Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit

1 Producent Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit Et SURVEYOR Scan KRAS og NRAS kit Exons 2, 3 & 4 CE IVD med DHPLC systemer Læs venligst denne brugsanvisning grundigt igennem, før dette produkt anvendes. Gem denne brugsanvisning til senere brug.

Denne side er blank med vilje

Indhold 1 Producent... 3 2 CRC RAScan Combination Kit... 3 2.1 Tilsigtet brug... 3 2.2 Brugsindikationer... 3 3 Principper for CRC RAScan KRAS og NRAS mutationsdetektion-analyse... 4 3.1 KRAS og NRAS... 4 3.2 Analyse af patientprøver med SURVEYOR Scan Kits... 4 3.3 SURVEYOR Nuclease... 5 4 Sporbarhed af kitkontroller... 6 5 Komponenter... 7 5.1 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2, 3 & 4 Æske (h 710107)... 7 5.2 SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 Æske (h 710400)... 8 5.3 Antal prøver, der kan testes med et Kit... 8 5.4 DNA sekventering... 9 6 Yderligere påkrævet udstyr og reagenser... 9 7 Reagenspræparation... 9 8 Opbevaring og holdbarhed... 10 9 Advarsler og forholdsregler... 10 10 Primær prøvetagning, håndtering og opbevaring... 10 11 Analyseprocedure... 11 11.1 Somatisk mutationsdetektion med SURVEYOR Scan Kits En oversigt... 11 12 Trin-for-trin vejledning... 11 12.1 DHPLC INDLEDENDE opsætning/kalibrering... 11 12.2 Overvejelser inden KRAS og NRAS prøveanalyse... 11 12.3 Templateovervejelser... 12 12.4 Arbejdsflowovervejelser... 12 12.5 Amplifikationsprotokol... 14 12.6 Termocyklerprogram for Amplifikationsprotokol... 16 12.7 Kvalitetskontrol af PCR produkter... 16 12.8 SURVEYOR Nuclease fordøjelse... 17 13 Kontrolprocedurer... 18 13.1 Kvalitetskontrol af CRC RAScan Combination Kit... 18 13.2 Sådan anvendes Kontrol Plasmid DNAer... 19 14 Fortolkning af resultater... 19 14.1 Analyse af KRAS og NRAS Exons 2, 3 og 4 med SURVEYOR Nuclease... 19 14.2 Dataevaluering af SURVEYOR Scan resultater... 20 14.3 Eksempler på resultater... 21 15 Ydelseskarakteristika... 28 15.1 Detektionsniveau af mutationer for SURVEYOR Scan kits... 28 15.2 Sekvensbekræftelse... 28 15.3 Analyseprocedurebegrænsninger... 29 Appendiks A... 30 A.1 Pladelayout plan for SURVEYOR Scan kits... 30 A.2 Kontrol DNA stempler... 30 A.3 Denaturering HPLC (DHPLC) systemkrav... 31 A.4 Laboratorieopstilling for PCR analyser... 33 A.5 Litteraturhenvisninger... 34 Appendiks B... 35 Problemløsningsguide... 35 Bestillingsoplysninger... 40 Kontaktoplysninger... 40 oversættelse Disclaimer... 40 Licenser, varemærker & copyright... 41

1 Producent 1 Producent Producent EU repræsentant M P Transgenomic Inc. 12325 Emmet Street, Omaha, NE 68164, USA Tlf. 1-402-452-5400 Transgenomic Limited 40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY, UK Tlf. +44-141-892-8800 2 CRC RAScan Combination Kit 2.1 Tilsigtet brug Kun til professional brug. Transgenomic s CRC RAScan Combination Kit er en in vitro diagnostisk analyse, der påviser somatiske mutationer i Exons 2, 3 & 4 af KRAS og NRAS gener. Disse mutationer indikeres ved SURVEYOR Nuclease kløvningspeaks og inkluderer de mutationer, der har et kendt potentiale for klinisk signifikans. Dette kit er designet til at blive brugt i et klinisk diagnostisk laboratorium med passende uddannet personale, der tester DNA, som er ekstraheret fra formalinfikseret, paraffinindlejret væv. Dette kit henvises til som katalognummer 710077. Denne Brugsanvisning er tilgængelig som en download på http://world.transgenomic.com/files/literature/482427-da.pdf. 2.2 Brugsindikationer Klinikere kan bruge CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer som hjælp til at bestemme, om patienters colorectale cancertumorer måske ikke vil respondere på en anti-egfr (epidermal growth factor receptor) behandling, som fx panitumumab. CRC RAScan Combination Kit må ikke anvendes til diagnose af colorectal eller nogen anden cancer. CRC RAScan Combination Kit er en analyse, der detekterer tilstedeværelsen af potentiellel somatiske mutationer i Exons 2, 3 & 4 af KRAS og NRAS gener, men som ikke bekræfter mutationens sekvensidentitet. For at identificere den præcise, detekterede mutation er yderligere analyse, som fx DNA-sekventering, påkrævet. Skønt de analysesresultater, der opnås med disse kits, vil indikere en patients mutationsstatus, skal andre kliniske faktorer tages i betragtning. De resultater, der opnås med CRC RAScan Combination Kit må ikke bruges som den eneste anvendte metode for at træffe afgørelse om eventuel behandling for patienter med colorectal cancer. Det er vigtigt at bemærke, at brugen af DHPLC til at identificere prøver, der tester positive for en KRAS eller NRAS mutation med dette kit, kun må anvendes som en retningslinje og alle mutationer skal bekræftes med yderligere analyse, som fx DNA-sekventering. Brugsanvisning for CRC RAScan kit med DHPLC systemer Side 3

3 Principper for CRC RAScan KRAS og NRAS mutationsdetektion-analyse 3 Principper for CRC RAScan KRAS og NRAS mutationsdetektion-analyse 3.1 KRAS og NRAS Terapeutiske agenser, der er målrettet mod den epidermal growth factor receptor (EGFR), har vist sig at være effektive mod colorectal cancer. Forskning har indikeret, at omkring 40% af colorectale tumorer bærer somatiske KRAS genmutationer og kliniske studier har demonstreret, at mutationer i KRAS exon 2 (codon 12 og 13) forudsiger manglende respons på anti-egfr behandlinger. Nyere eksplorative studier har demonstreret, at patientpopulationen kan blive yderligere forfinet, da patienter, hvis mcrc tumorer har en ekstra mutation i KRAS exons 3 og 4 eller NRAS exons 2, 3 og 4 også havde tendens til ikke at respondere på anti-egfr-indeholdende behandling 1-7. Dette kit er designet til brug i diagnostisk analyse af somatiske KRAS og NRAS exons 2, 3 & 4 mutationer. CRC RAScan Combination Kit er en analyse til detektering af alle sekvens og små insertion/deletion ændringer i Exons 2, 3 & 4 af KRAS og NRAS gener. Mutationer i KRAS og NRAS codon 12, 13, 59, 61, 117 og 146 er blevet associeret med manglende effektivitet af panitumumab. Positive Controls medleveres i dette kit for mutationer i codon 12, 61, 117 og 146. Dette kit anvender Transgenomic s proprietære SURVEYOR Nuclease teknologi og sammen med DHPLC System teknologi giver det en enkelt og sensitiv detektion af potentielle mutationer. Det er i stand til at detektere en blanding af 2-5% mutant i en baggrund af non-mutant DNA. Valideringsstudier har vist ekstremt høj konkordans med sekventering i velkarakteriserede colorectal cancer-prøver. Brug af CRC RAScan Combination Kit vil både reducere brugerens sekventeringsbyrde og bistå sekvensidentifikation, hvis automatiseret sekventeringssoftware ikke løser tilstedeværelsen af en lavniveau-mutation. På grund af denne analyses høje sensitivitet i forhold til Sanger sekventering anbefales det, at laboratorieopstillingen optimeres for at undgå krydskontaminering af prøve eller kontrol. For et eksempel på en ideel laboratorieopstilling se Appendiks A.4 Laboratorieopstilling for PCRanalyser. 3.2 Analyse af patientprøver med SURVEYOR Scan Kits CRC RAScan Combination Kit må kun anvendes i forbindelse med det arbejdsflow, der er anført nedenfor. Arbejdsflow Patientprøve Test KRAS og NRAS Exons 2, 3 & 4 Rapport resultat Figur 1 CRC RAScan Combination Kit arbejdsflow for screening af KRAS og NRAS For et forslag til opstilling af 96-brønds plader til analyse af alle KRAS og NRAS Exons 2-4 se Appendiks A.1 Pladelayout-plan for CRC RAScan Combination Kit. Brugsanvisning for CRC RAScan kit med DHPLC systemer Side 4

3 Principper for CRC RAScan Scan KRAS og NRAS mutationsdetektion-analyse 3.3 SURVEYOR Nuclease Transgenomic s SURVEYOR Nuclease er en mismatch-specific plante DNA endonuclease, der kan scanne for kendte og ukendte mutationer og polymorfismer i heteroduplex DNA 8. Enzymet kløver DNA med høj specificitet på steder med base-substitution mismatch og andre forandringer. Denne DNA endonuclease klipper begge strenge på et DNA heteroduplex på 3 -enden af mismatch positionen. Insertion/deletion-mismatches og alle base-substitution mismatches genkendes, men effektiviteten af kløvningen varierer med mismatch sekvensen. Figur 2. Virkningsmekanisme for SURVEYOR Nuclease. Endonucleasen genkender en mismatch og kløver 3 -enden af hver base i mismatchen. Dette kløver DNA-dobbeltstrengen og efterlader et enkelt base 3 -overhæng. SURVEYOR Nuclease har været brugt i en lang række sammenhænge for nøjagtigt at kunne detektere forskellige mutationer og og polymorfier i gener. SURVEYOR Nuclease er især blevet brugt til at verificere tilstedeværelse af kendte mutationer i en række gener, der er associeret med nyrecancer, lungecancer, hoved- og halscancer, leukæmi, endometrial cancer og til forudsigelse af respons på strålebehandling 9,10,11. CRC RAScan Combination Kit er blevet designet til at kløve mismatches i KRAS og NRAS Exons 2, 3 & 4 for efterfølgende DHPLC-analyse. Bemærk: hvis en prøve er 100% mutant DNA, kan der ikke dannes heteroduplexer og prøven vil blive vist som Wild-Type. Tumor-biopsiprøver vil imidlertid indeholde Wild- Type celler på grund af tumor heterogeneitet og/eller kontaminerende normalt væv; bemærk at prøver med 5% og 95% mutant DNA vil have identiske elektroferogrammer. Bemærk: Kun den DNA Polymerase, der leveres med dette kit, må bruges til analysens PCR-portion. Bemærk: Følg den specifikke vejledning i DHPLC systemets manual. For at bruge dette kit korrekt anbefaler vi stærkt, at denne manual læses grundigt igennem og at vejledninger og retningslinjer heri følges nøje. Førstegangsbrugere skal udføre de kontroleksperimenter, der er beskrevet i afsnittet Sådan anvendes Kontrol Plasmid DNAer. Hvis du skulle have yderligere spørgsmål eller brug for hjælp, bedes du ringe til (888) 233-9283 (kun Nordamerika), +1 (402) 452-5400 eller +44 (0) 141 892 8800 (Europa) og bede om KRAS and NRAS support. Du kan også sende os en e-mail på: SURVEYORscan@Transgenomic.com Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 5

