PLATELIA TM TOXO IgG TMB 96 TEST 72741

PLATELIA TM TOXO IgG TMB 96 TEST 72741 KIT TIL KVALITATIV/KVANTITATIV KONSTATERING AF ANTI-TOXOPLASMA GONDII IgG I HUMANT SERUM ELLER PLASMA MED ENZYMIMMUNANALYSE IVD Til in vitro-diagnosticering Alle de produkter, der produceres og markedsføres af Bio-Rad, gennemgår et komplet kvalitetssikringssystem fra modtagelsen af råmaterialerne til markedsføringen af slutproduktet. Hvert parti sendes til kvalitetskontrol og frigives kun til markedet, hvis det opfylder de fastsatte godkendelseskriterier. Registreringen af produktionen og kontrollen af de enkelte partier opbevares i virksomheden.

INDHOLDSFORTEGNELSE 1 - FORMÅL.............................................143 2 - KLINISK VÆRDI........................................143 3 - PRINCIPPER FOR PROCEDUREN.............................144 4 - INDHOLDET AF KITTET...................................144 5 - FORHOLDSREGLER OG ADVARSLER..........................146 6 - NØDVENDIGT MATERIALE, DER IKKE MEDFØLGER...............148 7 - FORBEREDELSE OG OPBEVARING AF REAGENSER...............148 8 - PRØVEMATERIALE......................................149 9 - ANALYSEPROCEDURE....................................150 10 - BEREGNING OG FORTOLKNING AF RESULTATERNE............152 11 - YDEEVNE OG BEGRÆNSNINGER FOR TESTEN................154 12 - REFERENCER.........................................158 142

1 - FORMÅL Platelia TM Toxo IgG TMB er et in-vitro diagnosticeringstestkit, der muliggør kvalitativ og kvantitativ konstatering af anti-toxoplasma gondii IgG i humant serum eller plasma. 2 - KLINISK INTERESSE T. gondii er et protozo, der fremkalder infektion hos et stort antal pattedyr og fugle. Toxoplasmosis, som ofte findes hos mennesker og dyr, er for det meste skjult. Udbredelsen af denne infektion i befolkningen påvises ved hjælp af serologiske test og kan variere, afhængigt af oprindelseslandet og alderen. Toxoplasmosis under graviditet er impliceret i alvorlige tilfælde af medfødte abnormiteter (især svækkede hjernefunktioner) og til tider dødfødte børn. Påvisning af Toxo IgG-antistof hos kvinder før en befrugtning giver sikkerhed for, at fosteret beskyttes mod eventuel toxoplasmosis under graviditeten. Tendens til alvorlig toxoplasmosis-infektion er almindelig hos personer, der er konstateret positive for AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome), eller som på anden vis har et nedsat immunforsvar. Disse infektioner skyldes hovedsagligt reaktivering af T. gondii-cyster, der var til stede før HIVinfektionen. Specifik diagnosticering af T. gondii-infektion kan være kompliceret, og parasitten selv bliver sjældent isoleret. Serologisk bekræftelse af T. gondiiantistoffer angiver, at patienten har været indikativ for eksponering for parasitten og er blevet bredt accepteret som en metode til at bestemme immunstatus og modtagelighed for infektion. Screening af flere isotyper muliggør enten datering af T. gondii og implementeringen af den rette behandling i tilfælde af en nylig infektion eller forslaget om profylaktiske anbefalinger: retningslinjer for hygiejne og kost til gravide kvinder, kemoprofylaxi i grupper med nedsat immunforsvar. 143

3 - ANALYSEPRINCIP Analyseprincippet for denne analyse er en enzymimmunanalyseteknik med fast fase, som kaldes en indirekte ELISA. Det T.gondii-antigen, der anvendes til at belægge mikrotiterpladen, kommer fra tachyzoitultrasonat, der er beriget med membranproteiner. Konjugatet består af et peroxidasemærket monoklonalt antistof, der er specifikt mod humane gammakæder. Første trin Fortyndede prøver placeres i brønde på mikrotiterpladen, som er belagt med T. gondii-antigen. Under inkubationen i en time ved 37 C binder T. gondii-antistofferne i prøven sig til det T. gondii-antigen, brøndene på mikrotiterpladen er belagt med. Efter inkubationen fjernes de ubundne immunglobuliner og serumproteiner ved vask. Andet trin Konjugatet (peroxidasemærket monoklonalt antistof, der er specifikt mod humane gammakæder) tilsættes brøndene på mikrotiterpladerne. I løbet af en anden inkubation på en time ved 37 C, binder de peroxidasemærkede monoklonale antistoffer sig til IgG antistoffets- T. gondii-antigenkomplekser, der er bundet til brøndene på mikrotiterpladen. Det ubundne konjugat fjernes ved vask. Tredje trin Forekomsten af immunkomplex (T. gondii Ag, anti-t. gondii IgG, anti IgGkonjugat) påvises ved tilsætningen af en opløsning, der indeholder et peroxidasesubstrat og et kromogen, der igangsætter en farveudviklingsreaktion. Fjerde trin Efter en halv times inkubation ved stuetemperatur, standses den enzymatiske reaktion ved at tilsætte en syre, H2SO4 1N. Den optiske densitetsaflæsning, som opnås med et spektrofotometer, der er indstillet til 450/620 nm, er proportional med den mængde T. gondii IgG-antistof, der findes i prøven. Aflæsningen konverteres til IU/ml ved hjælp af en standardkurve. Kalibratorsera (R4a, R4b og R4c) er kalibreret over for WHO-standarden (TOXM 185). 4 - INDHOLDET AF KITTET Alle reagenser er udelukkende til in vitro-diagnosticering. 144

