Natrium-kaliumpumper

Natrium-kaliumpumper - kan ny viden føre til bedre hjertemedicin? Naturvidenskabelig Bachelor, hus 14.1-1. semester, efterår 2013 Gruppe 7C; Nuura Abshir Yuusuf og Kamilla Dyreborg Bonnichsen Vejleder: Ole Skovgaard

Forside illustration: Illustrationen på forsiden af rapporten viser et billede af ouabain bundet til en natriumkaliumpumpe. Illustrationen er fra rapporten Structural insights into the high affinity binding of cardiotonic steroids to the Na+,K+-ATPase (Yatime et al., 2011). Forklaring til figuren findes i kapitel 5.

English Abstract The sodium-potassium pumps are membrane proteins that regulate the gradients of sodium- and potassium-ions across the cell membrane and thus are essential for hjertemyocyters membrane potential and action potential. The sodium-potassium pumps and action potentials play a vital role in the cytoplasmic concentration of calcium-ions, which are essential for cardiac myocytes to contract. Theories on the theme have shown that ouabain blocks the sodium-potassium pumps and thereby increases the cytoplasmic concentration of calcium ions in cardiac myocytes, resulting in a stronger heart contraction. Research shows details on this ligand binding between the sodiumpotassium pump and ouabain. During this project we have found evidence that this research could lead to better heart medication. Dansk Abstrakt Natrium-kaliumpumper er membranproteiner, som regulerer gradienterne af natrium-ioner og kalium-ioner over cellemembranen og herved har afgørende betydning for hjertemyocyters membranpotentiale og aktionspotentiale. Natrium-kaliumpumper og aktionspotentialer spiller en afgørende rolle i forhold til den cytoplasmatiske koncentration af calcium-ioner, som er central i forhold til hjertemyocyters kontraktion. Teorier om emnet har vist at ouabain blokkerer natriumkaliumpumperne og derved forøger den cytoplasmatiske koncentration af calcium-ioner i hjertemyocyterne, hvilket medfører en hårdere hjertekontraktion. Forskning viser i detaljer denne ligandbinding mellem natrium-kaliumpumpen og ouabain. Vi har gennem projektet fundet belæg for, at netop denne forskning vil kunne føre til bedre hjertemedicin.

Forord Dette projekt er udarbejdet fra september-december 2013 af 2 1.semester-studerende på Naturvidenskabelig Basisstudie på Roskilde Universitet. Vi har oprindelig været 7 personer i gruppen som har haft en stor interesse for molekylærbiologi og kemi. Denne interesse har ledt os til et projekt med mange små detaljer, som skulle forstås og forklares. Vi har efter noget tid valgt at arbejde videre på projektet i en mindre gruppe af 2, i og med vi valgte at gribe tingene an på forskellige måder. Projektet tager udgangspunkt i hjerteglykosiden ouabain og dets medicinske virkning på hjertet. Vi beskæftiger os med ny forskning udført af en forskergruppe fra Aarhus Universitet (Aarhusgruppen), som har ført til viden om ouabains komplekse binding med natriumkaliumpumperne. Vi skylder vores projektvejleder Lektor Ole Skovgaard stor tak for hjælpen med vores første projekt på Roskilde Universitet. Han har været en god hjælp særligt med henblik på, at lære os at læse videnskabelige rapporter og bruge disse i vores projekt. En særlig tak rettes til Lektor Søren Hvidt for hjælp og støtte i en kort periode, hvor Ole Skovgaard ikke havde mulighed for at hjælpe os. Tak til HUSK-lærer Martin Niss for altid at være på pletten, når vi har brug for ham. Vi vil også takke 5 medstuderende; Wesam, Elisabeth, Nazeer, Redaa og Aliya, som tidligere har været en del af projektgruppen.

Indholdsfortegnelse: 1) Indledning:... 1 2) Problemformulering... 2 3) Semesterbindingen... 2 4) Metode... 2 5) Teori... 4 a) Ouabains kemiske struktur... 4 b) Ouabains binding til natrium-kaliumpumperne... 7 c) Membranpotentialer... 13 d) Aktionspotentialer... 14 e) Hjertemyocyters opbygning... 16 f) Actin og myosin... 18 g) Ouabains effekt på kontraktionen... 20 6) Opsummering på teori... 23 7) Forskning omkring natrium-kaliumpumper... 24 a) 1. artikel... 24 b) 2. artikel... 27 8) Svinenyrer og menneskehjerter... 28 9) diskussion... 33 10) Konklusion... 37 11) Perspektivering... 37 Referencer... 38

1) Indledning: Hjerteglykosider såsom ouabain og digoxin er kendte for at have en medicinsk virkning på hjertet. Digoxin kan i dagens Danmark fås på recept, og ouabain fra planter har været brugt siden oldtiden og frem til nyere tid mod visse hjertelidelser. 420.000 danskere lever med en eller anden form for hjertekarsygdom ifølge Hjerteforeningen. Selvom antallet af dødsfald som følge af hjertekarsygdomme er faldet med 45 % fra 1995 til 2011, er hjertekarsygdomme stadig den næst hyppigste dødsårsag i Danmark ( Fakta om hjertekarsygdom i Danmark Hjerteforeningen, ). Problemet med digoxin og ouabain er, at de har et snævert terapeutisk vindue med stor risiko for overdosering ( Pro.medicin; Digoxin DAK, n.d.). Med andre ord er der kun lille forskel fra den mindste virksomme dosis til den dødelige dosis. Overdosering kan medføre rytmeforstyrrelser i hjertet eller i værste fald døden som følge af forgiftning. Spændende forskning har ført til, at man nu er tættere på at vide, hvordan hjerteglykosider virker (Yatime et al., 2011) (Laursen, Yatime, Nissen, & Fedosova, 2013). De kan blokere natriumkaliumpumperne, som er membranproteiner med centrale funktioner eksempelvis i forhold til hjertets kontraktion. Man har fundet ud af, hvordan bindingen mellem natrium-kaliumpumperne og ouabain ser ud på molekylært niveau. Denne forskning menes ifølge videnskab.dk ( Danske forskere har banebrydende nyt om livsvigtigt enzym, Anna Ringgaard) at kunne føre til udvikling af ny medicin, som kan hjælpe patienter med sygdomme, der involverer natrium-kaliumpumperne. Det fascinerer os at Jens Christian Skou opdagede natrium-kaliumpumperne allerede i 1957, men at forskerne stadig forsøger at forstå deres funktion og struktur. Forskningen fortsætter den dag i dag, og måske fører den til at kunne redde menneskeliv. Det, synes vi, er enormt fascinerende. Den nævnte forskning har vakt vores nysgerrighed i forhold til, hvordan natrium-kaliumpumper funger, og på hvilken måde ouabain har indflydelse på disses funktion. Opbygningen af aminosyrer til polypeptider og store, funktionelle biomolekyler finder vi utroligt interessant. Det er fascinerende hvordan deres kemi får vores krop til at fungere, og netop det, har vi arbejdet med i dette projekt. Vi har en stor interesse for molekylærbiologi og biokemi særligt i 1