4 Sporbarhed af kitkontroller 4 Sporbarhed af kitkontroller De kontroller, der leveres med dette kit, er plasmid-kloner af KRAS og NRAS Exons 2, 3 & 4 sekvenser. Alle kloner er blevet sekventeret for at kontrollere sekvensens nøjagtighed ved sammenligning med NCBI Reference Sequences: NG_007524.1 (KRAS) og NG_007572 (NRAS). Kontrollerne har et genetisk stempel. Se Appendiks A.2 Kontrol DNA Stempler; disse er variationer fra KRAS eller NRAS Wild-Type sekvenser i en region, der ikke forventes at have mutationer og kan bruges til at problemløse prøvekontaminering med Positive Controls. Se Appendiks B - Problemløsningsguide, Problem 8, for et eksempel på et SURVEYOR Scan spor af en sådan kontaminering. KRAS Control Wild-Type blev konstrueret ved syntese og cloning af KRAS Exons 2, 3 og 4 ved brug af NCBI Reference Sequence NG_007524.1. KRAS Positive Control Exon 2 blev konstrueret ved syntese af KRAS Exon 2 ved brug af ovenstående referencesekvens, men indeholdende G12D mutationen. DNA-sekventering bekræftede, at den eneste ændring i sekvensen er i codon 12 med en G12D, GGT>GAT ændring. Denne clon blandes derefter med KRAS Control Wild-Type DNA for at danne en heterozygot blanding. KRAS Positive Control Exon 3 blev konstrueret ved syntese af KRAS Exon 3 ved brug af ovenstående referencesekvens, men indeholdende Q61H mutationen. DNA-sekventering bekræftede, at den eneste ændring i sekvensen er i codon 61 med en Q61H, CAA>CAC ændring. Denne clon blandes derefter med KRAS Control Wild-Type DNA for at danne en heterozygot blanding. KRAS Positive Control Exon 4A blev konstrueret ved syntese af KRAS Exon 4 ved brug af ovenstående reference, men indeholdende K117N mutationen. DNA-sekventering bekræftede, at den eneste ændring i sekvensen er i codon 117 med en K117N, AAA>AAT ændring. Denne clon blandes derefter med KRAS Control Wild-Type DNA for at danne en heterozygot blanding. KRAS Positive Control Exon 4B blev konstrueret ved syntese af KRAS Exon 4 ved brug af ovenstående referencesekvens, men indeholdende A146T mutationen. DNA-sekventering bekræftede, at den eneste ændring i sekvensen er i codon 146 med en A146T, GCA>ACA ændring. Denne clon blandes derefter med KRAS Control Wild-Type DNA for at danne en heterozygot blanding. NRAS Control Wild-Type blev konstrueret ved syntese og cloning af NRAS Exons 2, 3 og 4 ved brug af NCBI Reference Sequence NG_007572. NRAS Positive Control Exon 2 blev konstrueret ved syntese af NRAS Exon 2 ved brug af ovenstående reference, men indeholdende G12D mutationen. DNA-sekventering bekræftede, at den eneste ændring i sekvensen er i codon 12 med en G12D, GGT>GAT ændring. Denne clon blandes derefter med NRAS Control Wild-Type DNA for at danne en heterozygot blanding. NRAS Positive Control Exon 3 blev konstrueret ved syntese af NRAS Exon 3 ved brug af ovenstående referencesekvens, men indeholdende Q61K mutationen. DNA-sekventering bekræftede, at den eneste ændring i sekvensen er i codon 61 med en Q61K, CAA>AAA ændring. Denne clon blandes derefter med NRAS Control Wild-Type DNA for at danne en heterozygot blanding. NRAS Positive Control Exon 4 blev konstrueret ved syntese af NRAS Exon 4 ved brug af ovenstående referencesekvens, men indeholdende A146T mutationen. DNA-sekventering bekræftede, at den eneste ændring i sekvensen er i codon 146 med en A146T, GCC>ACC ændring. Denne clon blandes derefter med NRAS Control Wild-Type DNA for at danne en heterozygot blanding. Brugsanvisning for CRC RAScan kit med DHPLC systemer Side 6

5 Komponenter 5 Komponenter CRC RAScan Combination Kit leveres i et enkelt omslag med to separate æsker: (a) en æske med reagenser til analyse af KRAS Exons 2, 3 & 4 og (b) en æske med reagenser til analyse af NRAS Exons 2, 3 & 4. Tilsammen indeholder æskerne nok reagenser til at udføre det antal analyser, der er anført i Afsnit 5.3. 5.1 SURVEYOR Scan KRAS Kit Exons 2, 3 & 4 Æske (h 710107) Æsken med komponenter til analyse af KRAS Exons 2, 3 & 4 har to indre æsker: (1) en SURVEYOR æske med fordøjelseskomponenter med 10 reagensrør og (2) en ydre rørholder med PCR-komponenter og -kontroller, der indeholder 20 reagensrør. Katalog nummercatalog Komponent SURVEYOR æske med fordøjelseskomponenter Rørhætte farve 130- Reaktion kit Volumen leveret 710160 SURVEYOR Nuclease W Lilla 3 x 105 µl 710161 SURVEYOR Enhancer W2 Sort 2 x 105 µl 708049 SURVEYOR Enhancer Cofactor Pink 2 x 105 µl 708027 0,15 M MgCl 2 Solution Brun 2 x 105 µl 708030 Stop Solution Rød 250 µl Æske med PCR-komponenter og -kontroller 703310 DNA Polymerase Gennemsigtig 2 x 100 µl 703315 10x DNA Polymerase Reaction Buffer Gennemsigtig 1 ml 703065 dntps (10 mm) Gennemsigtig 2 x 500 µl 710155F KRAS Primer: Exon 2 Forward (10 µm) Blå 125 µl 710155R KRAS Primer: Exon 2 Reverse (10 µm) Blå 125 µl 710157F KRAS Primer: Exon 3 Forward (10 µm) Blå 90 µl 710157R KRAS Primer: Exon 3 Reverse (10 µm) Blå 90 µl 710154F KRAS Primer: Exon 4A Forward (10 µm) Blå 90 µl 710154R KRAS Primer: Exon 4A Reverse (10 µm) Blå 90 µl 710156F KRAS Primer: Exon 4B Forward (10 µm) Blå 90 µl 710156R KRAS Primer: Exon 4B Reverse (10 µm) Blå 90 µl 710131 KRAS Control Wild-Type Gul 120 µl 710135 KRAS Positive Control Exon 2 Grøn 40 µl 710136 KRAS Positive Control Exon 3 Grøn 40 µl 710137 KRAS Positive Control Exon 4A Grøn 40 µl 710138 KRAS Positive Control Exon 4B Grøn 40 µl 710153F Universal Sequencing Primer 1 (10 µm) Orange 125 µl 710153R Universal Sequencing Primer 2 (10 µm) Orange 125 µl Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 7

5 Komponenter 5.2 SURVEYOR Scan NRAS Kit Exons 2, 3 & 4 Æske (h 710400) Æsken med komponenter til analyse af NRAS Exons 2, 3 & 4 har to indre æsker: (1) en SURVEYOR æske med fordøjelseskomponenter med 10 reagensrør uden nogen tomme huller og (2) en ydre rørholder med PCR-komponenter og -kontroller, der indeholder 14 reagensrør. Katalog nummer Komponent Rørhætte farve 100-Reaktion kit Volumen leveret SURVEYOR æske med fordøjelseskomponenter 710160 SURVEYOR Nuclease W Lilla 2 x 105 µl 710161 SURVEYOR Enhancer W2 Sort 105 µl 708049 SURVEYOR Enhancer Cofactor Pink 105 µl 708027 0,15 M MgCl 2 Solution Brun 105 µl 708030 SURVEYOR Stop Solution Rød 250 µl 710153F Universal Sequencing Primer 1 (10 µm) Orange 2 x 125 µl 710153R Universal Sequencing Primer 2 (10 µm) Orange 2 x 125 µl Æske med PCR-komponenter og -kontroller 703310 DNA Polymerase (250 U) Rød 100 µl 703312 DNA Polymerase (50 U) Rød 20 µl 703315 DNA Polymerase 10X PCR Buffer Gennemsigtig 1 ml 703065 dntps (10 mm) Gennemsigtig 500 µl 710452F NRAS Primer Exon 2 Forward (10 µm) Blå 90 µl 710452R NRAS Primer Exon 2 Reverse (10 µm) Blå 90 µl 710453F NRAS Primer Exon 3 Forward (10 µm) Blå 90 µl 710453R NRAS Primer Exon 3 Reverse (10 µm) Blå 90 µl 710454F NRAS Primer Exon 4 Forward (10 µm) Blå 90 µl 710454R NRAS Primer Exon 4 Reverse (10 µm) Blå 90 µl 710441 NRAS Control Wild-Type Mix Gul 120 µl 710442 NRAS Positive Control Exon 2 Grøn 40 µl 710443 NRAS Positive Control Exon 3 Grøn 40 µl 710444 NRAS Positive Control Exon 4 Grøn 40 µl 5.3 Antal prøver, der kan testes med et Kit CRC RAScan Combination Kit er designet til at kunne teste 230 reaktioner. Det totale antal prøver, der kan testes med dette kit, afhænger af den gennemsnitlige batchstørrelse, der testes på et enkelt tidspunkt, fordi ét sæt kontrolreaktioner (Wild-Type Controls, Positive Controls og uden template-kontroller) skal inkluderes i hver enkel reaktionsplade. Tabellen nedenfor viser antallet af prøver, der kan analyseres med KRAS og NRAS kittet alt afhængig af den gennemsnitlige prøvebatchstørrelse. Dette tager hensyn til (a) de 21 kontroller (7x Wild-Type, 7x Positive Controls, 7x uden template-kontroller), der er påkrævet for hver prøvekørsel og (b) grænsen på 230 reaktioner pr. kit. Bemærk: Hvis der køres flere plader, skal et sæt af de 21 kontroller, der er anført ovenfor, køres på hver enkel plade. To plader vil derfor kræve i alt 42 kontrolreaktioner, 3 plader vil kræve 63 kontrolreaktioner etc. Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 8

5 Komponenter Hvis prøvebatchstørrelsen forøges, vil antallet af prøver, der kan testet med et kit ligeledes blive forøget, hvilket vil reducere den gennemsnitlige reagenspris pr. prøve. Tabellen nedenfor er vejledning til antallet af prøver, der kan testes med kittene. Prøvebatchstørrelse Antal kontrolreaktioner + Antal prøve-amplikoner Antal reaktioner påkrævet pr. kørsel Samlet antal prøvebatchkørsler pr. kit Samlet antal prøver testet pr. kit 1 21 + 7 28 8 8 2 21 + 14 35 6 12 3 21 + 21 42 5 15 4 21 + 28 49 4 16 5 21 + 35 56 4 20 5.4 DNA-sekventering Sequencing primers (PNs 710153F og 710153R) leveres til brug for DNA-sekventering af alle de testede prøver. De PCR-amplikoner, der dannes inden SURVEYOR Nuclease fordøjelse, skal anvendes til sekventering. 6 Yderligere påkrævet udstyr og reagenser Yderligere komponenter og udstyr, der er påkrævet til brug af CRC RAScan Combination Kit med DHPLC inkluderer følgende: DHPLC system, kolonne, buffere, DNA størrelsesstandard - se Appendiks A.3.1 DHPLC Specifikationer for SURVEYOR Scan applikationer for karakteristika for et passende DHPLC system til brug med dette kit Vand af molekylærbiologisk kvalitet 0,2 ml PCR-rør, strimler eller 96-brønds plade Mikropipetter Pipettespidser Isbad Vortexer Mikrocentrifuge Termocykler Agarosegeler og elektroforeseudstyr til agarosegel 10% blegemiddel eller lignende rengøringsmiddel 7 Reagenspræparation Alle reagenser, der medleveres med dette kit, er parat til brug. Nogle komponenter skal optøs, vortexes eller centrifugeres i en mikrocentrifuge før brug; tjek detaljer i Analyseprocedure nedenfor. Reagenser skal kombineres for at producere Masterblandinger og reaktionsblandinger; detaljer er anført under Analyseprocedure nedenfor. Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 9

8 Opbevaring og holdbarhed 8 Opbevaring og holdbarhed Kittet skal opbevares mellem -18 ºC og -25 C i en fryser med konstant temperatur, indtil det skal bruges. Bemærk Udløbsdatoen for hvert enkelt kit, der modtages. Kittet må ikke anvendes efter udløbsdatoen er overskredet. SURVEYOR Nuclease-blandingen, der forberedes i Trin 7 af SURVEYOR Nuclease fordøjelse skal anvendes omgående da SURVEYOR Nuclease W inaktiveres over tid ved tilstedeværelse af de andre SURVEYOR Nuclease reaktionsblandingskomponenter. 9 Advarsler og forholdsregler Ingen af reagenserne i dette kit udgør en sundhedsfare i de kvantiteter, der leveres. Transgenomic s dokument nummer MSD-710077 kan downloades fra http://world.transgenomic.com/files/literature/710077-da.pdf Ingen substanser i dette kit er af animalsk eller human oprindelse, som kan udgøre en infektionsrisiko. Dette kit bør kun anvendes af personer, der er blevet uddannet i de behørige laboratorieteknikker. Ved arbejde med komponenterne i dette kit skal der altid bruges en egnet laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller. Efter brug skal kitkomponenterne bortskaffes som klinisk affald og i overensstemmelse med lokale regler og forordninger. Alikvoter af reagenser, der pipetteres fra rørene i dette kit, er kun beregnet til engangsbrug. Dette kits komponenter er blevet valideret som stabil efter 25 nedfrysnings-/optøningscyklusser. Dette kit må ikke anvendes, hvis dette antal af nedfrysnings-/optøningscyklusser overstiges. 10 Primær prøvetagning, håndtering og opbevaring CRC RAScan Combination Kit er blevet valideret til brug med DNA, som er ekstraheret fra formalinfikseret, paraffinindlejrede (FFPE) colorectale cancertumor-prøver. For optimal DNAekstraktion skal vævet fikseres i formalin i 14 24 timer, før det indlejres i paraffin. Tumor-biopsier er en heterogen blanding af tumorceller og non-tumorceller. Herudover er selve tumoren en heterogen blanding af tumorceller med mutationer og tumorceller uden mutationer. Da disse somatiske mutationer måske ikke er jævnt distribueret i hele tumoren, kan den resulterende mutationsanalyse af forskellige sektioner fra den samme tumor være forskellige. For at forøge sandsynligheden for at dektere en mutation, skal DNA fra vævenes tumorregion isoleres ved kun at skrabe tumorområdet af objektglasset med en ny, steril skalpel for hvert nyt objektglas. For korrekt brug af dette kit skal det ekstraherede DNA opfylde de kriterier, der er anført under Templateovervejelser. BEMÆRK: Ekstraherede DNA-prøver, der ikke er tiltænkt til øjeblikkelig analyse med dette kit, skal opbevares ved -20 ºC til -80 ºC. Brugsanvisning for CRC RAScan kit med DHPLC systemer Side 10

