Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier

Metoder til detektion og identifikation af ESβL producerende bakterier Forfatter: Christina Mejdahl Nielsen, født den 29.06.84 Projektgruppe: Rosa Helena Sinivuori, født den 04.10.84 Jeanette Olsen, født den 11.01.85 Bachelorprojektperiode: Den 14.04-09.06 2009. Uddannelsesinstitution: Bioanalytikeruddannelsen, Professionshøjskolen Metropol, København Fag: Mikrobiologi Vejledere: Charlotte Birk Olsen, Klinisk Mikrobiologisk afdeling, Næstved Sygehus Charlotte Kragh Klausen, Bioanalytikeruddannelsen København

Christina Mejdahl Nielsen Billederne illustreret på forsiden er: - Billede øverst i venstre hjørne er fra [24] Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier - Billedet nederst i venstre hjørne er fra [19] - Billedet øverst i højre hjørne er fra http://216.62.91.163/industry/cosmetic/vitek2compact/vitek2testcards.htm - Billedet nederst højre hjørne er fra http://www.biomerieux-diagnostics.com/servlet/srt/bio/clinicaldiagnostics/dynpage?open=cnl_cln_prd&doc=cnl_prd_cpl_g_prd_cln_21&pubparams.sf orm=9&lang=en Forord Dette er et bachelorprojekt, hvor den praktiske del er udarbejdet på Klinisk Mikrobiologisk Afdeling, Næstved Sygehus. Denne undersøgelse er delvis rettet mod bioanalytikeren i det mikrobiologiske laboratorium til at optimere deres arbejde i detektion og identifikation af ESβL producerende bakterier. Derudover er undersøgelsen rettet mod patienterne, som er inficeret med ESβL producerende bakterier, da der bestræbes at finde metoder med højere diagnostisk sensitivitet og specificitet, der vil kunne implementeres i det mikrobiologiske laboratorium. Jeg vil gerne sige en særlig tak til alle der hjulpet med til dette projekt: Søren Mattern Søes fra Oxoid for at være behjælpelig med svar på spørgsmål og ikke mindst for Brilliance TM ESβL Agar pladerne, Henrik Hasman og Lisbeth Andersen fra DTU Food samt Linda Schjerlund fra Klinisk Mikrobiologisk afdeling, Hvidovre Hospital for med kort varsel at kunne levere molekylærbiologisktestet stammer, Helle Morgenstjerne, Allan Panslev og Tina Alsing fra biomérieux for information, venlighed og hjælpsomhed for de problemer vi er stødt på undervejs. En stor tak skylder jeg bachelorprojektgruppen på Hvidovre Hospital for at måtte anvende deres data som reference. Til sidst, men ikke mindst, vil jeg gerne takke begge vores to vejledere Charlotte Birk Olsen og Charlotte Kragh Klausen samt personalet på Klinisk Mikrobiologisk afdeling, Næstved Sygehus, for at være imødekommende og hjælpsomme under bachelorperioden. Forfatterens navn og underskrift: Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, Professionshøjskolen Metropol, København 1 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Resumé Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier ESβL producerende Enterobacteriaceae er i dag et stigende problem over hele verden. ESβL udbrud er svære at kontrollere og giver epidemiske spredninger, som med stor sandsynlighed skyldes smitte fra patient til patient. På grund af den stigende prævalens er det vigtigt at finde en screeningsmetode samt en konfirmatorisk test med høj diagnostisk sensitivitet og specificitet. Disse metoder skal sørge for at detektere og identificere ESβL producerende bakterier hurtigt og præcis, så der er mulighed for at nedsætte patientens dødelighed. Metoder Flere firmaer lancerer deres bud på detektionen af ESβL producerende bakterier, hertil har vi fundet 4 metoder: To screeningsmetoder; ChromID ESβL agar og Brilliance ESβL Agar, og to konfirmatoriske tests; Cica-Beta-Test samt VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort. Resultater Vi fandt den diagnostiske sensitivitet og specificitet for ChromID ESβL agar til 85,0 % og 70,0 %, mens den for Brilliance ESβL Agar var 87,0 % og 67,5 %. Derudover fandt vi Cica-Beta-Test til at have en diagnostisk sensitivitet og specificitet på henholdsvis 83,0 % og 92,5 %, samt VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort til at have en på 100 % og 11,4 %. Konklusion Brilliance ESβL Agar og ChromID ESβL agar havde næsten den samme diagnostiske sensitivitet, men da Brilliance ESβL Agar koster mindre, foreslår jeg, at denne screeningsplade implementeres på KMA, Næstved Sygehus. Cica-Beta-Test viser høj specificitet, og derfor mener jeg, metoden godt kan anvendes i laboratoriet på KMA, Næstved Sygehus. Cica-Beta-Test ville kunne anvendes ved udbrud på Næstved Sygehus, og jeg foreslår, at metoden anvendes i tilfælde, hvor lægerne mener, at det er nødvendigt. Ud fra vores undersøgelse kan vi ikke konkludere på, hvordan VITEK 2 AST-GN27 ESβL kortet og VITEK 2 Compact apparatet fungerede, da den diagnostiske sensitivitet og specificitet ikke var valid eller pålidelig. 2 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Indholdsfortegnelse Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier FORORD... 1 RESUMÉ... 2 INDHOLDSFORTEGNELSE... 3 FORKORTELSER... 5 INTRODUKTION... 6 METODERNE NÆSTVED SYGEHUS ANVENDER I DAG... 6 FORMÅL... 7 MÅL... 8 PROBLEMFORMULERING... 8 TEORI... 8 BETALAKTAMANTIBIOTIKA... 8 BETALAKTAMASER... 9 EXTENDED-SPECTRUM BETA-LACTAMASES (ESβL)... 12 ANALYSEPRINCIP FOR CHROMID ESβL AGAR (BIOMÉRIEUX)... 13 ANALYSEPRINCIP FOR BRILLIANCE TM ESβL AGAR (OXOID)... 14 GLYKOSIDASER... 16 ANALYSEPRINCIP FOR CICA-BETA-TEST (MAST GROUP)... 16 ANALYSEPRINCIP FOR VITEK 2 COMPACT OG AST-GN27 ESβL KORT (BIOMÉRIEUX)... 18 METODEVALG OG AFGRÆNSNINGER... 19 VALG AF BAKTERIEPOPULATION... 19 VIDEN OM BAKTERIEPOPULATION... 20 METODEVALG... 20 METODEAFGRÆNSNINGER... 21 MATERIALER... 22 BAKTERIEPOPULATION... 23 STAMMER... 23 METODER... 24 CEFPODOXIM... 24 DETEKTION AF ESβL PRODUCERENDE BAKTERIER... 24 IDENTIFIKATION MED VITEK 2 ESβL... 24 IDENTIFIKATION MED CICA-BETA-TEST... 25 STATISTISK BEREGNING... 25 RESULTATVURDERING... 25 RESULTATVURDERING AF CHROMID ESβL AGAR OG BRILLIANCE ESβL AGAR:... 25 RESULTATVURDERING AF VITEK 2 ESβL AST-GN27 KORT:... 26 RESULTATVURDERING FOR CICA-BETA-TEST (CBT-1+CBT-ESβL):... 26 3 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier RESULTATER... 27 DISKUSSION... 28 SCREENINGSMETODERNE... 28 CHROMID ESβL AGAR FRA BIOMÉRIEUX... 28 BRILLIANCE ESβL AGAR FRA OXOID... 