Etiket Reagenstype Præsentation R1 Microplate Mikrotiterplade: 12 strimler á 8 aftagelige brønde, 1 plade belagt med T.gondii-antigener (RH-stamme). R2 Concentrated Koncentreret vaskeopløsning (10x): 1 flaske Washing TRIS-NaCl-buffer (ph 7,4), 1 % Tween 20. 100 ml Solution Konserveringsmiddel: 0,01% Thimerosal. R3 Calibrator 0 Kalibrator 0: Humant serum, der ikke erreaktivt over for 1 flaske T. gondii-antistoffer, hepatitis B-overfladeantigen (HBs Ag), 1ml HIV1/HIV2-antistoffer (Human Immunodeficiency Virus) og hepatitis C-antistoffer (HCV). Konserveringsmiddel: < 0,01 % Thimerosal R4a Calibrator 6 Kalibrator 6 IU/ml: TRIS-NaCl-buffer (ph 8 ± 0,2), humant serum, 1 flaske der er reaktivt over for T. gondii-antistoffer og ikke-reaktivt over for 1 ml hepatitis B-overfladeantigen (HBs Ag), HIV1/HIV2-antistoffer (Human Immunodeficiency Virus), hepatitis C-antistoffer (HCV), bovin serum albumin, glycerol, E102 og E122. Konserveringsmiddel: < 0,01% Thimerosal og < 0,5 % Proclin 300. R4b Calibrator 60 Kalibrator 60 IU/ml: TRIS-NaCl-buffer (ph 8 ± 0,2), humant 1 flaske serum, der er reaktivt over for T. gondii-antistoffer og ikke-reaktivt over 1 ml for hepatitis B-overfladeantigen (HBs Ag), HIV1/HIV2-antistoffer (Human Immunodeficiency Virus), hepatitis C-antistoffer (HCV), bovin serum albumin, glycerol, E102 og E122. Konserveringsmiddel: < 0,01% Thimerosal og < 0,5 % Proclin 300. R4c Calibrator 240 Kalibrator 240 IU/ml: TRIS-NaCl-buffer (ph 8 ± 0,2), humant 1 flaske serum, der er reaktivt over for T. gondii-antistoffer og ikke-reaktivt 1 ml over for hepatitis B-overfladeantigen (HBs Ag), HIV1/HIV2-antistoffer (Human Immunodeficiency Virus), hepatitis C-antistoffer (HCV), bovin serum albumin, glycerol, E102 og E122. Konserveringsmiddel: < 0,01% Thimerosal og < 0,5% Proclin 300. R6 Conjugate Konjugat: Peberrodperoxidasemærket murint monoklonalt 1 flaske (50x) antistof mod humane gammakæder. Koncentreret (50x). 0,6 ml R7 Diluent Prøve og konjugatfortynder: 2 flasker TRIS-NaCl-buffer (ph 7,7 ± 0,15), bovin serum 80 ml albumin, 0,1% Tween 20 og fenolrød. Konserveringsmiddel: < 0,01% Thimerosal. R8 TMB Substratbuffer: 1 flaske Substrate Opløsning af citronsyre og natriumacetat med ph 60 ml Buffer 4,0, som indeholder 0,015% H2O2 og 4% DMSO. R9 Chromogen: Kromogen: 1 flaske TMB Solution Opløsningmed tetrametylbenzidin (TMB). 5 ml R10 Stopping Stopopløsning: 1 flaske Solution 1N-svovlsyreopløsning 28 ml Selvklæbende film 4 145