11 Analyseprocedure 11 Analyseprocedure 11.1 Somatisk mutationsdetektion med SURVEYOR Scan Kits - En oversigt Mutationsdetektion og bekræftelse med SURVEYOR Nuclease involverer tre trin: Trin 1 - Forbered PCR-amplikoner fra mutant (test) og normal (reference) DNA, fortsæt fra den endelige PCR-amplifikationscyklus for at smelte alle dobbeltstrenge og afkøl derefter langsomt for optimal dannelse af hetero- og homoduplexer (heteroduplexer opstår, når en streng af en Wild-Type sekvens annealer med en streng fra en mutant sekvens). Trin 2 - Behandl en portion af den annealede heteroduplex-/homoduplexblanding med SURVEYOR Nuclease. SURVEYOR Nuclease vil klippe begge strenge på DNA heteroduplexen og forårsage DNA-fragmenter. Control Wild-Type DNA, der behandles på samme måde, anvendes som en baggrundskontrol. Trin 3 - Analysér DNA-fragmenterne på et DHPLC system. Dannelsen af nye kløvningsprodukter, der skyldes tilstedeværelsen af en eller flere mismatches, indikeres ved tilstedeværelse af yderligere chromatografiske peaks. Kløvningsprodukternes migrationstider indikerer fragmenternes størrelse og dermed mismatchens eller mismatchernes omtrentlige placering. 12 Trin-for-trin vejledning 12.1 DHPLC INDLEDENDE opsætning/kalibrering Ved opsætning af SURVEYOR Nuclease pladen for analyse med DHPLC, se Appendiks A.3 Denaturering HPLC (DHPLC) systemskrav. 12.2 Overvejelser inden KRAS og NRAS prøveanalyse Inden prøver køres på et DHPLC system, skal en passende DNA størrelsesstandard køres for at sikre, at systemet fungerer korrekt. Laboratoriepersonale, der bruger instrumentet, skal kontrollere kvaliteten af DNA størrelsesstandardens opløsning, før der fortsættes til analyse. Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 11

12 Trin-for-trin vejledning 12.3 Templateovervejelser 1. For FFPE-isoleret template-dna skal der bruges normale laboratorieprocedurer til at vurdere den ekstraherede DNA's kvalitet og kvantitet for at sikre, at der er tilstrækkelig template for PCR. 2. 260/280 absorbansforholdet skal være større end >1,80. 3. For at fremskynde PCR-opsætning skal den anvendte template-koncentration justeres til ca. 12,5 ng/µl. Fortynd template-dnaet med vand af molekylærbiologisk kvalitet, hvis det påkræves. 12.4 Arbejdsflowovervejelser Kittet er designet til at tillade analyse af 130 reaktioner. Mindre prøvebatches kan køres, men kitkontrollerne og en uden template-kontrol skal inkluderes med hver enkel prøvebatch. Der er tilstrækkelige kontrolmaterialer i kittet til, at 130 reaktioner af alle kombinationer af prøvebatchstørrelser kan bruges. Generelt set skal bearbejdning af prøver udføres fra start til slut, som beskrevet i denne Brugsanvisning. Hvis bearbejdning af en prøve skal stoppes, før alle trin er fuldført, skal DNA'et opbevares ved -20 C ved de anførte punkter. Det skal imidlertid undgås, at frosne prøver bliver udsat for gentagne nedfrysnings-/optøningscyklusser og opbevaring af PCR-amplificeret DNA eller SURVEYOR Nuclease fordøjelsesprodukter i fryser ( -18 to -25 C) i længere perioder (>1 uge) skal undgås. Analyse af prøver skal følge det arbejdsflow, der er vist nedenfor: Afskrabet væv 1 DNA Isolering & PCR 2 Gelelektroforese 3 5 SURVEYOR Scan Mislykket Score Robust/Faint (svag)pcr 4 SURVEYOR Nuclease & DHPLC Analyse SURVEYOR Scan Positiv SURVEYOR Scan Negativ 7 6 Sekvensbekræftelse NVD 8 Sekvenskvalitet Mislykket Sekvenskvalitet Bestået 9 Mutationer i KRAS eller NRAS codon G12, G13, A59, Q61, K117 eller A146 NVD Figur 3: Arbejdsflow for CRC RAScan Combination Kit analyse Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 12

12 Trin-for-trin vejledning Bemærkninger til Figur 3 1. Isolér DNA fra FFPE ved at følge normale laboratorieprocedurer. 2. Udfør PCR og kontroller kvalitet af DNA med gelelektroforese. 3. Registrer om PCR-bånd er Robust ( 20 ng/µl) eller Faint (svag) (<20 ng/µl). Hvis der er flere PCR-bånd, skal der forberedes nyt genomisk DNA fra FFPE. 4. For prøver, der scores som enten Robust PCR eller Faint PCR efter PCR-amplifikation, fortsættes der med SURVEYOR Nuclease behandling og DHPLC systemanalyse. Bemærk, at med en Faint PCR-identifikation kan der være utilstrækkeligt DNA til generering af meningsfyldte resultater med DHPLC, men der kan være nok DNA til sekventering. 5. Se Appendiks B Problemløsningsguide for eksempler på mislykkede SURVEYOR Scan resultater. Alle prøver med et mislykket SURVEYOR Scan resultat skal ombearbejdes ved enten at: a. gentage PCR, hvis der er nok genomisk DNA tilbage b. re-ekstrahere DNA fra FFPE; dette bør være det sekundære valg, da det normalt er uønskværdigt at skære endnu en FFPE blok. c. hvis en anden sektion eller blok anvendes, skal hele analysen gentages, da uoverensstemmelse i fordøjelse kan skyldes tumor heterogeneitet. 6. Hvis der ikke er nogen synlige kløvningspeaks, skal der registreres et negativt SURVEYOR Scan resultat, dvs. NVD = Ingen variant detekteret. 7. Hvis en prøve viser SURVEYOR Nuclease kløvningsprodukter (matcher ikke den relevante Wild-Type Control), skal den sendes til sekvensbekræftelse. 8. Hvis sekvensbekræftelse-analyse er uacceptabel, skal man enten: a. gentage PCR, hvis der er nok genomisk DNA tilbage b. re-ekstrahere DNA fra FFPE; dette bør være det sekundære valg, da det normalt er uønskværdigt at skære yderligere snit fra en FFPE blok. 9. Hvis sekvensbekræftelse-analyse er acceptabel, skulle resultaterne indikere enten: a. Wild-Type sekvens, det vil sige Ingen variant detekteret (NVD); eller b. Variant detekteret. Hvis sekvensbekræftelse indikerer en base-ændring, der resulterer i en aminosyre-ændring i: i. codon 12 eller 13 ii. codon 59 eller 61 iii. codon 117; eller iv. codon 146 scores det som KRAS eller NRAS mutation positiv. Bemærk: det er muligt at have en positiv SURVEYOR Scan identifikation, der ligeledes resulterer i Ingen variant detekteret fra en sekvensbekræftelse-test. Detektionsniveauet (LOD) for SURVEYOR Nuclease på et DHPLC system er så lavt som 2% mutant i 98% Wild-Type DNA for nogle mutationer, hvorimod LOD for sekventering er omkring 10-25% mutant i 90-75% Wild-Type DNA. Bemærk: hvis en prøve er 100% mutant DNA, kan der ikke dannes heteroduplexer og prøven vil blive vist som Wild-Type. Tumor-biopsiprøver vil imidlertid indeholde Wild-Type celler på grund af tumor heterogeneitet og/eller kontaminerende normalt væv. Bemærk: prøver med 5% og 95% mutant DNA vil have identiske elektroferogrammer. Bemærk: positive SURVEYOR Scan resultater kan skyldes andre base-ændringer end de, der er blevet fundet at være KRAS- eller NRAS-aktiverende. Skønt disse mutationer er sjældne, vil Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 13

12 Trin-for-trin vejledning bekræftelse med en anden metode, som fx DNA-sekventering være påkrævet for at bestemme, hvorvidt eller ej et positivt SURVEYOR Scan resultat er en KRAS- eller NRAS-aktiverende mutation. Bemærk: formalin-fikseringsprocessen, der anvendes ved tilberedning af FFPE tumorbiopsiprøver kan resultere i deaminering af cytosiner. Denne deaminering omdanner cytosin til uracil. Polymerasen vil læse denne uracil som en thymin og inkorporere en adenin i de kopierede strenge. Dette vil så forekomme at være en mutation, hvor det normale G nu er udskiftet med et A og forårsager en GC til AT mutation, hvilket er en kunstig mutation, der resulterer fra fikseringsprocessen og ikke en ægte somatisk mutation. Disse er sjældne begivenheder, men hvis de kopieres tidligt i PCR-cyklusserne, vil de ligne mutationer. De vil ikke blive gentaget ved reanalyse. Eksempler på potentielle cytosin deaminering-mutationer, der ville blive overvejet for at bestemme patientbehandling, er for KRAS: - Codon 12: AGT (G12S) og GAT (G12D) - Codon 13: AGC (G13S), GAC (G13D) og GGT (G13G, en tavs mutation) - Codon 146: GCA>ACA (A146T) Eksempler på potentielle cytosin deaminering-mutationer, der ville blive overvejet for at bestemme patientbehandling, er for NRAS: - Codon 12: GGT> AGT (G12S) eller GAT (G12D) - Codon 13: GGT> AGT (G13S), GAT (G13D) eller GGC (G13G, en tavs mutation) - Codon 146: GCC>ACC (A146T) Det anbefales derfor, at enhver sådan mutation bekræftes med dobbeltanalyse af det samme genomiske DNA, eller at alle prøver underkastes dobbeltanalyse fra analysens start. 12.5 Amplifikationsprotokol 1. Transgenomic forblandede dntp solutions (PN 703065 og 705020) leveres som arbejdskoncentration på 10 mm total deoxynukleotid (2,5 mm af hver af de fire deoxynukleotider). 2. KRAS og NRAS Forward og Reverse PCR-primere (KRAS PN 710155F/R, 710157F/R, 710154F/R og 710156F/R; NRAS PN 710452F/R, 710453F/R og 710454F/R) leveres som 10 µm. 3. Tag 10 µm primere, 10 mm dntps og DNA Polymerase 10X PCR Buffer (PN 703315) ud af fryser og optø dem på is. 4. Efter optøning vortex alle kitkomponenter ~10 sekunder, så de blandes grundigt og centrifugér dem kortvarigt ~10 sekunder for at sikre, at der ikke er noget væske tilbage på rørlågene og placér dem på is. 5. Forbered Masterblandingerne på is. 6. Brug den følgende tabel som en vejledning til tilberedning af en Masterblanding for hver enkelt af KRAS Exon 2, KRAS Exon 3, KRAS Exon 4A, KRAS Exon 4B reaktioner, NRAS Exon 2, NRAS Exon 3 og NRAS Exon 4 reaktioner: Antal reaktioner (7 prøver + 3 kontroller): 10 Volumenberegning: Vandvolumen (µl) 330** DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µl) 50 dntps (µl) 40 Forward Primer (µl) 25 Reverse Primer (µl) 25 DNA Polymerase (µl) 10 Total volumen af Masterblanding 48.0 Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 14

