyggeligt, hvorefter brøndpladen centrifugeredes. På pladen blev der yderligere kørt to referencegener samt standardkurver og blanke prøver for alle tre primerpar. En oversigt over primere samt sekvenser ses nedenfor: Gen Type Gensekvens TGF- β Forward Backward PPIA Forward Backward YHWAZ Forward Backward CCGAGCCAGGGGGAGGTG CGGTCGCGGGTGCTGTTGTA TCCTGGCATCTTGTCCATG CCATCCAACCACTCAGTCTTG ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA CCGCCAGGACAAACCAGTAT Det kørte qpcr- program for forsøget ses illustreret i figur 8.6. For yderligere beskrivelse af denne se figurteksten. Figur 8.6. Her vises skematisk det kørte program fra qpcr. 1) Viser første trin, hvor temperaturen hæves til 95 C i 5 minutter, hvorved at polymerasen aktiveres. Heref- ter begynder den egentlige qpcr- cyklus 2) Ved andet trin holdes temperaturen på 95 C i 15 sekunder. 3) Viser tredje trin, hvor temperaturen sænkes til 60 C, og annealingen samt elongering udføres. Som slut på tredje trin registreres mængden af flurosence, illustreret ved kamaraet i slutningen af tredje trin. 4) Her gentages trin to og tre 50 gange, hvor der for hver cyklus registreres mængden af flourosence. 5) I femtetrin udføres der en smeltekurve, hvor der for hvert femte sekundt hæves i C og mængden registreres, illustreret ved kameraet under femte trin. Femte trin slutter, når temperaturen når 95 C, da man her forventer at alle produkter er smeltet. 32/43

9. Resultater I dette afsnit vil egne resultater fra forsøget blive gennemgået. Flowcytometri Nedenfor vil data for FCM blive præsenteret. Kun data for co- kultur vil blive vist med dotplots samt histogrammer. Resultaterne for de andre setups vil være at finde nederst i afsnittet angivet i tabel. Histogrammerne for co- kultur ses nedenfor. På figur 9.1 ses histogrammerne for monocytter/dc fra kontrolbrøndene. På figur 9.1a ses kontrol tilsat antistof. På 9.1a er DC populationen afgrænset via en gate startende fra cirka 70.000 til cirka 260.000 på FSC- A aksen. På SSC- A aksen er gaten startende ved cirka 20.000 og til cirka 180.000. Samme gate er benyttet for kontrol tilsat isotype, hvilket der kan ses på figur 9.1b. Gatens placering er valgt på baggrund af erfaring, da det forventes, at det er indenfor denne, at de ønskede celler er placeret. Events, der ligger indenfor gaten, er blevet yderligere analyseret, og disse resultater vil blive gennemgå- et senere i kapitlet. Figur 9.1 viser dotplot over monocytter/dendritiske celler i kontrol. Hver prik i diagrammet repræsenterer data for en enkelt event. Y- aksen, side scatter (SSC) viser granularitet. X- aksen, forward scatter (FSC) viser cellestørrelse. Gaten er ens for A og B. A. viser en cellepopulation fra DC kontrol tilsat HLA- DR- APC- H7, CD83- APC, CD86- PE og CD80- PE- Cy5 antistoffer. B. viser en cellepopulation fra DC kontrol tilsat APC- H7, APC, PE og PE- Cy5 isotyper. K = kilo (*1000). På figur 9.2 ses histogrammerne for monocytter/dc fra brøndene indeholdende HEK- celler. På figur 9.2a ses HEK- celler tilsat antistof. På 9.2a er DC populationen afgrænset via en gate startende fra cirka 20 til cirka 3000 på FITC aksen. På SSC- A aksen er gaten startende ved cirka 40.000 og til cirka 240.000. Sam- me gate er benyttet for kontrol tilsat isotype, hvilket der kan ses på figur 9.2b. Gatens placering er valgt på baggrund af erfaring, da det forventes, at det er herinden for, at de ønskede celler er placeret. Events, der ligger indenfor gaten, er blevet yderligere analyseret, og disse resultater vil blive gennemgå- et senere i kapitlet. 33/43

Figur 9.2 viser dotplot over monocytter/dendritiske celler (DC) + Human embryonic kidney cells (HEK). Hver prik i diagrammet repræsenterer data for en enkelt event. Y- aksen, side scatter (SSC) viser granularitet. X- aksen, FITC, måler grønt fluorescerende lys. HEK er transfekterede med grønt fluorescerende protein (GFP). Gaten er ens for A og B. A. viser en cellepopulation fra DC + HEK tilsat HLA- DR- APC- H7, CD83- APC, CD86- PE og CD80- PE- Cy5 antistoffer. B. viser en cellepopulation fra DC + HEK kontrol tilsat APC- H7, APC, PE og PE- Cy5 isotyper. På figuren er K=kilo (1000). På figur 9.3 ses histogrammerne for monocytter/dc fra brøndene indeholdende ASC- celler. På figur 9.3a ses kontrol tilsat antistof. På 9.3a er DC populationen afgrænset via en gate startende fra cirka 0 til cirka 1000 på FITC aksen. På SSC- A aksen er gaten startende ved cirka 50.000 og til cirka 250.000. Samme gate er benyttet for kontrol tilsat isotype, hvilket der kan ses på figur 9.3b. Gatens placering er valgt på baggrund af erfaring, da det forventes, at det er herinden for, at de ønskede celler er placeret. Events, der ligger indenfor gaten, er blevet yderligere analyseret, og disse resultater vil blive gennemgå- et nedenfor i kapitlet. Nedenfor ses data fra flowcytometri videre analyseret i histogrammer. Histogrammerne er baseret på ovenstående gates. Figur 9.3 viser dotplot over dendritiske celler (DC) + adipøst deriverede mesenchymale stamceller (ASC). Hver prik i diagrammet repræsenterer data for en enkelt event. Y- aksen, side scatter (SSC) viser granularitet. X- aksen, FITC, måler grønt fluorescerende lys. ASC er transfekterede med grønt fluorescerende protein (GFP). Gaten er ens for A og B. A viser en cellepopulation fra DC + HEK tilsat HLA- DR- APC- H7, CD83- APC, CD86- PE og CD80- PE- Cy5 antistoffer. B. viser en cellepopulation fra DC + HEK kontrol tilsat APC- H7, APC, PE og PE- Cy5 isotyper.på figuren er K=kilo (1000). Figur 9.4 viser histogrammerne for HLA- DR, hvor figur 9.4a er gældende for kontrolcelle- prøven, 9.4b er gældende for HEK- celle- prøven samt 9.4c for ASC- prøven. På figur 9.4a ses isotypen liggende langt til venstre imens, antistoffet ligger til højre herfor. På figur 9.4b ses isotypen delt i to populationer, hvor den liggende længst til højre er low- population. For antistoffet ses, at der sammenlignet med 9.4a, er opstået en venstreforskudt low- population. Low- populationen samt en del af high- populationen overlapper grafen for isotypekontrollen. For figur 9.4c ses det, at isotypekontrollen er lignende den gælden- de for figur 9.4b. På figuren ses det ydermere, at antistof- grafen næsten ligger placeret identisk med isotype- grafen og derfor er markant venstreforskudt sammenlignet med 9.4a samt 9.4b. 34/43

Figur 9.4 Viser histogram over antistof HLA- DR- APC- H7 (blå line) og APC- H7 isotype (rød linie). X- aksen måler intensiteten af fluorescerende lys fra APC- H7. Y- aksen måler antal celler. A. viser histogram over dendrittiske celler (DC) kontrol. B. viser histogram over DC + Human embryonic derived kidney cells (HEK). C. viser histogram over DC + adi- pøstderiverede stamceller (ASC). Figur 9.5 viser histogrammerne for CD80, hvor figur 9.5a er gældende for kontrolcelle- prøven, 9.5b er gældende for HEK- celle- prøven samt 9.5c for ASC- prøven. På figur 9.5a ses isotypen liggende langt til venstre imens, antistoffet ligger til højre herfor. Mellem de to grafer ses en mindre overlapning. På figur 9.5b ses isotypen liggende til venstre. For antistoffet ses, at den er venstre forskudt sammenlignet med 9.5a. Ydermere ses det, at isotypekontrollen samt antistoffet nu overlapper hinanden mere end ved figur 9.5a. For figur 9.5c ses det, at isotypekontrollen er lignende den gældende for figur 9.5a samt 9.5b. På figuren ses det ydermere, at antistof- grafen næsten ligger placeret identisk med isotype- grafen. Figur 9.5 viser histogram over antistof CD80- PE- Cy5 (blå line) og isotype PE- Cy5 antistoffer (rød linie). X- aksen måler intensiteten af fluorescerende lys fra PE- CY. Y- aksen måler antal celler. A. Viser histogram over dendrittiske celler (DC) kontrol. B. Viser histogram over DC + Human embryonic derived kidney cells (HEK). C. Viser histogram over DC + adipøst- deriverede stamceller (ASC). Figur 9.6 viser histogrammerne for CD86, hvor figur 9.6a er gældende for kontrolcelle- prøven, 9.6b er gældende for HEK- celle- prøven samt 9.6c for ASC- prøven. På figur 9.6a ses isotypen liggende langt til venstre imens, antistoffet ligger til højre herfor. Mellem de to grafer ses en mindre overlapning. På figur 9.6b ses isotypen liggende til venstre. For antistoffet ses, at der er opstået tre populationer sammenlignet med 9.6a, hvoraf den længst til venstre ligger oveni isotypen, imens at nummer to population er blevet mindre sammenlignet med 9.6a. På figur 9.6c ses det for isotypekontrollen, at der er kommet en højreforskudt high- population sammenlignet med 9.6a samt 9.6b. På figuren ses det ydermere, at antistof- grafen næsten ligger placeret identisk med isotype- grafen. 35/43