30 SAMLEDE DISKUSSION AF CHROMID ESβL AGAR OG BRILLIANCE ESβL AGAR.... 33 SCREENINGSMETODERNE VED DEN NYE NOMENKLATUR... 35 DE KONFIRMATORISKE TESTS... 36 CICA-BETA-TEST FRA MAST GROUP... 36 VITEK 2 AST-GN27 ESβL KORT FRA BIOMÉRIEUX... 39 GENERELT FOR VORES PROJEKT... 42 KONKLUSION... 42 PERSPEKTIVERING... 43 REFERENCER... 45 FIGURER... 47 BILAG... 47 1. Konfirmatorisk test beskrevet mere uddybende. 2. Eksempel på svar printet ud fra VITEK 2 Compact. 3. Detaljeret informationer om alle de brugte stammer. 4. Fuldt detaljeret fremgangsmåde. 5. Alle resultater for Cefpodoxim zonen samt resultater for ChromID ESβL agar (biomérieux) og Brilliance TM ESβL Agar (Oxoid). 6. Alle resultater for CICA-BETA-TEST (MAST Group). 7. Alle resultater for VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort (biomérieux). 8. Resultaterne på VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort hentet fra Hvidovre Hospital. 9. Beregninger af diagnostisk sensitivitet og specificitet. 10. Slideshow fra Oxoid reference: Søren Mattern Søes, Oxoid, tlf. 44 97 97 35. 11. Oversigt over alle falske positive for alle fire metoder. 12. Oversigt over alle falsk negative resultater for alle 4 metoder. 13. Artikel (kilde 16 i litteraturlisten): Extended spektrum Beta-lactamase (ESβL) en ny trussel. 14. Billeder af pladerne overblik over de forskellig farvede kolonier vi har observeret. 15. Indlægsseddel for Vitek2 AST-GN27. Gram negativt Resistenskort. biomeriéux. 16. Instruktionsmanual for biomeriéux VITEK 2 COMPACT apparat. 17. Indlægsseddel for biomeriéux ChromID TM ESβL agar Selektivt kromogent medium til screening for Extended Spektrum β -laktamase producerende enterobakterier (ESβL). 18. Indlægsseddel for biomeriéux ID indole TDA (ID-TDA) Påvisning af indoldannelse og TDA. 4 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Forkortelser Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Forkortelse Navn AES Advanced Expert System ATCC American Type Culture Collection CBT-1 Cica-Beta-Test 1 CBT-AmpC Cica-Beta-Test C CBT-ESβL Cica-Beta-Test CVA CBT-substrat Cica-Beta-Test substrat C. freundii Citrobacter freundii DNA Deoxyribonukleinsyre E. cloacae Enterobacter cloacae E. coli Escherichia coli EDTA Etylen-diamin-tetra-eddikesyre ESβL Extended-spectrum beta-lactamase FN Falsk negative FP Falsk positive HH Hvidovre Hospital KESC Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter KMA Klinisk Mikrobiologisk afdeling K. oxytoca Klebsiella oxytoca K. pneumoniae Klebsiella pneumoniae MβL Metallobetalaktamaser MIC Mindst hæmmende koncentration M. morganii Morganella morganii NaCl Natriumklorid/saltvand NFS Nykøbing Falster Sygehus NS Næstved Sygehus P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa PBP Penicillinbindende proteiner PCR Polymerase chainreaction P. mirabilis Proteus mirabilis Proteeae Proteus, Providencia og Morganella RH Regionshospitalet Herning S. bareilly Salmonella bareilly S. maltophilia Stenotrophomonas maltophilia SN Sandt negative SP Sandt positive SS Slagelse Sygehus 5 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Introduktion Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Extended-spectrum beta-lactamase (ESβL) producerende bakterier blev i Europa første gang omtalt i starten af 1980 erne, kort tid efter indførelse af tredje generations cefalosporiner [4, 5, 10, 18, 26]. I dag er ESβL producerende Enterobacteriaceae et velkendt og stigende problem over hele verden og er især årsag til nosokomielle infektioner [4, 8, 9, 14]. ESβL udbrud er svære at kontrollere og giver epidemiske spredninger, som med stor sandsynlighed skyldes smitte fra patient til patient [4, 10, 14]. Den ESβL producerende bakterie indeholder bakterielle enzymer (betalaktamaser), som er i stand til at hydrolysere og nedbryde betalaktamringen i penicilliner, cefalosporiner, monobaktamet aztreonem samt nogle typer af carbapenemer [1, 2, 10, 13, 15, 16, 22, 26]. Udover enzymernes evne til at udvikle resistens, forårsager disse også problemer i forhold til de plasmider, som ESβL-generne sidder på. Disse plasmider bærer i de fleste tilfælde også på gener, som er co-resistente over for aminoglycosider og fluorokinoloner, hvilket vil sige, at behandlingsmulighederne er begrænsede [1, 8, 15, 16, 26]. Det betyder, at det er vigtigt at finde metoder, der er hurtige og præcise til at detektere og identificere ESβL producerende bakterier [5]. ESβL detektionstiden tager i dag minimum 48 timer [11]. Ved sepsis med enten Escherichia coli (E. coli) eller Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), hvor en ESβL produktion ikke forekommer, vil dødeligheden være omkring 20 % [1, 3, 14]. Ved sepsis med en ESβL producerende bakterie, vil patienten i løbet af de nævnte 48 timer kunne ses i klinisk bedring, da betalaktamaserne endnu ikke har nedbrudt antibiotikummet. Efter få dage vil betalaktamaserne have hydrolyseret betalaktamantibiotikummet, og behandlingen er hermed inaktiv [16]. Denne forkerte behandling og på grund af detektionstiden gør, at dødeligheden stiger med faktor 2-3, hvilket vil sige 40-60 % [1, 3, 14]. Metoderne Næstved Sygehus anvender i dag Den screeningsmetode, Klinisk Mikrobiologisk Afdeling (KMA), Næstved Sygehus, i dag anvender til at detektere en mulig ESβL producerende bakterie, er diskdiffusionsmetoden, hvor der udføres en primær resistensbestemmelse. Cefpodoximdiskens hæmningszone fungerer som screeningen på resistenspladen. Findes en nedsat hæmningszone 1 for cefpodoxim, udføres en konfirmatorisk test. 1 24mm for E. coli, K. pneumoniae og Klebsiella oxytoca (K. oxytoca), 29mm for Proteus mirabilis (P. mirabilis) og 19mm for Citrobacter species [31] 6 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier I forbindelse med screeningsmetoden kan der ske en række fejl. Da screeningen foregår i forbindelse med den primære resistensbestemmelse, kan det forekomme, at der på pladen ligger en ESβL producerende bakterie i blanding med andre bakterier. Her kan det være nødvendigt at lave en yderligere isolering til dagen efter. Dette bevirker, at detektionstiden bliver længere. Tilmed kan der i andre tilfælde optræde en sparsom mængde af ESβL producerende bakterier i prøvematerialet. Dette ses ved