12 Trin-for-trin vejledning **Bemærk: Brugeren skal sigte efter at have minimum 25 ng DNA pr. 50 µl PCRreaktion. Hvis ekstraherede DNA-koncentrationer er mindre end 12,5 ng/µl, skal volumen af ekstraheret DNA forøges proportionelt for at sikre 25 ng pr. reaktion. Volumen af vand i Masterblandingerne skal ligeledes reduceres med den samme mængde for at resultere i 50 µl pr. reaktion. Alle prøver, der forberedes med disse Masterblandinger, skal have den ekstraherede DNA fortyndet til ca. det samme laveste koncentrationsniveau. Brug af ekstraherede DNA-koncentrationer på mindre end 5 ng/µl anbefales ikke. 7. Beregn de påkrævede volumener for enhver given Masterblanding i henhold til ovenstående diagram; bemærk at: (a) For Masterblanding 1, KRAS Exon 2, vil tre yderligere reaktioner være påkrævet pr. prøveplade: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 2 og KRAS Exon 2 uden template-kontrol(ntc1). (b) For Masterblanding 2, KRAS Exon 3, vil tre yderligere reaktioner være påkrævet pr. prøveplade: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 3 og KRAS Exon 3 uden template-kontrol (NTC2). (c) For Masterblanding 3, KRAS Exon 4A vil tre yderligere reaktioner være påkrævet pr. prøveplade: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 4A og KRAS Exon 4A uden template-kontrol (NTC3). (d) For Masterblanding 4, KRAS Exon 4B vil tre yderligere reaktioner være påkrævet pr. prøveplade: KRAS Control Wild-Type, KRAS Positive Control Exon 4B og KRAS Exon 4B uden template-kontrol (NTC4). (e) For Masterblanding 5, NRAS Exon 2 vil tre yderligere reaktioner være påkrævet pr. prøveplade for NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 2 og NRAS Exon 2 uden template-kontrol (NTC5). (f) For Masterblanding 6, NRAS Exon 3 vil tre yderligere reaktioner være påkrævet pr. prøveplade for NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 3 og NRAS Exon 3 uden template-kontrol (NTC6). (g) For Masterblanding 7, NRAS Exon 4 vil tre yderligere reaktioner være påkrævet pr. prøveplade for NRAS Control Wild-Type, NRAS Positive Control Exon 4 og NRAS Exon 4 uden template-kontrol (NTC7). Bemærk: tag i betragtning, at en Masterblanding-volumen, der er lidt større end denne beregning, vil være påkrævet for at tage hensyn til tab under pipettering. 8. Afmærk 0,2 ml PCR-rør eller brønde i en 96-brønds plade med behørig prøveinformation. 9. Afmærk 2,0 ml-centrifugerør til Masterblanding-præparation. 10. Tilsæt det påkrævne volumen af vand af molekylærbiologisk kvalitet til de 2,0 mlcentrifugerør afmærket Masterblanding. 11. Tilsæt den påkrævne mængde DNA Polymerase 10X PCR Buffer til Masterblandingrørene. 12. Tilsæt det påkrævne volumen af 10 mm dntps til Masterblanding-rørene. 13. Tilsæt den påkrævne volumen af KRAS eller NRAS Forward Primers til deres respektive Masterblanding-rør. 14. Tilsæt den påkrævne volumen af KRAS eller NRAS Reverse Primers til deres respektive Masterblanding-rør. 15. Tag DNA Polymerase (PN 703310) ud af fryseren. 16. Centrifugér DNA Polymerase i ~10 sekunder. 17. Vortex DNA Polymerase i ~10 sekunder. 18. Tilsæt den påkrævne mængde DNA Polymerase til Masterblanding-rørene. 19. Sæt hætte på Masterblanding-rørene. 20. Vortex Masterblanding-rørene før brug i ~30 sekunder og centrifugér derefter kortvarigt i ~10 sekunder. Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 15

12 Trin-for-trin vejledning 21. Opbevar på is indtil brug. 22. Afpipettér 48,0 µl (se bemærkning ovenfor i Trin 6) Masterblanding i de behørige brønde, idet der skiftes pipettespids ind imellem, hvis der anvendes en enkeltkanalpipette. Hvis der bruges en repeatpipette, skal det sikres, at der ikke er spild eller stænk fra brønd til brønd. Pladen skal opbevares på is. 23. De behørige brønde tilsættes 2,0 µl (se bemærkning ovenfor i Trin 6) af hver enkelt prøve-template-dna, eller vand (uden template-kontrol, NTC). Brug separat pipettespids for hver enkelt prøve og undgå krydskontaminering af prøverne med stænk. Luk brøndene, der indeholder prøve-dnaer og uden template-kontrol (NTC) med 8-hætte strimlerne (hvis der bruges en 96-brønds plade) eller sæt hætter på 0,2 ml PCR-rørene. Tjek at hætterne er forseglet korrekt. 24. Først nu må kitkontrol-template-dnaernes (PN 710131, 710135, 710136, 710137, 710138, 710441, 710442, 710443 & 710444) rør åbnes et ad gangen. Afpipettér 2,0 µl af hver af kontrol-templaterne til sidst for at formindske chancen for at kontaminere prøve- DNA. Luk igen hver enkelt brønd med 8-hætte strimlerne (hvis der bruges en 96-brønds plade) eller sæt hætte på 0,2 ml PCR-rørene. Tjek at hætterne er forseglet korrekt. BEMÆRK: Det er god prakis at placere uden template-kontrollerne (NTC) i brønde, der ikke er tilstødende til Positive Controls eller prøver. BEMÆRK: For et forslag til opstilling af 96-brønds plader til analyse af alle KRAS og NRAS exons 2-4 se Appendiks A.1 Pladelayout-plan for SURVEYOR Scan kits. 25. Vortex (~1/2 hastighed) i 10 sekunder. 26. Centrifugér i 1-2 minutter for at sikre, at alle opløsninger er samlet i bunden af brøndene eller rørene. Kontrollér at opløsningen er i bunden af hver brønd eller rør. Hvis ikke, skal centrifugeringen gentages. 12.6 Termocyklerprogram for Amplifikationsprotokol 1. Brug den følgende termocyklerprotokol for PCR-amplifikation og heteroduplex-dannelse: 15 cyklusser 30 cyklusser Initial denaturering 95 C 5 minutter Touchdown amplifikation 95 C 30 sekunder 62 C, -0,5 ºC/cyklus 30 sekunder 72 C 25 sekunder Amplifikation 95 C 30 sekunder 55 C 30 sekunder 72 C 25 sekunder Endelig forlængelse 1 cyklus 72 C 2 minutter Heteroduplex-dannelse 95 ºC 2 minutter 12 C 12.7 Kvalitetskontrol af PCR-produkter 1. Det anbefales, at amplikon kvalitet og kvantitet kontrolleres med gelelektroforese (eller tilsvarende metode), før der fortsættes med SURVEYOR Nuclease fordøjelse. 2. Analysér en alikvot af PCR-produktet sammen med flere forskellige mængder af en 100- bp DNA mass ladder. 3. Brug ladderen til at estimere koncentrationen af den amplificerede DNA. Hold Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 16

12 Trin-for-trin vejledning 4. Kun et enkelt bånd større end 20 ng/µl, der korresponderer med hoved-pcr-produktet, skulle observeres. 5. Hvis der er flere bånd tilstede, skal det sikres, at kvaliteten af input-template-dna var tilstrækkelig (se Appendiks B Problemløsningsguide). 6. Hvis der ikke observeres noget produkt, skal det sikres, at kvaliteten af input-template- DNA var tilstrækkelig (se Appendiks B Problemløsningsguide). Hvis kvaliteten opfylder specifikationerne, skal template-volumen forøges til 4,0 µl pr. 50 µl reaktion (reducér vand pr. reaktion til 31,0 µl). 7. Ingen PCR-produkter skulle være synlige i uden-template-kontrolprøven. Hvis DNAprodukter er synlige med denne kontrol, skyldes det sandsynligvis kontaminering; se Appendiks B - Problemløsningsguide. 8. Scor PCR som Robust PCR eller Faint PCR. a. Robust PCR skulle have et enkelt bånd større end eller lig 20 ng/µl. b. Faint PCR skulle have et enkelt bånd mindre end 20 ng/µl. c. Fortsæt med SURVEYOR Nuclease fordøjelse med både Robust og Faint PCR score. ET TIP: på dette trin kan PCR-produkter opbevares ved -20 ºC eller herunder i op til en uge. 12.8 SURVEYOR Nuclease fordøjelse 1. Når prøve-pcr'en anses for at være af tilstrækkelig kvalitet og kvantitet, skal SURVEYOR Nuclease fordøjelsesreaktionen udføres, som beskrevet nedenfor. En prøvekoncentration, der er større eller lig 40 ng/µl er påkrævet for optimal fordøjelse af SURVEYOR Nuclease. 2. Optø rørene med 0,15 M MgCl 2 Solution og SURVEYOR Enhancer Cofactor på is. 3. Tilsæt 10,0 µl af hver PCR-amplificeret prøve fra ovenstående til et nyt 0,2 ml PCR-rør eller brønd i en 96-brønds plade. 4. Forbered en ny blanding af 0,15 M MgCl 2 Solution, SURVEYOR Enhancer Cofactor, SURVEYOR Enhancer W2 og SURVEYOR Nuclease W (SURVEYOR Nucleaseblanding). Brug den følgende tabel som en vejledning til tilberedning af SURVEYOR Nuclease fordøjelse Masterblanding til analyse af flere prøver. Nedenstående eksempel har volumenerne for en 10 prøve-masterblanding. Tag i betragtning, at en Masterblanding-volumen, der er lidt større end denne beregning, vil være påkrævet for at tage hensyn til tab under pipettering. Antal SURVEYOR Nuclease fordøjelsesreaktioner: 10 Volumenberegning: 0,15 M MgCl 2 Solution (µl) 10.0 SURVEYOR Enhancer Cofactor (µl) 10.0 SURVEYOR Enhancer W2 (µl) 10.0 SURVEYOR Nuclease W (µl) 20.0 Total volumen af Masterblanding: 50.0 Tilsæt 5 µl SURVEYOR Nuclease Masterblanding til PCR-amplificeret prøve (µl) 10.0 Total volumen af SURVEYOR Nuclease fordøjelsesreaktion: 15.0 a. Centrifugér hver enkelt reagens før brug. b. Vortex forsigtigt hver enkelt reagens før afpipettering; centrifugér kortvarigt i ~10 sekunder efter hvert vortex-trin. Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 17

12 Trin-for-trin vejledning c. For hver enkelt fordøjelse skal de følgende komponenter tilsættes til et 0,2 ml PCR- (eller større) mikrocentrifugerør. 1,0 µl 0,15 M MgCl 2 Solution (PN 708027) 1,0 µl SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN 708049) 1,0 µl SURVEYOR Enhancer W2 (PN 710161) 2,0 µl SURVEYOR Nuclease W (PN 710160) Eller tilsæt 5 µl Masterblanding forberedt i henhold til ovenstående tabel. 5. Vortex forsigtigt SURVEYOR Nuclease fordøjelse Masterblanding i 10 sekunder ved lav hastighed 6. Centrifugér SURVEYOR Nuclease fordøjelse Masterblanding i 10 sekunder ved lav hastighed 7. Placér SURVEYOR Nuclease fordøjelse Masterblanding på is indtil brug. Bemærk: SURVEYOR Nuclease fordøjelse Masterblandingen, der forberedes i Trin 7, skal anvendes omgående, da SURVEYOR Nuclease W inaktiveres over tid ved tilstedeværelse af de andre SURVEYOR Nuclease fordøjelse Masterblandingkomponenter. 8. Afpipettér 5,0 µl-alikvot af SURVEYOR Nuclease fordøjelse Masterblandingen i hvert rør eller brønd, der indeholder 10,0 µl alikvot af amplificeret PCR-produkt (se Trin 3 ovenfor). 9. Når afpipettering er fuldført skal 0,2 ml PCR-rørene eller 96-brønds pladen centrifugeres i 10 sekunder. 10. Vortex forsigtigt prøve- 0,2 ml PCR-rørene eller 96-brønds pladen i 10 sek. 11. Centrifugér i 10 sekunder ved lav hastighed (dette trin er særligt vigtigt, hvis fordøjelsen udføres i et instrument uden et opvarmet låg). 12. Inkubér ved 42 C i 30 minutter. 13. Tilsæt 1,0 µl SURVEYOR Stop Solution (PN 708030) til hvert enkelt rør eller brønd og vortex forsigtigt (total SURVEYOR Nuclease reaktionsvolumen er 16,0 µl). ET TIP: SURVEYOR fordøjelsesprodukter kan opbevares ved -20 ºC i op til en uge. 14. Sæt prøvefordøjelserne på et DHPLC system. Bemærk: For foreslåede DHPLC systemgradientindstillinger til analysering af SURVEYOR Nuclease fordøjelser, se venligst http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/geneticanalysis-kits/crc-rascan-kits-eu/dhplcsystemsettings. 13 Kontrolprocedurer 13.1 Kvalitetskontrol af CRC RAScan Combination Kit Kontrol Plasmid DNA'er er inkluderet i kittet for kvalitetskontroltjek ved specifikke trin i analyseproceduren. For Amplifikationsprotokollen er disse kontroller en metode til at sikre, at Masterblandingerne er forberedt rigtigt og at amplifikationen fungerer korrekt. Uden templatekontroller (hvor vand tilsættes i stedet for template-dna) er ligeledes påkrævet for at tjekke for mulig kontamination af kitkomponenter med en fremmed DNA-template. På SURVEYOR Nuclease fordøjelse-trinnet giver amplikonerne fra disse Kontrol Plasmid DNA'er et effektivt tjek på, hvorvidt kløvningsreaktionsbetingelserne (SURVEYOR Nuclease fordøjelse Masterblandingspræparation og inkubationbetingelser) var tilfredsstillende. På analysetrinnet giver DHPLC System kromatogrammerne af de SURVEYOR Nuclease fordøjede kontrolamplikoner vejledning om, hvor de kløvningsproduktpeaks, der korresponderer med disse mutationer i KRAS og NRAS Exons 2, 3 og 4, selv ved lave niveauer, vil eluere (se Figur 4-10). Kløvningsproduktpeaks, der korresponderer til andre mutationer i KRAS eller NRAS Exons 2, 3 og 4 kan eluere i lidt forskellige positioner. Hvis PCR-amplikonerne ikke matcher de resultater, der er anført i Kvalitetskontrol af PCRprodukter, skal Appendiks B - Problemløsningsguide konsulteres eller Transgenomic Technical Support kontaktes, før der fortsættes med yderligere trin i analysen af prøverne. Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 18

