Forord. Januar 2007. Maria Rasmussen

Forord Denne specialerapport er resultatet af et eksperimentelt og et teoretisk arbejde, udført i perioden fra Oktober 2005 til Januar 2007 på Biokemisk Afdeling, Institut for Molekylær Biologi. Jeg vil gerne rette en stor tak til min vejleder Stine Falsig Pedersen for uvurderlig hjælp og vejledning i forsøgene og under rapportskrivningen. Ligeledes vil jeg gerne takke alle de studerende for en fantastisk tid igennem speciale, det har været en fornøjelse at være blandt jer. En stor del af mine resultater er præsenteret i posterform til den årlige Experimental Biology konference i Washington DC, April 2007 og er derfor publiceret i abstrakt form. Desuden er en del af resultaterne submitted til publikation i December. Januar 2007 Maria Rasmussen 1

Abstract Ezrin, radixin, and moesin (ERM proteins) are plasma membrane-cytoskeleton linkers coupling F-actin with integral membrane proteins, including NHE1. I therefore hypothesized that ERM proteins might be early sensors of cell volume changes and play a role in shrinkage-induced activation of NHE1. The aim of this study was to investigate the effect of osmotic cell shrinkage on ERM proteins, and to investigate the possible causal relationship between ERM proteins, NHE1 activity, Rho activity, and F-actin organization, and to address whether ezrin is involved in regulating cell survival during osmotic shrinkage. A second aim was to investigate the mechanisms involved in NHE1-mediated regulation of MAP kinases after osmotic shrinkage, specifically whether this effect could be mediated through changes in ph or in MEK1/2 and/or MKK3/6 activity. PCR analyses demonstrated the presence of ezrin, radixin, moesin and the related protein merlin in Ehrlich Lettre Ascites (ELA) cells. Osmotic shrinkage resulted in a rapid ( 1 min) phosphorylation of ERM proteins (T 558 in moesin, T 567 in ezrin, T 564 in radixin), indicative of activation. Immunocytochemical studies in ELA cells indicated that ERM protein activation was associated with translocation to the cortical region. Ezrin knockdown in ELA cells by sirna caused a 70-80 % decrease in ezrin protein levels, and increased the rate of shrinkage-induced intracellular alkalinization by about 20 %. Thus, ezrin is not responsible for the shrinkageinduced NHE1 activation, but rather appears to act as a negative regulator of NHE1 activity. Shrinkage-induced ERM protein activation was not NHE1-dependent, since it was similar in AP1 cells lacking functional NHE1 versus AP1 cells overexpressing human NHE1. RhoA was activated by osmotic shrinkage of ELA cells, in a manner partially dependent on ezrin, and ezrin also appeared to be involved in the shrinkage-induced formation of ezrin- and F-actin containing microvillus-like protrusions. Ezrin was not involved in regulation of cell survival, as ezrin knock-down was not associated with changes in shrinkage-induced loss of cell viability. Elevation of ph o and ph i significantly stimulated basal JNK1/2 activity, and, to a lesser extent, p38 MAPK activity, while ERK1/2 seem to be independent of ph i. MEK1/2, the upstream kinase activating ERK1/2, was inhibited by osmotic cell shrinkage in an NHE1-dependent manner. Neither shrinkage nor NHE1 inhibition affected the activity of MKK3/6, the upstream kinase activating p38 MAPK. This indicates that shrinkageinhibition of ERK1/2 occurs at or above the MEK1/2 level, while p38 MAPK is activated independently of NHE1. MTT assays revealed that inhibition of NHE1, JNK1/2, or ERK1/2 exacerbated, while inhibition of p38 MAPK attenuated, shrinkage-induced cell death. In conclusion, ERM proteins are activated by osmotic cell shrinkage in an NHE1-independent manner. Ezrin negatively regulates NHE1, and is an important regulator of Rho activation and formation of mikrovillus-like protrusions during osmotic shrinkage, yet does not regulate shrinkage-induced cell death. The NHE1-dependent inhibition of ERK1/2 during cell shrinkage involves NHE1-dependent inhibition of MEK1/2, apparently in a ph-independent manner, while NHE1-dependent stimulation of JNK1/2 during cell shrinkage appears to reflect the alkaline optimum for JNK1/2 activity. NHE1, JNK1/2, and ERK1/2 activity favors cell survival during osmotic shrinkage, while p38 MAPK activity contributes to shrinkage-induced cell death. 2