patienter med en bærertilstand, hvor den ESβL producerende bakterie ikke har forårsaget infektionen. Her kan det risikeres, at den ESβL producerende bakterie trods totaltspredningen ikke ligger ved cefpodoximdisken og måske ikke detekteres, da bakterien ikke ses i cefpodoxims hæmningszone 2. Forskellige firmaer er begyndt at fremstille screeningsplader indeholdende cefpodoxim til at detektere de hyppigst forekommende ESβL producerende bakterier [5, 9, 22 og bilag 17]. Den konfirmatoriske test, KMA, Næstved Sygehus, anvender, er: Cefalosporin/clavulansyre kombinationsdisk på iso-sensitest agar [4]. Her bruges fire antibiotikadisks: Ceftazidim ± clavulansyre og cefotaxim ± clavulansyre, som lægges på en totalspredt iso-sensitest plade uden blod. Ved en hæmningszonedifference på 5mm mellem to antibiotika ved tilstedeværelse af clavulansyre er en ESβL produktion påvist [4, 15] (se bilag 1 for uddybning). Ved den konfirmatoriske test kan der også forekomme fejl. Der kan være tvivl ved aflæsning af hæmningszonestørrelse. Her skal vurderes, om væksten på iso-sensitest pladen uden blod er semikonfluerende, og ved tvivl skal videre test udføres. I nogle tilfælde vil en ny udsåning være nødvendig. Alt dette er med til at forsinke detektionstiden yderligere. Ifølge Overlæge Ole Heltberg, KMA, Næstved Sygehus, ses desuden flere nylige fund af ESβL producerende stammer 3 at have en difference på 3-4mm. Her fejler den nuværende konfirmatoriske test. Der tænkes på at ændre retningslinjerne eller eventuelt finde bedre alternativer. I forbindelse med screeningsmetoden vil vi gerne teste biomérieuxs ChromID ESβL agar og Oxoids Brilliance ESβL Agar. Med hensyn til den konfirmatoriske test vil vi gerne afprøve to metoder: biomérieuxs VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort og MAST Groups Cica- Beta-Test. Formål Vi undersøger disse metoder for at finde hurtigere og bedre detetktionsmetoder, hvor også flere ESβL producerende bakterier findes. Hvis patientens ESβL producerende bakterie 2 Charlotte Birk Olsen, Klinisk Mikrobiologisk afdeling, Næstved Sygehus. 3 Formentligt er det fra samme klon. 7 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier detekteres og identificeres hurtigere, er der mulighed for at nedsætte dødeligheden. Ydermere vil en mere præcis metode finde flere tilfælde af bakterier, der producerer ESβL, hvilket samtidigt også gør, at der reddes flere liv. Mål Målet med vores bachelorprojekt er at undersøge de fire nævnte metoder med henblik på detektion af ESβL producerende bakterier. Vi vil finde metodernes diagnostiske sensitivitet og specificitet. Udover dette vil der i projektet blive diskuteret detektionstiden og økonomien, da disse to aspekter også er væsentlige. Ud fra resultaterne fra vores forsøg vurderes metoderne, med henblik på en mulig implementering på KMA, Næstved Sygehus. Problemformulering Hvilke af analysemetoderne: ChromID ESβL agar (biomérieux), Brilliance ESβL Agar (Oxoid), Cica-Beta-Test (MAST Group) samt VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort (biomérieux) har den højeste diagnostiske sensitivitet og specificitet og vil kunne anvendes i det mikrobiologiske laboratorium til detektion og identifikation af ESβL producerende bakterier? Teori Betalaktamantibiotika Antibakterielle midler, som går ind og skader bakteriens cellevæg uden at skade den humane celle, er nogle af de vigtigste og mest brugte midler [33]. Blandt disse midler er den største og vigtigste gruppe betalaktamantibiotika, som inddeles i penicilliner, cefalosporiner, monobaktamer og carbapenemer, som fælles for alle har en betalaktamring med en betalaktambinding i deres kemiske struktur (se figur 1). Figur 1: Her ses betalaktamringen (rød cirkel) og betalaktambindingen (blå firkant) [33]. 8 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Alt efter de kemiske sidegrupper ændres virkningsmekanismen i de forskellige midler f.eks. at være smalspektret til at være bredspektret [33]. Bakteriers cellemembran indeholder peptidoglycan. Betalaktamantibiotika går ind og hæmmer cellemembranens enzymer (proteinstoffer), der er med til at opbygge peptidoglycanet. Hæmningen sker ved, at betalaktamantibiotikummet binder sig ved hjælp af kovalente bindinger til proteinstofferne. Disse bindinger kaldes penicillinbindende proteiner (PBP). De Gram-negative bakterier, som Enterobacteriaceae hører til, har kun et tyndt peptidoglycanlag (1-2 lag). Peptidoglycanlaget ødelægges, fordi laget ikke kan klare det høje osmotiske tryk inde i bakterien. Dette kaldes bakteriolyse [33]. Penicilliner er opdelt i tre grupper: 1) Smalspektrede betalaktamasefølsomme penicilliner, 2) smalspektrede betalaktamaseresistente penicilliner og 3) penicilliner med udvidet spektrum [33]. ESβL producerende bakterier er resistente over for de fleste penicilliner, dog viser resistensbestemmelser, at mecillinam tilhørende gruppe 3) oftest er følsomme. Hertil vælges mecillinam frem for andet [34]. Cefalosporiner er inddelt i generationer (1.-4.), som er baseret på, hvornår de er fremstillet, men også på deres antibakterielle aktivitet, hvor en stigning af generationen gør at antibiobikummet har et større spektrum og derved virker på flere forskellige arter af bakterier. 3. og 4. generation har en god aktivitet på Enterobacteriaceae og Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Fra 3. generation kan nævnes cefpodoxim, cefotaxim og ceftazidime og fra 4. generation findes cefepime og cefpirome [20, 33]. Monobaktamer har deres effekt på betalaktamaser, som dannes af aerobe Gram-negative bakterier. Under monobaktamerne findes kun aztreonam, som er i klinisk brug [33]. Carbapenemer er det af alle betalaktamantibiotika, der har det bredeste spektrum og derved den største effektivitet. De virker både på aerobe og anaerobe Gram-positive og Gramnegative bakterier dog med få undtagelser. Blandt carbapenemer er meropenem, som er mest aktive mod Gram-negative bakterier, og imipenem, som foretrækkes i brug ved Gram-positive bakterier [20, 33]. Betalaktamaser Betalaktamaser er bakterielle enzymer, som er i stand til at hydrolysere og nedbryde betalaktamringen i betalaktamantibiotika. Hidtil er der rapporteret 533 betalaktamaser [1, 2, 9 