13 Kontrolprocedurer 13.2 Sådan anvendes Kontrol Plasmid DNAer Kittene leveres med ni kontrol DNAer: KRAS Control Wild-Type; PN 710131 KRAS Positive Control Exon 2; PN 710135 KRAS Positive Control Exon 3; PN 710136 KRAS Positive Control Exon 4A; PN 710137 KRAS Positive Control Exon 4B; PN 710138 NRAS Control Wild-Type; PN 710441 NRAS Positive Control Exon 2; PN 710442 NRAS Positive Control Exon 3; PN 710443 NRAS Positive Control Exon 4; PN 710444 Disse kontrol DNAer er plasmider med inserts. De Positive Controls indeholder to plasmider hver: en blanding af KRAS eller NRAS Control Wild-Type og en mutationsklon, der er forskellig fra Wild- Type på et enkelt basepar. Kontrollerne leveres i separate hætteglas, hver i en koncentration på 10 5 kopier/µl. KRAS og NRAS Exons 2, 3 og 4 Forward og Reverse PCR primere, der er nødvendige for PCRamplifikation, leveres separat i kittene. Følg vejledningen i Amplifikationsprotokollen, SURVEYOR Nuclease fordøjelse og Analyse af KRAS og NRAS Exons 2, 3 & 4 for brug af SURVEYOR Nuclease for disse kontroller. VI ANBEFALER STÆRKT, AT FØRSTEGANGSBRUGERE UDFØRER EKSPERIMENTER MED KONTROLLERNE ALENE, FØR DE TESTER GENOMISKE PRØVER 14 Fortolkning af resultater 14.1 Analyse af KRAS og NRAS Exons 2, 3 og 4 med SURVEYOR Nuclease For sammenlignings- og kontrolformål skal der ALTID udføres SURVEYOR Nuclease fordøjelse på hver af kontrollerne (Wild-Type og Positive Controls), en uden template-kontrol, såvel som prøve-dnaerne og køres i samme DHPLC system prøveplade. På SURVEYOR Nuclease fordøjelse-trinnet giver amplikonerne fra disse Kontrol Plasmid DNA'er et effektivt tjek på, hvorvidt kløvningsreaktionsbetingelserne (SURVEYOR Nuclease blandingspræparation og inkubationsbetingelser) var tilfredsstillende. På analysetrinnet giver DHPLC systemets spor af disse SURVEYOR Nuclease fordøjede kontrolamplikoner vejledning om, hvor DNA-fragmenterne, der resulterer fra kløvning ved disse specifikke mutationers mismatch positioner, selv ved lave niveauer, vil eluere (se Figur 4-10). Hvis enten PCR-amplikonerne eller SURVEYOR Nuclease kløvningsfragmenterne, der er afledt fra Kontrol DNAerne, ikke matcher de resultater, der er anført, skal Appendiks B - Problemløsningsguide konsulteres eller Transgenomic Technical Support kontaktes, før der fortsættes med yderligere trin i analysen af prøverne. De eksempler, der er givet nedenfor, er kun til illustrationsformål og kan IKKE anvendes til at bestemme en given mutations identitet. Bekræftelse af en mutations identitet er påkrævet for entydigt at bestemme tilstedeværelsen af en specifik base-ændring i Exons 2, 3 eller 4 af KRAS og NRAS generne. SURVEYOR Nuclease kløver ved alle mismatches, der resulterer fra heteroduplex-dannelse mellem Wild-Type og mutante DNAer og ikke blot mutationer i Exons 2, 3 eller 4. SURVEYOR Nuclease bekræfter, at en mismatch er tilstede. Mutationens specifikke base-ændring identitet er påkrævet for bestemmelse af KRAS- og NRAS-aktiverende status og den skal bekræftes med en anden metode, som fx sekventering. Brugsanvisning for CRC RAScan kit med DHPLC systemer Side 19

14 Fortolkning af resultater 14.2 Dataevaluering af SURVEYOR Scan resultater Inspicér kromatogrammerne og sammenlign dem for Wild-Type og de Positive Controls med det for prøven. Bestem om prøvens kromatogram ligner eller er forskellig fra Wild-Type mønsteret. Hvis den er forskellig, skal prøven anses for at være SURVEYOR Scan Positiv og sendes til DNA-sekvensanalyse. Se Figur 4-10 for eksempler og Appendiks B Problemløsningsguide, Problem 7 & 8 for eksempler på sådanne prøver. Enhver prøve med et SURVEYOR Nuclease mønster, som er forskelligt fra Wild-Typen, skal sendes til sekvensbekræftelse, selv hvis den ikke er identisk med kontrollen. Se Appendiks B Problemløsningsguide, Problem 7 for et eksempel på en sådan prøve. Når det påkræves, zoom ind i regionen af interesse og overlay prøve-kromatogrammet med Wild- Type Control for dette amplikon. Bemærk alle forskelle mellem Wild-Type Control og den analyserede prøve. Vigtigt! Efter en grundig evaluering af hver prøve skal datarevieweren undersøge, hvorvidt tilstødende prøver i analysepladen har identiske positive SURVEYOR Scan resultater. Hvis identiske positive resultater forekommer, kan de være et resultat af prøve- eller kontrolkrydskontaminering og analysen skal gentages. Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 20

14 Fortolkning af resultater 14.3 Eksempler på resultater Eksempler på resultater opnået med CRC RAScan Combination Kit med et DHPLC system er vist i Figur 4-10 nedenfor. I disse eksempler, hvor der blev brugt WAVE 4500HT-HS System med både UV- og fluorescerende detektorer, blev processen, der er beskrevet i afsnittet Trin-for-trin vejledning, fulgt præcist. For vejledning om foreslåede DHPLC systemgradientindstillinger til analysering af SURVEYOR Nuclease fordøjelser, se venligst http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysis-kits/crc-rascan-kitseu/dhplcsystemsettings. Figur 4A DHPLC gennemstrømning G12D danner 74 og 116-bp fragmenter KRAS Control Wild-Type KRAS Control Exon 2 UkløvetPrøve 1, KRAS Exon 2 200-bp Prøve 2, KRAS Exon 2 amplikon Prøve 3, KRAS Exon 2 DNA Sizing Standard Ukløvet 190-bp amplikon DHPLC Afvaskning Figur 4B G12D danner 74 og 116-bp fragmenter KRAS Control Wild-Type KRAS Control Exon 2 UkløvetPrøve 1, KRAS Exon 2 200-bp Prøve 2, KRAS Exon 2 amplikon Prøve 3, KRAS Exon 2 DNA Sizing Standard Ukløvet 190-bp amplikon Figur 4A og 4B: WAVE DHPLC analyse med UV- (Figur 4A) og fluorescerende (Figur 4B) detektion af SURVEYOR Nuclease fordøjelser af KRAS Positive Control Exon 2 og KRAS Control Wild-Type og CRC DNA isoleret fra FFPE-sektioner. Når kromatogrammerne evalueres visuelt, skal de fordøjede prøver sammenlignes med Wild-Type Control (brun linje). KRAS Positive Control Exon 2 (blå linje) er en blanding af Wild-Type og mutant G12D plasmider, der resulterer i fordøjelsespeaks på 74 og 116 bp; denne kontrol indikerer, at SURVEYOR Nuclease fordøjelsestrinnet fungerer og viser regionen af kromatogrammet, der skal inspiceres visuelt for at bestemme, om en prøve skal sendes til DNA-sekvensanalyse. Ved sammenligning af fordøjelsesmønstre for Prøve 1-3 med Wild-Type ufordøjet elektroferogram, fremgår det, at Prøve 1 & 2 (rød & turkis linje) har sandsynlige mutationer og skal sekventeres for at bekræfte tilstedeværelse eller fravær af en mutation på den relevante codon. Prøve 3 (grøn linje) har lignende kromatogrammer til de, der observeres for Wild-Type Control og behøver ikke at blive sendt til DNA-sekvensanalyse. Bemærk, at sekventeringsresultatet er det definitive resultat, da der kan være andre ikke-relevante mutationer, der kan resultere i de samme fragmentstørrelser. Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 21

14 Fortolkning af resultater Figur 5A DHPLC gennemstrømning KRAS Control Wild-Type KRAS Control Exon 3 UkløvetPrøve 1, KRAS Exon 3 200-bp Prøve 2, KRAS Exon 3 amplikon Prøve 3, KRAS Exon 3 DNA Sizing Standard Q61H danner 65 og 135-bp fragmenter Ukløvet 200-bp amplikon DHPLC Afvaskning Figur 5B Q61H danner 65 og 135-bp fragmenter KRAS Control Wild-Type KRAS Control Exon 3 UkløvetPrøve 1, KRAS Exon 3 200-bp Prøve 2, KRAS Exon 3 amplikon Prøve 3, KRAS Exon 3 DNA Sizing Standard Ukløvet 200-bp amplikon Figur 5A og 5B: WAVE DHPLC analyse med UV- (Figur 5A) og fluorescerende (Figur 5B) detektion af SURVEYOR Nuclease fordøjelser af KRAS Positive Control Exon 3 og KRAS Control Wild-Type og CRC DNA isoleret fra FFPE-sektioner. Når kromatogrammerne evalueres visuelt, skal de fordøjede prøver sammenlignes med Wild-Type Control (brun linje). KRAS Positive Control Exon 3 (grøn linje) er en blanding af Wild-Type og mutant Q61H plasmider, der resulterer i fordøjelsespeaks på 65 og 135 bp; denne kontrol indikerer, at SURVEYOR Nuclease fordøjelsestrinnet fungerer og viser regionen af kromatogrammet, der skal inspiceres visuelt for at bestemme, om en prøve skal sendes til DNA-sekvensanalyse. Ved sammenligning af fordøjelsesmønstre for Prøve 1-3 med Wild-Type ufordøjet elektroferogram, fremgår det, at Prøve 2 (sort linje) har sandsynlig mutation og skal sekventeres for at bekræfte tilstedeværelse eller fravær af en mutation på den relevante codon. Prøve 1 og 3 (blå og rød linje) har lignende kromatogrammer til de, der observeres for Wild-Type Control og behøver ikke at blive sendt til DNA-sekvensanalyse. Bemærk, at sekventeringsresultatet er det definitive resultat, da der kan være andre ikke-relevante mutationer, der kan resultere i de samme fragmentstørrelser. Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 22