Figur 9.7 viser histogrammerne for APC, hvor figur 9.7a er gældende for kontrolcelle- prøven, 9.7b er gældende for HEK- celle- prøven samt 9.7c for ASC- prøven. Figur 9.6 Viser histogram over antistof, CD86- PE (blå line) og PE isotype (rød linie). X- aksen måler intensiteten af fluorescerende lys fra PE. Y- aksen måler antal celler. A. Viser histogram over dendrittiske celler (DC) kontrol. B. Viser histogram over DC + Human embryonic derived kidney cells (HEK). C. Viser histogram over DC + adipøstderivere- de stamceller (ASC). På figur 9.7a ses isotypen liggende langt til venstre imens, antistoffet er delt i to populationer, hvor en low- population ligger højreforskudt samt en high- population, der er venstreforskudt. På figur 9.7b ses isotypen venstreforskudt. For antistoffet ses, at der sammenlignet med 9.7a, en lavere low- population, der er højreforskudt, samt en high- populationen, der er en anelse venstreforskudt. High- populationen overlapper delvist isotypen. På figur 9.7c ses det, at isotypekontrollen er lignende den gældende for figur 9.7a samt 9.7b. På figuren ses det ydermere, at antistof- grafen ligger placeret næsten identisk med isotype- grafen og derfor er markant venstreforskudt sammenlignet med 9.7a samt 9.7b. Figur 9.8 viser histogrammet for FITC- mærkede monocytter/dc i kontrol. An- tistoffet overlapper I høj grad isotypen, men er dog en anelse højreforskudt i forhold til denne. Figur 9.7 Viser histogram over antistof CD83- APC (blå line) og APC isotype (rød linie). X- aksen måler intensiteten af fluorescerende lys fra APC. Y- aksen måler antal celler. A. Viser histogram over dendrittiske celler (DC) kontrol. B. Viser histogram over DC + Human embryonic derived kidney cells (HEK). C. Viser histogram over DC + adipøstderiverede stamceller (ASC). Figur 9.8 viser et histogram over antistof CD14- FITC (blå) og FITC- isotype (rød) for dendritiske celler (DC) kontrol. X- aksen måler intensiteten af fluorescerende lys fra FITC. Y- aksen måler antal celler. Nedenfor ses en tabel, der opresummerer samtlige forsøgsopstillingers resultater fra FCM (se appendix 4). For yderligere forklaring til tabellen henvises til teksten hertil. 36/43

Tabel 1 Tabellen viser en oversigt over resultaterne fra flowcytometri for samtlige forsøgsopstillinger. Den viser, hvorvidt der er tale om op-, ned, eller ingen ændring af de forskellige testede markører i forhold til hvert forsøgs respektive kontroller. angiver en nedregulering i forhold til kontrol, angiver opregulering i forhold til kontrol, ( ) angiver en lille nedregulering, ( ) angiver en lille opregulering, - angiver ingen forskel i forhold til kontrol og 0 angiver, at isotypen samt kurven for markøreren falder sammen. Testetmarkør HLA- DR CD80 CD83 CD86 CD14 Co- kultur HEK ( ) ( ) - Ikke testet ASC Ikke testet Transwell HEK ( ) - - - ASC - 0 ( ) ( ) Konditioneret medie 1 HEK - - ( ) ( ) ( ) ASC - - ( ) - ( ) Konditioneret medie 2 HEK - - - - - ASC - - - ( ) ( ) qpcr I dette afsnit vil der blive gennemgået resultaterne for smeltepunkt, smeltekurver, amplikafikationskur- ver samt for standardkurverne. Figur 9.9 viser smeltepunkt for referencegenerne YWAZ (figur 9.9a) og PPIA(figur 9.9b) samt for gene of interest TGF- β (figur 9.9c). Det ses, at smeltepunktet for YWHAZ og PPIA peaker nogenlunde synkront, imens der for TGF- β ses diffuse kurver uden et fælles peak. Figur 9.9 viser smeltepunkt for referencegener og TGF- β. Y- aksen viser differentialet af fluorescens. X- aksen viser temperatur i C. A. viser smelteunkt for referencegen YWHAZ. B. viser smeltepunkt for referencegen PPIA. C. viser smeltepunkt for gene of interest TGF- β. 37/43

Det ses ligledes på figur 9.10, som repræsenterer smeltekurverne for kontrolgener (figur 9.10a og 9.10b), at disse er synkrone, da de på samme tidspunkt har et fælles fald i mængden af flourosence. Dog ses det for figur 9.10c, som repræsenterer TGF- β, at kurverne er diffuse og ikke har et fælles fald. Figur 9.10 viser smeltekurve for referencegen og TGF- β. Y- aksen viser fluorescens. X- aksen viser temperatur i C. A. viser smeltekurve for referencegen YWHAZ. B. viser smeltekurve for referencegen PPIA. C. viser smeltekurve for TGF- β. For log- amplikationskurverne, figur 9.11 ses YWHAZ og PPIA (figur 9.11a og 9.11b), som parallelle kurver med synkron udfladning. Figur 9.11c for TGF- β viser, at kurverne ikke er parallelle samt, at kurverne ikke har en synkron udfladning. Ligeledes for figur 9.11c ses det, at opformeringen af flouroscencen først sker efter cirka 30 cykler, hvor, at der for YWHAZ og PPIA på figur 9.11a samt 9.11b ses en opformering af flouroscense efter cirka 15 cykler. Figur 9.11 viser amplifikationskurve for referencegen og TGF- β. Y- aksen viser log.fluorescens. X- aksen viser cykler. A. viser amplifikationskurve for referencegen YWHAZ. B. viser amplifikationskurve for referencegen PPIA. C. viser ampli- fikationskurven for TGF- β. Standardkurverne ses på figur 9.12, hvor, de for YWHAZ og PPIA ses på figur 9.12a og 9.12b samt den for TGF- β ses på figur 9.12c. Kurverne viser for kontrolgenerne en fin ret linje med en R 2 for YWHAZ på 1,00 og for PPIA på 0,999. For TGF β ses R 2 på 0,970. Figur 9.12 viser standardkurve for referencegen og TGF- β. Y- aksen viser antal cykler. X- aksen viser log.startværdier. Cirklene langs indikerer kendte Ct værdier. Krydserne indikerer den ukendte prøve. A. viser standardkurve for referencegen YWHAZ. B. viser standardkurve for referencegen PPIA. C. viser standardkurve for TGF- β Grundet kvaliteten af qpcr laves der ikke videre databehandling af disse. 38/43

10. Diskussion Resultatet fra FCM indikerer i overensstemmelse med tidligere litteratur [Puissant et al, 2004; Ivanova- Todorova et al, 2009], at ASC har en inhiberende effekt på monocytters differentiering til DC. Dette vurderes på baggrund af en tydelig nedregulering af HLA- DR, CD80, CD83 og CD86 på monocytter/dc i både co- kultur (se figur 9.4c, 9.5c, 9.7c samt 9.6c) og i mindre grad for transwell- insert (se tabel 1) sammenlignet med kontrol. Da der ikke ses opregulering af disse markører, antages det, at cellerne er forblevet monocytter og derved ikke er differentieret. Denne formodning om tilstedeværelse af monocytter blev forstærket, idet det viste sig, at cellerne var CD14 + i transwell- insert opsættet (se tabel 1). Dette kunne ligeledes gøre sig gældende for det udførte co- kultur forsøg, men kan dog ikke bekræftes grundet manglende test for CD14. Dog har et tidligere studie [Jiang et al, 2005] undersøgt sidstnævnte, hvilket viste, at monocytter i co- cultur bevarede det høje niveau af CD14 + celler. Dette indikerer, at cellerne bibeholdt monocytkarakteristika og derfor ikke var differentierede. Dette forventes ligeledes gældende for det udførte forsøg med co- kultur. I forsøgsopsættet med konditioneret medie 1 ses formentligt en differentiering af monocytter til DC, da der for dette opsæt var tale om en opregulering af CD80 samt mangel på CD14 (se tabel 1). Der optræ- der dog low- populationer i diagrammerne for de to modningsmarkør, CD83 og CD86, hvilket indikerer, at mediet har haft en mindre inhiberende effekt på modning af nogle DC (se tabel 1). Tidligere studier har vist lignende tendenser, hvor de konkluderer, at konditioneret medie ikke har haft nogen effekt [Puissant et al, 2004; Zhang et al, 2004]. Dette kan tænkes relateret til ASCs sensivitet, da forskellige stimuli kan påvirke deres differentiation og funktion til at skabe et passende mikromiljø. Da monocytter/dc ikke kan stimulere ASC i opsættene med konditioneret medie, og dermed udnytte deres sensivitet for signaler, kan det forklare, hvorfor det konditionerede medie fra ASC ikke giver en bemær- kelsesværdig nedregulerende effekt. Opsummeret findes den største inhibering af monocytternes differentiering ved co- kultur, hvilket indikerer, at celle- celle kontakt øger supprimeringen. Dog ses der ydermere en nedregulering af markørne ved transwell- insert, hvilket kan indikere, at cytokinmedieret interaktion ligeledes har en indflydelse. Dette viste sig ligeledes for MSC i tidligere studier værende gældende [Zhang et al, 2004]. Gældende for konditioneret medie ses kun en minimal nedregulering ved tilsætning dag 1 samt ingen effekt ved til- sætning dag 6 (se tabel 1). Dette indikerer yderligere, at det er nødvendig, at cellerne kan interagere. 39/43