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier 16, 20, 22]. Bakterier kan udover kromosomer også indeholde to andre former for deoxyribonukleinsyre (DNA): Plasmider og transposoner [20, 27]. Der findes flere forskellige måder at inddele betalaktamaser. I Amblers klassifikationssystem inddeles betalaktamaserne i fire grupper; A, B, C og D [2, 4, 8, 20]. Klassificeringen sker molekylært på baggrund af deres ligheder i aminosyresekvensen [20]. Klasse A: Klasse B: Klasse C: Gruppe D: Den består af de klassiske ESβL. Vi har beskæftiget os mest med denne gruppe, da den er hyppigst forekommende og derved det største problem. Gruppen vil blive uddybet nærmere i næste afsnit. Denne gruppe er metallobetalaktamaserne (MβL) og skal bruge zink eller et andet tungmetal for at blive katalyseret. Disse ses hyppigst hos Legionella og Stenotrophomonas maltophilia (S. maltophilia). Alle MβL hæmmes af etylendiamin-tetra-eddikesyre (EDTA), mens nogle MβL også hæmmes af aztreonam. MβL er resistente overfor penicilliner, cefalosporiner og carbapenemer. Størstedelen af MβL er kromosomalt kodet og er oftest af typerne VIM og IMP [2, 20]. Gruppen består af AmpC og er typisk kromosomalt kodet, men kan også være plasmidmedieret [15, 20]. AmpC producerende bakteriers resistensmønster minder om de ESβL producerende bakteriers, men AmpC hæmmes ikke af clavulansyre, sulbactam eller tazobactam men i stedet af kloxacillin og borsyre [6, 7]. AmpC produktion ses i bakterier som Citrobacter freundii (C. freundii) og Enterobacter cloacae (E. cloacae) og viser følsomhed overfor 4. generations cefalosporinet cefepime, som også bruges til screening. Blandt AmpC findes for eksempel generne CMY, FOX, ACT og ACC [4, 20]. I nogle tilfælde udtrykker ESβL producerende bakterier også AmpC. Findes en AmpC producerende bakterie til at være cefepime resistent 4, kunne det godt tyde på, at der også var en ESβL produktion [15]. Den sidste gruppe består af oxacillin hydrolyserende betalaktamaser (OXA) og PSE. Denne gruppe hæmmes ligesom ESβL af clavulansyre bare i en mindre grad og derudover hæmmes OXA af natriumklorid (NaCl). OXA produktion ses i bakterier som Acinetobacter species, P. aeruginosa og Enterobacteriaceae [20]. 4 Breakpoint er 27 mm. 10 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Tabel 1: Amblers klassifikationssystem Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Klassificering β-laktamaser Inhibitorer Klasse A ESβL Clavulansyre, sulbactam og tazobactam. Klasse B MβL EDTA Klasse C AmpC Kloxacillin og borsyre Klasse D OXA- og PSE gruppen Clavulansyre og NaCl (skema udarbejdet i samarbejde med Rosa Sinivuori og Jeanette Olsen) Der er blevet fremlagt en ny forståelse for inddelingen af betalaktamaser. Giske C.G. et al. (2009) har lavet nye opdelinger med henblik på at forenkle klassifikationerne og gøre det mere overskueligt, så sundhedspersonalet kan bidrage til en større indsats mod spredningen af betalaktamaser. Det har været svært for mikrobiologerne på KMA, Næstved Sygehus, at formidle nye fund som f.eks. AmpC producerende bakterier til sundhedspersonalet, da der er mange ting, de skal kunne overskue. Proceduren ved fund af AmpC producerende bakterier på KMA, Næstved Sygehus, har, ifølge overlæge Ole Heltberg, været simpel: Laboratoriet har svaret, at der ikke er fundet nogen ESβL producerende bakterier og har herefter indtastet resistensmekanismerne i systemet. På sådanne svar vil der ikke blive ført samme slags interventioner 5, som der gøres ved fund af en ESβL producerende bakterie, hvilket ikke er optimalt og på baggrund af dette kan den nye forståelse give forbedringer [29]. Inddelingen for den nye forståelse er som følgende (se tabel 2 næste side): De klassiske ESβL, som hører til Amblers klassifikationssystem klasse A, hedder nu ESβL A. Denne gruppe hæmmes af clavulansyre. ESβL 6 M er anden gruppe, som herunder inddeles i ESβL M-C, som er plasmidmedierede AmpC enzymerne, og ESβL M-D, som er OXA-ESβL. Disse hører til Amblers klassifikationssystem klasse C og D og hæmmes af kloxacillin og borsyre. Den sidste gruppe er ESβL CARBA og er givet, når en bakterie er i stand til at hydrolysere mindst et carbapenem. ESβL CARBA inddeles i tre undergrupper: 1) ESβL CARBA-A, 2) ESβL CARBA-D og 3) ESβL CARBA-D. ESβL CARBA-A består af blandt andet KPC 7 og GES typerne og hæmmes af borsyre, mens ESβL CARBA-D er metallobetalaktamaser blandt andet af typerne VIM og IMP, og disse hæmmes af EDTA. Den sidste undergruppe er ESβL CARBA-D og består af OXAcarbapenemaser. Disse findes ved fænotypisk eller genotypisk bestemmelse [29]. I vores resultater bruger vi forståelsen af Amblers klassifikationssystem, men der bliver i diskussionen inddraget den nye forståelse, beskrevet af Giske C.G. et al. (2009), da dette måske ændrer på nogle ting ved vores projekt. 5 Isolering, øget hygiejne osv. 6 ESβL miscellaneous oversat diverse ESβL 7 Klebsiella pneumonia klasse A carbapenemase 11 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Tabel 2: Klassificering af ny nomenklatur Klassificering β-laktamaser Inhibitorer ESβL A ESβL Clavulansyre, sulbactam og tazobactam. ESβL M : ESβL M-C Plasmidmedieret AmpC Kloxacillin og borsyre ESβL M-D OXA-ESβL Kloxacillin og borsyre ESβL CARBA OXA- og PSE gruppen Clavulansyre (dog i mindre grad end ESβL A ) og NaCl ESβL CARBA-A ESβL carpenenemaser Borsyre ESβL CARBA-B MβL EDTA ESβL CARBA-D OXA-carbapenemases Findes ved fænotipisk og/eller genotyipisk bestemmelse (skema udarbejdet i samarbejde med Rosa Sinivuori og Jeanette Olsen) Extended-Spectrum Beta-Lactamases (ESβL) Den ESβL producerende bakterie indeholder bakterielle betalaktamaser, som er i stand til at hydrolysere og nedbryde betalaktamringen af de fleste betalaktamantibiotika [1, 2, 13, 15, 16, 22, 26]. ESβL tilhører klasse A i Amblers klassifikationssystem og findes af gentyperne: SHV, TEM, CTX-M, OXA og PER [4, 9, 20, 26]. De første fund beskrevet var hovedsagelig K. pneumoniae i forbindelse med nosokomiel infektioner og var af generne TEM-1, TEM-2 og SHV-1 [8, 26]. Nu findes ESβL producerende bakterier hyppigst ved E. coli med en betydelig stigning af gener med CTX-M enzymerne og er ikke kun nosokomiel, men også samfundserhvervet. Fælles