5 - FORHOLDSREGLER OG ADVARSLER 146 Forholdsregler Resultaternes pålidelighed afhænger af en korrekt implementering af følgende regler for god laboratoriepraksis: Undgå at anvende forældede reagenser. Bland ikke reagenser fra forskellige partier i samme testkørsel. Bemærk! Det er muligt at bruge andre partier reagenser end dem der er leveret i dette kit under forudsætning af, at det samme parti bruges inden for hele testforløbet: vaskeopløsning (R2, etiketidentifikation: 10x farvet blå), substratbuffer (R8, etiketidentifikation: TMB-buffer, farvet blå), kromogen (R9, etiketidentifikation: TMB-opl., farvet grøn) og stopopløsning (R10, etiketidentifikation: 1N farvet rød). Disse reagenser kan anvendes sammen med en række andre produkter fra vores virksomhed. Kontakt vores tekniske serviceafdeling for detaljerede oplysninger. Det er nødvendigt at vente 30 minutter før brug, så reagenserne kan stabilisere sig ved stuetemperatur. Rekonstituer reagenserne forsigtigt for at undgå kontamination. Undgå at udføre testen i nærheden af reaktive dampe (syre, alkaliske dampe og aldehyddampe) eller støv, der kan påvirke konjugatets enzymaktivitet. Benyt engangsmateriale, eller hvis dette ikke er muligt, udstyr af glas, som er vasket grundigt og skyllet med demineraliseret vand. Undgå, at mikrotiterpladen tørrer mellem vask og fordelingen af reagens. Enzymreaktionen er meget følsom over for metalioner. Undgå derfor, at metalelementer kommer i berøring med de forskellige konjugat- eller substratopløsninger. Farvefremkaldeopløsningen (substratbuffer + kromogen) skal være farveløs. Hvis der forekommer en blå farvning nogle få minutter efter rekonstitueringen, kan reagensen ikke anvendes og skal udskiftes. Forberedelsen af denne opløsning kan udføres i en ny engangsplastikbakke eller en glasbeholder, der først er vasket med 1N HCI og derefter skyllet grundigt med destilleret vand og tørret. Opbevar opløsningen et mørkt sted. Brug en ny pipettespids til hver prøve. Grundig vask af mikrotiterpladen er et afgørende trin i proceduren:

Overhold det anbefalede antal vaskecykler, og kontroller, at alle brønde bliver helt fyldt og derefter helt tømt. Forkert vask kan medføre unøjagtige resultater. Brug aldrig den samme beholder til at fordele konjugat- og udviklingsopløsning. Kontroller, at pipetterne og andet udstyr er i orden og fungerer korrekt. Analyseproceduren må ikke ændres. Sundheds- og sikkerhedsmæssige forholdsregler Alle reagenserne i kittet er beregnet til in vitro-diagnosticering. Brug engangshandsker, når reagenser håndteres. Undgå at pipettere med munden. Humant kildemateriale, der er brugt til klargøring af reagenser, er blevet testet og fundet ikke-reaktivt for hepatitis B-overfladeantigen (HBs Ag), antistoffer til hepatitis C (HCV) og antistoffer mod HIV 1 og HIV 2 (Human Immunodeficiency Virus). Eftersom ingen metode kan give fuld garanti for fravær af smitsomme stoffer, skal reagenser af human oprindelse og patientprøverne håndteres som potentielt smittefarlige. Betragt alt materiale, der har været i direkte kontakt med prøver og reagenser af human oprindelse, samt vaskeopløsninger som smittefarligt materiale. Undgå at spilde prøver eller opløsninger, der indeholder prøvemateriale. Sspildes materiale, renses efter med natriumhypoklorit i en opløsning på 10%. Hvis den kontaminerende væske er en syre, skal det spildte materiale først neutraliseres med natriumbikarbonat, derefter renses med natriumhypoklorit og tørres op med sugende papir. Det materiale, der anvendes til rengøringen, skal kasseres og placeres i en affaldsbeholder til farligt afffald. Prøver, reagenser af human oprindelse og kontamineret materiale og produkter skal kasseres efter desinfektionen: - enten ved nedsænkning i natriumhypoklorit med en endelig koncentration på 5% natriumhypoklorit i 30 minutter, - eller ved autoklavering ved 121 C i mindst to timer. Autoklavering i min. én time ved 121 C er den bedste metode til deaktivering af HIV- og HB-vira. 147

ADVARSEL: UNDGÅ AT PLACERE OPLØSNINGER, DER INDEHOLDER NATRIUMHYPOKLORIT, I AUTOKLAVEN. ADVARSEL: Visse reagenser indeholder: *Pro Clin 300 < 0,5%: LOKAL IRRITERENDE R43: Kan give overfølsomhed ved kontakt med huden. S28-37: Kommer stof på huden vaskes straks med store mængder vand og sæbe. Brug egnede beskyttelseshandsker Xi-irriterende under arbejdet. Kemikalier skal håndteres og kasseres ifølge god laboratoriepraksis. Undgå, at hud og slimhinder kommer i kontakt med substratbufferen, kromogenet og stopopløsningen (fare for forgiftning, irritation eller ætsning). Sikkerhedsdataarket udleveres efter anmodning. 6 - NØDVENDIGT MATERIALE, DER IKKE MEDFØLGER Vortex-mixer. Mikrotiterpladelæser med filtre på 450 nm og 620 nm (*). Vandbad eller tilsvarende inkubator til mikrotiterplader med termostatindstilling til 37± 1 C (*). Beholder til farligt biologisk affald. Natriumhypoklorit og natriumbikarbonat. Destilleret eller demineraliseret vand. Graduerede cylinderglas med kapaciteter på hhv. 25, 50, 100 og 1.000 ml. Engangslatexhandsker. Beskyttelsesbriller. Sugende papir. Automatiske eller halvautomatiske, justerbare eller forudindstillede pipetter eller multipipetter til måling og fordeling af 10 1000 µl og 1, 2 og 10 ml. Manuel, halvautomatisk eller automatisk mikrotiterpladevasker (*). Engangsrør. (*) Kontakt os, hvis detaljerede oplysninger om det udstyr, der anbefales af vores tekniske afdeling ønskes. 7 - REKONSTITUERING OG OPBEVARING AF REAGENSER Kittet skal opbevares ved 2 8 C indtil udløbsdatoen på pakken. Bemærk! Lad reagenserne stabilisere sig ved stuetemperatur (18 30 C), før de anvendes. 148