Der kan derfor argumenteres for, at den immunsupprimerende effekt både vil kræve, at celler har en direkte kontakt samtidigt med, at cytokinpåvirkning er nødvendig. De mulige involverede cytokiner er endnu ikke kendte, men det har været overvejet, hvorvidt TGF- β kunne spille en rolle i dette respons [Puissant et al, 2004]. Dog viste egen qpcr, at mrna et ikke kodede for TGF- β i hverken ASC eller HEK- celler. TGF- β blev for- modet at være en af aktørerne i inhiberingen af differentieringen til DC. Da der først registreres en opformering af cdna efter 30 cykler, forkastes dette resultat, da dette ikke betragtes som opformering af det konkrete cdna. Ligeledes blev der på smeltekurven iagttaget en uregelmæssighed i smeltetempera- tur, hvilket indikerer, at der ikke er sket en opformering af en cdna- sekvens for TGF- β, men muligvis flere uspecifikke sekvenser. En forklaring kunne være, at cellerne, som der er lavet qpcr på, er dyrket alene, og derfor ikke har været stimuleret til at secernere TGF- β. Det kunne derfor undersøges om sece- neringen af TGF- β kræver tilstedeværelse af monocytter, enten i form af celle- cellekontakt eller via cellernes opløselige faktorer. Dette kunne blive afklaret ved at undersøge ASC eller deres konditionerede medie fra co- kultur for at tjekke for tilstedeværelsen af TGF- β- mrna i cellerne eller TGF- β- cytokinet. Der blev dog testet for cytokinet TGF- β i et tidligere studie på MSC, og det viste ingen målbare værdier af TGF- β på trods af, at MSC var dyrket sammen med monocytter [Puissant et al, 2004]. Grundet de to uafhængige resultater overvejes det derfor, hvorvidt det er TGF- β, der udøver den inhiberende effekt på differentieringen.. Hvis denne mulige immunsupprimerende effekt skulle implementeres klinisk, ville dette dog kræve yderligere undersøgelser af den konkrete virkningsmekanisme. I tilfælde af, at denne immunsupprimerende effekt viser sig at kunne implementeres vil ASC eksempelvis kunne benyttes ved dannelse af nyt væv fra raske donorer, som derefter kan transplanteres til en modtager. Her vil der kunne opstå en immunreaktion, da værtscellerne udløser et immunrespons, som måske kunne nedreguleres med indgivelse af ASC samtidigt med det nye organ. Dette vil muligvis kunne hæmme kroppens afstødningsreaktion og øge chancen for at transplantationen bliver en succes. 40/43

11. Konklusion Forsøgets resultater indikerede, at der optrådte en mulig inhiberende effekt, grundet ASCs påvirkning af monocytterne/dc. Dette vurderes på baggrund af et mindsket udtryk af de testede markører, som viste en tydelig nedregulering i forsøget med co- kultur. Ligeledes optrådte hos transwell- insert en mulig inhiberende effekt, som dog ikke var udtrykt i samme høje grad som ved co- kultur. Konditioneret medie viste ingen tydelig nedregulerende effekt. Baseret på dette kan det derfor indikeres, at celle- celle kontakt skaber en øget immunsupprimerende virkning. Endvidere blev det undersøgt hvorledes den immunsupprimerende effekt var medieret af TGF- β, hvilket dog ikke kunne bekræftes ved hjælp af qpcr. På baggrund af tidligere nævnte resultater opfordres der til yderligere forskning indenfor området således, at de bagvedliggende mekanismer kan blive klarlagt. 41/43

12. Perspektivering Interessen for brugen af ASC har længe vakt forskernes interesse, da disse udgør potentielle muligheder til brug for adskillige kliniske formål. I et større perspektiv er den immunregulatoriske effekt blot én ud af det multifaktorielle potentiale, som ASC besidder. Derfor undersøges det i dag, hvorledes ASC blandt andet vil kunne benyttes i behandlingen af en række forskellige sygdomme, hvor den immunregulatoriske effekt vil kunne udnyttes i samspil med andre af ASCs egenskaber. Økonomisk er det i fremtiden ligeledes interessant, hvorvidt den mulige kliniske brug af ASC kunne være en bedre økonomisk løsning frem for anden mulig og livslang behandling. ASC har endvidere vist sig at være forholdsvis billige at udvinde, da de er let tilgængelige - også i store mængder. Set i et økonomisk perspektiv er det endvidere værd at have for øje, at private virksomheder kunne have interesse i dette område. Allerede i dag eksisterer virksomheder [American CryoStem], der tilbyder, mod betaling, at opbevare folks ASC, således disse er tilgængelige til fremtidig brug. Da den kliniske anvendelse af ASC stadig er forholdsvist ny, kan det etisk debatteres, hvorvidt dette er at udnytte folks desperation og uvi- denhed inden for området. Ligeledes kan markedsføringen inden for den private sektor have tendens til at fremstille fedtsugninger samt opbevaring af ASC som et fornuftigt klinisk indgreb modsat alene kos- metisk forfængelighed således, at fedtsugninger fordelagtiggøres i et helbredsmæssigt henseende. Det- te kommer blandt andet til udtryk hos en virksomhed indenfor området, der proklamerer sig med: American CryoStem is the gateway to future individual healthcare solution [American CryoStem]. Til trods for mulige etiske samt økonomiske problemstillinger, er det dog stadig et område med muligt stort klinisk potentiale, hvorfor videre forskning er ønskværdigt. 42/43

13. Litteraturliste ARTIKLER Aggarwal S., Pittenger M.F.; Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses; 2001 Asari S., Itakura S., Ferreri K., Liu C.P., Kuroda Y., Kandeel F., Mullen Y.; Mesenchymal stem cells suppress B- cell terminal differentiation; 2009 Baer P.C, Geiger H.; Adipose- Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells Tissue Localization, Characteriza- tion, and Heterogeneity; 2012 Bartholomew A, Sturgeon C., Siatskas M., Ferrer K., McIntosh K., Patil S., Hardy W., Devine S., Ucker D., Deans R., Moseley A., Hoffman R; Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo; 2002 Cannon J.G; Inflammatory Cytokines in Nonpathological States; 2000 Corcione A., Benvenuto F., Ferretti E., Giunti D., Cappiello V., Cazzanti F., Risso M., Gualandi F., Mancardi GL., Pistoia V., Uccelli A..; Human mesenchymal stem cells modulate B- cell functions; 2006 Di N., Carlo- Stella C., Magni M., Milanesi M., Longoni P.D., Matteucci P., Grisanti S., Gianni A.M., Human bone marrow stromal cells suppress T- lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mito- genic stimuli; 2002 Djouad F., Plence P., Bony C., Tropel P., Apparailly F., Sany J., Noël D., Jorgensen C.; Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals; 2003 Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper- Cortenbach I., Marini F., Krause D., Deans R., Keating A., Prockop D.J, Horwitz E.; Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal cells. The In- ternational Society for Cellular Therapy position statement; 2006 Garbi N., Kreutzberg T.; Dendritic Cells Enhance the Antigen Sensivity of T- Cells; 2012 Glennie S., Soeiro I., Dyson P.J., Lam E.W.- F., Dazze F.; Bone marrow mesenchymal stem cells induce division arrest anergy of activated T cells; 2004 Ivanova- Todorova E., Bochev I., Mourdjeva M., Dimitrov R., Bukarev D., Kyurkchiev S., Tivchev P, Al- tunkova I., Kyurkchiev D.S.; Adipose tissue- derived mesenchymal stem cells are more potent suppres- sors of dendritic cells differentiation compared to bone marrow- derived mesenchymal stem cells; 2009 Jiang X.- X., Zhang Y., Liu B., Zhang S.X., Wu Y., Yu X.- D., Mao N.; Human Mesenchymal stem cells inhibit differentiation and function of monocyte- derived dendritic cells; 2005 43/43