forhold til at forstå, hvordan biomolekyler fungerer inde i menneskekroppen. Da vi læste ovennævnte artikel fra videnskab.dk, fangede emnet straks vores interesse. Masser af spørgsmål meldte sig omkring natrium-kaliumpumpers funktion og deres indflydelse på kroppens celler. Kimet til dette projekt har været at forstå, hvordan natrium-kaliumpumperne egentlig virker, hvad de gør i kroppens celler og hvordan man kan påvirke dem. Det er et bredt emne, og vi har derfor valgt at sætte fokus på, hvordan et stof som ouabain kan påvirke natrium-kaliumpumperne på hjertemyocyter og der igennem have en indflydelse på hjertets funktion. Vi vil her opsøge, hvad det præcis er den nye forskning har ført frem til af viden, og om denne nye viden mon i fremtiden kan føre til bedre hjertemedicin. 2) Problemformulering Kan viden om ouabains binding til natrium-kaliumpumpen føre til bedre hjertemedicin? 3) Semesterbindingen På dette semester er vi underlagt følgende semesterbinding; projektet skal tage udgangspunkt i anvendelse af naturvidenskab i teknik og samfund. Dødeligheden blandt hjertepatienter er stor, og det er et problem som samfundet har interesse i at få løst. Fra en samfundsøkonomisk vinkel har det også af almen interesse, at kunne hjælpe patienter med hjertesygdomme. Med indsigt i relevante videnskabelige teorier vil vi derfor diskutere, om den nye forskning er et skridt hen imod, at hjælpe patienter med hjertesygdomme. 4) Metode Vores tilgang til projektet er en blanding af litteratursøgning på relevante teorier i lærebøger og lignende samt en gennemgang af to udvalgte artikler fra Aarhus Universitet om den nye forskning omkring natrium-kaliumpumpers binding til ouabain. Tilsammen skal disse to metoder føre til en besvarelse af vores problemformulering. Vi vil erhverve os en dybdegående viden om følgende for at sætte os ind i emnet: Ouabains kemiske struktur og medicinske virkning Natrium-kaliumpumpens overordnede struktur og funktion Ouabains binding med natrium-kaliumpumper 2

Ouabains indvirkning på hjertets sammentrækning Vi har udvalgt to artikler udgivet af en gruppe forskere fra Aarhus Universitet, som vi finder mest relevante for vores projekt: Structural insights into the high affinity binding of cardiotonic steroids to the Na+,K+- ATPase fra oktober 2010 Crystal structure of the high-affinity Na+,K+-ATPase ouabain complex with Mg2+ boundin the cation binding site fra 21. December 2012 Efterfølgende vil vi henvise til forskerne bag de ovennævnte 2 videnskabelige artikler som Aarhusgruppen. Disse to nævnte artikler handler om bindingen mellem ouabain og natriumkaliumpumper fra svinenyrer. Vi begrænser os til kun at diskutere de ovennævnte to rapporter. Vi er bevidste om, at der er mange andre forskergrupper som beskæftiger sig med ouabains binding til natriumkaliumpumper. I dette projekt kan vi ikke forholde os til alle samtlige rapporter om emnet. Desuden vil vi afgrænse os fra at behandle specifikke hjertesygdomme i detaljer. I stedet fokuserer vi på overordnet at finde frem til, hvordan ouabain kan have en effekt på hjertets kontraktion. 3

5) Teori Dette kapitel er inddelt i 7 underafsnit, som udgør rapportens teoridel. Det grundlæggende formål med teoriafsnittet er, at beskrive hvilken indflydelse ouabain har på hjertemusklers sammentrækning. Dette er nødvendigt for at kunne forstå, hvordan forskningen fra Aarhus Universitet med tiden måske vil kunne føre til ny hjertemedicin. I underafsnit a) vil vi beskrive hvad ouabain er, set med kemikerens øjne. Dette leder hen imod underafsnit b), hvor vi beskriver ouabains binding til natrium-kaliumpumperne. Disse to underafsnit skal give en grundforståelse for, hvilke forhold der gør det muligt for ouabain, at binde sig til natrium-kaliumpumper. I underafsnit c) og d) kommer vi ind på henholdsvis membranpotentialer og aktionspotentialer. Disse to begreber er vigtige at have kendskab til, for at man kan forstå de efterfølgende underafsnit. Underafsnit e), f) og g) handler om henholdsvis hjertemuskelcellers opbygning, hjertemuskelcellers kontraktion og ouabains indvirkning på hjertemuskelcellers kontraktion. Kapitel 5 leder samlet set til en forståelse for, hvilken effekt ouabain har på hjertet. Kapitlet afsluttes med en delkonklusion. a) Ouabains kemiske struktur For at forstå hvordan ouabain lige netop passer ind i natrium-kaliumpumpen, skal vi først se på ouabains kemiske struktur. Hjerteglykosiders binding til natrium-kaliumpumper er et vidt begreb netop fordi der findes flere forskellige typer natrium-kaliumpumper, men også fordi der findes utroligt mange forskellige hjerteglykosider. I dette underafsnit kommer vi ind på hjerteglykosiders overordnede kendetegn samt hjerteglykosidet ouabains kemiske struktur. Dette leder hen imod underafsnit b), hvor vi vil beskrive ouabains binding til natrium-kaliumpumperne. Hjerteglykosider er steroider. Steroider er derivater af perhydrocyclopentanophenanthren, som er en tetra-cyklisk carbonhydrid. At den er tetra-cyklisk vil sige, at der er 4 ringe (på figur 5a1 markeret som A, B, C og D), og at det er en carbonhydrid (eller kulbrinte) betyder, at det består udelukkende af grundstofferne carbon (kulstof) og hydrogen (brint). 4

Figur 5a1 Her til venstre ses perhydrocyclopentanophenanthrens struktur, som steroider er derivater af. Figuren er fra www.biosite.dk At steroider er derivater af perhydrocyclopentanophenanthren betyder, at grundstrukturen i steroider er som perhydrocyclopentanophenanthren, og alt efter hvilket steroid man har med at gøre, er der variationer i forhold til følgende: antallet og positioner af dobbeltbindinger i typen, positionen og antallet af substituerede funktionelle grupper i konformationen af bindingerne mellem de substituerede grupper og kernen konfigurationen af ringene i forhold til hinanden, eftersom kulbrinten har 6 asymmetriske carbonatomer ( BioSite Leksikon, steroid ). Hjerteglykosider lader til at have følgende strukturer til fælles (Katz et al., 2010): Isometrien mellem A/B ringene og C/D ringene skal være trans Der skal være en hydroxylgruppe ved carbon nummer 14 (C14) Der skal være en umættet lacton ved C17 En lacton er en kemisk forbindelse hvor en esterbinding mellem en carboxylsyregruppe og en hydroxygruppe i samme molekyle danner en cyclisk ester ( BioSite Leksikon, ). Også ouabain har denne kemiske struktur se figur 5a2.. Ouabains glykosid ved C3 er rhamnose. Sukkermolekylets art har ingen egentlig betydning for, om bindingen kan finde sted, men er afgørende for bindingens affinitet (dvs. styrken af den molekylære binding mellem ouabain og natrium-kaliumpumpen) og bindingshastigheden (Katz et al., 2010). 5