for alle ESβL producerende bakterier er, at de inhiberes af clavulansyre, sulbactam og tazobactam 8 [2, 8, 10, 13, 15, 20, 26]. ESβL-generne sidder oftest på plasmider. Disse er årsagen til, at der let videreføres resistens imellem bakterierne. Tilmed har plasmiderne oftest også andre gener med resistens over for aminoglycosider og fluorokinoloner siddende, og dette begrænser behandlingsmulighederne [1, 8, 15, 16, 26, 34]. I de fleste tilfælde virker carbapenemer, men ved udbredt anvendelse af carbapenemer vil prævalensen af MβL og carbapenemaser resistente end ESβL, hvilket vil sige, at der slet ikke er muligheder for behandling [15, 16]. Også i de gener, som er ansvarlige for betalaktamdannelsen, sker der oftest mutationer. Disse går videre til de næste generationer og gør, at generne i høj grad kan ændre betalaktamasens virkningsspektrum [14, 27]. ESβL produktion findes hovedsagelig i Enterobacteriaceae, men ses også hos andre bakterier. Det kan f.eks. være P. aeruginosa og Acinetobacter species [8, 9 stige. Disse frygtes at være mere 8 Dog med undtagelse af inhibitor-resistent TEM (IRT) 9 Betalaktamaser, der spalter carbapenemer 12 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier 12]. Ydermere ses en stigning i ESβL producerende bakterier, som også udtrykker en AmpC produktion [13, 15]. Analyseprincip for ChromID ESβL agar (biomérieux) ChromID ESβL agar giver en direkte farveidentifikation af de hyppigst forekomne ESβL producerende bakterier. Pladen er et selektivt indikativt kromogent medium, der er beregnet til screeningsmetode for ESβL producerende bakterier (se bilag 17). Det selektive i pladen er, at pladen er tilsat forskellige antibiotika, herunder cefpodoxim, som gør, at ESβL producerende bakterier vokser frem på pladen, mens andre bakterier inhiberes [18 og bilag 17]. Cefpodoxim fungerer som screeningsmarkør for ESβL, da de fleste ESβL producerende bakterier er resistente over for cefpodoxim [9]. Chrompladen giver samtidigt et indikativt resultat, da to kromogene substrater og et naturligt substrat er tilsat i pladen og bevirker, at bakterierne vokser frem med forskellige farvede kolonier alt afhængig af bakterieart. Vi ved ikke præcist, hvad substraterne består af, da dette er en fabrikshemmelighed. E. coli kolonier bliver lyserød eller bourgognefarvet. Farveudviklingen for E. coli sker, fordi disse bakterier danner glukuronidase. Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter (KESC) kolonier bliver grønne, brunlig grønne eller blåfarvet, men skal den pågældende mikroorganisme bestemmes på artsniveau, kræves yderligere tests. KESC-gruppens farve skyldes, at disse bakterier danner glukosidase. Proteeae (Proteus, Providencia og Morganella) giver kolonierne en mørkebrun til lysebrun farve. Stammerne får denne farve, da de udtrykker deaminase [18 og bilag 17]. Figur 2: Set fra venstre:1) E. coli, der kun producerer glukuronidase (bordeaux kolonier), 2) KESC-gruppen, som producerer galaktosidase (grønne kolonier), 3) P. mirabilis, som udtrykker deaminase (brune kolonier) og 4) E. coli, som ikke producerer glukuronidase (farveløse kolonier) 10. 10 Egne billeder taget i laboratoriet. (se større billeder i bilag 14) 13 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier På pladen kan alle typer prøver anvendes: Rektale podepinde, urin, respiratoriske sekreter etc. De kan inokuleres direkte på agaren (se bilag 17) Efter tilsætning af inokulum inkuberes pladerne med agarsiden opad ved 35 C i atmosfærisk luft i 18-24 timer, og herefter aflæses deres farve. Hvis der ikke er nogen vækst på pladen efter første inkubering, tolkes dette som et negativt resultat, og pladen inkuberes yderligere i 18-24 timer for at øge detektionsfølsomheden (se bilag 17). Pladen har nogle begrænsninger, som der skal tage højde for: E. coli-stammer, som ikke producerer glukuronidase, og Proteus mirabilis (P. mirabilis), som kun udtrykker lav ESβL produktion, kan vokse frem på pladen med farveløse kolonier. Ved fund af farveløse kolonier, skal der udføres en oxidasetest. Hvis oxidasetesten på de farveløse kolonier er negativ, skal denne bakterie mistænkes for at indeholde en mulig ESβL produktion. Nogle Pseudomonas-stammer kan ligne Proteeae, idet de kan vokse frem som brune i deres pigmentering. Hertil bruges igen oxidasetesten til adskillelse. En positiv oxidasetest er Pseudomonas, mens en negativ oxidasetest er Proteeae. Ved positivt resultat sker en blå reaktion (se bilag 17). Udover oxidasetesten skal indoltesten også bruges. Indoltesten udføres på alle fund af kolonier, der er lyserød til bourgognefarvet. Dette skyldes, at andre bakterier end E. coli, som for eksempel C. freundii, E. cloacae og Salmonella sp. også kan danne disse lyserøde eller bourgognefarvede kolonier. Ved en positiv indoltest er fundet af E. coli bekræftet, mens der ved en negativ indoltest er yderligere identifikation påkrævet (se bilag 17). Ved påvisning af indol udnyttes tryptofan, som pladen indeholder, og reagenset ID indole TDA (ID-TDA) R1. Bakterier, som har tryptofanase i sig, vil være i stand til at nedbryde tryptofanet og frigøre indol. Ved en positiv indoldannelse vil der ske en blåfarvning (se bilag 18). På mediet kan der også vokse andre ikke-esβl producerende bakterier. Andre multiresistente mikroorganismer kan også vokse som typiske kolonier på mediet. Videre identifikation af disse bakterier skal udføres (se bilag 17). Analyseprincip for Brilliance TM ESβL Agar (Oxoid) Brilliance TM ESβL Agar er også et selektivt indikativt kromogent medium til screening for ESβL. Brilliance TM ESβL Agar pladen differentierer mellem de hyppigst forekommende 14 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier ESβL producerende bakterier og fungerer på samme måde som ChromID ESβL agar. Princippet er det samme: Pladen indeholder også cefpodoxim og andre almindelige antibakterielle stoffer, som inhiberer ikke-esβl producerende bakterier. De andre antibakterielle stoffer er en fabrikshemmelig, så vi ved ikke, hvilke disse er. Pladen indeholder også to kromogener, som er specifikt rettet imod enzymerne galaktosidase og glukuronidase [22]. Farvereaktionerne er lidt anderledes end på ChromID ESβL agar. E. coli, der både producerer