14 Fortolkning af resultater Figur 6A DHPLC gennemstrømning DHPLC KRAS Afvasknin Control Wild-Type KRAS Control Exon 4A UkløvetPrøve 1, KRAS Exon 4A 200-bp Prøve 2, KRAS Exon 4A amplikon DNA Sizing Standard K117N danner 80 og 88-bp fragmenter Ukløvet 168-bp amplikon DHPLC Afvaskning Figur 6B K117N danner 80 og 88-bp fragmenter DHPLC KRAS Afvasknin Control Wild-Type KRAS Control Exon 4A UkløvetPrøve 1, KRAS Exon 4A 200-bp Prøve 2, KRAS Exon 4A amplikon DNA Sizing Standard Ukløvet 168-bp amplikon Figur 6A og 6B: WAVE DHPLC analyse med UV- (Figur 6A) og fluorescerende (Figur 6B) detektion af SURVEYOR Nuclease fordøjelser af KRAS Positive Control Exon 4A og KRAS Control Wild-Type og CRC DNA isoleret fra FFPE-sektioner. Når kromatogrammerne evalueres visuelt, skal de fordøjede prøver sammenlignes med Wild-Type Control (grøn linje). KRAS Positive Control Exon 4A (blå linje) er en blanding af Wild-Type og mutant K117N plasmider, der resulterer i fordøjelsespeaks på 80 og 88 bp; denne kontrol indikerer, at SURVEYOR Nuclease fordøjelsestrinnet fungerer og viser regionen af kromatogrammet, der skal inspiceres visuelt for at bestemme, om en prøve skal sendes til DNA-sekvensanalyse. Ved sammenligning af fordøjelsesmønstre for Prøve 1 & 2 med Wild-Type ufordøjet elektroferogram, fremgår det, at Prøve 1 (rød linje) har sandsynlig mutation og skal sekventeres for at bekræfte tilstedeværelse eller fravær af en mutation på den relevante codon. Prøve 2 (sort linje) har et lignende kromatogram til det, der observeres for Wild-Type Control og behøver ikke at blive sendt til DNA-sekvensanalyse. Bemærk, at sekventeringsresultatet er det definitive resultat, da der kan være andre ikke-relevante mutationer, der kan resultere i de samme fragmentstørrelser. Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 23

14 Fortolkning af resultater Figur 7A DHPLC gennemstrømning Ukløvet 194-bp amplikon DHPLC KRAS Afvasknin Control Wild-Type KRAS Control Exon 4B Ukløvet Prøve 1, KRAS Exon 4B 200-bp Prøve 2, KRAS Exon 4B amplikon Prøve 3, KRAS Exon 4B DNA Sizing Standard DHPLC Afvaskning A146T danner 78 og 116-bp fragmenter Figur 7B A146T danner 78 og 116-bp fragmenter DHPLC KRAS Afvasknin Control Wild-Type KRAS Control Exon 4B Ukløvet Prøve 1, KRAS Exon 4B 200-bp Prøve 2, KRAS Exon 4B amplikon Prøve 3, KRAS Exon 4B DNA Sizing Standard Ukløvet 194-bp amplikon Figur 7A og 7B: WAVE DHPLC analyse med UV- (Figur 7A) og fluorescerende (Figur 7B) detektion af SURVEYOR Nuclease fordøjelser af KRAS Positive Control Exon 4B og KRAS Control Wild-Type og CRC DNA isoleret fra FFPE-sektioner. Når kromatogrammerne evalueres visuelt, skal de fordøjede prøver sammenlignes med Wild-Type Control (brun linje). KRAS Positive Control Exon 4B (mørkegrøn linje) er en blanding af Wild-Type og mutant A146T plasmider, der resulterer i fordøjelsespeaks på 78 og 116 bp; denne kontrol indikerer, at SURVEYOR Nuclease fordøjelsestrinnet fungerer og viser regionen af kromatogrammet, der skal inspiceres visuelt for at bestemme, om en prøve skal sendes til DNA-sekvensanalyse. Ved sammenligning af fordøjelsesmønstre for Prøve 1-3 med Wild-Type ufordøjet elektroferogram, fremgår det, at Prøve 3 (rød linje) har sandsynlig mutation og skal sekventeres for at bekræfte tilstedeværelse eller fravær af en mutation på den relevante codon. Prøve 2 & 3 (sort og lysegrøn linje) har lignende kromatogrammer til de, der observeres for Wild-Type Control og behøver ikke at blive sendt til DNA-sekvensanalyse. Bemærk, at sekventeringsresultatet er det definitive resultat, da der kan være andre ikke-relevante mutationer, der kan resultere i de samme fragmentstørrelser. Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 24

14 Fortolkning af resultater Figur 8A DHPLC gennemstrømning NRAS Control Wild-Type NRAS Control Exon 2 UkløvetPrøve 1, NRAS Exon 2 200-bp Prøve 2, NRAS Exon 2 amplikon DNA Sizing Standard G12D danner 88 og 148-bp fragmenter Ukløvet 236-bp amplikon DHPLC Afvaskning Figur 8B G12D danner 88 og 148-bp fragmenter NRAS Control Wild-Type NRAS Control Exon 2 UkløvetPrøve 1, NRAS Exon 2 200-bp Prøve 2, NRAS Exon 2 amplikon DNA Sizing Standard Ukløvet 236-bp amplikon Figur 8A og 8B: WAVE DHPLC analyse med UV- (Figur 8A) og fluorescerende (Figur 8B) detektion af SURVEYOR Nuclease fordøjelser af NRAS Positive Control Exon 3 and Wild- Type Controls og CRC DNA isoleret fra FFPE-sektioner. Når kromatogrammerne evalueres visuelt, skal de fordøjede prøver sammenlignes med NRAS Control Wild-Type (blå linje). NRAS Positive Control Exon 2 (grøn linje) er en blanding af Wild-Type og mutant G12D plasmider, der resulterer i fordøjelsespeaks på 88 og 148 bp; denne kontrol indikerer, at SURVEYOR Nuclease fordøjelsestrinnet fungerer og viser regionen af kromatogrammet, der skal inspiceres visuelt for at bestemme, om en prøve skal sendes til DNA-sekvensanalyse. Ved sammenligning af fordøjelsesmønstre for Prøve 1 og 2 med Wild-Type -fordøjet elektroferogram, fremgår det, at Prøve 1 (rød linje) har sandsynlig mutation og skal sekventeres for at bekræfte tilstedeværelse eller fravær af en mutation på den relevante codon. Sample 2 (sort linje) har et lignende kromatogram til det, der observeres for NRAS Control Wild-Type og behøver ikke at blive sendt til DNA-sekvensanalyse. Bemærk, at sekventeringsresultatet er det definitive resultat, da der kan være andre ikke-relevante mutationer, der kan resultere i de samme fragmentstørrelser. Brugsanvisning for CRC RAScan kit med DHPLC systemer Side 25

14 Fortolkning af resultater Figur 9A DHPLC gennemstrømning Q61K danner 78 og 125-bp fragmenter DHPLC Afvaskning Ukløvet 203-bp amplikon NRAS Control Wild-Type NRAS Control Exon 3 UkløvetPrøve 1, NRAS Exon 3 200-bp Prøve 2, NRAS Exon 3 amplikon DNA Sizing Standard Figur 9B Q61K danner 78 og 125-bp fragmenter NRAS Control Wild-Type NRAS Control Exon 3 UkløvetPrøve 1, NRAS Exon 3 200-bp Prøve 2, NRAS Exon 3 amplikon DNA Sizing Standard Ukløvet 203-bp amplikon Figur 9A og 9B: WAVE DHPLC analyse med UV- (Figur 9A) og fluorescerende (Figur 9B) detektion af SURVEYOR Nuclease fordøjelser af NRAS Positive Control Exon 3 og Wild- Type Controls og CRC DNA isoleret fra FFPE-sektioner. Når kromatogrammerne evalueres visuelt, skal de fordøjede prøver sammenlignes med NRAS Control Wild-Type (grøn linje). NRAS Positive Control Exon 3 (blå linje) er en blanding af Wild-Type og mutant Q61K plasmider, der resulterer i fordøjelsespeaks på 78 og 125 bp; denne kontrol indikerer, at SURVEYOR Nuclease fordøjelsestrinnet fungerer og viser regionen af kromatogrammet, der skal inspiceres visuelt for at bestemme, om en prøve skal sendes til DNA-sekvensanalyse. Ved sammenligning af fordøjelsesmønstre for Prøve 1 & 2 med Wild-Type fordøjet elektroferogram, fremgår det, at Prøve 1 (rød linje) har sandsynlig mutation og skal sekventeres for at bekræfte tilstedeværelse eller fravær af en mutation på den relevante codon. Sample 2 (sort linje) har et lignende kromatogram til det, der observeres for NRAS Control Wild-Type og behøver ikke at blive sendt til DNAsekvensanalyse. Bemærk, at sekventeringsresultatet er det definitive resultat, da der kan være andre ikke-relevante mutationer, der kan resultere i de samme fragmentstørrelser. Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 26

14 Fortolkning af resultater Figur 10A DHPLC gennemstrømning Ukløvet 233-bp amplikon NRAS Control Wild-Type NRAS Control Exon 4 Ukløvet Prøve 1, NRAS Exon 4 200-bp Prøve 2, NRAS Exon 4 amplikon DNA Sizing Standard A146T danner 68 og 165-bp fragmenter DHPLC Afvaskning Figur 10B A146T danner 68 og 165-bp fragmenter NRAS Control Wild-Type NRAS Control Exon 4 Ukløvet Prøve 1, NRAS Exon 4 200-bp Prøve 2, NRAS Exon 4 amplikon DNA Sizing Standard Ukløvet 233-bp amplikon Figur 10A og 10: WAVE DHPLC analyse med UV- (Figur 10A) og fluorescerende (Figur 10B) detektion af SURVEYOR Nuclease fordøjelser af NRAS Positive Control Exon 4 og Wild- Type Controls og CRC DNA isoleret fra FFPE-sektioner. Når kromatogrammerne evalueres visuelt, skal de fordøjede prøver sammenlignes med NRAS Control Wild-Type NRAS Control Wild- Type (grøn linje). NRAS Positive Control Exon 4 (blå linje) er en blanding af Wild-Type og mutant A146T plasmider, der resulterer i fordøjelsespeaks på 68 og 165 bp; denne kontrol indikerer, at SURVEYOR Nuclease fordøjelsestrinnet fungerer og viser regionen af kromatogrammet, der skal inspiceres visuelt for at bestemme, om en prøve skal sendes til DNA-sekvensanalyse. Ved sammenligning af fordøjelsesmønstre for Prøve 1 & 2 med Wild-Type fordøjet elektroferogram, fremgår det, at Prøve 1 & 2 (rød og sort linje) har lignende kromatogrammer til de, der observeres for NRAS Control Wild-Type og behøver ikke at blive sendt til DNA-sekvensanalyse. Bemærk, at for SURVEYOR Scan positive resultater, er sekventeringsresultatet det definitive resultat, da der kan være andre ikke-relevante mutationer, der kan resultere i de samme fragmentstørrelser. Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 27

15 Ydelseskarakteristika 15 Ydelseskarakteristika 15.1 Detektionsniveau af mutationer for SURVEYOR Scan kits Validering af SURVEYOR Scan kits for DHPLC platforme ved brug af plasmid kloner af alle indikerede mutationer har vist, at SURVEYOR Nuclease peaks kan detekteres i en blanding af 2-5% mutant i en Wild-Type baggrund. Automatiseret sekventeringsidentifikation af både forward og reverse strenge forfejler ofte at detektere mutationer ved niveauer under 10% i blandinger med Wild-Type DNA. Sammen med SURVEYOR Nuclease resultaterne er det muligt at fortolke de 5-10% mutant sekventeringelektroferogrammer med større sikkerhed. Hvis en prøveanalyse viser et SURVEYOR Scan positivt resultat, men der ikke er nogen detekterbar KRAS eller NRAS mutation med DNA-sekventering, anbefaler vi, at der registreres et Ingen variant detekteret resultat. Se Arbejdsflowovervejelser for yderligere information. 15.2 Sekvensbekræftelse Fortsæt med sekvensbekræftelse for alle SURVEYOR Scan positive resultater for at bestemme KRAS eller NRAS Exon 2, 3 eller 4 mutationens sekvensidentitet. Figur 11 er et eksempel på vigtigheden af sekvensbekræftelse for at bestemme den præcise mutation. Gå ikke videre til sekvensbekræftelse, hvis SURVEYOR Scan havde et negativt resultat. Prøven kan rapporteres som Wild-Type eller ingen variant detekteret. De Universal Sequencing Primers, der er inkluderet i dette kit, er beregnet til at blive anvendt til sekvensbekræftelse. Forward primeren er PN 710153F (Universal Sequencing Primer 1) og reverse primeren er PN 710153R (Universal Sequencing Primer 2). Prøve 1: G13C Prøve 2: G13D Figur 11 Sekvensanalyse af prøver med det samme KRAS Exon 2 SURVEYOR Nuclease fordøjelsesmønster. Prøve 1 og 2 ovenfor viste det samme DHPLC peakmønster efter SURVEYOR Nuclease fordøjelse og blev yderligere analyseret med DNA-sekventering. Sekventeringen viser, at det er 2 forskellige mutationer; G13C og G13D. Disse prøver illustrerer (a) SURVEYOR Nucleases evne til at detektere potentielle mutationer og (b) dens manglende evne til at bestemme den præcise placering, eller den specifikke baseændring af en mutation/mutationer, der er tilstede i en testprøve. Bemærk: Det er vigtigt, at kontrollere for fravær af stempel -sekvensen i hvert eneste sekventering-elektroferogram for at bekræfte, at mutationen ikke er resultatet af kontaminering af prøven med en af kittets kontroller. Bemærk: Hvis testprøven er Wild-Type ved den/de relevante codon(s) af interesse og den stemplede sekvens er tilstede, er testprøven kontamineret og skal reanalyseres. Tilstedeværelse af stemplet indikerer, at testprøven kunne være kontamineret med en af kittenes Wild-Type Controls; denne kontaminering kunne maskere en lavniveau-mutation, der er tilstede i testprøven. Se A.2 Kontrol DNA stempler for oplysninger om kontrollernes stempel-sekvenser. Brugsanvisning for CRC RAScan kit med DHPLC systemer Side 28