1) Brugsklare reagenser Reagens 1 (R1): mikrotiterplade Hver bakke indeholder 12 strimler á 8 aftagelige brønde i en forseglet foliepose. Klip posen op med en saks eller skalpel 0,5 1 cm over linjen. Læg straks de ubrugte teststrimler tilbage i posen. Efter åbning er strimlerne holdbare i en måned hvis posen lukkes omhyggeligt, og opbevaresn ved 2 8 C.. Reagens 3 (R3), Reagens 4a (R4a), Reagens 4b (R4b), Reagens 4c (R4c), Reagens 10 (R10): Reagenserne er holdbare indtil udløbsdatoen på etiketten, hvis de opbevares ved 2 8 C (også efter åbning). 2) Reagenser til rekonstituering Reagens 2 (R2): Koncentreret vaskeopløsning 10x Opløs reagensen i forholdet 1:10 i destilleret vand for at opnå en brugsklar opløsning (R2d). Forbered 350 ml til en enkelt plade med 12 teststrimler med manuel afvaskning. Holdbar i to uger efter fortyndingen ved 2 8 C. Den koncentrerede opløsning kan opbevares ved 2 25 C. Konjugatopløsning: Reagens 6 (R6) + Reagens 7 (R7) Til en enkelt mikrotiterplade, fortyndes 0,5 ml 50x konjugatkoncentrat i 25 ml fortynder (R7) for at opnå brugsopløsningen. Bland grundigt. Del disse mængder i 10 for at opnå den nødvendige volumen til en teststrimmel med 8 brønde. Brug konjugatbrugsopløsningen (R6d) inden for 60 minutters efter fremstilling. Farvefremkaldeopløsning: Reagens 8 (R8) + Reagens 9 (R9) Opløs kromogenet (R9) i forholdet 1:11 i buffersubstratet (R8) (f.eks.: 1 ml reagens R9 + 10 ml reagens R8). Reagenserne kan opbevares et mørkt sted i op til 6 timer ved stuetemperatur (18 30 C) efter fortynding. 8 - PRØVETAGNING 1.Serum eller plasma (EDTA, citrat og heparin) anbefales som prøvetyper. 2.Følg nedenstående anbefalinger for håndtering, behandling og opbevaring af blodprøver: Indsaml alle blodprøver under overholdelse af de generelle forholdsregler for venepunktur. 149

Lad serumprøverne størkne fuldstændigt, før de centrifugeres. Sørg for, at rørene altid er lukkede. Adskil serummet eller plasmaet fra de koaglet eller de røde blodlegemer i et tæt tillukket opbevaringsrør efter centrifugeringen. Prøverne kan opbevares ved 2 8 C, hvis screeningen udføres inden 7 dage. Hvis analysen ikke udføres inden for 7 dage, eller prøverne skal sendes, skal de nedfryses til mindst -20 C. Optø prøverne højst tre gange. Tidligere nedfrosne prøver skal blandes grundigt efter optøning, før testen udføres. 3. Prøver, der indeholder op til 90 g/l albumin, 100 mg/l bilirubin, lipemiske prøver med mængder, der svarer til 36 g/l triolein (triglycerid), og hæmolyserede prøver, der indeholder op til 10 g/l hæmoglobin, påvirker ikke resultaterne. 4. Undgå at opvarme prøverne. 9 - ANALYSEPROCEDURE 150 Følg den angivne procedure nøje. Brug kalibratorerne til hver serie af bestemmelser til at validere testresultaterne. Anvend god laboratoriepraksis. 1. Fastlæg prøvefordelingen og identifikationsoversigten omhyggeligt. 2. Klargør den fortyndede vaskeopløsning (R2d) (se afsnit 7). 3. Tag transportbakken og strimlerne (R1) ud af beskyttelsesposen. 4.Vask mikrotiterpladestrimlerne en enkelt gang med vaskebrugsopløsningen (R2d). Vend mikrotiterpladen, og dup den forsigtigt med sugende papir for at fjerne resterende væske. 5. Fortynd testsera ved at tilsætte 10 µl prøvemateriale til 1 ml fortynder (R7). Kalibratorer på 0, 6, 60 og 240 IU/ml (R3, R4a, R4b og R4c) fortyndes på samme måde for at give en fortynding i forholdet 1:101. Bland de fortyndede prøver på Vortex-mixeren. 6.Ved manuel udførelse af analysen, tilsættes 200 µl fortyndede kalibratorer og testprøver i brøndene således: Brønd 1A: 200 µl kalibrator 0 IU/ml (R3) Brønd 1B: 200 µl kalibrator 6 IU/ml (R4a) Brønd 1C: 200 µl kalibrator 60 IU/ml (R4b) Brønd 1D: 200 µl kalibrator 240 IU/ml (R4c) Brønd 1E, 1F, 1G osv. 200 µl prøvemateriale