glukuronidase og galaktosidase, giver blåfarvede kolonier. E. coli, der kun producerer glukuronidase, giver pink kolonier. KESC producerer galaktosidase, hvilket fremkalder grønne kolonier på Brilliance TM ESβL Agar [22]. Proteeae vokser med brunlige kolonier. Til farvereaktionen anvendes ikke nogle af de kromogene substrater, men i stedet udnyttes det faktum, at bakterierne er i stand til at deaminere tryptohan [22] (se figur 3 nedenfor). Ved Salmonella, Acinetobacter og forskellige bakterier med andre resistensmekanismer kan der vokse farveløse kolonier frem på mediet. Fund af farveløse kolonier er muligvis klinisk signifikans på bakterien, og denne bør undersøges yderligere [22]. Figur 3: Set fra venstre:1) E. coli, der producerer glukuronidase og galaktosidase (blå kolonier), 2) E. coli, der kun producerer glukuronidase (pink kolonier), 3) KESC-gruppen, som producerer galaktosidase (grønne kolonier), 4) P. mirabilis, som deaminere tryptophan (brune kolonier) og 5) P. aeruginosa (farveløse kolonier) 11. Der kan anvendes alle typer prøver direkte på pladen: Screening prøver, fækale prøve, isolerede kolonier eller flydende suspension som for eksempel urin [23]. Efter tilsætning af inokulum inkuberes pladerne med agarsiden opad ved 35 C i atmosfærisk luft i 18-24 timer, og herefter aflæses deres farve. Hvis der ikke er nogen vækst på pladen efter første døgn, tolkes dette som et negativt resultat, og pladen inkuberes ydereligere i 18-24 timer [22, 23]. Ved blå og lyserøde kolonier bruges RapID Spot Indoleddikesyre test, som kan bekræfte E. coli identifikationer [23]. 11 Billede 1), 2), 3) og 5) ses i bilag 11. Billede 5) Eget billede taget i laboratoriet (se større af alle i bilag 14) 15 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Prøver, der indeholder fækalt materiale eller blod, kan medføre misfarvninger på mediet. Misfarvningen skal ikke forveksles med en ægte chromogenreaktion, hvor farvede kolonier er synlige [23]. Figur 4: Misfarvning af agar (se bilag 10) Glykosidaser Mange bakterier indeholder glykosidaser, som er hydrolytiske enzymer, der spalter glykosid [30]. F.eks. producerer 96 % E. coli glukuronidase, mens 89 % E. coli og 98 % af K. pneumoniae producerer enzymet galaktosidase [17]. I ChromID ESβL agar og Brilliance TM ESβL Agar er glykosidaserne de syntetiske kromogene substrater. Begge chromplader indeholder enzymerne glukuronidase og galaktosidase, som vil frembringe farvede kolonier, hvis bakterien producerer nogle af de enzymer. K. pneumoniaes indhold af galaktosidase betyder, at bakterien er i stand til at danne glukosidase, som spalter glykosidbindingen i laktose. Et kemisk fremstillet stof bruges ved påvisning galaktosidase og indeholder samme glukosidbinding som laktose [30]. Analyseprincip for Cica-Beta-Test (MAST Group) Cica-Beta-Test er en test, der ved en farvereaktion direkte kan påvise ESβL, hyperproducerende AmpC enzymer og MβL [19]. Cica-Beta-Test består af 4 plastik strips, men da vi har taget detektionen af MβL ud af vores forsøg (se senere afsnittet metodeafgrænsninger ), bruger vi 3 af 4 plastik strips. Disse er: 1) Cica-Beta-Test 1 (CBT-1), som bruges til detektion af ESβL og MβL. 2) Cica-Beta-Test CVA (CBT-ESβL), som bruges til konfirmation af ESβL. 3) Cica-Beta-Test C (CBT-AmpC), som bruges til detektion af AmpC. De 3 strips har hver især et filter i enden indeholdende forskellige stoffer. CBT-1 indeholder ingen inhibitorer, mens CBT-ESβL indeholder clavulansyre, der inhiberer ESβL og CBT- AmpC indeholder Benzo-thiophene-2-boronicsyre, som inhiberer AmpC enzymer [11]. For at få en farvereaktion tilsættes Cica-Beta-Test substrat (CBT-substrat) på hvert filter. CBTsubstrat indeholder det sammensatte HMRZ-86 [19]. 16 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Figur 5: Her ses HMRZ-molekylet Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier HMRZ-86 er en kromogenisk cefalosporin, hvor en carboxy-propyloxyimino gruppe fæstnes til sidekæde på position 7 (se rød cirkel på figur 5). Denne gruppe beskytter betalaktamringen fra en række betalaktamaser, men ikke ESβL eller MβL. En hydrolysering af enzymernes betalaktamring ændrer bølge-længden absorberet af den konjugerede dobbeltbinding på position 3 (se blå cirkel på figur 5), hvilket gør, at der sker en farvereaktion af gul til rød (se billede til højre) [28]. Testen udføres i et flow, hvilket vil sige at: Figur 6: To teststrips; Én uden reaktion (gul) og én med reaktion (rød) [19] CBT-1 + frisk kolonimateriale = Gul Testen stoppes her, for der er ingen ESβL produce- = Rød rende bakterie. Vi har dog lavet CBT-1 og CBT- ESβL samtidigt. CBT-ESβL + frisk kolonimateriale = Gul En ESβL produktion er påvist. = Rød CBT-AmpC + frisk kolonimateriale = Gul En AmpC produktion er påvist. = Rød - - - - - - - - - - - - - - - - - - CBT-MβL har vi ikke med - - - - - - - - - - - - - - - - - - - CBT-MβL + frisk kolonimateriale = Gul En MβL produktion er påvist. = Rød Multipel β-laktamase producerende bakterier. Begrænsningerne for Cica-Beta-Test er, at testen skal udføres på renkultur, og at alle fire strips skal laves, da nogle bakterier kan udtrykke multiple resistensmekanismer [19]. 17 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Analyseprincip for VITEK 2 Compact og AST-GN27 ESβL kort (biomérieux) Som konfirmatorisk test findes blandt andet det automatiserede VITEK 2 Compact system. Systemet analyserer på kort indeholdende brønde med forskellige antimikrobielle stoffer. Alt efter hvad, der ønskes at undersøge 12, vælges forskellige kort til enten identifikation eller resistensbestemmelse (se bilag 15). VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort er et nyt resistensbestemmelseskort, der lige er kommet på markedet og er specielt lanceret med henblik på ESβL producerende bakterier. Kortet består af 19 brønde, som skal vurderes med henblik på at være et muligt alternativ til andre konfirmatoriske test. Brøndene indeholdende antimikrobielle stoffer bestemmer sensitiviteten for klinisk signifikant aerobe Gram-negative bakterier in vitro. Stofferne i brøndene er: 1) Positiv kontrol, 2) Amikacin, 3) Amoxicillin med Clavulansyre, 4) Ampicillin, 5) Cefazolin, 6) Cefepime, 7) Cefotaxim, 8) Cefoxitin, 