Resumé Ezrin, radixin og moesin (ERM proteiner) er plasmamembran-cytoskelet kædere, der kobler F-aktin med integral membrane proteiner, inklusiv NHE1. Jeg har derfor testet om ERM proteiner kan være tidlige sensorer for cellevolumen ændringer og om de har en vigtig funktion i skrumpnings-induceret aktivering af NHE1. Formålet med dette speciale var at undersøge effekter af osmotisk skrumpning på ERM proteiner og at undersøge de mulige causale sammenhænge mellem ERM proteiner, NHE1 aktivitet, Rho aktivitet og F-aktin organisering. Jeg har også undersøgt om ezrin er involveret i regulering af celleoverlevelse under osmotisk skrumpning. Et andet formål var at undersøge de mekanismer der er involveret i NHE1-medieret regulering af MAP-kinaser efter osmotisk skrumpning, specielt om denne effekt kan være medieret gennem ændringer i ph eller i MEK1/2 og/eller MKK3/6 aktivitet. PCR analyse har demonstreret tilstedeværelse af ezrin, radixin, moesin og det relaterede protein merlin i Ehrlich Lettre Ascites (ELA) celler. Osmotisk skrumpning resulterede i hurtig ( 1 min) fosforylering af ERM proteiner (T 558 i moesin, T 567 i ezrin, T 564 i radixin) hvilket indikerer at de aktiveres. Immunocytokemi studier i ELA celler, har indikeret at ERM protein aktivering er associeret med translokering til den kortikale region. Ezrin knock-down i ELA celler vha. sirna forårsagede et 70-80 % fald i ezrin protein niveau og øgede raten af skrumpnings-induceret intracellulær alkalinisering med omkring 20 %. Derved er ezrin ikke ansvarlig for den skrumpnings-inducerede NHE1 aktivering, men ser i stedet ud til at virke som en negativ regulator, for NHE1 aktivitet. Skrumpnings-induceret ERM protein aktivering var ikke NHE1 afhængig, idet den var ens i AP1 celler, der mangler funktionel NHE1, versus AP1 celler der har overekspresseret human NHE1. RhoA blev aktiveret af osmotisk skrumpning i ELA celler, på en måde der delvist er afhængig af ezrin. Ezrin ser også ud til at være involveret i skrumpnings-induceret dannelse af ezrin- og F-aktin indeholdende mikrovillus-lignende protrusioner. Ezrin var ikke involveret i regulering af celleoverlevelse, idet ezrin knock-down ikke var associeret med ændringer i skrumpnings-induceret tab af celle viabilitet. Øget ph o og ph i stimulerede significant basal JNK1/2 aktivitet og i mindre grad p38 MAPK aktivitet, mens ERK1/2 ser ud til at være uafhængig af ph i. MEK1/2, opstrøms kinasen der aktiverer ERK1/2 blev hæmmet af osmotisk skrumpning, på en NHE1-afhængig måde. Mens hverken osmotisk skrumpning eller NHE1 hæmning påvirkede aktiviteten af MKK3/6, opstrøms kinasen der aktiverer p38 MAPK. Dette indikerer at osmotisk skrumpning hæmmer ERK1/2, på et niveau over MEK1/2, mens p38 MAPK aktiveres uafhængigt af NHE1. MTT assays har vist, at hæmning af NHE, JNK1/2, eller ERK1/2 forværrer celledød, mens hæmning af p38 MAPK fremmer skrumpningsinduceret celledød. Konklusion: ERM proteiner bliver aktiveret af osmotisk celleskrumpning, på en NHE1 uafhængig måde. Ezrin regulerer negativt NHE1 og er en vigtig regulator af Rho aktivering og dannelse af mikrovillus-lignende protrusioner, under osmotisk skrumpning, men regulerer ikke skrumpnings-induceret celledød. Den NHE1-afhængige hæmning af ERK1/2 under celleskrumpning involverer NHE1-afhængig hæmning af MEK1/2, tilsyneladenede på en ph uafhængig måde, mens NHE1 afhængig stimulering af JNK1/2 under celleskrumpning, ser ud til at afspejle et alkalisk optimum for JNK1/2 aktivitet. NHE1, JNK1/2 og ERK1/2 aktivitet stimulerer celleoverlevelse under osmotisk skrumpning, mens p38 MAPK aktivitet medvirker til skrumpnings-induceret celledød. 3