7. Når det er muligt, tildækkes mikrotiterpladen med selvklæbende film. Pres filmen forsigtigt ned over hele pladen, så en tæt forsegling sikres. Inkuber derefter mikrotiterpladen i et termostatkontrolleret vandbad eller en inkubator til mikrotiterplader ved 37±1 C i 1 time ± 5 minutter. 8. Forbered konjugat brugsopløsningen (R6d) 15 minutter før afslutningen af den første inkubationsperiode. Fortynd 0,5 ml 50x konjugatkoncentrat (R6) i 25 ml fortynder (R7) til en mikrotiterplade. Bland grundigt (se afsnit 7). 9. Fjern den selvklæbende film. Sug indholdet af alle brønde op i en beholder til biologisk farligt affald (en beholder med natriumhypoklorit). Vask mikrotiterpladen en enkelt gang med vaskebrugsopløsningen (R2d). Vend mikrotiterpladen, og dup den forsigtigt med sugende papir for at fjerne resterende væske (se afsnit 10). 10.Fordel straks 200 µl konjugatbrugsopløsningen(r6d) i alle brønde. Opløsningen skal rystes forsigtigt før brug. 11.Tildæk mikrotiterpladen med selvklæbende film. Pres filmen forsigtigt ned over hele pladen, så en tæt forsegling sikres. Inkuber derefter mikrotiterpladen i et termostatkontrolleret vandbad eller en inkubator til mikrotiterplader ved 37±1 C i 1 time ± 5 minutter. 12.Fjern den selvklæbende film, tøm alle brønde ved opsugning, og vask fire gange som beskrevet ovenfor. Vend mikrotiterpladen, og dup den forsigtigt med sugende papir for at fjerne resterende væske. 13.Fordel straks og hurtigt 200 µl omrystet farvefremkaldeopløsning (R8 + R9) i hver brønd. Lad reaktionen foregå i mørke i 30 minutter ved stuetemperatur (18 30 C). Undgå at bruge selvklæbende film under inkubationen. 14.Tilsæt 100 µl stopopløsning (R10) i samme rækkefølge og med samme fordelingsfrekvens som for farvefremkaldeopløsningen. 15.Tør undersiden af pladen forsigtigt af. Aflæs den optiske densitet ved 450/620 nm ved hjælp af en mikrotiterpladelæser inden for 30 minutter, efter reaktionen er stoppet (teststrimlerne må aldrig udsættes for lys før aflæsningen). 16.Kontroller, at alle resultater stemmer overens, hvad angår aflæsning, plade, prøvefordeling og identifikationsoversigt. 151

10- BEREGNING OG FORTOLKNING AF RESULTATERNE 1) Oplysninger om kalibrering Forekomsten og mængden af IgG-antistoffer til T. gondii i testprøven bestemmes ved at sammenligne den optiske densitet (OD) i prøven med et standardinterval. Kalibratorerne på 6, 60, 240 UI/ml i kittet er kalibreret efter WHO-standard (TOX M 185) serum. Visse uoverensstemmelser i titrene kan dog observeres for det samme serum, når det testes med forskellige serologiske teknikker. Denne forskel skyldes, at de T. gondii, der bruges i de forskellige teknikker, indeholder variable mængder opløseligt membranantigen. 2) Kvalitetskontrol Medtag alle kalibratorerne til hver testkørsel. Nedenstående kriterier skal opfyldes ved validering af analysen. Værdier for optisk densitet: - OD R3 0,200 - OD R4c 1,000 Forhold: OD R4a/OD R3 2 Hvis specifikationerne ikke bliver opfyldt, skal testen køres igen. 3) Fastlæggelse af standardkurven a) Tegning af standardkurven Brug linjeret papir til manuel datareduktion, og anfør OD-aflæsningerne for kalibratorerne (R3, R4a, R4b og R4c) på den lodrette akse (y-aksen). Indsæt den tilsvarende koncentration i IU/ml på den vandrette akse (x-aksen). Tegn en kurve gennem de fire punkter, som passer bedst muligt. Ved automatisk datareduktion anvendes en udjævningsfunktion for at oprette en optimal kurve ud fra de OD-aflæsninger, der opnås for kalibratorerne. 152 b) Beregning af koncentrationen i IU/ml Hvis OD-aflæsningen af testprøven befinder sig i intervallet for OD R4a og OD R4c, skal dentilsvarende værdi findes for testprøvens ODaflæsning på y-aksen og en vandret linje tegnes til standardkurven. Fra skæringspunktet med standardkurven tegnes en lodret linje til x-aksen. Aflæs koncentrationen i IU/ml ved skæringspunktet med x-aksen. NB: Hvis OD-aflæsningen for en testprøve, der er fortyndet i forholdet 1:101, er større end OD R4c, skal prøven fortyndes i forholdet 1:1010 i R7 og analyseres igen.