Figur 5a3. Her ses ouabains kemiske struktur i hhv. 2d og 3d. Figurerne er fra PubChem. På figuren til venstre ses tydeligt strukturen af et steroid, hvorpå der oppe i højre hjørne ved C17 sidder den cykliske ester og nede i venstre hjørne sidder glykosiden rhamnose. Ouabain er et hjerteglykosid, som er bygget op af de to stoffer rhamnose (C 6 H 12 O 5 ) og ouabagenin (C 23 H 34 O 8 ) ( Ouabain - PubChem, n.d.). Det er en af de mest hydrofile hjerteglykosider, idet den har 4 hydroxyl-grupper på β-overfladen og en enkelt hydroxylgruppe på α-overfladen samt en umættet lactonring og 3 hydroxylgrupper på sukkergruppen rhamnose (Laursen et al., 2013) - Se figur 5a3. Figur 5a3 Her ses ouabains struktur. Det fremgår tydeligt at der er tale om et meget hydrofilt molekyle, idet det indeholder mange hydroxylgrupper. (Laursen et al., 2013) 6

b) Ouabains binding til natrium-kaliumpumperne I dette underafsnit kommer vi omkring ouabains binding med natrium-kaliumpumperne. Dette gør vi ved at se på forskning fra Aarhusgruppen. Denne binding er en ligand-binding, hvor ouabain er liganden, idet den binder sig til natrium-kaliumpumpen som er et stort protein. Natrium-kaliumpumpen er et membranprotein og en ATPase, hvorved 3 natrium-ioner flyttes ud ad cellen og 2 kalium-ioner flyttes ind i cellen for hver pumpecyklus. Pumpen skal bruge energi, som den får fra ATP (se figur 5b2), fordi ionerne flyttes til et område, hvor der i forvejen er større koncentration af den pågældende ion. I cellemembranen findes desuden ionkanaler, som uden brug af ATP lader ioner diffundere igennem membranen. Se figur 5b1. Figur 5b1 Her ses en illustration, som viser natrium-kaliumpumpen (til venstre) og en ionkanal (til højre). Forskellen mellem dem er, at en pumpe bruger ATP for at flytte ionerne gennem cellemembranen, og en ionkanal lader ionerne diffundere igennem. (Guyton, 2006) Figur 5b2 Her ses den kemiske struktur for Adenosin trifosfat (ATP), som leverer energien til blandt andet natriumkaliumpumpen ved at fraspalte sit yderste fosfatmolekyle. (Guyton, 2006) 7

Natrium-kaliumpumpen består af aminosyrer i en særlig sekvens som er foldet og opviklet i en unik 3d-struktur - som alle andre proteiner. Der findes i alt 20 forskellige aminosyrer. En polymer af aminosyrer kaldes et polypeptid, og et protein er et biologisk funktionelt molekyle, som består af mindst ét polypeptid. Der findes omkring 100-1000 aminosyrer i proteiner (Campbell, Neil A. og Reece, 2012). Natrium-kaliumpumpen er et stort protein med omkring 1000 aminosyrer. Proteiner foldes og oprulles i primær, sekundære, tertiære og kvartnære strukturer. Primær strukturens opbygning er en kæde af aminosyrer, der har en unik sekvens for hvert enkelt protein som bestemmes ud fra det gen, der koder for proteinet. Den primære struktur kan betragtes som en lineær kæde. Se figur 5b3 Figur 5b3 Her ses et eksempel på et polypeptid, som danner primærstrukturen i et protein. Hver lilla cirkel på figuren repræsenterer en aminosyre. Indeni er disse cirkler der tre bogstaver, som er særligt kendetegnende for netop den aminosyre. Som det fremgår af figuren er aminosyrerne nummererede. Den viste polypeptid har en længde på 127 aminosyrer. (Campbell, Neil A. og Reece, 2012) Aminosyrerne benævnes med enten et enkelt bogstav eller tre bogstaver alt efter hvilken notation man fører. Den sekundære foldning kendetegnes særligt ved to strukturer kaldet α-helix og -sheets. En α- helix har form som en proptrækker, mens -sheets er mere glatte strukturer (Campbell, Neil A. og Reece, 2012). Se figur 5b4. Når man ser på illustrationer af proteiner, er α-helixer og -sheets nok de mest iøjnefaldende. 8

Den tertiære form er et resultat af ion-bindinger og bindinger mellem aminosyrernes sidekæder. Nogle aminosyrer har upolære sidekæder som gør dem hydrofobe. Udover dette så holder van der Waals interaktioner de ikke- polære aminosyrer sammen. Også hydrogen-bindinger mellem aminogrupper i aminosyrekæden og sidekæderne har indvirkning på proteinets 3d-struktur. Endvidere har man svovlbroerne som er en binding mellem cysteiner, som er den ene af de 20 aminosyrer (Campbell, Neil A. og Reece, 2012). Den kvartnære struktur er overordnet bestående af sammenlægning af flere polypeptidunderenheder, således at det fungerer som et stort makromolekyle. Den tærtiære struktur kan derfor anses som en underenhed af den kvartnære struktur. Således er natrium-kaliumpumpen bygget op som et protein med α-helixer og β-sheets som udgør et biologisk aktivt molekyle med - for os livsvigtige funktioner. Natrium-kaliumpumperne består af tre underenheder; α, β og γ. Alle underenhederne er polypeptider som hver især alle er foldet i ovennævnte sekundære, tertiære og kvartnære strukturer og de indeholder alle 3 både α-helixer og β-sheets. Hver af disse underenheder har sin egen unikke opgave i natrium-kaliumpumpen, men fungerer ikke for sig selv. Hver for sig er de blot polypeptider, men sat sammen i deres fælles kvartnære struktur, udgør de et protein, som har en specifik molekylærbiologisk funktion. α- og β-underenhederne udgør tilsammen den minimale funktionelle del. Det vil sige at uden både α- og β-underenhederne vil pumpen ikke fungere. En α- og en β-underenhed findes i de forskellige isoformer: α1, α2, α3 og α4 samt β1, β2 og β3 som har lidt forskellige kemiske og biokemiske egenskaber, som følge af små variationer i sekvensen af aminosyrerne. Særligt relevant har de forskellige isoformer af α-underenhederne forskellig affinitet og bindingsrate til ouabain (Katz et al., 2010). Natrium-kaliumpumpen er et membranprotein. Cellemembranens fosfolipider er hydrofobe. Derfor ville det være oplagt, at aminosyrerne i den del af pumpen, som ligger indeni cellemembranen (kaldet den transmembrane del), også er hydrofobe. Ellers ville membranen og pumpen ikke kunne arbejde sammen. Men selve ionkanalen i pumpen, altså den kanal hvorigennem natrium-ioner og kalium-ioner bevæger sig igennem, befinder sig i vandige opløsninger, idet både cytoplasma og den extracellulære væske er en vandig opløsning. Derfor vil de fleste aminosyrer i dette område være hydrofile. Hjerteglykosider binder sig til den transmembrane del af α-underenhed men fra den ekstracellulære side af α-underenheden (se figur 5b4). Den isoform af α-underheden der er mest udbredt i hjertecellers natriumkaliumpumper er α2-varianten. Ydermere har forskning vist, at netop α2-9