9) Ceftazidim, 10) Ciprofloxacin, 11) Figur 7: VITEK 2 AST- GN27 ESβL kort. ESβL 13, 12) Gentamicin, 13) Imipenem, 14) Nitrofurantoin, 15) Norfloxacin, 16) Piperacillin, 17) Piperacillin med Tazobactam, 18) Tetracyclin og 19) Trimethoprim med Sulfamethoxazol (se bilag 15). Figur 8: VITEK 2 Compact apparatet I VITEK 2 Compact systemet anvendes der synligt lys til direkte måling af organismetilvæksten. Dette kaldes transmittansoptik. Inden væksten i brønden er begyndt, tages en nul lysaflæsning. Herefter måles hver 15. minut hver brønds organismetilvækst, og der måles på, hvor meget lys, der passerer gennem brønden (se bilag 16). Dette er turbedimetrisk måling. Kortets princip bygger på mindst hæmmende koncentration (MIC) bestemmelse (se bilag 16). VITEK 2 Compact systemet har udover en guideline med MIC-værdier, som tolker, om bakterien er følsom, intermedier følsom eller resistent, også et Advanced Expert System (AES). Dette system har en stor vidensdatabase med forventede MIC-fordelinger. 12 Gram-negative, Gram-positive, stave, kokker eller lignende. 13 ESβL brønden indeholder 6 forskellige antibiotika: Cefepime med og uden Clavulansyre, Cefotaxim med og uden Clavulansyre og Ceftazidim med og uden Clavulansyre. 18 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Ifølge Tina Alsing, produktspecialist fra biomérieux, er VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort specielt egnet til ESβL producerende bakterier, da kortet indeholder to forskellige tests: 1. test består af en ESβL-test, som indeholder 3 forskellige cefalosporiner 14, som testes med og uden clavulansyre. Her vurderer VITEK 2 Compact systemet om der er en væsentlig vækstforskel i antibiotika med og uden clavulansyre. 2. test består af de øvrige cefalosporiner 15, hvor VITEK 2 Compact systemet ser specielt på disses MIC-værdier. I løbet af 6-13 timer 16 laver AES en samlede vurdering ud fra begge tests. Resultaterne for ESβL-test samt hver brønd findes under Susceptibility Information, mens det endelige svar findes på printet under AES findings og Phenotype (se bilag 2, der viser et eksempel for et svar printet ud fra VITEK 2 Compact). Ved fund af en positiv ESβL stamme vil alle penicilliner, cefalosporiner og aztreonam uanset resistensmekanisme skulle svares ud som resistente [15 og bilag 15]. Derudover kan det ved et negativt ESβL resultat ikke udelukke tilstedeværelsen af en ESβL produktion, da bakterien kan være maskeret, hvis bakterien både er AmpC og ESβL. En maskering gør, at den ESβL producerende bakterie ikke detekteres (se bilag 15). Metodevalg og afgrænsninger Valg af bakteriepopulation Vi har i vores valg af stammer ledt efter molekylærbiologisktestet materiale, både til den positive og den negative population. Det betyder, at vi ikke har medtaget kontroller, da vi ved, hvad er positivt og negativt. Den positive population består af 100 ESβL producerende stammer: Heraf 51 E. coli, 48 K. pneumoniae og 1 P. mirabilis. De positive stammer er af de hyppigst forekommende typer: CTX-M, SHV og TEM (se bilag 3). I den positive population er der også medtaget 2 E. coli stammer, som både er ESβL og AmpC positive, da nogle af firmaerne (se bilag 15) advarer om, at der ved en produktion af både AmpC og ESβL kan forekomme en maskering og kan give et falsk negativt resultater. 14 Cefepime, Cefotaxim og Ceftazidim 15 1. generation: Cefazolin, 2. generation: Cefoxitin, 3. generation: Cefotaxim og Ceftazidim, og 4. generation: Cefepime. 16 Gennemsnitsdetektionstiden er 7,5 timer. 19 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier Den negative population består af 40 stammer, som er nøje udvalgt til projektet. Disse er: K. pneumonieae, E. coli og Enterobacter species, K. oxytoca, Pseudomonas species, C. freundii, Salmonella species, Hafnia alvei og Morganella morganii (M. morganii). Stammerne er valgt for at se, hvilke problemstillinger det kan give. Heriblandt har vi medtaget 20 AmpC positive bakterier, da ESβL og AmpC godt kan ligne hinanden, og AmpC positive bakterier måske kan falde ud som ESβL positive. Derudover har vi fundet 20 bakteriestammer med udvidede resistensmekanismer i forhold til arten og bakteriearter, som ifølge videnskabelige artikler og analysemetodernes forskrifter kan give falsk positive svar [5, 9]. Ved den sidstnævnte gruppe har det ikke været muligt, at alle var molekylærbiologisktestet. Viden om bakteriepopulation For at give et overblik vil næste afsnit handle om de valgte stammer og hvad vi ved om dem (For oversigt af følgende afsnit se bilag 3). Bakterier, som er molekylærbiologisktestet for ESβL, er stammerne nr. 14-78, 93-127 og 130-134, mens de bakterier, som er molekylærbiologisktestet for AmpC, er stammerne nr. 1-26, 70 og 79-92. Bakteriestammerne, som er fundet positive for enten ESβL eller AmpC ud fra deres følsomhed overfor cefepime 17, er nr. 1-13 og 71-92. Var cefepime resistent ( 26mm) kunne det godt være, at der også var en ESβL produktion og omvendt var cefepime sensitiv ( 27mm) kunne der være en AmpC produktion tilstede. Til sidst skal nævnes de stammer, som er blevet fænotypisk testet på enten Hvidovre Hospital 18 eller Næstved Sygehus 19. Disse er nr. 40-69, 93-113, 128-129 og 135-140. Metodevalg Vi har valgt at teste ChromID ESβL agar, for at finde ud af om pladen kan bruges som screeningsplade for ESβL producerende bakterier. Pladen kan måske gå ind og erstatte screeningsmetoden, der anvendes i dag, og har den fordel, at pladen indeholder cefpodoxim, hvilket giver mulighed for at selektere en produktion af ESβL. Ydermere kan screeningspladen måske fange bakterier, som patienten har i kronisk bæretilstand (se bilag 17 Data fra Regionshospitalet i Herning, bachelorgruppe med ESβL-projekt (jan-2007) og data fra Næstved Sygehus, bachelorgruppe med AmpC-projekt (jan-2009). 18 På Hvidovre Hospital laves en konfirmatorisk for både ESβL og AmpC med henholdsvis cefpodoxim og cefepime. 19 På Næstved Sygehus laves en konfirmatorisk for ESβL med cefpodoxim. 