15 Ydelseskarakteristika 15.3 Analyseprocedurebegrænsninger Kontaminerende substanser, der overføres fra ektraktion af formalin-fikserede, paraffinindlejrede prøver, kan interferere med PCR-amplifikationen og SURVEYOR Nuclease fordøjelsesprocedurerne. De kvalitetskontrolprocedurer, der er beskrevet i Kvalitetskontrol af PCR-produkter, vil sikre, at det ekstraherede DNA er egnet til brug i dette kit. Dette kit er blevet valideret til analyse af formalinfikserede, paraffinindlejrede colorectale cancertumor-prøver. Det er ikke blevet valideret til diagnostisk brug for andre cancer-typer eller med friske eller frosne biopsiprøver. For problemløsning af ikke-standard resultater og faktordetaljer, som kan påvirke denne analyse, henvises der til Appendiks B - Problemløsningsguide nedenfor. Man skal være omhyggelig med at undgå overførsel og krydskontaminering med dette kit. Analysemetodens ekstreme sensitivitet kræver, at der træffes forholdsregler ved de følgende punkter: Sørg for, at alle prøver håndteres således, at der ikke kan ske krydskontaminering prøver imellem. Der skal arbejdes i en PCR-arbejdsstation eller et andet passende sted, hvor arbejdsområdet kan blive udsat for UV-lys før opstilling af PCR-amplifikationsreaktionerne. Brug en separat PCR-arbejdsstation eller et separat rum til åbning af prøverne efter PCRamplifikationen for kvalitetskontrol med gelelektroforese. SURVEYOR Nuclease fordøjelsesopstilling skal udføres i et separat rum eller en anden PCR-arbejdsstation end den, hvor den initiale PCR blev opstillet. Sørg for, at kittets plasmid-kontroller håndteres separat fra testprøverne på alle analysens trin. o Sørg for, at alle opløsninger, uden template-kontrol og prøve-dna brønde er påført hætter, før rørene, der indeholder kontrol plasmid DNA'er åbnes. o o HÅNDTER KONTROLLER TIL SIDST. Tilsæt først kontrol plasmid-dnaerne til de behørige rør, NÅR ALLE uden template-kontrol og prøvebrønde er blevet påsat hætte. Efter påsætning af hætter på kontrol DNA-rørene skal ALLE rør og hætter aftørres med et DNA-dekontamineringsmiddel (som fx 10% blegemiddel) før overførsel til et andet område. Sørg for, at der ved pipettering af prøver i 96-brønds plader ikke tillades prøvekontaminering af tilstødende brønde pga. enten stænkning under blanding eller ved ikke at skifte pipettespidser. Brugsanvisning for CRC RAScan kit med DHPLC systemer Side 29

Appendiks A Appendiks A A.1 Pladelayout-plan for SURVEYOR Scan kits Den pladelayout-plan, der er foreslået nedenfor, er til udførelse af SURVEYOR Scan analyse af alle syv KRAS og NRAS Exons samtidigt på 10 prøver. Nøgle: Ex = Exon; WT = Wild-Type; Mut = Mutation; NTC = Uden template-kontrol. A.2 Kontrol DNA stempler Sekvenser med et Stempel er anført nedenfor. Nøgle: De mest almindelige mutationsregioner er fremhævet med Lilla. Sekvens med STORE bogstaver er kodende base; sekvens med små bogstaver er ikke-kodende base. Kontrollerne har genetisk stempel fremhævet med Gult; denne variation fra KRAS eller NRAS Wild-Type sekvensen i en region, der ikke forventes at have mutationer, kan bruges til at problemløse prøvekontaminering med Positive Controls. Se Appendiks B - Problemløsningsguide, Problem 8, for et eksempel på et SURVEYOR Scan spor af en sådan kontaminering. KRAS Exon 2 Stempel Amplikonstørrelse: 190 bp. For dannelse af KRAS Exon 2 kontrol plasmids genetiske stempel ændres TAT til ATA. Codon 12 og 13 er ligeledes fremhævet nedenfor. GCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAAATAGAT KRAS Exon 3 Stempel Amplikonstørrelse: 200 bp. For dannelse af KRAS Exon 3 kontrol plasmids genetiske stempel ændres ACC til TGG. Codon 59 og 61 er ligeledes fremhævet nedenfor. GAATGGTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG KRAS Exon 4A *Stempel Amplikonstørrelse: 168 bp. For dannelse af KRAS Exon 4A kontrol plasmids genetiske stempel ændres AGA til TCT. Codon 117 er ligeledes fremhævet nedenfor. AATAAATGTGATTTGCCTTCTAGAACAGTTCTCAC Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 30

Appendiks A KRAS Exon 4B Stempel Amplikonstørrelse: 194 bp. For dannelse af KRAS Exon 4B kontrol plasmids genetiske stempel ændres agt til tca. Codon 146 er ligeledes fremhævet nedenfor. TCAGCAAAGACAAGACAGgtatcaaac NRAS Exon 2 Stempel Amplikonstørrelse: 236 bp. For dannelse af NRAS Exon 2 kontrol plasmids genetiske stempel ændres aca til tgt. Codon 12 og 13 er ligeledes fremhævet nedenfor. ccatgtggttcttgctggtgtgaaatgactgagtacaaactggtggtggttggagcaggtggtgtt NRAS Exon 3 Stempel Amplikonstørrelse: 203 bp. For dannelse af NRAS Exon 3 kontrol plasmids genetiske stempel ændres GAC til CTG. Codon 59 og 61 er ligeledes fremhævet nedenfor. ACAGCTGGACAAGAAGAGTACAGTGCCATGAGACTGCAA NRAS Exon 4 Stempel Amplikonstørrelse: 233 bp. For dannelse af NRAS Exon 4 kontrol plasmids genetiske stempel ændres CAA til GTT. Codon 117 og 146 er ligeledes fremhævet nedenfor. AACAAGTGTGATTTGCCAACAAGGACAGTTGATACAAAAGTTGCCCACGAACTGGCCAAGAGTTACGGG ATTCCATTCATTGAAACCTCAGCCAAG A.3 Denaturering HPLC (DHPLC) systemkrav A.3.1 DHPLC Specifikationer for SURVEYOR SCAN applikationer De følgende specifikationer er minimumskravene for DHPLC systemspecifikationer for udførelse af SURVEYOR Scan KRAS & NRAS kit analyser. Højtydende gradientsolvens-leveringssystem (High Performance Gradient Solvent Delivery System) Binær gradient-kapabilitet; højt tryk eller lavt tryk Flowhastighedskontrol, minimumsområde: 0,7 1,6 ml/min Flowhastighedsnøjagtighed: ± 2% (H 2 O ved 20 ºC) Solvensafgasser Autosampler Temperaturkontrol til kølige plader, indstillelig: 4 to 14 ºC Injektionsvolumen: 5 50 µl Separationscartridge Designet til dsdna fragmentstørrelse-separation, fragmentstørrelser 50 bp til 250 bp Ovn med højpræcision-temperaturkontrol Temperaturområde: 40 to 70 ºC Temperaturpræcision: ± 0,2 ºC Temperaturreproducerbarhed: ± 0,2 ºC Linearitet over det samlede temperaturområde: ± 2,0 ºC Detektionsalternativ 1 UV/VIS-detektor Bølgelængdeområde: 190 700 nm UV-kilde: Deuterium-lampe Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 31

Appendiks A Detektionsalternativ 2 Fluorescerende detektor Bølgelængdeområde: excitation: 200 850 nm; emission: 250 900 nm Fluorescens-kilde: 150W Xenon-lampe Fluorescerende farvestof-pumpe Fast flowhastighed på 0,1 ml/min 20%/+50% Lavt pulserende flow A.3.2 Systemdrift For opsætning og drift af DHPLC system, se og følg producentens anbefalinger for analyse af dsdna fragmenter, der er i størrelsesområdet 50 bp til 250 bp, med tilsigtet størrelsesdiskrimination på 10 bp eller bedre. Dette er størrelsesområdet for fragmenter efter SURVEYOR Nuclease fordøjelse ved brug af dette kit. For vejledning om foreslåede DHPLC systemgradientindstillinger til analysering af SURVEYOR Nuclease fordøjelser, se venligst http://world.transgenomic.com/diagnostic-tools/genetic-analysiskits/crc-rascan-kits-eu/dhplcsystemsettings. A.3.3 Vedligeholdelse af DHPLC Cartridges For vedligeholdelse af DHPLC cartridges følg producentens anbefalinger. Bemærk: analyse af SURVEYOR Nuclease reaktioner vil kræve mere hyppige og strengere rengøringsprotokoller end dem for standard PCR-prøveanalyse. Der henvises til DHPLC systemets retningslinjer for yderligere information. Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 32

Appendiks A A.4 Laboratorieopstilling for PCR-analyser For at producere pålidelige og kontamineringsfri PCR-resultater skal god laboratoriepraksis følges når PCR-laboratorielayoutet designes. Ved planlægning af laboratoriearrangement skal behovet for spatial separation af PCRamplifikationsopstilling og postamplifikation-aktiviteter tages i betragtning. Det er vigtigt at separere (i) DNA isolering: (ii) PCR-amplifikation; og (iii) Post-PCR-aktiviteter såsom åbning af rør, der indeholder amplificerede prøver som forberedelse på kørsel af geler og opstilling af andre analyser som fx SURVEYOR Nuclease fordøjelser og DNA-sekventering. Det er også vigtigt, at have laboratoriematerialer og -udstyr, der er dedikeret til hvert enkelt område og kun må anvendes i det pågældende område. Aftørring af overflader med 10% (v/v) blegemiddel, der friskfremstilles en gang om ugen, vil hjælpe med til at eliminere DNA-fragmenter 500 bp som templates for PCR. Det kan ydermere være nyttigt at behandle plastikudstyr og opløsninger ved at udsætte det i 7 10 minutter med kortbølge-uv-lys med en UV-crosslinker. Bemærk: enzymer og DNA, der skal amplificeres må ikke behandles med UV-lys. Ved at bruge behørigt beskyttelsestøj, skifte handsker hyppigt og aftørre sine behandskede hænder med 10% (v/v) blegemiddelopløsning, før man går til en arbejdsstation, vil man bistå meget til at reducere kontaminering. Som minimum skal der være en opstilling, der ligner To-rums arrangementet i diagrammet nedenfor, der er designet specifikt for PCR og analyse med SURVEYOR Nuclease. Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 33