underenheden er afgørende for hjertemusklers sammentrækning (Katz et al., 2010). Vi kommer nærmere omkring dette i afsnit 5f og 5g. Der er desuden en γ-enhed som varierer alt efter hvilken type væv pumpen befinder sig i, men denne underenhed har tilsyneladende ingen effekt på bindingen mellem hjerteglykosider og natrium-kaliumpumperne (Yatime et al., 2011). Figur 5b4 Her til højre ses bindingen mellem Ouabain (farvet grøn og rød) og en α1-β1-natriumkaliumpumpe fra svinenyrer. Cellemembranen ligger mellem de to blå streger. Alt der ligger over den øverste blå streg er ekstracellulært, mens alt det der ligger under den nederste blå streg er cytoplasmatisk. På figuren ses de forskellige underenheder i pumpen; α, β og γ samt domænerne P, N og A som vi ikke kommer ind på her, da de ikke har relevans for denne rapport. De store M er indikerer, at det er dele af natrim-kaliumpumperne som ligger indeni membranen. Modificeret (Yatime et al., 2011) 10

Figur 5b5 Her ses i større detaljer ouabains binding med α-underenheden. Ouabain er her gul og rød. Koderne (et bogstav og tre tal) på figuren indikerer nogle få af de forskellige aminosyrer som α- underenheden er bygget op af. Her er hver aminosyretype repræsenteret med et bogstav. Tallet indikerer nummeret af aminosyre i rækken. Eksempelvis betyder E117 at aminosyre nummer 117 i polypeptiden er glutaminsyre. (Laursen et al., 2013) Natrium-kaliumpumperne arbejder i en fast cyklus, som i princippet kan køre baglæns. Det vil sige at natrium-kaliumpumpen teoretisk kan pumpe to kalium-ioner ud og tre natrium-ioner ind, hvis dette skulle være nødvendigt for at få den rette koncentrationskoefficient over membranen. Natrium-kaliumpumpens tertiære og kvartnære strukturer skifter desuden i løbet af pumpens arbejdscyklus. Hjerteglykosider binder sig til natrium-kaliumpumpers α-underenhed. Hjerteglykosider har højest affinitet til pumpen, hvis pumpens tertiære og kvartnære strukturer er, så pumpens α-underenheder er klar til at binde kalium-ioner, men endnu ikke har bundet kalium. Denne tilstand eller struktur kaldes E2P - se figur 5b6 (Yatime et al., 2011). Ser man på cyklussen i forlæns rækkefølge (med uret på figur 5b6), er der følgende trin; 1) E1- ATP: pumpen binder 3 natrium-ioner og et ATP-molekyle, 2) E1P-ADP: Det yderste fosfatmolekyle er fraspaltet ATP og har bundet sig til natrium-kaliumpumpen med en kovalent binding. Fosforliering af pumpen er gennemført og natrium-kaliumpumpen exciteres, så den ændrer struktur på en måde, så natrium-ionerne frigives til det ekstracellulære, 3) E2P: natrium- 11

kaliumpumpen er klar til at binde enten 2 kalium-ioner eller en hjerteglykosid og defosforlieringen går i gang, 4) E2: fosfatmolekylet er spaltet fra og natrium-kaliumpumpen ændrer her struktur, så kalium-ionerne lukkes ind i cellen og igen kan binde ATP og natrium-ioner. Cyklus vil her starte forfra (Yatime et al., 2011). Figur 5b6 Natrium-kaliumpumpen ændrer sin molekylære struktur i løbet af sin arbejdscyklus. Hver struktur har sin egen betegnelse, som ses i figuren til højre. I strukturer hvor betegnelsen indeholder et 1-tal, er pumpen i en tilstand hvor den er i stand til at binde natrium-ioner. Det vil sige at bindingsstedet for natrium-ioner vender ind imod cytoplasma. Indeholder betegnelsen et 2-tal, vil pumpen være i en tilstand hvor den enten kan binde kalium-ioner eller en hjerteglykosid, og her vil bindingsstedet for kaliumioner være blotlagt for det ekstracellulære. Et P i betegnelsen står for, at der er bundet en fosfatgruppe til pumpen med en kovalent binding. P betyder, at fosfat er bundet til natrium-kaliumpumpen med en ionbinding. Figuren er modificeret fra (Yatime et al., 2011). Når ouabain binder sig til natrium-kaliumpumpen, fastlåses pumpen i den struktur, som pumpen havde umiddelbart inden ouabain binder sig. Pumpen bliver derfor ineffektiv og kan hverken flytte natrium-ioner eller kalium-ioner over cellemembranen. Ouabain blokkerer herved natriumkaliumpumpen (Katz et al., 2010). På hver celle er der flere natrium-kaliumpumper. Hvilken betydning det har for en hjertemuskelcelle at nogle af pumperne er blokerede, vil vi komme ind på i kapitel 5f og 5g. En forskergruppe fra Aarhus Universitet har undersøgt ouabains binding til natrium-kaliumpumper fra svinenyrer, hvor natrium-kaliumpumperne netop var i strukturformen E2P. De konkluderer blandt andet, at bindingen til fosfatgruppen doneret af ATP giver pumpens α-underenhed en højere affinitet for ouabain sammenlignet med E2-isoformen hvor bindingen til fosfatgruppen allerede er 12

ophørt (Yatime et al., 2011). Men som Adriana Katz et al pointerer, har der været meget lidt forskning i, hvilken effekt hjerteglykosider har på hjertet (Katz et al., 2010). Den mest udbredte α- isoform i nyreceller er α1, mens den mest udbredte i hjerteceller er α2. Dette vender vi tilbage til i kapitel 6, 7 og 8. Vi har indtil nu fundet ud af, at bindingen mellem Natrium-kaliumpumperne og ouabain er ret kompleks. Natrium-kaliumpumper har højest affinitet til hjerteglykosider, når natriumkaliumpumpen er af α2-typen og pumpen er i E2P-strukturen, hvor den ellers ville binde kaliumioner. Ouabain er hydrofil og har den molekylære egenskab netop at passe ind i α-underenheden fra den extracellulære side. Når ouabain binder sig til natrium-kaliumpumper, blokeres pumperne således, at de ikke længere kan flytte natrium-ioner og kalium-ioner over membranen. c) Membranpotentialer Natrium-kaliumpumper spiller en afgørende rolle i forhold til dannelsen og opretholdelse af membranpotentialer. I dette afsnit vil vi beskrive hvad membranpotentialer er, og vi vil forklare hvordan de opstår i levende celler. Det er vigtigt at forstå hvordan membranpotentialer opstår, for at kunne forstå hvad et aktionspotentiale er. Aktionspotentialet er en væsentlig brik for forståelsen af hjertemuskelcellers kontraktion. Cellemembraner fungerer som barrierer mellem de to miljøer, der findes indenfor og udenfor cellerne, og er også med til at opretholde koncentrationsgradienter af forskellige ioner over membranen. Membranerne lader ioner diffundere igennem via ionkanaler, som er specifikke for den pågældende ion se figur 5b1. Alle ionerne vil søge at fordele sig, således at koncentrationerne af ionerne er ens både indenfor og udenfor cellen. Derfor vil ionerne søge at diffundere gennem cellemembranen via specificerede ionkanaler og udligne koncentrationsforskellene. Ionkanalerne er ikke konstant åbne for diffusion. De aktiveres typisk når gradienterne mellem ionkoncentrationerne over cellemembranen får en vis størrelse. Diffusion forekommer i meget lille grad i forhold til de mængder, der flyttes den anden vej via aktiv transport, som eksempelvis via natriumkaliumpumperne (Nelson, 2004). Ioner er ladede, og en forskel i den samlede ladning indeni cellen i forhold til udenfor cellen fører til en spændingsforskel over membranen kaldet membranpotentialet. De fleste celler har et membranpotentiale, men det er særligt udbredt blandt eksempelvis muskelceller. Hjertet består 13