Ordliste BCECF 2,7 -bis-(2-carboxyethyl)-5,6-carboxyflourescein BSA Bovin Serum Albumin CaM Calmodulin Caspase Cysteine-dependent aspartate specific protease DTT DiThioThreitol EATC Ehrlisch Ascites Tumor Cells EIPA EthylIsoPropylAmilorid ELA Ehrlisch Lettre Ascites ERK Extracellular Signal Regulated Kinase ERM Ezrin/Radixin/Moesin FITC Flourescein IsoThioCyanat JNK C-Jun NH 2 -terminal Kinase LALS Large Angle Light Scatter MAPK Mitogen Activated Protein Kinase MLCK Myosin Ligth Chain Kinase Moesin Membrane-Organizing Extension Spike protein MOPS 3-(N-MOrpholino) PropaneSulfonic MTT 3,[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium bromide NHE Na + /H + exchanger NIK NF- κb Inducing Kinase NKCC Na + /K + /2Cl - Cotransportør p38 Protein 38 p53 Protein 53 PBS Phosphate Buffered Saline PDGF Platelet-Derived Growth Factor PKA Protein Kinase A PKC Protein Kinase C PCD Programed Cell Death ROCK Rho-activated kinase RNAi RNA-interference RVI Regulatory Volume Increase SAPK Stress Activated Protein Kinase SDS-PAGE Sodium- Dodecyl- Sulfat- Poly- Acrylamide-Gel-Electroforese S.E.M. Standard Error of the Mean sirna Small Interference RNA Ste-20 Sterile-20 TBS Tris Buffered Saline 4

1 Formål... 11 2 Introduktion... 12 2.1 Volumen sensorer... 12 2.2 Aktin cytoskelettet... 13 2.3 ERM Proteiner... 14 2.3.1 ERM protein familien... 14 2.3.2 ERM protein familiens fysiologiske funktioner... 15 2.3.3 ERM proteins lokalisering... 16 2.3.4 Struktur af Ezrin... 16 2.3.5 ERM proteiners funktionsmekanisme... 17 2.3.6 Regulering af ERM proteiner... 18 2.3.6.1 Regulering af ERM proteiner via PIP 2... 19 2.3.6.2 Regulering af ERM proteiner gennem fosforylering... 19 2.3.7 Inaktivering af ERM proteiner... 20 2.4 Rho GTPaser... 20 2.4.1 Små GTP bindende proteiner... 20 2.4.2 Rho som molecular switches... 21 2.4.3 Aktivering og effektorer af Rho GTPaser... 22 2.5 Reciprok regulering imellem Rho og ERM proteiner... 23 2.6 ERM protein regulering gennem NHE1... 25 2.7 Cellevolumen regulering... 26 2.7.1 Steady state volumen... 27 2.7.2 Regulering efter akutte cellevolumen ændringer... 28 2.7.2.1 RVD... 28 2.7.2.2 RVI... 29 2.7.3 Langtids- cellevolumen regulering... 30 2.8 NHE - isoformer... 31 2.8.1 NHE1... 31 2.8.1.1 NHE1 drivkraft og struktur... 31 2.8.1.2 Regulering af NHE1 aktivitet... 32 2.8.1.3 Regulering af NHE1 under hyperton skrumpning... 33 2.8.2 Hæmning af NHE1... 34 2.9 Mitogen aktiverede protein kinaser (MAPK)... 35 2.9.1 ERK, JNK og p38 MAPK... 36 2.9.1.1 ERK... 36 2.9.1.2 JNK... 37 2.9.1.3 P38... 37 5