De tilknyttede værdier (IU/ml) skal derefter ganges med faktor 10. 4) Fortolkning af resultaterne Konstateringen af IgG anti-t.gondii med Platelia Toxo IgG TMB viser patienternes immunstatus. Titer < 6 IU/ml Ubetydelig forekomst af antistof med denne teknik = ingen immunitet. 6 IU/ml Titer 9 UI/ml Ubetydelig forekomst af antistof med denne teknik = Resultatet for en enkelt serumprøve leverer ikke tilstrækkeligt bevis til en fastlæggelse af patientens immunstatus i forhold til T. gondii. Ifølge anbefalingerne i Frankrig skal der udføres nye test af en anden prøve ved hjælp af to andre teknikker. 9 UI/ml < Titer 240 UI/ml Betydelig forekomst af antistof = langvarig immunitet eller tidlig fase i serokonversion. Titer > 240 UI/ml Udbredt forekomst af antistof = nylig serokonversion eller permanent høj immunstatus, som observeres hos visse personer. Begrænsninger for proceduren Diagnosticering af nylig infektion med parasitten kan kun fastlægges på baggrund af en kombination af kliniske observationer og serologiske data. Resultatet af en enkelt serumprøve leverer ikke tilstrækkeligt bevis til en diagnosticering af en nylig infektion. Kun er markant stigning i titeren for anti-t. gondii IgG-antistof i to serumprøver, der er indsamlet med mindst tre ugers interval og testet i for samme analyseserie kan danne basis for en diagnosticering af en nylig infektion og kan betragtes som bevis for en nylig infektion af parasitten. Forekomsten af IgM-antistof til T. gondii skal også evalueres som del af den serologiske overvågning af personer, der mistænkes for at have en T. gondii-infektion, eftersom forekomsten af anti- T. gondii IgG-antistof kan optræde en smule senere end anti-t. gondii IgM-antistof. 5) Hjælp til fejlfinding Reaktioner, der ikke valideres eller bekræftes ved gentagelse, skyldes ofte: 153

Utilstrækkelig vask af mikrotiterplader. Kontamination af negative prøver med serum eller plasma med en høj antistoftiter. Kontamination af farvefremkaldeopløsningen med iltningsmiddel (natriumhypoklorit, metalioner o.lign.). Kontamination af stopopløsningen. 6) Eksempel på beregning Bemærk! Følgende data er angivet som eksempel og må ikke bruges i stedet for resultaterne for brugeren. Resultater Indhold OD Koncentration i brønd (450/620 nm) (IU/ml) R3 (negativ) 0,121 0 R4a 0,615 6 R4b 1,466 60 R4c 2,099 240 Serum 1 (fortynding 1:101) 0,108 Negativ Serum 2 (fortynding 1:101) 0,675 7 IU/ml Serum 3 (fortynding 1:101) 0,808 12 IU/ml Serum 4 (fortynding 1:101) 2,080 231 IU/ml Serum 5 (fortynding 1:101) 1,283 43 IU/ml *Ved fortynding i forholdet 1:1010 er slutkoncentrationen = IU/ml x 10 Validering af testen - Værdier for optisk densitet - Forhold. OD R3 0,200. OD R4a/OD R3 2. OD R4c 1,000 11 - YDEEVNE OG BEGRÆNSNINGER FOR TESTEN Undersøgelserne blev udført på prøver, indsamlet i tørglas, SST-rør, rør med koagelaktivator eller rør med forskellige antikoagulanter (EDTA, heparin og citrat). 1. Ydeevne Egenskaberne for Platelia TM Toxo IgG TMB-testens ydeevne er sammenfattet nedenfor og er opnået ved hjælp af friske serumprøver fra gravide kvinder, patienter med nedsat immunforsvar eller normale, ambulante bloddonorer og friske serumprøver, der er kendt som positive eller negative. 154