hovedsageligt af muskelceller. Natriumkaliumpumpen bidrager væsentligt til membranpotentialet, idet den pumper to kalium-ioner (K + ) ind i cellen mens tre natrium-ioner (Na + ) pumpes ud. Både Na + og K + er kationer - altså positivt ladede. Derfor vil der være flere positive ioner udenfor cellen end indenfor, og dette danner en spændingsforskel over membranen (Nelson, 2004). d) Aktionspotentialer Aktionspotentialet er regelmæssige udsving i membranpotentialet se figur 5d1. Hvilemembranpotentiale er det membranpotentiale, der er, når alle ionkanaler er lukkede, og det er typisk på omkring -80mV. Hjertet er bygget op af muskelceller kaldet hjertemyocyter, som beskrives i afsnit 5e og 5f. Hjertemyocyter er excitable, hvilket betyder, at de kortvarigt kan ændre membranpotentialet ved at åbne og lukke bestemte ionkanaler (Karp, 2012). Det samlede membranpotentiale kan variere mellem 20 og 200 mv med cellens inderside negativt ladet i forhold til ydersiden. Udsvinget i membranpotentialet kaldes aktionspotentialet (Prentø, 2000). Aktionspotentialet har afgørende betydning for hjertemyocyters evne til at trække sig sammen. 14

Figur 5d1. Her til venstre ses en figur, som viser typiske udsving i membranpotentialet (millivolt) for hjertemuskler som funktion af tiden (sekunder). Dette udsving kaldes aktionspotentialet. (Guyton, 2006) Ved kurvens start haves hvilemembranpotentialet. I cellemembranen sidder natriumkanaler, som åbnes så der diffunderer natrium-ioner ind i cellen. Dette ses på grafen ved at kurven stiger. Cellen de-polariserer; Den bliver mindre ladet relativt til før. Samtidig åbnes calciumkanaler så calciumioner (Ca 2+ ) strømmer ind i hjertecellens cytoplasma. Dette vender vi tilbage til og uddyber i afsnit 5g. Når flest mulige natrium-ioner er lukket ind i cellen forekommer det højeste positive potentiale. Dette kaldes et Peak og ses på figuren ovenfor som grafens højeste punkt. Så åbnes kaliumkanalerne og kalium-ioner diffunderer ud af cellen. Cellen bliver mindre positiv i forhold til peak et, cellen begynder at re-polarisere. Det flade område i toppen af grafen (plateau phase) kommer af, at Ca 2+ fortsat strømmer ind i cellen og forsinker repolariseringen (se afsnit 5g for uddybning). Calciumkanalerne lukker og den egentlige re-polarisering kommer. Fordi kaliumkanalerne er længere tid om at lukke igen, vil membranpotentialet kortvarigt komme under hvilemembranpotentialet. Nu vil natrium-kaliumpumper og andre ionpumper begynde at arbejde for, at membranpotentialet igen opnår samme værdi som hvilemembranpotentialet. Hele denne cyklus tager kun godt ét sekund at gennemføre, ca. så lang tid som et hjerteslag (Nelson, 2004). 15

I underafsnit 5c og 5d har vi fundet ud af, at natrium-kaliumpumperne spiller en hovedrolle i forhold til cellers membranpotentiale og aktionspotentiale. Dette skyldes, at natriumkaliumpumperne spiller bidrager til at skabe en koncentrationsgradient af positive ioner over cellemembranen, hvilket fører til en potentialeforskel. I underafsnittene 5f og 5g kommer vi ind på, hvilken indvirkning aktionspotentialet har på hjertemyocyters kontraktion. Dette er en væsentlig brik i forhold til at finde ud af, hvordan ouabain har indvirkning på hjertet, når det binder sig til natriumkaliumpumper. e) Hjertemyocyters opbygning For at forstå hjertemyocyters kontraktion, vil vi her gennemgå deres opbygning og funktion. Hjertemuskulatur ligner på flere måder skeletmuskulatur, men der er visse grundlæggende forskelle. I modsætning til skeletmuskler er hjertemyocyter aldrig i hvile og skal fungere spontant i den forstand, at vi ikke aktivt skal tænke over, at hjertet skal slå. Hjertet skal bruge relativt meget ilt. Dette skyldes at mitokondrierne bruger ilt til respirationen, hvorved ADP omdannes til ATP, og de fleste af ionkanalerne, som har indvirkning på hjertets funktion, bruger ATP. Natrium-kaliumpumperne bruger omkring 30% af cellens ATP (Nelson, 2004). Derfor fylder mitokondrier 30-35% af hjertemyocyters volumen for at kunne producere ATP nok. Sammenlignet med skeletmyocyter er hjertemyocyter noget kortere og smallere. Hjertemyocyter har kun en eller to cellekerner - skeletmuskelceller kan have flere hundrede cellekerner (Feher, 2012). En hjertemyocyts cellemembran er omgivet af et lag polysaccharider og collagen-fibriller. Tilsammen går cellemembranen samt laget af polysaccharider og collagen-fibriller under termen sarcolemma (Guyton, 2006). Som nævnt i afsnit 5d opstår aktionspotentialet ved, at forskellene i ionkoncentrationerne over membranen ændres over tidsperioder på ca. 1 sekund. Aktionspotentialet spreder sig langs sarcolemma og sarcolemma depolariseres og repolariseres af aktionspotentialet (Feher, 2012). 16

Figur 5e1: Her ses et udsnit af muskelfiber fra en frøs muskler, som minder om menneskets hjertemuskelfibre. Her ses det tydeligt at hele muskelfiberen er omringet af et sarcolemma. Transverse tubule (T-tuber) sikrer at aktionspotentialet kan brede sig langs sarcolemma langt ind imellem muskelcellerne. I muskelcellerne er der desuden mitokondrier, som omdanner ADP til ATP ved at forbrænde lipider (fedt). I sarcoplasmatisk reticulum opmagasineres calcium-ioner indtil et aktionspotentiale lader calcium-ionerne strømme ud i cytoplasma og bevirke en muskelsammentrækning. Dette vender vi tilbage til i afsnit 5f og 5g. Figur er modificeret fra (Feher, 2012) En anden vigtig forskel mellem hjertemyocyter og skeletmyocyter er, at skeletmyocyter er forbundet af sener, mens hjertemyocyter er tæt forbundet med en samling (junction) kaldet en indskudt disk (Intercalated Disk, ID). I ID findes der gap junctions, en slags kanal mellem nabohjertemyocyters cytoplasma som muliggør, at en strøm kan brede sig fra celle til celle se figur 5e2. At alle hjertemyocyterne på denne måde er elektrisk forbundet muliggør sammentrækninger i alle hjertemyocyter næsten simultant (Feher, 2012). Det er dette som muliggør at hjertet fungerer som en pumpe, idet den simultane sammentrækning af myocyterne får hjertet til at arbejde næsten som én stor muskel. 17