2.9.1.4 MAP-kinaser og celleskrumpning... 38 2.9.1.5 Regulering af MAPKs og NHE1... 39 2.9.1.6 Skrumpnings-induceret NHE1 aktivering regulerer MAP-kinase aktivitet... 39 2.9.1.7 MAP-kinaser regulerer NHE1 aktivering... 40 2.10 Død og overlevelses-signalering... 40 2.11 Mulige arbejdsmodeler... 43 3 Metoder... 44 3.1 Celler og celledyrkning... 44 3.1.1 ELA celler... 44 3.1.2 AP-1 celler og S5 celler... 44 3.1.3 Celledyrkning... 45 3.2 Osmotisk skrumpning... 45 3.3 Hel-celle RNA oprensning fra ELA celler... 45 3.3.1 Teori bag RNA oprensning vha. RNeasy teknologi... 46 3.3.2 Praktisk udførelse af RNA oprensning... 46 3.3.3 Beregning af RNA indhold... 46 3.3.4 Verificering af RNA indhold i ekstrakter... 47 3.4 RT og PCR... 47 3.4.1 Praktisk udførelse af RT... 47 3.5 PCR... 48 3.5.1 Praktisk udførelse af PCR... 49 3.6 Teoretiske betragtninger bag brug af fluorescerende prober... 49 3.7 Måling af ændringer i intracellulær ph... 51 3.7.1 Teoretiske betragtninger bag måling af intracellulær ph (ph i )... 51 3.7.1.1 BCECF... 51 3.7.2 Ratio-metoden... 53 3.7.3 Bestemmelse af ph i ved kalibrering... 54 3.7.4 Beskrivelse af apparatur... 55 3.7.5 Praktisk udførelse af ph i bestemmelser... 56 3.7.6 Databehandling... 57 3.8 Bestemmelse af cellevolumen... 57 3.8.1 Teori... 57 3.8.2 Praktisk udførelse af LALS... 58 3.9 CLSM... 58 3.9.1 Teori... 58 3.9.2 Praktisk udførelse af præparater til CLSM... 60 3.10 Western blotting... 61 6

3.10.1 Fremstilling af helcelleekstrakt... 61 3.10.2 Proteinbestemmelse... 61 3.10.2.1 Udregning... 61 3.10.3 SDS-PAGE teori... 62 3.10.4 Praktisk udførelse af SDS-PAGE... 62 3.10.5 Western blotting- og immunodetektions teori... 63 3.10.6 Praktisk udførelse af Immunodetektion... 63 3.10.7 Kvantitativ analyse... 64 3.11 RNA interference (RNA i )... 64 3.11.1 Kontrol for sirna forsøg... 66 3.11.2 Praktisk udførelse af sirna forsøg... 66 3.12 MTT viabilitets-assay... 67 3.12.1 Praktisk udførelse af MTT forsøg... 68 3.12.1.1 ELA cellers dødelighed ved tilstedeværelse af MAPK hæmmere... 68 3.12.1.2 ELA cellers dødelighed ved tilstedeværelse af ezrin sirna, samt kontrol sirna... 69 3.13 Rho aktiverings assay... 70 3.13.1 Teori... 70 3.13.2 Praktisk udførelse af Rho aktiverings assay... 70 3.13.3 SDS PAGE og Western Blot analyse... 71 3.14 F-aktin kvantificering... 71 3.14.1 Teori... 71 3.14.2 Praktisk udførelse af F-aktin kvantificering... 72 3.15 Statestik... 72 4 Resultater... 74 4.1 NHE1 aktiveres ved celleskrumpning... 74 4.1.1 NHE isoformer i ELA celler... 74 4.1.2 Effekt af skrumpning på NHE1 og dens rolle i volumen regulering... 74 4.2 ERM proteiner aktiveres ved celleskrumpning... 76 4.2.1 ERM proteiners tilstedeværelse i ELA celler... 76 4.2.2 Lokalisering og skrumpnings-induceret translokation af ezrin i ELA celler... 77 4.2.3 Co-lokalisering af fosforylerede ERM proteiner med F-aktin i kortex og i mikrovilli-lignende protrusioner... 78 4.3 Rho aktiveres ved celleskrumpning... 79 4.4 NHE1s mulige roller i skrumpnings-induceret aktivering af ERM... 80 4.5 Ezrins roller ved hyperosmotisk celleskrumpning... 81 4.5.1 Effekten af ezrin sirna knockdown... 81 4.5.2 Effekten af ezrin sirna knockdown på NHE1 protein niveau... 82 7