20 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier 17). Kan screeningspladen ikke gå ind og erstatte, kunne den være et supplement til at detektere flere ESβL producerende bakterier. Da vi gerne ville have noget at sammenligne ChromID ESβL agar med, fandt vi ud af, at Oxoid lige havde lanceret en tilsvarende screeningsplade, så derfor fandt vi Brilliance TM ESβL Agar interessant at tage med i vores bachelorprojekt. Cica-Beta-Test vidste vi ikke noget om, men KMA, Næstved Sygehus, var meget interesseret i at få testen undersøgt på grund af dens detektionstid. Cica-Beta-Test tager kun mellem 2-15 minutter og med en så kort detektionstid, ville patienten hurtigt kunne komme i den rigtige behandling og derved sænke dødeligheden. Så med ønske fra afdelingen blev testen taget med i vores projekt. VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort havde vi på forhånd hørt positivt om, og vi fandt kortet interessant, da det køres på VITEK Compact, som er et automatiseret apparat, hvilket gør, at de menneskelige fejl minimeres. Ydermere har vi valgt at se på alle bakteriestammernes følsomhed overfor cefpodoxim, som er et 3. generations cefalosporin. Til vurdering af hæmningszone, farve på kolonier, vækst og reaktioner har vi været blindet for de faktiske stammer, så disse ikke kunne have nogen indflydelse på resultaterne. Valg af statistik er baseret på udregning af metodernes diagnostiske sensitivitet og specificitet. Da ESβL producerende bakterier, som nævnt tidligere, er farlig fordi behandlingsmulighederne er så begrænset, vil en screeningsmetode kræve, at sensitiviteten er meget høj. Det gælder om at finde alle sandt positive, så en hurtig behandling kan sættes ind. Den konfirmatoriske test skal efter screeningsmetodens fund have en god diagnostisk specificitet, da denne skal udelukke bakterier, som ikke indeholder en ESβL producerende bakterie. Metodeafgrænsninger Oxoids Brilliance TM ESβL Agar plade er først blevet lanceret den 1.april 2009, og vi er de første, der afprøver pladerne, i Danmark. Da pladen er så ny på markedet, betyder det også, at de publicerede artikler er begrænset. Derfor er det eneste vi kan forholde os til den medfølgende brochure og indlægssedlen samt to studier; et fra Oxoid og et fra MOSAR [21, 22, 23, 24]. VITEK 2 AST-GN27 ESβL kort blev lanceret ved årsskiftet, og der er derfor ikke nogle publiceret artikler for dette kort. Ifølge Tina Alsing, produktspecialist fra biomérieux, er 21 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier AST-GN27 en opdatering af AST-N041, så denne vil bruges i diskussionen. Tilmed har nogle kort en ESβL-test, og disse kort kan bruges til at sammenligne AST-GN27 korts ESβL-test med deres. Hertil bruger vi AST-N045. Cica-Beta-Test har mulighed for at teste for ESβL, hyperproducerende AmpC enzymer og metallobetalackamaser (MβL) [19]. På grund af vores projekts fokus og økonomien har vi valgt at tage detektionen af MβL ud af forsøget. Ydermere er der ved Cica-Beta-Test kun blevet undersøgt for AmpC med CBT-AmpC på de stammer, hvor reaktionen blev rød i CBT- 1 og rød i CBT-ESβL, da budgettet ikke var til, at vi testede CBT-AmpC på alle stammerne. AmpC producerende bakterier er ikke en del af vores problemformulering, så derfor fravælger vi at regne en diagnostisk sensitivitet og specificitet, hvor CBT-AmpC er medtaget. Ud fra Cica-Beta-Tests afgrænsninger bliver vi nødt til at regne den diagnostiske sensitivitet og specificitet udelukkende ud fra detektionen af de ESβL producerende bakterier og ikke de tre andre muligheder; AmpC, MβL og multiple betalaktamaser. Materialer I det følgende afsnit findes tabeller over anvendt apparatur og reagenser. Yderligere gives en oversigt over, hvor vi har vores bakteriepopulation fra samt tabeller med, hvordan de er kategoriseret i forhold til ESβL og AmpC producerende bakterier. Apparatur Producent Lot. nr. Udløbsdato VITEK 2 Compact biomérieux Densichek biomérieux IDK203463 ChromID ESβL agar biomérieux 831861401 2009-06-24 VITEK 2 ESβL AST-GN27 kort biomérieux 267138010 2010-09-24 Cica-beta-test 1 (CBT-1) MAST Group 8S0771 2009-08-12 Cica-beta-test CVA (CBT-ESβL) MAST Group 8P0063 2009-05-01 Cica-beta-test C (CBT-AmpC) MAST Group 8R0141 2009-07-03 Brilliance ESβL Agar Oxoid 759950 2009-05-12 Cefpodoxim disks (10µg) Oxoid 708359 Reagensglas 08360125 Iso-sensitest uden blod SSI 757222 2009-09-11 5 % blodplade SSI 2009-04-08 2009-06-17 Reagenser Producent Lot. nr. Udløbsdato 0,45 % NaCl AirLife G071233 2011-05 Oxidase reagens SSI 2009-04-17 2009-06-19 ID indole TDA (ID-TDA) R1 biomérieux 828955701 2009-12-03 22 af 48

Christina Mejdahl Nielsen Bakteriepopulation Bioanalytikeruddannelsen, København Detektion og indikation af ESβL producerende bakterier I dette bachelorprojekt er der blevet anvendt 140 stammer fra Nykøbing Falster Sygehus (13), Hvidovre Hospital (66), DTU Food 20 (21), Universitetshospitalet Nord-Norge (5) [32], Regionshospitalet Herning 21 (8), Slagelse Sygehus (4), Næstved Sygehus (9), American Type Culture Collection (ATCC) stammer (2) samt QC stammer fra Quality Assurance Laboratory i London (12). Se bilag 3 for rådata om stammerne. Tabel 3: Fordelingen af stammer, som er ESβL positive og AmpC negative Stammer QC ATCC DTU HH RH NFS NS SS Food E. coli 4-11 25 3 1 1 4 K. pneumoniae 2 1 2 29 2 12 - - P. mirabilis - - - 1 - - - - HH = Hvidovre Hospital NS = Næstved Sygehus RH = Regionshospitalet Herning SS = Slagelse Sygehus NFS = Nykøbing Falster Sygehus Tabel 4: Fordelingen af stammer, som er ESβL negative og AmpC negative Stammer ATCC QC Hvidovre Hospital Næstved Sygehus E. coli 1 3 2 - K. pneumoniae - 2 3 - C. freundii - 1 - - P. aeruginosa - - - 4 S. typhimurium - - - 2 S. enteritidis - - - 1 Pseudomonas species - - - 1 Tabel 5: Fordelingen af stammer, som er ESβL positive og AmpC positive Stammer Regionshospitalet Herning E. coli 2 Tabel 6: Fordelingen af stammer, som er ESβL negativ og AmpC positiv Stammer Universitetshospitalet i Nord-Norge [32] DTU Food Regionshospitalet Herning Hvidovre Hospital E. coli - 6 1 5 K. pneumoniae - - - 1 Enterobacter species 1 - - - K. oxytoca 1 - - - Hafnia alvei 1 - - - Morganella morganii 1 - - - S. heidelberg - 1 - - S. bareilly - 1 - - C. freundii 1 - - - 20 Henrik Hasman, Seniorforsker, DTU Fødevareinstituttet, Afdeling for Mikrobiologi og Risikovurdering. 21 Helga Schumacher, Overlæge på Klinisk Mikrobiologisk afdeling, Regionshospitalet Herning. 23 af 48