Figuren er taget fra (Feher, 2012) Figur 5e2 Figuren viser strukturen i en hjertemuskel. De mørkerøde, lodrette striber er ID, som er en slags cellemembran mellem de forskellige muskelceller, hvori der findes gap junctions. Gap junktions lader ioner diffundere nærmest uhindret mellem de forskellige muskelcellers cytoplasma. f) Actin og myosin I dette afsnit vil vi komme omkring hvordan den cytoplasmatiske calciumkoncentration styrer muskelkontraktionerne i hjertet. Vi redegør for, hvordan ouabain kan påvirke den cytoplasmatiske calciumkoncentration og derved forårsage en hårdere muskelkontraktion. Myofibriller strækker sig tværs gennem cellens cytoplasma i hele cellens længde. De består af sammentrækkelige (kontraktile) filamenter indeholdende kæder af proteinet actin. Myofibrillerne trækker sig sammen ved at myosin binder sig til tropomyosin, som sidder på actinkæden. Dette er en ATPase. Når myofibrilerne er i hvile, dækker proteinet troponin for tropomyosin og forhindrer myosin i at binde sig. For at en sammentrækning kan forekomme skal tropomyosin derfor først blotlægges. Calcium-ioner binder sig til proteinet troponin og sørger for, at myosin kan binde sig til actinkæden så myofibrilerne kan kontraheres. Se figur 5f1 (Torp, 2010). 18

Figur 5f1. Figuren viser kæder af actin (grønne), og hvordan myosin får actinkæderne til at bevæge sig i forhold til hinanden og forårsage, at myofibrilerne sammentrækkes. Figur a: figuren viser cyklussen for actinkædernes sammentrækning. 1) ATP binder sig til myosin, hvorved myosins spids bøjes fremad. 2) myosin binder sig til et bindingssted på actinkæden. 3) ATP fraspalter sit yderste fosfatmolekyle. 4) fosfatgruppen falder af myosin. Dette bevirker at spidsen på myosin igen bøjes og myosin trækker i actinkæden. Myosin slipper actinkæden og cyklussen kan starte forfra. Figur b og c:når musklen ikke er sammentrukket, dækker proteinet troponin for myosinbindingsstedet på actin. En calcium-ion kan binde sig til troponin og derved tilgængeliggøre bindestedet for myosin. Idet myosin binder sig til actinkæden, forskubbes kæden på langs, og myofibrilerne kontraheres. Når myofibrilerne kontraheres, vil hele hjertemusklen kontraheres. Calcium oplagres i det sarcoplasmatiske reticulum (SR) og frigøres herfra, når musklen skal trækkes sammen (Torp, 2010). 19

Når calciumkoncentrationen stiger, vil flere myosiner binde sig til actinkæderne, og kontraktionen i hjertemuskelcellen vil blive hårdere (Feher, 2012). Det er derfor calciumkoncentrationen indeni cellerne har stor betydning for hjertets kontraktion. Den normale gennemsnitlige koncentration af calcium-ioner i menneskekroppen er mellem 10-8 og 10-7 mol pr. liter, hvilket ikke er nok til at forårsage en muskelsammentrækning. For at nok myosin kan få lov at binde sig til actinkæderne skal der typisk være en koncentration af calcium-ioner på mellem 10-6 og 10-5 mol pr. liter (Guyton, 2006). Det er her sarcolemma og calcium-kanaler kommer ind i billedet. Sammen kan disse regulere koncentrationen af calcium-ioner i cellen efter behov. Men hvordan kan man så ændre på calciumkoncentrationen? Vi vil i det følgende give én af mulighederne for, at øge den intracellulære calciumkoncentration. g) Ouabains effekt på kontraktionen Herunder vil vi forklare i detaljer, hvilken indvirkning det har på hjertets kontraktion, når hjerteglykosider som ouabain binder sig til natrium-kaliumpumper. Vi har tidligere redegjort for natrium-kaliumpumpernes funktion og disses rolle i forhold til aktionspotentialet (se underafsnit 5b og 5d). Aktionspotentialet bevirker at der spreder sig en depolarisering som vandrer fra celle til celle langs sarcolemma; hvorved sarcolemma exciteres. Undervejs når exciteringen kommer forbi én af cellernes calciumkanaler (DHPR), som sidder nede i T-tuberne mellem cellerne (se figur 5g1). Det exciterede sarcolemma aktiverer ionkanalen DHPR og dermed lukkes Calcium-ioner ind i cellen. Disse calcium-ioner binder sig til receptorer (ryanodine receptors, RyR2) på sarcoplasmatisk reticulum (SR) og aktiverer en calcium-kanal ( calcium-induced calcium release, CICR) (Feher, 2012). Hjertemyocyters SR er mindre udviklet end SR i eksempelvis skeletmuskler, hvilket gør, at hjertemusklers SR ikke kan opmagasinere calcium-ioner i nær så store koncentrationer som skeletmusklers SR (Guyton, 2006). Der er ikke nok calcium-ioner i hjertemyocyters SR alene til at forårsage en sammentrækning (se figur 5g1). Til gengæld er hjertemyocyters T-tuber (se figur 5e1) ca. 5 gange så brede i diameter i hjertemyocyter sammenlignet med skeletmuskulatur. I hjertemyocyters T-tuber er der et stort antal mycopolysakkarider, som er elektronegative og kan binde store koncentrationer af calcium-ioner. Calcium-ioner frigives herfra og diffunderer ind i hjertemyocytens cytoplasma når aktionspotentialet exciterer sarcolemma og DHPR åbnes. På den måde får hjertemyocytens cytoplasma en tilpas høj koncentration af calcium-ioner til, at kontraktionen af hjertemuskulaturen kan foregå (Guyton, 2006). Se figur 5g1 20