Krampera M., Glennie S., Dyson J., Scott D., Laylor R., Simpson E., Dazzi F.; Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen- specific T cells to their cognate peptide; 2002 Letterio J.J., Roberts A.B.; Regulation of immune responses by TGF- beta; 1998 Lund P., Pilgaard L., Duroux M., Fink T. & Zachar V.; Effect of growth media and serum replacements on the proliferation and differentiation of adiposederived stem cells; 2009 Lundsted D.H;Trypsin- induced VEGF expression in adiposederived stem cells; optimization of assays; 2012 Nauta A.J., Krisselbrink A.B, Lurvink E., Willemze R., Fibbe W.E.; Mesenchymal Stem Cells inhibit Genera- tion and Function of Both CD34 - Derived and Monocyte Derived Dendritic Cells; 2006 Puissant B., Barreau C., Bourin P., Clavel C., Corre J., Bousquet C., Taureau C., Cousin B., Abbal M., La- harrague P., Penicaud L., Casteilla L., Blancher A.; Immunomodulatory effect of human adipose tissue derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells; 2004 Ramasamy R., Fazekasova H., Lam E.W.- F., Soeiro I., Lombardi G., Dazzi F.; Mesenchymal Stem Cells In- hibit Dendritic Cell Differentiation and Function by Preventing Entry Into the Cell Cycle; 2006 Sotiropoulou P.A., Perez S.A. Salagianni M., BaxeVanis C.N., Papamichail M.; Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells ; 2006 Reya T., Morrison S.J, Clarke M.F., Weissman I.L.; Stem Cells, Cancer and Cancer Stem Cells; 2001 Abdi R., Fiorina P., Adra C.N, Atkinson M., Sayegh M.H; Immunomodulation by Mesenchymal Stem Cells; 2008 Robinson J.P.; Flow Cytometry; 2004 (OBS. PDF: http://www.cyto.purdue.edu/archive/flowcyt/research/pdfs/encyclopedia_2004.pdf) Švajger U. & Jeras M; Optimal Dendritic Cell Differentiation in RPMI Media Requires the Absence of HEPES Buffer; 2011] Sotiropoulou P.A., Perez S.A, Gritzapis A.D., Baxevanis C.N., Papamichail M.; Interactions Between Hu- man Mesenchymal Stem Cells and Natural Killer Cells; 2005 Tacghee Yi, Sun U. Song.; Immunomodulatory Properties of Mesenchymal Stem Cells and Their Thera- peutic Applications; 2012. Tasso R., Ilengo C., Quarto R., Cancedda R., Caspi R.R., Pennesi G.; Mesenchymal stem cells induce func- tionally active T- regulatory lymphocytes in a paracrine fashion and ameliorate experimental autoim- mune uveitis; 2012 Tobin L.M., Healy M.E., English K., Mahon B.P.; Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4 + T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft- versus- host disease; 2013 44/43

Yuan R.; Structure and mechanism of multifunctional restriction endonucleases; 1981 Zhang W., Ge W., Li C., You S., Liao L., Han Q., Deng W., Zhao R.C.C; Effects of Mesenchymal Stem Cells on Differentiation, Maturation, and Function of Human Monocyte- Derived Dendritic cells; 2004 HJEMMESIDER: Annenberg Learner: http://www.learner.org/courses/biology/textbook/hiv/hiv_3.html Biotech Academy: http://www.biotechacademy.dk/undervisningsprojekter/mikrochip/teori/mikrochip.aspx Corning: http://catalog2.corning.com/lifesciences/media/pdf/transwell_guide.pdf Genetics Explained: http://www2.le.ac.uk/departments/emfpu/genetics/explained/images/pcr- process.gif Gyldendals Encl: http://www.denstoredanske.dk/krop,_psyke_og_sundhed/sundhedsvidenskab/immunologi/dendritiske _celler (DC er) http://www.denstoredanske.dk/krop,_psyke_og_sundhed/sundhedsvidenskab/immunologi/dendritiske _celler http://www.denstoredanske.dk/natur_og_milj%c3%b8/biokemi_og_molekyl%c3%a6rbiologi/molekyl% C3%A6rbiologi/genteknologi (Genteknolo- gi)http://www.denstoredanske.dk/natur_og_milj%c3%b8/biokemi_og_molekyl%c3%a6rbiologi/moleky l%c3%a6rbiologi/genteknologi Invitrogen: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/product- Technical- Resources/media_formulation.193.html (RPMI) http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/product- Technical- Resources/media_formulation.109.html (Alpha- MEM) http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/1intro/player.html (Flourescence) Molecular Expressions: http://micro.magnet.fsu.edu/primer/lightandcolor/fluoroexcitation.html Nerliens Meszansky: http://www.nmas.no/produkter/flowcytometri/antistoffer/4395 WHO: http://www.who.int/transplantation/en/ Biomedical Instrumentation Center: 45/43

http://www.usuhs.mil/bic/cytometry/pdf/tutorial.pdf Life Technologies: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/tutorials.html Life Technologies - qpcr: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/products- and- Services/Applications/PCR/real- time- pcr/qpcr- education/real- time- pcr- handbook.html Gibco/Invitrogen: http://biology.usf.edu/cmmb/research/data/handbook%20for%20cell%20culture%20basics%20 (Gibco).pdf ProMedicin: http://pro.medicin.dk/laegemiddelgrupper/grupper/317578 American CryoStem: http://www.americancryostem.com BØGER: Agger R., Nielsen C.H, Leslie G., Aasted B.; Immunologi; Munksgaard; 1. Udg. 1.oplag; 2011 Borup V.; Biokemi; FADL; 1.udgave, 1. Oplag; 2010 Cooper G.M; The Cell: A Molecular Approach; 2. Udg; 2000 Geneser F.; Histologi - på molekylærbiologiske grundlag; 1. udg; 2011]. Kielberg, Brünner & Briand; Celledyrkning en praktisk håndbog i dyrkning af mammale celler; 3. udgave, 1. Oplag, ISBN: 978-87- 02-13778- 1; 2012 Lillevang S.T., Møller B.K.; Immunologi - En kortfattet lærebog; 2. Udg; ISBN: 978-87- 7749-493- 2; 2009 Sadler T.W; Langmanns Embryologi; udgave 3.; 2010; ISBN: 9788762809390 Shapiro H.M.; Practical Flow Cytometry; 4th ed.; 2003 46/43

Appendix 1a. Analysebrugsanvisning 4. Semester, MedIS og Medicin Navn Cas. nr. Koncen- tration H/R- sætninger P/S- sætninger Piktogram (Billede) Affalds- gruppe α- MEM 100 % Ikke farligt Ingen affalds- gruppe 0.9% NaCl 7647-14- 5 0,9 % Ikke farligt (med mindre man indtager store mæng- der) X Lymfoprep Trypan Blå 72-57- 1 0,4 % H350: Kan fremkalde kræft. Ikke farligt P202: Anvend ikke produktet, før alle advarsler er læst og for- stået. P281: Anvend de påkrævede personlige værnemidler. P308+313: VED eksponering eller mistanke om eksponering: Søg lægehjælp B PBS Ikke farligt - 1mM EDTA 6381-92- 6 1 mm This product is not classified as dangerous according to European H 47/43

union legislation L- Glutamine 56-85- 9 Ikke farlig H Methylviolet eddikesyre FCS (føtalt kalveserum) RPMI 1640+HEPES (uden glutamin) Buffycoat (serum) Ikke farlig 9014-81- 7 100 % Handsker for sterilitet Ikke farligt Ikke farlig Ikke farlig - brug af handsker for egen beskyt- telse(da det er fra blod) - - Autoklave- ring Penicillin/ streptomyocin 3810-74- 0;69-57- 8 Penicillin 10,000 U/ml- strepto- mycin 10,000 ug/ml 100 ml 1% H319: Forårsager alvorlig øjenirritation H315: Forårsager hudirritation H317: Kan forårsage allergisk hudreaktion. H335: Kan forårsage irritation af luftveje- ne. P280: Bær beskyttelses- handsker og øjenbeskyttel- se Z Human GM- CSF Ikke farligt Ingen affalds- gruppe Human IL- 4 Ikke farligt Ingen affalds- gruppe RPMI1640 med 1% P/S Ikke farligt Ingen affalds- 48/43

gruppe Natriumazid 26628-22- 8 1 % H302: Farlig ved indtagelse. H412: Skadelig for vandlevende orga- nismer, med langvari- ge virkninger. EUH032: Ud- vikler meget giftig gas ved kontakt med syre. P301+312: I TILFÆLDE AF INDTAGELSE: I tilfælde af ubehag ring til en GIFTIN- FORMATION eller en læge P273: Undgå udledning til miljøet. X OBS. Skyl vasken efter med rigeligt vand! LPS - Ikke farlig H Formaldehyd 1% 50-00- 0 H351: Mistænkt for at fremkalde kræft. H317: Kan forårsage allergisk hudreaktion. P202: Anvend ikke produktet, før alle advarsler er læst og for- stået P281: Anvend de påkrævede personlige værnemidler. P308+313: VED eksponering eller mistanke om eksponering: Søg lægehjælp H Gentamycin 1403-66- 3 0,5 % H319: Forårsager alvorlig øjenirritation. P280: Bær beskyttelses- hand- H 49/43