Appendiks A A.5 Litteraturhenvisninger 1. Amgen News Release (2013) New analyses identify predictive biomarkers for Vectibix (panitumumab) in patients with metastatic colorectal cancer. http://wwwext.amgen.com/media/media_pr_detail.jsp?-year=2013&releaseid=1820728 2. Peeters M et al (2013) Massively parallel tumor multigene sequencing to evaluate response to panitumumab in a randomized phase III study of metastatic colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 1902-12. 3. De Roock W et al (2010) Association of KRAS p.g13d mutation with outcome in patients with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. JAMA 304 1812-20. 4. Peeters M et al (2013) Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic colorectal cancer: assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to panitumumab. J Clin Oncol. 31 759-65. 5. Andre T et al (2013) Panitumumab combined with irinotecan for patients with KRAS wildtype metastatic colorectal cancer refractory to standard chemotherapy: a GERCOR efficacy, tolerance, and translational molecular study. Ann Oncol. 24 412-9. 6. Loupakis F et al (2009) KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer. Br J Cancer 101 715-21. 7. De Roock W et al (2010) Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol. 11 753-62. 8. Qiu P et al (2004) Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques 36 702-707 9. Kuang Y et al (2009) Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15 2630-6 10. Mitani N et al (2007) Surveyor nuclease-based detection of p53 gene mutations in haematological malignancy. Ann. Clin. Biochem. 44 557-9 11. Engelman JA et al (2006) Allelic dilution obscures detection of a biologically significant resistance mutation in EGFR-amplified lung cancer. J. Clin. Invest. 116 2695-2706 Se ligeledeshttp://world.transgenomic.com/files/literature/482146.pdf for henvisninger til SURVEYOR Nuclease og dets applikationer. Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 34

Appendiks B Appendiks B Problemløsningsguide Effektiv brug af SURVEYOR Scan kits for DHPLC afhænger af korrekt fuldførelse af en række trin. Et af det mest kritiske er PCR-amplifikation, der skal resultere i produktionen af specifikke DNA'er af ensartet størrelse i tilstrækkelig kvantitet til at blive detekteret efter hybridisering og kløvning. Dette er igen afhængig af kvaliteten af den oprindelige prøve. Udførelse af analysen med DNA, der ikke opfylder kvalitets- og kvantitetskriterierne, anbefales ikke. Bemærk: Hvis det er første gang, du bruger SURVEYOR Nuclease, skal du udføre de eksperimenter, der er beskrevet i afsnittet Sådan anvendes Kontrol Plasmid DNAer efter du har læst og forstået afsnittet Trin-for-trin vejledning. Sørg for at have resultaterne fra Kontrol Plasmid DNA'erne ved hånden, før du kontakter Transgenomic Technical Support. Denne Problemløsningsguide dækker en række spørgsmål, som du kan komme ud for ved brug af SURVEYOR Scan kits for DHPLC og forslag til, hvordan de kan løses. De viste eksempler er fra både KRAS og NRAS exons. Konsultér DHPLC systemets instrumentmanual for detaljeret information om instrumentets drift og vedligehold. Manualen indeholder specifikke procedurer for tjek og opretholdelse af kolonneydelse og inkluderer problemløsningsinformation. Problem 1 Lavt PCR udbytte eller intet PCR produkt ved analyse på agarosegel LAVT PCR UDBYTTE Godt PCR udbytte Ringe PCR udbytte MULIG ÅRSAG Ringe kvalitet af DNA template For meget RNA i prøven vil overestimere DNAkoncentrationen Termocykler ikke kalibreret Ikke nok template LØSNING Gentag rensning af DNA; evaluér den anvendte rensningsmetode. Hvis FFPEekstraheret DNA er for fragmenteret, kan andre FFPE-blokke være påkrævet. Gentag RNase-behandling af DNA-prøven og gentag rensning af DNA. Udfør kalibrering af termocykler. Forøg mængden af template. RNA bånd Bemærk: Højkvalitets DNA fra FFPE skal anvendes. DNAet skal have en koncentration på 25 ng/µl, som bestemt ved absorbans ved 260 nm, have et absorbansforhold ved 260/280 nm på over 1,8 og være større end 90% DNA (dvs. fri for de fleste trna- og rrna-kontamineringer som bedømt ved udseende på en agarosegel). DNA prøver skal opbevares ved mellem -20 C og -80 C. Analyse af DNA-template ekstraheret fra paraffinindlejret væv kræver, at der træffes adskillige forholdsregler. Det ekstraherede DNA kan behandles med uracil DNA glycosylase for at forhindre amplifikation af DNA fragmenter, der indeholder deamineret C-rester. Ofte vil en høj procentdel af det A 260 adsorberende materiale, der ekstraheres fra paraffinindlejret væv, ikke blive amplificeret særlig godt under PCR. Brug af en større mængde starting DNA vil ofte hjælpe til at producere et passende amplifikationsprodukt. En anden overvejelse ville være at vælge FFPE-tumorsektioner med en høj procentdel af tumorceller. Mikrodissektion kan også anvendes, men dette er en tidskrævende mulighed og ville ikke blive anbefalet til generel laboratorietestning. Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 35

Appendiks B Problem 2 Flere PCR-produkter ved analyse på agarosegel FLERE PCR-PRODUKTER MULIG ÅRSAG LØSNING Godt PCR udbytte Flere bånd PCR Annealingtemperatur for lav Tjek kalibrering af termocykler. Bemærk: PCR skal producere et tilstrækkeligt højt udbytte (større end 20 ng/µl) af en ENKELT amplificeret art af den korrekte størrelse. Den DNA Polymerase og DNA Polymerase 10X PCR Buffer, der er inkluderet i dette kit, skal bruges til PCR. Amplikoner fra Kontroller skal fordøjes med SURVEYOR Nuclease og køres i parallel, så falsk baggrundsstøj ekskluderes ved visuel sammenligning af elektroferogramprofiler (se Eksempler på resultater, Figur 4-10). Undersøg hvert enkelt amplificeret DNA-produkt før fordøjelse med gelelektroforese (eller med DHPLC systemanalyse) for at sikre, det er en enkelt art af den forventede størrelse. Problem 3 Ingen kløvningsprodukter observeret ved analyse efter SURVEYOR Nuclease behandling af heteroduplexer INGEN KLØVNINGSPRODUKTER MULIG ÅRSAG LØSNING Position for manglende heteroduplexer Følg korrekt PCR og hybridiseringsprocedure. Brug frisk hybridiseret DNA i SURVEYOR Nuclease fordøjelser. Udfør ny PCRamplifikation ved brug af (1) samme DNAtemplate kvantitet; (2) forøgelse af starting DNA; eller (3) isolering af frisk DNA fra samme eller forskellig FFPEsektion. Ikkeafskårent homoduplex peak Proportion af mismatch-target for lav Ineffektiv dannelse af heteroduplexer Inaktiv SURVEYOR Nuclease Tjek analyse med Kontroller. Udfør Positive Control reaktion for at verificere enzymydelse. Brug kun frisk tilberedte SURVEYOR Nuclease Masterblandinger. Bemærk: SURVEYOR Nuclease kløver hovedsageligt ved mismatches i heteroduplexer. Proportionen af heteroduplex til homoduplex i den hybridiserede prøve vil bestemme størrelsen af Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 36

Appendiks B SURVEYOR Nuclease fordøjelsessignalet. Hvis KRAS eller NRAS mutationen er tilstede ved en meget lav koncentration i den genomiske DNA-prøve, kan signalet være for lavt til at give et positivt resultat. Det er vigtigt at sikre, at hybridiseringstrinnet er inkluderet i termocyklerprogrammet (se Amplifikationsprotokol) for at maksimere effektiviteten af heteroduplex-dannelse. Heteroduplexer dannes meget ineffektivt under standard PCR-reaktioner. Bemærk: signal-til-støj forholdet er generelt højt nok til at detektere mutationer tilstede ved en lav procendel af den totale DNA-template; det er muligt at detektere så lavt som 2% mutant DNA. Figur 4-10 viser de fordøjelsesprodukter, der dannes med homoduplex og heteroduplex KRAS og NRAS Positive Control DNAer (inkluderet i dette kit) og FFPE-prøver på et WAVE DHPLC 4500 System. Kløvningsprodukterne ses klart som to nye peaks, der eluerer med de forventede størrelser, der kan estimeres relativt til DNA-størrelsesmarkøren. Forsigtig: kommercielt tilgængelige PCR-buffere varierer dramatisk i indhold og formuleringerne er ofte ikke defineret af leverandørerne. Adskillige buffere er IKKE kompatible med SURVEYOR Nuclease pga. ph eller tilstedeværelse af additives, surfaktanter eller andre proprietære indholdsstoffer. Der MÅ IKKE anvendes andre polymerase eller 10X polymerase-buffere end de, der er inkluderet i kittet. Problem 4 Høj baggrund efter SURVEYOR Nuclease behandling HØJ BAGGRUND MULIG ÅRSAG LØSNING Suboptimalt hybridiseringstrin Gør følgende: 1. Sørg for, at DNAkoncentrationen er i området >25 ng/µl. 2. Gentag heteroduplexdannelsetrinnet og vær omhyggelig med at følge den anbefalede procedure; se 12.7.1. DHPLC Gennemstrømning Prøve med støjende baseline DHPLC vask DNA-mængde for lav Non-specifikke PCRprodukter SURVEYOR Enhancer W2 og/eller SURVEYOR Enhancer Cofactor har mistet aktivitet Tjek udbytte og kvalitet af template-dna Tjek udbytte og kvalitet af template-dna. Tjek kittets udløbsdato. Bemærk: SURVEYOR Nuclease kan sommetider bryde (nick) dobbeltstrenget DNA på tilfældigt matchede steder. Dette producerer baggrund efter fordøjelse. Denne aktivitet undertrykkes af SURVEYOR Enhancer W2 og dets Cofactor uden nogen anden negativ indvirkning på mismatchkløvningsreaktionen. SURVEYOR Enhancer W2 og SURVEYOR Enhancer Cofactor er inkluderet i dette kit og skal altid anvendes. Hvis denne brydning (nicking) stadig forekommer, vil den generere mindre peaks på DHPLC systemet. Wild-Type Control fordøjelse vil fremvise de samme mindre peaks. Denne sammenligning bruges til at se efter forskelle i elektroferogrammønstrene mellem Wild-Type Control og testprøven og bruges ved sammenligning af mønstret for testprøven og for Wild-Type Control. Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 37

Appendiks B Problem 5 SURVEYOR Nuclease fordøjelsespeaks i negative kontroller FORDØJELSESPEAKS I NEGATIVE KONTROLLER DHPLC Gennemstrømning Svagt signal fordøjelsespeaks i Wild-Type Control Ikkeafskårent homoduplex peak DHPLC vask MULIG ÅRSAG Kontaminering af kitindhold med KRAS eller NRAS amplikoner eller plasmid-kontroller. Problem 6 Mislykkede SURVEYOR Nuclease resultater LØSNING Bortskaf alle kitkomponenter og brug et nyt kit. Kontakt Transgenomic Technical Support for at diskutere potentielle kontamineringsårsager og -kilder. SURVEYOR NUCLEASE FORDØJELSE AF POSITIVE KONTROLLER ER MISLYKKET MULIG ÅRSAG LØSNING Ingen tydelige fordøjelsespeaks Ikkeafskårent homoduplex peak SURVEYOR Nuclease blev ikke tilsat SURVEYOR Nuclease fordøjelse blev udført ved forkert temperatur Fordøj en ny prøve Fordøj en ny prøve Problem 7 Uforventede peaks i SURVEYOR Nuclease fordøjelsesspor SURVEYOR NUCLEASE FORDØJELSE AF POSITIVE CONTROLS ER MISLYKKET MULIG ÅRSAG LØSNING Ikkeafskårent homoduplex peak Mutation tilstede i usædvanlig position Sekventer prøven for at verificere mutation Uforventet fordøjelsespeak DHPLC Gennemstrømning Forventede fordøjelsespeaks DHPLC vask Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 38

Appendiks B Problem 8 Kontaminering af prøver med Positive Controls FORDØJELSESMØNSTRE ER KONSISTENTE MED TILSTEDEVÆRELSE AF BLANDEDE POSITIVE CONTROLS STEMPLEDE REGION OG WILD-TYPE HETERODUPLEXER Prøve 1 Prøve 2 Prøve 3 MULIG ÅRSAG Ringe pipetteringsteknik LØSNING Man skal være omhyggelig ved pipettering af prøverne for at undgå krydskontaminering. Tjek kontrolstempelsekvensregioner for Positive Control kontaminering. Sekventering, der afslører NRAS Exon 2 stempelregioner, der kontaminerer en testprøve. Codon 12 og 13 region af NRAS Exon 2 Kontrol plasmid Stempel region af NRAS Exon 2 Prøve er Wild-Type Stempel-sekvens er tilstede Kontamineret Prøve er mutant Ingen stempelsekvens Ringe pipetteringsteknik Man skal være omhyggelig ved pipettering af prøverne for at undgå krydskontaminering. Tjek kontrolstempelsekvensregioner for Positive Control kontaminering. Prøve er Wild-Type Ingen stempel-sekvens er tilstede Gyldig prøve Brugsanvisning for CRC RAScan Combination Kit med DHPLC systemer Side 39