Den forhøjede calcium-koncentration i cytoplasma bevirker at CICR på SR åbnes. Calcium-ioner, som var opmagasineret i SR, vil nu strømme ud i cellens cytoplasma fra sarcoplasmatisk reticulum og forhøje koncentrationen af calcium-ioner i cytoplasma yderligere. Herfra vil calcium forårsage en muskelkontraktion som beskrevet under afsnit 5f (Guyton, 2006). Jo højere den lokale koncentration af calcium-ioner er omkring RyR2, jo flere RyR2 åbnes. Mængden af calcium-ioner der kommer ind gennem DHPR fra T-tuberne har derfor en effekt på antallet af RyR2 der åbner på SR (Feher, 2012). Så længe koncentrationen af calcium-ioner er høj omkring myofibrilerne, vil myofibrilerne være sammentrukkede. Dog er der nogle calciumpumper (CERCA2a på figur 5e1), som konstant pumper calcium-ioner fra cytoplasma ind i SR. Dette gør at imellem aktionspotentialerne, vil koncentration af calcium-ionerne være lav i cytoplasma, dette gør at actin ikke længere kan trække sig sammen, og musklen slapper af (Guyton, 2006). Se desuden figur 5d1. På hver hjertemyocyt er der typisk flere natrium-kaliumpumper. Hvad der så sker, når ouabain blokkerer én eller flere af natrium-kaliumpumperne er, at færre kalium-ioner kan blive pumpet ind i cellen, og færre natrium-ioner kan pumpes ud. Dette betyder, at natriumkoncentrationen i cytoplasma er større end sædvanligt. Dette mindsker membranpotentialet (og aktionspotentialet) ganske lidt eftersom cellens indre bliver en smule mere positiv når forskellen i ionkoncentrationerne bliver mindre (Guyton, 2006). Natrium-calcium-exchanger (NCX) har den funktion, at lukke 3 natrium-ioner ind i cellen for hver calcium-ion den lukker ud. NCX er ikke en ATPase-pumpe, men er afhængig af den elektrokemiske gradient af natrium over sarcolemma; idet natrium koncentrationen forøges, bliver cellen mere positiv, aktionspotentialet bliver mindre og NCX bliver mindre aktiv. Det medfører at koncentrationen af calcium-ioner indeni cellen bliver højere, da NCX pumper færre calcium-ioner ud af cellen. Det ekstra calcium vil blive opsamlet i SR (Feher, 2012). 21

Figur 5g1, Figuren viser effekten af hjerteglykosider på den cytoplasmatiske calciumkoncentration. Her vises to hjertemyocyter med sarcolemma (SL) og sarcoplasmatisk reticulum (SR). På myocyten til højre sidder der en hjerteglykosid i natrium-kaliumpumpen (Na K-ATPase). Hjerteglykosiden blokkerer én eller flere af hjertemyocytens natrium-kaliumpumper og mindsker membranpotentialet en smule. Dette medfører at NCX bliver mindre aktiv og koncentrationen af calcium-ioner stiger i cytoplasma. En høj koncentration af calcium-ioner oplagres i SR indtil aktionspotentialet aktiverer DHPR. Ved aktivering af DHPR lukkes calcium ind i cellen fra det ekstracellulære. Disse calcium-ioner bindes til receptorer (RyR2) på CICR og lukker calcium-ionerne ud af SR. Den øgede koncentration af calcium-ioner medfører, at der er flere calcium-ioner til at blotlægge myosin-bindestederne på actinkæderne. Det medfører at flere myosin kan binde sig til actinkæderne. Derved bliver kontraktionen i muskelcellen hårdere, tiden for én kontraktion bliver kortere og hjertefrekvensen bliver højere. Modificeret fra (Feher, 2012). Det vil altså sige, at ouabain påvirker koncentrationen af calcium-ioner indeni cellen ved at blokerer natrium-kaliumpumpen. Derved ændres calciumkoncentrationen i hjertemyocytens cytoplasma, hvilket forårsager en kraftigere kontraktion. 22

6) Opsummering på teori Gennem de 7 underafsnit i kapitel 5 er vi kommet frem til følgende: Natrium-kaliumpumperne spiller en stor rolle i forhold til hjertemyocyters sammentrækning. Når ouabain blokerer nogle af natrium-kaliumpumperne på en hjertemyocyt, fører det til en forhøjet koncentration af natrium indeni myocyten. Dette medfører at natrium-calciumkanalen (NCX) flytter færre calcium-ioner ud af cellen se afsnit 5f og 5g. Derfor stiger koncentrationen af calcium-ioner indeni hjertemyocyterne, når natrium-kalium-pumpen blokkeres af et hjerteglykosid som ouabain. Calcium-ionerne opmagasineres i sarcoplasmatisk reticulum og i mycopolysakkarider i T-tuberne, indtil aktionspotentialet exciterer sarcolemma. Ved excitering af sarcolemma strømmer store mængder Calcium-ioner ind i myocyternes cytoplasma fra to steder: 1) mycopolysakkariderne i T- tuberne gennem DHPR og 2) sarcoplasmatisk reticulum gennem CICR. Myofibriler indeholder kæder af actin og myosin, som strækker sig på tværs gennem hver hjertemyocyt, og de kontraheres ved store koncentrationer af calcium-ioner. Dette sker ved, at calcium-ioner binder sig til troponin og forårsager, at myosin-bindestedet på actinkæden blotlægges, så myosin kan binde sig til actinkæden. Ved ATPase forårsager myosins binding til actin, at actinkæderne bevæger sig på langs af hinanden, og dette medfører en sammentrækning af myofibrilerne. Den stærkt forhøjede koncentration af calcium-ioner i cytoplasma, som er en følge af aktionspotentialet, medfører, at nok myosin-bindesteder på actin blotlægges til, at en kontraktion kan forekomme. Når myofibrilerne kontraheres, resulterer det i, at hjertemyocyterne kontraheres og hjertet pumper blod rundt i kroppen. Ouabain og andre hjerteglykosider har netop den kemiske egenskab, at kunne blokere natriumkaliumpumpen ved at binde sig til α-underenheden. Ouabains binding til natrium-kaliumpumperne forårsager, at koncentrationen af calcium-ioner i cytoplasma bliver højere end sædvanligt. Dette fører til en kraftigere kontraktion i hjertemyocyterne. Hjertet vil pumpe hårdere. Dette kan have stor betydning for patienter med visse hjertesygdomme. En lang række forhold har indvirkning på natrium-kaliumpumpens affinitet til ouabain. Affiniteten er særlig høj, når natrium-kaliumpumpen er i E2P-formen. Der kendes fire isoformer af α- underenhederne, men hjerteglykosiders binding til natrium-kaliumpumper er ens for alle fire isoformer kun affiniteterne for hjerteglykosider er forskellige. 23