H315: Forårsager hudirritation. H317: Kan forårsage allergisk hudreaktion. H335: Kan forårsage irritation af luftveje- ne. sker/øjenbesk yttelse. P302+352: VED KONTAKT MED HUDEN: Vask med rigeligt sæbe og vand. P304+340: VED INDÅN- DING: Flyt personen til et sted med frisk luft og sørg for, at ved- kommende hviler i en stilling, som letter vejr- trækningen. P305+351+33 8: VED KON- TAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gø- res let. Fort- sæt skylning. Trypsin 20-08- 2009 0,25 % Ikke farligt, men kræver EUH- sætning 208: Kan udløse allergisk reaktion Handsker skal benyttes pga. aller- giske reaktioner Ingen affalds- gruppe 50/43

Sikkerhed på de fortyndede stoffer. Det er slutkoncentrationen på de sammenblandede reagenser, der skal oplyses og ikke- mærkede kemikalier. Navn Cas. nr. Kon- cent- ration H/R- sætninger P/S- sætninger Piktogram (Billede) Af- falds - grup pe Trypan Blå 72-57- 1 0,2 % H350: Kan fremkalde kræft. P202: Anvend ikke produktet, før alle advarsler er læst og forstået. P281: Anvend de påkrævede personlige værnemidler. P308+313: VED eksponering eller mistanke om eksponering: Søg læ- gehjælp B Formalin 50-00- 0 3,7% i PBS H351: Mistænkt for at fremkalde kræft. H317: Kan forår- sage allergisk hudreaktion. P202: Anvend ikke produktet, før alle advarsler er læst og forstået. α- MEM 89 % Ikke farligt FCS 10 % Ikke farligt PBS 7.4 ph + 1mM EDTA 6381-92- 6 1 mm This product is not classified as dangerous according to European union legislation H Trypsin 20-08- 2009 0,125 % Ikke farligt, men kræver EUH- sætning 208: Kan udløse allergisk reaktion Handsker skal benyttes pga. aller- giske reaktioner In- gen affalds - grup pe 51/43

EDTA 60-00- 4 0,01 M (Ikke kor- rekte konc) Produktet er ikke klassificeret ifølge Miljøministeriets Bekendtgørelse nr. 1075 af 24.11.2011 om klassificering og mærkning mv. H PBS +0,1% BSA + 0,01% natriumazid 26628-22- 8 0,01 % Af- falds grup pe X - skyl efter med vand. PBS + For- maldehyd 1 % 50-00- 0 1 % H351: Mistænkt for at fremkalde kræft. H317: Kan forår- sage allergisk hudreaktion. P202: Anvend ikke produktet, før alle advarsler er læst og forstået P281: Anvend de påkrævede personlige værnemidler. P308+313: VED eksponering eller mistanke om eksponering: Søg læ- gehjælp H Anvendelse af personlige værnemidler og særlige forholdsregler ved brug enkelte reagenser Navn Værnemidler/handsketype/forholdsregler LPS Sørg for effektiv procesventilation f.eks stinkskab. Brug engangshandsker ved uundgåelig kontakt med stoffet. Vær opmærksom på gennem- brudstid, søg oplysning hos handskeleverandør. Der skal være let adgang til nødbruser, øjenskylleflaske og håndvask med sæbe. Arbejdet skal tilrettelægges så kontakt med stoffet undgås Penicillin 10,000 U/ml- streptomycin 10,000 ug/ml 100 ml Kittel, handsker, øjenbeskyttelse 52/43

Trypan Blå Arbejdet skal tilrettelægges så kontakt med stoffet undgås. Indkøb i hensigtsmæssige mængder, således at evt. afvejning kan und- gås. Anvend et velfungerende stinkskab, der er testet via en sporgastest (testrapporten skal dokumentere, at der ikke forekommer udslip, og at der er en sikkerhedsfaktor på ca. 45). Anvendes stoffet i en Biologisk sikkerhedsbænk, skal det være med personbeskyttelse og med afkast til det fri. Bænken skal leve op til samme krav som stinkskabet (sporgastest og sikkerhedsfaktor på ca. 45). Alternativt anvendes handskeboks. Der skal være let adgang til nødbruser, øjenskyller og håndvask med sæbe. Oprydning: Engangmateriale (handsker, pipettespidser, underlag, filtre m.m.) opsamles i beholder, der behandles som kemikalieaffald (se afsnit F). - Øvrigt udstyr skylles i stinkskab inden opvask. Ved arbejdspladsvurderingen skal der tages særlige hensyn, da stoffet er skadeligt eller mistænkt for skadeligt for fostre, æg- og sædceller. Flytning til andet arbejde kan være nødvendigt. Engangshandsker af nitril skal anvendes ved risiko for direkte kontakt eller støvpåvirkning. Gentamycin Sørg for effektiv procesventilation f.eks stinkskab. Brug engangshandsker ved uundgåelig kontakt med stoffet. Vær opmærksom på gennem- brudstid, søg oplysning hos handskeleverandør. Der skal være let adgang til nødbruser, øjenskylleflaske og håndvask med sæbe. Arbejdet skal tilrettelægges så kontakt med stoffet undgås. Natriumazid, 1% Vær opmærksom på, at stoffet og dets dampe let optages gennem huden. Sørg for effektiv procesventilation f.eks stinkskab. Brug engangshandsker ved uundgåelig kontakt med stoffet. Vær opmærksom på gennem- brudstid, søg oplysning hos handskeleverandør. Der skal være let adgang til nødbruser, øjenskylleflaske og håndvask med sæbe. Ved arbejdspladsvurderingen skal der tages særlige hensyn, da stoffet er skadeligt eller mistænkt for skadeligt for fostre, æg- og sædceller. Flytning til andet arbejde kan være nødvendigt. Trypsin Benyt handsker pga. risiko for allergisk reaktion Buffycoat Grundet risiko for smitte, bruges altid handsker 53/43

1b. Kemisk Arbejdspladsvurdering til mutagene, reproduktionsska- dende og kræftfremkaldende stoffer (Udvidet APV) Stof: Trypan Blå Formål: Farvning af døde celler Dato: Semester/gruppe nr.: 408 Projektlaborant: Brita Holst Jensen Vejleder: Simone Elkjær Riis BESKRIVELSE AF ARBEJDSPROCESSEN KEMIKALIER (Navn, cas. nr. og koncentration ) Trypan blå 72-57- 1 (0,4 og 0,2) VÆSENTLIGE FARER FRA KEMIKALIERNE (H eller R sætninger) H350: Kan fremkalde kræft. VÆSENLIGE FARER FRA ARBEJDSPROCESSEN ( F.eks. laser, vacuum, sammenblanding af kemikalier,opvarmning af reagenser mm.) Arbejdet skal tilrettelægges så kontakt med stoffet undgås. Der skal være let adgang til nødbruser, øjenskyller og håndvask med sæbe. Oprydning: Engangmateriale (handsker, pipettespidser, underlag, filtre m.m.) opsamles i beholder, der behandles som kemikalieaffald RISIKO FOR PÅVIRKNING (Vurder reel risiko ifht. arbejdsproces. At kemikalierne er farlige ved indånding er ikke ensbetydende med at der er risiko for indånding ved denne arbejdsproces. Overvej hvor i arbejdsprocessen den pågældende risiko er tilstede er det under hele arbejdsprocessen eller kun i en enkelt delproces.) SUBSTITUTIONSOVERVEJELSER (Her redegøres for hvad er er gjort af forsøg og overvejelser ifht. substitution af farlige kemikalier eller arbejdsprocesser. Husk at det også er substitution at anvende små mængder i stedet for store mængder.) NØDVENDIGE SIKKERHEDSFORANSTALTNINGER Ventilation Stinkskab: Punktsug: X Laf- bænk: Andet: Er det angivne nødvendigt i hele arbejdsprocessen, eller kun i dele, beskriv: Ja, det er nødvendigt under hele arbejdsprocessen. Kemikaliehandsker Hvilke: Nitril handsker 92-600 54/43

Er de angivne handsker nødvendige i hele arbejdsprocessen, eller kun i dele, beskriv: Ja, nødvendigt under hele arbejdsprocessen. Andre personlige værnemidler Kittel: X Sikkerhedsbriller: Nej Åndedrætsværn(angiv filter): Særligt fodtøj (angiv hvilket): På grund af reglerne i biomedi- cinbygningen bæres der indesko. Dette skyldes ikke sikker- heden. Andet: Er det angivne nødvendigt i hele arbejdsprocessen, eller kun i dele, beskriv: Ja, det er nødvendigt under hele arbejdsprocessen. Sikkerhedsforanstaltning Særlig varmekilde v. brandfare: Nej er i øvrigt Andet: Særligt nødhjælpsudstyr Særligt brandslukningsmiddel: Nej Evt. modgift: Andet: Særlig uddannelse eller Lovpligtig uddannelse, hvilken: Nej instruktion Instruktion i brug af særligt farligt udstyr, hvilket: Intet Andet: HVAD SKAL GØRES VED UHELD OG EVT SPILD? (Her beskrives handling ved relevante uheld, opsamling og bortskaffelse af spild, procedure for information ved uheld o.s.v). Indånding: Personen bringes i frisk luft, holdes i ro og under opsyn. Ved risiko for bevidstløshed lejres personen i aflåst sideleje og holdes varm. Ved manglende vejrtrækning gives kunstigt åndedræt. Hud: Skyl længe og grundigt med vand, fjern forurenet tøj og evt. smykker. Øjne: Skyl straks med vand. Spil øjet grundigt op. Fjern kontaktlinser. Fortsæt skylningen indtil læge overtager behandlingen. Indtagelse: Skyl straks munden og drik vand eller mælk. Giv ikke væske til bevidstløse. Fremkald ikke opkastning. Ved vedvarende gener søg læge og medbring denne brugsanvisning AFFALD (Instruks om mærkning af affald) Spild og bortskaffelse Kommunekemiaffaldsgruppe: B Da der arbejdes med celler, afsprittets med 70% sprit til rengøring af dækglas. 55/43