Sammenlignende undersøgelser I alt blev 787 tilfældigt valgte prøver fra gravide kvinder analyseret ved hjælp af Platelia TM Toxo IgG TMB-testen og med en anden EIA-test på markedet. Der blev benyttet en direkte agglutinationstest til at udrede uoverensstemmende resultater. Tvivlsomme resultater fra 23 prøver blev udeladt fra de efterfølgende beregninger for den relative specificitet og sensitivitet og den relative overensstemmelse. Platelia Toxo IgG TMB Resultat Negativt Positivt I alt Anden EIA-test Negativt 488 0 488 Positivt 5 271 276 I alt 493 271 764 Resultater for den prospektive undersøgelse (sted 1) Relativ specificitet 488/488 100% (99,0 100,0) Relativ sensitivitet 271/276 98.2% (95,6 99,3) Relativ 759/764 99.3% overensstemmelse - (98,8 99,9) Undersøgelse af specificiteten Specificiteten for Platelia TM Toxo IgG TMB-testen blev evalueret på to uafhængige steder. De analyser, der blev anvendt til serumbeskrivelsen, var EIA-analyser, som fandtes på markedet. Specificiteten for analysen blev bestemt ud fra denne beskrivelse. Der blev benyttet en direkte agglutinationstest til at udrede uoverensstemmende resultater. Tvivlsomme resultater blev udeladt fra de efterfølgende beregninger for specificitet: - sted 1: 99,8 % (403/404) - sted 2: 100 % (488/488) I alt: 99,9 % (891/892) Undersøgelse af sensitiviteten: Sensitiviteten for Platelia TM Toxo IgG TMB-testen blev evalueret på to uafhængige steder. De analyser, der blev anvendt til serumkarakterisering, var EIA-analyser, som fandtes på markedet. Sensitiviteten for analysen blev bestemt ud fra denne karakterisering. Der blev benyttet en direkte 155

agglutinationstest til at udrede uoverensstemmende resultater. Tvivlsomme resultater blev udeladt fra de efterfølgende beregninger for sensitiviteten: - Sted 1: 100 % (196/196) - Sted 2: 98,2 % (271/276) I alt: 98,9 % (467/472) Paneler med serokonvertering (sted 1 og 2) eller post-infektion (sted 1) fra: 84 serumprøver fra 33 gravide kvinder (sted 1) 48 serumprøver fra 14 gravide kvinder (sted 2) blev testet med Platelia TM Toxo IgG TMB. De analyser, der blev anvendt til serumkarakterisering, var EIA-analyser, som fandtes på markedet. Der blev benyttet en direkte agglutinationstest til at udrede uoverensstemmende resultater. På sted 1 gav Platelia TM Toxo IgG TMB-testen tidligere et positivt resultat end med den anden EIA-test i 5 tilfælde. På sted 2 gav den anden EIAtest, der ikke svarede til den første, tidligere et positivt resultat end med Platelia TM Toxo IgG TMB i 6 tilfælde. Udbredelse Udbredelsen af positive resultater for anti-t.gondii IgG-antistoffer i befolkningen varierer meget fra land til land. I området omkring Paris (Frankrig) udgør de positive resultater 67,6 % for en formodet sund bloddonorgruppe: FREKVENS 80 70 60 50 40 30 20 10 0 HISTOGRAM N FOR PRØVEGENFORDELING = 216 68 69 65 0 10 1 1 3 2 5 0 0 0 30 32 34 31 23 <2 [2-4[ [4-6[ [6-8[ [8-10[ [10-20[ [20-40[ [40-80[ [80-160[ TITER IU/ml 22 17 19 [160-240[ PLATELIA Toxo G TMB EIA-analyse > 240 0 156

2. Præcision Gentagelsesnøjagtighed i samme analyseserie: 3 positive og 1 negativ prøve blev analyseret 30 gange i samme analyseserie. Prøve Negativt Positiv 1 Positiv 2 Positiv 3 forhold Titre IU/mL Gennems 0,25 11 38 110 -nitsværdi Standard -afvigelse 0,02 0,83 1,35 9,53 Variations -koefficient 6,29 7,57 3,55 8,64 Reproducerbarhed mellem analyseserier: 3 positive og 1 negativ prøve blev analyseret tre gange på fem forskellige dage af to forskellige teknikere. Prøve Negativt Positiv 1 Positiv 2 Positiv 3 forhold Titre IU/mL Gennems 0,22 11,8 39,2 127,5 -nitsværdi Standard -afvigelse 0,08 1,65 5,14 14,13 Variations -koefficient 34,11 13,90 13,10 11,08 157

3. Relevante interferencer Der blev undersøgt 141 prøver med nedenstående egenskaber, som kunne resultere i uspecifikke reaktioner. Specificitet = 99,29 % (140/141). Prøve var Reaktiv Bemærkning positiv for CMV IgG 5 1 Negativ ved andet forsøg CMV IgM 5 0 VZV IgM 10 0 VZV IgG 9 0 Mumps IgG 7 0 Mumps IgM 3 0 Rubeola IgG 7 0 Rubeola IgM 7 0 EBV IgG 8 0 EBV IgM 9 0 Rubella IgG 5 0 Rubella IgM 5 0 HSV IgG 5 0 HSV IgM 5 0 HIV 15 0 Myeloma 8 0 RF 15 0 ANA 10 0 HAMA 3 0 Total 141 1