7) Forskning omkring natrium-kaliumpumper I dette kapitel vil vi gennemgå to af Aarhusgruppens artikler. Med mindre der refereres til andre kilder, vil det efterfølgende i dette kapitel være skrevet på baggrund af disse to artikler. I arbejdet med kapitel 5 har vi erhvervet os en grundlæggende teoretisk viden, om betydningen af ouabains binding med natrium-kaliumpumperne, i forhold til hjertets kontraktion. Dette kapitel er et oplæg til kapitel 8 og 9, hvor Aarhusgruppens artikler vil blive holdt op imod den viden, vi har tilegnet os gennem arbejdet med kapitel 5. a) 1. artikel Structural insights into the high affinity binding of cardiotonic steroids to the Na+,K+-ATPase - Udgivet oktober 2010 En gruppe forskere fra Aarhus Universitet (Aarhusgruppen) bestående af Laure Yatime, Mette Laursen, J. Preben Morth, Mikael Esmann, Poul Nissen og Natalya Fedosova har undersøgt krystalstrukturen for natrium-kaliumpumpen i sin E2P-form bundet med ouabain. Ouabains bindested er i en slags lomme dannet af α-underenheden i natrium-kaliumpumpen, og der kan bindes et enkelt ouabain-molekyle til hver pumpe ifølge tidligere forskning, skriver Aarhusgruppen. De skriver, at natrium-kaliumpumper kan binde ouabain uanset hvilken form pumpen er i, men at det er E2P-formen der har højest affinitet for ouabain. Der er tale om beskrivelse af en ny strukturform af den krystalliserede natrium-kaliumpumpe, idet den er forskellig for alle tidligere beskrevne krystalformer af natrium-kaliumpumpen. Det nye i deres forskning er derfor, at de har beskrevet krystalstrukturen for E2P-formen af natriumkaliumpumpen i kompleksbinding med ouabain. De har sammenlignet krystalstrukturerne for natrium-kaliumpumper i E2P-formen i ouabainbunden tilstand med den tidligere beskrevne (af blandt andre: (Morth et al., 2007)) [K 2 ]E2Pouabain-form (se figur 7a1). Deraf har de fundet ud af, at E2P-formen har en højere affinitet for ouabain end [K 2 ] E2P-formen, altså den form hvor natrium-kaliumpumpen desuden er bundet til to kalium-ioner. Dette kommer til udtryk ved, at i E2P-formen er α-underenhedens elementer tættere omkring ouabain, end formen hvor pumpen har bundet både 2 K + og ouabain. Dette ses på figur 7a1. 24

Figur 7a1 Her ses grafik af E2P-ouabain-formen(blå) og [K 2 ]E2P-ouabain-formen (brun) lagt ovenpå hinanden, så de kan sammenlignes. Buerne på figuren til venstre understreger de dele af natrium-kaliumpumpen, som er forskellige, når de to former sammenlignes. Størrelsen af buerne indikerer hvor vigtige forskellene er for Aarhusgruppens forskning. Ouabain binder sig til begge former. I E2P-formen har ouabain rykket sig omkring 2Å (2 ångstrøm = 2 10 ) i forhold til ouabains position i [K 2 ]E2P-formen, dette er indikeret med 2Å på figuren til højre. Man kan se, at α-underenhedens elementer i E2P-formen er tættere på ouabain-molekylet, end i [K 2 ]E2P-formen. (Yatime et al., 2011) Bindingen til ouabain medfører at M1 og αm2 rykker tættere sammen i både E2P-formen og [K 2 ] E2P-formen. I [K 2 ]E2P-ouabain-formen bliver kalium-ionerne lukket inde i deres bindesteder af ouabain, og dette forhindrer en høj-affinitets binding af ouabain, idet M1 og αm2 ikke har mulighed for, at rykke helt tæt sammen. Lactonringen på ouabain vil komme for tæt på αm3 og αm6, hvilket vil forårsage steriske sammenstød (for tæt approksimation mellem de to elementers elektronskyer). Men i E2P-formen forårsager bindingen til ouabain, at indgangen fra det ekstracellulære lukkes til, fordi de forskellige α-helixer rykker tæt sammen. Aarhusgruppen har fundet ud af, at denne tillukning formentlig er skyld i ouabains høje affinitet for natriumkaliumpumpernes E2P-form. 25

Selv umiddelbart små ændringer i den rummelige organisering af natrium-kaliumpumpers αm1, αm2, αm3 og αm4 helixer har stor betydning for α-underenhedens affinitet til hjerteglykosider såsom ouabain. Aarhusgruppen skriver at dette antyder en eller begge følgende forhold; 1) at bindingsstedet for ouabain passer bedre til ouabain i E2P-formen, 2) at ouabain-bindingen fremkalder en strukturændring i natrium-kaliumpumpers E2P-form som ikke kan forekomme i [K 2 ]E2P-formen. Den lille forskydning på 2Å af ouabains bindested i E2P-formen sammenholdt med [K 2 ]E2Pformen kan altså være af betydning for, om åbningen til det extracellulære kan snøre sig sammen, således at ouabains binding til α-underenheden bliver højaffinitiv. Aarhusgruppen skiver, at en afklaring af dette afhænger af en sammenligning med krystalstrukturen i E2P-formen uden en hjerteglykosid, hvilket ikke er udfærdiget på det tidspunkt, hvor omtalte artikel blev udgivet. De konkluderer, at natrium-kaliumpumpers binding til ouabain har højest affinitet, når pumperne er fosforlierede af ATP. De nævner desuden i deres konklusion, at γ-subunit ikke lader til at have nogen indflydelse på bindingen mellem α-underenheden og ouabain. Dette begrundes med, at γ-underenheden har samme position i både E2P-formen og [K 2 ]E2P-formen, samt at γ-underenheden ligger relativt lang fra ouabains bindested til α-underenheden. Dog understreger de også, at γ-underenhedernes rolle i selve natrium-kaliumpumpernes funktion ikke er blevet afklaret endnu. Der er en stor farmakologisk interesse for hjerteglykosider, netop fordi disse kan blokkere natriumkaliumpumper, og fordi natrium-kaliumpumper er involverede i dannelse og opretholdelse af membranpotentialer, skriver Aarhusgruppen i deres indledning. De beskriver også ganske kort hjerteglykosiders virkemåde på baggrund af andres forskning i emnet; hjerteglykosider nedsætter natrium-kalium-atpase-aktiviteten i cellerne, hvilket fører til ophobning af natrium-ioner inde i cellen. Den formindskede natrium-gradient over cellemembranen medfører formindsket aktivitet af natrium-calciumkanalen og derved også en øget koncentration af calcium-ioner i cellen. En højere koncentration af calcium-ioner indeni en hjertemyocyt fører til en hårdere hjertekontraktion. (frit oversat fra engelsk) 26

Det fremgår af artiklen, at deres arbejde er støttet af Hallas-Møller fonden fra Novo-Nordisk Foundation og Danscatt Programmet fra Ministeriet for Forskning, Innovation og Videregående Uddannelser. b) 2. artikel Crystal structure of the high-affinity Na+,K+-ATPase Ouabain complex with Mg2+ bound in the cation binding site - Udgivet Dec.2012 Siden udgivelsen 2010 har Aarhusgruppen her gentaget deres forsøg med en bedre opløsning på 3,4Å i forhold til tidligere opløsning på 4,6Å. Dette har resulteret i et bedre billede af α- underenhedernes bindested for ouabain, se figur 7b1. Figur 7b1 Med en opløsning på 3,4Å har Aarhusgruppen kunnet lave et mere detaljeret billede af, [Mg]E2P-ouabain komplekset. Her ses det hvordan ouabain placerer sig i lommen af α-underenheden. Desuden ses at en magnesium-ion (Mg 2+ ) også er bundet til natriumkaliumpumpen. Se desuden figur 7a1. (Laursen et al., 2013) Desuden har de undersøgt konkurrencen mellem kalium-ioner og magnesium-ioner for det samme bindested i α-underenheden, samt hvilken betydning disse to ioners binding har for affiniteten for ouabain. En øget extracellulær koncentration af kalium-ioner giver en samlet lavere affinitet for ouabain, hovedsageligt fordi [K + ]-E2P har en laver affinitet for ouabain end E2P har. Aarhusgruppen konkluderer at det endnu ikke er bekræftet, at konkurrencen mellem kalium-ioner 27