Afspritnings kluden aflukkets sammen med spidsten I en pose, der opbevares under punkt sug, efter brug deponeres pose ved knude. Bortskaffes ved autoklavering. GRAVIDE OG AMMENDE (Er arbejdsprocessen sikker for gravide og ammende) Gravide skal så vidt muligt undgå kontakt med stoffet, men i de mængder der bruges er der umiddel- bart ikke fare for skade. 56/43

2. Protokol Tidslinje over projekt Dag - 5 Tilvænne stamceller og HEK- celler RP10- medie (RP10:α- MEM = 50/50) Dag - 2 Tilsætte 100 % RP10 til stamceller og HEK- celler Dag - 1 HEK/ASC- celler bliver talt og sået ud Dag 0 - Oprænsning af PBMC fra fuldblod - Monocyt oprensning ved adhærens - Afvask af lymfocytter - Tilsætning af RP10 medium + cytokiner + Co- kultur etableres Dag 2 Tilsætning af RP10 medium + cytokiner Dag 5 Tilsætning af RP10 medium + cytokiner Dag 6 Modning - tilsætning af LPS Dag 7 Høst af celler + flowcytometri Dag PCR 16 Dyrkning af HEK celler samt ASC Dag- 5, 25.4.2013: En 50/50 blanding skal laves af α- MEM og RP10. Medierne er udleveret, men skal blandes med 7,5 ml. fra hver. 1. 8 ml RP10- medie overføres til eget rør. 2. Afpipettær 7,5 ml RP10- medie og 7,5 ml α- MEM (ADAC og kontrol) i blanderør med pipetboy og 10 ml stripette, og overfør til en 50 ml centrifugrør 3. Cellerne tages ud af inkubator, konfluens bedømmes under mikroskop 4. Løsn låg på flasken med celler, og sug væsken op. 5. 15 ml 50:50 medie (det centrifugerede, dvs. α- MEM + RP10) sættes ind i flasken 6. Så er mediet skiftet! Tjek i mikroskopet om cellerne stadig er der 7. Stil i inkubator Dag - 2 d. 29/4-2013 Formålet med dagens labratoriearbejde er at skifte 50/50 α- MEM/RP10 medie, med rent RP10 medie. HEK- cellerne og ASC skal befinder sig i hver sin T75 flaske i et medie af α- MEM, FCS, pen/strep og gentamycin. Via en gradvis koncentrationsændring, skal ASC- og HEK- cellerne vendes til at befinde sig i et RPMI- medie, som er det medie, de dendritiske celler går i. Løsne låg på mediet, så det er klar (men la lokket stå på, så det ikke kommer snavs i). 1. Tag 25 ml stripette på pipteboy, og sug al 50/50 medie ud. Hold flasken skråt under arbejdet, og stripetten sættes i hjørnet af flasken. 57/43

2. Tag 15 ml RP10 med 25 ml stripette. Ikke skyl ned på overfladen hvor cellerne er, det kan skylle cellerne væk. 3. Inkuber cellerne i 5 % CO! for at opretholde ph på 7,2. Dag - 1: 30.4.2013 DEL 1: 1. Flyt konditioneret medie med pipetboy og en 25 ml stripette over i et 15 ml centrifugerør 2. Centrifuger mediet i 10 min ved 1200 rpm 3. Sterilfiltrer mediet gennem et 0,22 µl membranfilter. OBS. Gøres, når de 10 minutters centrifugering er færdig. 4. Imens skyl flasken med 10 ml PBS. Dette må ikke gøres direkte på cellerne. Skyl ved at vippe flasken. 5. Sug PBS fra, med pipetboy og 15 ml stripette 6. Tilsæt 1,5 ml Trypsin/EDTA- blanding med pipette og tilhørende tip. Vip flasken, så Trypsin/EDTA blandingen fordeler sig over cellerne og sæt den i inkubations- skabet (37 grader, 5% CO! ). Cellerne skal løsne sig, og det tager ca. 5. min. Tjek fremskridt i mikroskop. 7. Tilsæt 6 ml RP- 10 medie, for at inaktivere trypsin 8. Sug hele blandingen op med pipetpipetboy og en 25 ml stripette og kom det i et 20 ml cen- trifugerør 9. Centrifuger i 10 min ved 1200 rpm 10. Hæld RP- 10+Trypsin+EDTA (=supernatant) fra 11. Tilsæt 1,5 ml RP- 10 medie 12. Bland grundigt med pipette for at få en ensartet blanding 13. Udtag 10 µl af suspensionen med RP10 + HEK celler + tip og overfør det til den ene ende af tællekammeret 14. Tæl cellerne i 16 kvadranter eller flere, indtil vi har nået 100 celler. 15. Regn ud, hvor mange celler, der totalt var i vores flaske vha. følgende formel: Konc. af celler = (Antal talte celler * fortyndingsfaktor * 10^4)/ antal talte kamre For at finde antal celler i hele blandingen = Concentrationen af celler * ml medie 16. Tilsæt 15 ml RP- 10 til det 20 ml centrifugerør, hvori cellerne er. 17. Herefter sendes cellerne afsted til inaktivering. DEL 2: Cellerne kommer tilbage fra inaktivering 18. Udsåning af cellerne: der kan være 2 ml per brønd, dvs. 1 ml HEK/stamceller og 1 ml monocytter. Volumen skal være 1:1 og koncentrationsforhold ASC/HEK kontra monocytter 1:10 Dyrkning af humane DC ved adhærens - Co- kultur Materialer: - Fullblod - 0.9% NaCl (Sigma Aldrich, kat nr.s9888-1kg)(sterilt) (se opskrift) - Lymfoprep, densitet 1.077± 0.001g/ml (sterilt) (Medinor, kat. nr.: 1114545-1xPBS (laves ud fra 10x, steril filtreret) (Life Technologies, kat.nr.: 70011-01) 58/43

- PBS ph 7.4 + 1mM EDTA (Titriplex III) (MERCK, kat nr.1084180250) (steril filtreret) (Se opskrift) - Methylviolet eddikesyre (0.5% eddikesyre) (Ampliqon, kat.nr.: AMPQ00315.0250) - Trypan blå (0.4%) (Sigma, kat.nr.: 93595) - RPMI 1640 med 25mM HEPES uden glutamine (Invitrogen/Life Technologies, kat.nr.: 42401018) - L- Glutamine (stock konc. 100mM) (Invitrogen, kat.nr.: 21051-024) - Penicillin/Streptomycin (P:10,000 U/ml / S:10,000 μl/ml) (Sigma- Aldrich/Invitrogen, kat.nr.: P433) - FCS ( fra KIA lab sygehus Nord Lotte Hatting ) - RP- 10 (se opskrift) - Human GM- CSF (stock. 100μg/ml) (Peprotech, kat.nr.:# 300-03) - Humant IL- 4 (stock 100μg/ml) (Peprotech, kat.nr.: #200-04) - LPS (stock 10μg/ml) (Sigma, kat.nr.: E.coli 0111:34) - PBS + 0.1%BSA (Sigma, kat.nr.: A2153) + 0.01% natriumazid (MERCK, kat nr.822335.0100) (steril filtreret pga flow kørsel) (se opskrift) - PBS + 1% formaldehyd (MERCK, kat. nr. 1040032500) (Er lavet for jer) Plast: - 50ml centrifuge rør (TPP)(Starstedt, kat.nr.: 62547254) - 15ml centrifuge rør (TPP)(Starstedt, kat.nr.: 62554502) - Sterile pasteurpipetter (Copan, kat.nr.: 200CS01) - Steril filtre (Q.max syringe filter, kat.nr.: CAPS2502100S) - Sprøjte (Terumo, kat.nr.: 612-0120) - Lang kanyle (Misawa, kat.nr.: 137727-10014) - PP FACS rør (Falcon, kat.nr.: 60818-292) - 6 brøndsbakker (Corning, kat. nr.: 3506) 59/43