12 REFERENCES 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, 1433-1443. 2. BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the HEMOCO and SEROCO Study Groups : Incidence and risk factors of toxoplasmosis in a cohort of Human immuno-deficiency virus-infected patients (1988-1995). Clinical Infectious Diseases 1999; 28, 575-581. 3. BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. : Evaluation of some of the parameters of the enzyme-linked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279-S285. 4. DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT C., VALENTI D. and COX L. : Prenatal management of 746 pregnancies at risk for congenital toxo-plasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 18, 271-275. 5. DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, 310-315. 6. DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G., ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L., SALAMON R. and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group. Predictive value of Toxoplasma gondii antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIVinfected patients.aids 1996; 10, 1521-1527. 7. DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and COLIN J.: Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des méthodes simples, pour des questions précises. Le concours médical 1985; 107-03, 227-234. 8. DUBEY J.P. and BEATTIE C.P. : Toxoplasmosis of animal and man. CRC Press (1988). 9. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in 35 940 pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2900-2906. 10. JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxo-plasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2907-2913. 11. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G.: Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti- Toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol. 1997 ; 35, 1972-1977. 12. LAPPALAINEN M., KOSKELA P., KOSKINIEMI M., AMMALA P., HILESMAA V., TERAMO K., RAIVIO K.O., REMINGTON J.S., HEDMAN K. : Toxoplasmosis acquired during pregnancy: improved serodiagnosis based on avidity of IgG. J. Infect. Dis. 1993; 41, 155-158. 13. LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, 2 155-158. 14. LEBECH M., JOYNSON D.H.M., SEITZ H.M. THULLIEZ P., GILBERT R.E., DUTTON G.N., OVLISEN B. and PETERSEN E., : Classification system and case definition of Toxoplasma gondii infection in immunocompetent pregnant women and their congenitally infected offspring. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 799-805. 15. LUFT B.J. and REMINGTON J.S. : Toxoplasmic encephalitis. Clinical Infectious Diseases 1992; 15, 211-222. 16. NAESSENS A., HEUNINCKX W., FOULON W. and LAUWERS S. : Evaluation of seven commercially available enzyme immunoassays for immunoglobulin G and M antibody detection of Toxoplasma gondii. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 258-262. 17. PETITHORY J.C., REITER-OWONA I., BERTHELOT F., MILGRAM M., DE LOYE J. and PETERSEN E. : Performance of European laboratories testing serum samples for Toxo-plasma gondii. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, 45-49. 18. REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; 191-332. 19. SABIN A.B., and FELDMAN H.A. : Dyes as microchemical indicators of a new immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma), Science 1948; 108: 660-663.

20. SANTORO F., AFCHAIN D., PIERCE J.R., CESBRON J.Y., OVLAQUE G. and CAPRON A. : Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified parasite protein P30. Clin. Exp. Immunol. 1885; 62, 262-269. 21. SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and REMINGTON J.S. : Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognized by human IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131: 977-983. 22. SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 63-69. 23. SULZER A.J. and HALL EC. : Indirect fluorescent antibody tests for parasitic diseases : IV Statistical study of variation in the indirect fluorescent antibody (IFA) test for toxoplasmosis. Amer. J. Epidemiol. 1967; 86: 401-407 24. WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, 3112-3115. 25. WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7, 299-316.

OVERSIGT OVER ANALYSEPROCEDUREN 1. Indstil inkubatorentil 37±1 C. 2. Fortynd kromogenet R9 i forholdet 1:11 i substratbufferen R8 (farvefremkaldeopløsning). 3. Fortynd vaskeopløsningen R2, der er koncentreret 10x, i forholdet 1:10 i destilleret vand. 4. Vask alle brønde en enkelt gang med fortyndet vaskeopløsning (R2d). 5. Fortynd kalibratorerne og prøverne i forholdet 1:101 i R7. 6. Fordel 200 µl fortyndede kalibratorer og prøver i brøndene efter nedenstående plan. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 E5 B R4a E6 C R4b E7 D R4c E8 E E1 E9 F E2 E10 G E3 E11 H E4 E12 7. Inkuber i 1 time ved 37 C. 8. Forbered konjugatet brugsopløsningen (R6 +R7). 9. Sug indholdet op, og vask derefter 3 gange med fortyndet vaskeopløsning (R2d). 10. Fordel 200 µl konjugat brugsopløsning i alle brønde. 11. Inkuber i 1 time ved 37 C. 12. Sug indholdet op, og vask derefter 4 gange med fortyndet vaskeopløsning (R2d). 13. Fordel 200 µl enzymudviklingsopløsning (R8 + R9) i alle brønde. 14. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur (18 30 C) på et mørkt sted. 15. Fordel 100 µl stopopløsning (R10) i alle brønde. 16. Aflæs absorberingerne med et spektrofotometer ved 450/620 nm. 159

0459 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 05/2006 Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 code: 881002