Opskrifter Forberedes inden forsøgs dag 0: RPMI 1640 + 1% P/S, 500ml - 5ml P/S tilsættes 500ml RPMI1640 RP-10 (500 ml) - RPMI1640 med 1% P/S (445ml) - 2mM glutamine (15ml) - 10% varmeinaktiveret FCS (50ml) - Behøves ikke at steril filtreres da alle komponenter er sterile, skal holdes sterilt PBS + 1mM EDTA, 400ml - 1mM EDTA (MW:744,48 g/mol) - 149 mg EDTA opløses i ca. 360-380 ml 1xPBS. EDTA bliver først opløst ved ph >8.0,pH stilles ned til ph 7.4 efter at EDTA opløses (der toppes evt. med 1XPBS indtil slutvolumen 400ml) - Steril filtreres inden brug og holdes sterilt. PBS + 0.1% BSA + 0.01% natriumazid, 100ml - 99 ml 1x PBS + 1 ml natriumazid (fra stockopløsning på 1 %) blandes. - 0,1 g BSA hældes forsigitgt oven på opløsning og BSA en vil roligt sive ned i opløsningen. Efter ca 20 min skulle alt BSA en være opløst og blandingen vendes forsigtigt nogle gange for at få evt. rester af BSA på siderne opløst. (steril filtreret pga flow kørsel) 0.9% NaCl, 200ml - 0,9 g NaCl opløses i 200ml demineraliseret vand, sterilfiltreres inden brug og holdes sterilt. Dag 0 Onsdag den 1. maj. Oprensning af PBMC fra buffycoat 60/43

Lymfoprep ud af køleskab så det kan nå at få stuetemp inden punkt. 2. 1 1. Fortynd fullblod 1:2 med RPMI1640 + pen/strep - Der bruges ca. 54 ml fullblod 2. Fordel det fortyndede buffycoat på 50ml TPP rør (ca.15-20ml pr rør) og lejr FORSIGTIGT Lymfoprep under fullblod med en lang kanyle. 3. Centrifuger cellerne i 20min, 180xg, 18-20 o C, bremse 0. 4. Sug FORSIGTIGT ca. 7.8 ml supernatant fra med en lang pipette. 5. Centrifuger cellerne i 20min, 380xg, 18-20 o C. bremse 0. 6. Høst interfasen/pbmc med en engangs plast- pasteur pipette, og saml to interfaser i et 50ml TPP rør indeholdende 10-15ml kold 2 PBS+1mM EDTA. Fyld op med kold PBS+1mM EDTA til 25ml. 7. Vask cellerne 3 gange i ca. 10 ml kold PBS+1mM EDTA- pool cellerne undervejs så man efter 2. vask har samlet alle interfaser i et 50 ml rør TPP rør. 8. Vask: 1. 300xg, 4 o C, 10min, bremse 0 2. 300xg, 4 o C, 10min, bremse 2 3. 200xg, 4 o C, 10 min, bremse 2 9. Efter 3. vask resuspender cellerne i koldt 2 RP10 medium. - Der resuspenderes i 3 ml 10. Tæl cellerne i methylviolet 3 (90μl methylviolet + 10μl celler) (Dette gøres ved at overføre 10μl cellesuspension fortyndet i methylviolet på et tællekammer, og dernæst tælles celler indtil der er talt min. 100 celler (se figur) og cellekoncentrationen udregnes) Talt antal celler= 210 Celletal (C)= antal talte celler x fortyndingen af celler x 10 4 / antal kamre talt Indstil cellerne på 8x10 6 celler/ml i RP10 medium 61/43

Oprensning af monocytter ved adhærens De 6 brøndsbakker I skal udså cellerne i er der i forvejen celler: Brønd 1+2 er der udsået stamceller og i brønd 3+4 udsået kontrol celler. 1. Sug alt eksisterende medie fra i brøndene. 2. Udså i hver brønd 8x10 6 celler, dvs. 1 ml cellesuspension 3. Tilsæt yderligere 2 ml RP10 medium til alle brøndene. 4 Sæt bakken i 37 C CO 2 - inkubator i 1½ timer, hvorved monocytterne vil adhærere til bunden af brøndene. 5 Efter 1½ time sug supernatanten fra (indeholdende non- adhærente celler), og skyl efter- følgende hver brønd forsigtigt 2 gange med ca. 1 ml varmt cytokinfrit RPMI 1640 + 1% P/S medium. Gør dette ved at holde bakken skrå, så mediet blot løber ned over bun- dende af brøndene (gentages 2-3 gange med samme medium), og medium suges herefter bort 4. Gentag proceduren fra den modsatte side af bakken med nyt varmt skylleme- dium. 6 PBMC er indeholder ca. 15% monocytter, resten adhærerer ikke og skylles derfor fra. Tilsæt RP10 medium med cytokiner (se nedenfor) Tilsætning af RP10 medium + cytokiner 7 Optø og slyng cytokinerne (GM- CSF + IL- 4). Cytokinerne antages for friske i op til 5 dage ved 4 o C efter optøning. 8 Der tilsættes 3 ml RP10 medium pr. brønd med cytokiner til alle 6 brønde se nedenfor. Slutkonc. af cytokiner i alle brønde er følgende: a. GM- CSF 5 : 60 ng/ml medie (stock konc. 100 μg/ml) b. IL- 4 5 : 100 ng/ml medie (stock konc. 100 μg/ml) RP10: 2,989 ml GM- CSF: 1,8 μl IL- 4: 3 μl 62/43

9 Stil cellerne i 37 o C CO 2 - inkubator. Dag 2 fredag den 3. maj Tilsætning af medium + cytokiner 10 Tilsæt 0.5 ml frisk cytokin- holdigt RP10 medium (samme konc. som herunder) til alle brøndene. a. GM- CSF: 360 ng/ml medie (stock konc. 100 μg/ml) b. IL- 4: 600 ng/ml medie (stock konc. 100 μg/ml) RP10: 0,495 ml GM- CSF: 1,8 μl IL- 4: 4 μl 11 Stil cellerne i 37 o C CO 2 - inkubator Dag 5 mandag den 6.maj Tilsætning af medium + cytokiner 12 Tilsæt 1 ml cytokin- holdigt RP10 medium alle brøndene. a. GM- CSF: 180 ng/ml medie (stock konc. 100 μg/ml) b. IL- 4: 300 ng/ml medie (stock konc. 100 μg/ml) RP10 medium: 0,9952ml 63/43

GM- CSF: 1,8 μl IL- 4: 3 μl 13 Stil cellerne i 37 o C CO 2 - inkubator. Dag 6 tirsdag den 7. maj Modning 14 Til alle brønde tilsæt LPS (modningstimuli) i slutkoncentration 10ng/ml (stock 10μg/ml). Dvs. fortynd LPS 1:1000 i brønden ca. kl 09.00 Medium: - ml/brønd LPS stock: 4,5 μl /brønd 15 Stil cellerne i 37 o C CO 2 - inkubator Dag 7 onsdag den 8. maj 2013 Høst af celler + flowcytometri 16 Kig på cellerne i mikroskopet, noter hvad der observeres, og tag billeder 17 Høst alle celler ved at suge medie med celler fra med pipette og overfør suspensionen til et 50 ml TPP rør. For at høste de semi- adhærente celler, spul hver brønd flere gange med koldt RPMI 1640, og overfør ligeledes til samme 50 ml TPP rør. (Dette kan tage op til 5min pr brønd). Der tages billeder af hver brønd efter høst, for at se hvor meget der er høstet. 18 Brønd 1+2 samles i et 50 ml TPP rør. Brønd 3+4 samles i et andet 50 ml TPP rør. Brønd 5+6 samles i et tredje 50 ml TPP rør. 19 Centrifuger cellerne i 10min, 300xg, 22 o C, bremse 2. 20 Hæld supernatanten fra (så meget som muligt) og resuspender cellerne i 100 μl PBS + 0.5% BSA + 0,01% sodium azid. Tilbageløbet svarer til ca. 200-300 μl, dvs. nu er der ca. 300 400 μl cellesuspension totalt. Mål nøjagtilt hvor meget der er i alt. 21 Tæl cellerne i trypanblåt 6 (fortyndes 1:2)(10 μl trypanblå + 10 μl cellesuspension ) Celletal: Kunn ikke tælles Celletal: Kunne ikke tælles 64/43

Noter: Celletal: Kun kontrol kunne telles: 37 stk 22 Gør 3x2 FACS rør klar med følgende antistoffer samt isotype kontroller for de forskellige markører (se skema): Rør med antistoffer Rør med isotyper CD80- PE- Cy5 20μl PE- Cy5 isotype 20μl HLA- DR- APC- H7 5μl APC- H7 isotype 5μl CD86- PE 20μl PE isotype 20μl CD83- APC 20μl APC isotype 20μl CD14- FITC 10μl CD14 isotype 10 μl 23 Overfør halvdelen af cellesuspensionen fra hver 50 ml TPP rør til ét FACS rør indeholdende antistoffer og til ét rør indeholdende isotype kontroller 24 Inkuber rørene ½ time ved 4 o C under sølvpapir 25 Tilsæt 1,5 ml PBS + 0,5% BSA + 0,01% sodium azid pr. rør 26 Centrifuger rørene i 5min, 300xg, 20 o C, bremse 2 27 Hæld supernatanten fra og resuspender pellet i 2 ml PBS + 0,5% BSA + 0,01% sodium azid pr. rør 28 Centrifuger rørene i 5min, 300xg, 20 o C, bremse 2 29 Hæld supernatanten fra og resuspender pellet i 500 μl PBS + 1%formaldehyd og vortex (NB! Formaldehyd er kræftfremkaldende, stå i stinkskab under tilførslen, og luk FACS rør med prop). Hvis cellerne skal analyseres samme dage, kan pellet resuspenderes i 500m μl PBS. 30 Analysér på flowcytometer eller gem ved 4 o C indtil analyse (inden 7 dage) Mærkningsdato: Indkørselsdato: 1. Lymfoprep opbevares i køleskab, når det først er blevet åbnet, men for at densiteten skal være korrekt, skal Lymfoprep varmes op til stuetemperatur inden brug. 65/43

2. Idet at monocytter adhærerer til plastik ved 37 o C, er det vigtigt på nuværende tidspunkt at bruge kolde materiale, og centrifugere ved 4 o C, da vi ikke vil have, at monocytter ad- hærerer til rørene på nuværende tidspunkt. 3. Methylviolet farver leukocytters kerne, men eddikesyrer ødelægger eventuelle erythro- cytter. 4. Idet at monocytter adhærere til petriskålen ved 37 o C, fjerne vi lymfocytterne ved at fjerne supernatanten. Efter vaskene kan man kiggge i mikrosopen, der burde ikke være nogle/ret mange løse celler, hvis der er, skal man nok vaske en gang mere. PBMC er indeholder ca. 15% monocytter, så kun 15% af celler vil forblive i skålen. 5. IL- 4 og GM- CSF inducerer diffenetieringen af monocytter til umodne dendritiske celler. GM- CSF inititerer monocytters differnetiering til dendritiske celler, mens IL- 4 forhindrer monocytters differentiering til makrofager. 6. Trypan blå farver døde celler blå, mens farven ikke kan trænge ind i levende celler, hvorved disse vil lyse klart (evt. med en blålig membran) 66/43

3. Beregninger Dag - 5 UDREGNINGER (A) Sammensætning af stoffer i RP10/ α-mem i 15 ml 50:50 blanding alfa-mem/rp10 Alfa- MEM: 89 % alfa- MEM: (7.5 ml x 89 % alfa- MEM) / 100 = 6,675 ml alfa- MEM 10 % Føtalt kalveserum (FCS): (7,5 ml x 10 %) / 100 = 0,75 ml FCS 1% Pen/Strep: (7,5 ml x 1 %) / 100 = 0,075 ml Pen/Strep 0,5 % Gentamycin: (7,5 ml x 0,5 %) / 100 = 0,375 ml Gentamycin Der er taget udgangspunkt i opskriften fra udleveret protokol, for at finde procenten af de forskellige koncentrationer: RP10 500ml: RPMI inkl 1 % Pen/Strep: (445 ml/500 ml) x 100 = 89 % RPMI m/ 1 % Pen/Strep Glutamin (200 mm): (5 ml / 500 ml) x 100 = 1 % glutamin FCS: (50 ml/500 ml) x 100 = 10 % FCS Koncentration af de af nedeståene stoffer i 7,5 ml bliver: 89 % RPMI m/ 1 % Pen/Strep: (7,5 ml x 89 % PRMI) / 100= 6,675 ml RPMI m/ 1 % Pen/Strep 1 % Glutamin: (7,5 ml x 1 %) / 100 = 0,075 ml glutamin 10 % føtalt kalveserum (FCS): (7,5 ml x 0 %) /100 = 0,750 ml FCS Dag - 2 Dag - 1 100 % RP10 medie, 15 ml blev tilsat (B) Utregning af antal HEK- celler og tilsætning af cellesuspension Nb, Gruppen havde HEK- celler Der skulle udregnes hvor mange HEK- celler der skulle udsåes for at forholdet skulle blive 1:10 mellem HEK:monocytter. Der skal tilsættes 8 x 10⁶ PBMC, hvor det antages at 10 % ( 800 000) monocytter adhærer, svarende til at der skal sås 80 000 HEK- celler per bakke. Cellekoncentration blev utregnet med formel: Cellekoncentration (C): (Antal talte celler x fortyndingen af cellerne x Volumen i talte kvadrant) / 67/43

antal talte kamre Dette svarede til: (1532 stk celler x 2 x 10⁴) ) / 4 stk kamre = 7,66 x10⁶ celler/ml (C) Mængde cellesupension der skal tilsættes For at finde ud hvor meget cellesuspension som skal tilsættes for, at det bliver en koncentration på 80000 celler per brønd i 4 ml, bruges formlen: C₁ x V₁= C₂ x V₂ à V₁ = (C₂ x V₂)/ C₁) ) 7,66 x10⁶ celler/ml x V₁ = 800000 celler x 4 ml V₁ =(80000 x 4)/ (7,66 x10⁶) V₁ = 42 microliter Dag 0 (D) Udregning af mængde cellesuspesion i PBMC Samme formel som overstående blev brugt til at finde cellekoncentration: (210 stk celler x 10 x 10⁴) / 1 kammer = 210 x10⁶ celler/ml Efter resuspendering i RP10: 3 ml x (210 x10⁶ celler /ml) = 630 x10⁶ celler i hele suspension For at finne sutvolumen slik at der tilsvarer 8 x10⁶ celler per ml bruges formel C₁ x V₁ = C₂ x V₂ à V₁ = (C₂ x V₂)/ C₁) ) (8 x10⁶) x V₁ = (630 x10⁶ celler) x 1ml V₁ = ((630 x10⁶ celler) x 1ml))/ (8 x10⁶) V₁ = 7,8 ml skal slutvolumen være Eftersom cellerne er resuspenderte i 3 ml: 7,8 ml 3 ml = 4,8 ml ekstra medie tilsættes. (E) Udregning af cytokinmængde Der skal tilsættes 3ml cytokin- holdigt RP10 medie GM- CSF: 60 ng/ml (stock konc. 100 microgram/ml) IL- 4: 100 ng/ml medie (stock. Konc. 100 microgram/ml) 68/43

100 microgram/ml = 100000 ng/ml Til udregning af cytokiner er følgende formel brugt: C₁ x V₁= C₂ x V₂ à V₁ = (C₂ x V₂)/ C₁ GM- CSF: 100000 ng/ml x V ml = 60 ng/ml x 3 ml à V₁ = (60 ng/ml x 3)/ 100000 V= 0,0018 ml = 1,8 microliter GM CSF IL- 4 100000 ng/ml x V = 100 ng/ml x 3 ml V = 0,003 ml = 3 microliter IL- 4 Dag 2 (F) Udregning af cytokinmængde Dag 2 Der skal tilsættes 0,5 ml cytokin- holdigt RP10 medie GM- CSF: 360 ng/ml (stock konc. 100 microgram/ml) IL- 4: 600 ng/ml medie (stock. Konc. 100 microgram/ml) 100 microgram/ml = 100000 ng/ml (Formel C₁ x V₁= C₂ x V₂ à V₁ = (C₂ x V₂)/ C₁) ) = V₁ GM- CSF: 100000 ng/ml x V ml = 360 ng/ml x 0.5 ml V =(360 ng/ml x 0.5 ml) /100000 V= 0,0018 ml = 1,8 microliter GM CSF IL- 4 100000 ng/ml x V = 600 ng/ml x 0,5 ml (600 ng/ml x 0,5 ml) /1000000 V = 0,003 ml = 3 microliter IL- 4 Dag 5 (G) Udregning af cytokinmængde Dag 5 Der skal tilsættes 1 ml cytokin- holdigt RP10 medie GM- CSF: 180 ng/ml (stock konc. 100 microgram/ml) IL- 4: 300 ng/ml medie (stock. Konc. 100 microgram/ml) 100 microgram/ml = 100000 ng/ml (Formel: C₁ x V₁= C₂ x V₂ à V₁ = (C₂ x V₂)/ C₁) GM- CSF: 100000 ng/ml x V ml = 180 ng/ml x 1 ml V= 0,0018 ml = 1,8 microliter GM CSF 69/43

IL- 4 100000 ng/ml x V = 300 ng/ml x 1 ml V = 0,003 ml = 3 microliter IL- 4 Dag 6 (H) LPS skal fortyndes 1:1000 Eftersom det er 4,5 ml RP10 m/cytokiner (3 ml (dag 0) + 0,5 ml (dag 2) + 1ml (dag 5): 4,5 ml/1000 = 0,0045 ml = 4,5 microliter LPS tilsættes 70/43

4. Resultater for tranwell- insert og konditonerert medie tilsat dag 1 og 6 Flowcytometri Konditioneret medie 1 Kontrolceller: 71/43

HEK+ monocytter 72/43

ASC+monocytter 73/43

Konditioneret medie 2 Kontrolceller: 74/43

HEK+ monocytter: 75/43

ASC+ monocytter 76/43

Transwell- insert Kontrol: 77/43

Co- kultur Kontrol 80/43