4.5.3 Ezrins effekt på skrumpnings-induceret NHE1 aktivering... 82 4.5.4 Ezrins rolle i skrumpnings-induceret Rho aktivering... 84 4.5.5 Ezrins rolle i regulering af F-aktin indhold og organisering under celleskrumpning i ELAceller... 85 4.6 Roller for NHE1, ezrin og PI3-kinasen i skrumpnings-induceret celledød... 87 4.7 Rho-ROCK vejens rolle i skrumpnings-induceret aktivering af NHE1... 89 4.8 NHE1, MAPKs og celledød efter osmotisk skrumpning af ELA-celler... 90 4.8.1 phs betydning for basal aktivitet af MAPK (ERK, p38 og JNK)... 90 4.8.2 MEK1/2, MKK3/6 og NHE1s effekt i skrumpnings-induceret aktivering af ERK og p38 MAPK... 92 4.8.3 Effekt af hæmning af de tre MAPKs (ERK, JNK og p38 MAPK) på ELA celler viabilitet94 5 Diskusion... 96 5.1 Del A... 97 5.1.1 ERM proteiner... 97 5.1.2 NHE1... 98 5.1.3 Den causale sammenhæng mellem NHE1 og ERM proteiner under hyperton skrumpning i ELA celler... 99 5.1.4 Aktivering af Rho-ROCK vejen efter osmotisk skrumpning og mulige causale sammenhænge med NHE1 aktivering... 100 5.1.5 Causale sammenhænge mellem ezrin og Rho aktivering... 100 5.1.6 Skrumpnings-inducerede F-aktin ændringer i ELA-celler... 101 5.1.7 Ezrins rolle i balancen mellem død og overlevelse efter hyperton skrumpning... 102 5.2 Del B... 104 5.2.1 phis betydning for fosforylering af MAP-kinaser (ERK1/2, p38 MAPK og JNK1/2)104 5.2.2 NHE1s mulige rolle i skrumpnings-induceret regulering af MEK1/2 og MKK3/6... 105 5.2.3 Effekt af NHE1, samt effekten af hæmning af de tre MAPKs (ERK1/2, JNK1/2 og p38 MAPK) på celledød og celleoverlevelser, efter hyperton skrumpning... 106 6 Konklusion... 108 7 Perspektivering... 110 9 Stjerneartikler... 127 10 Appendiks... 128 10.1 Materialer... 128 10.2 Opløsninger... 129 10.3 Antistoffer... 131 10.4 Hæmmere... 132 10.5 sirna... 132 10.6 Primere... 132 8

Figur liste Figur 1. ERM familie medlemmer. 10 Figur 2. En strukturel model for ezrins opbygning 11 Figur 3. En model for ERM protein familiens kædning til plasmamembranen 12 Figur 4. Aktivering af ERM proteiner ved hyperosmotisk stress. 13 Figur 5. Regulering af Rho-GTPase cyclen.. 16 Figur 6. Rho aktivering og effektorer 18 Figur 7. En model for Rho-afhængig regulering af ERM proteiner. 19 Figur 8. En model for aktivering af ERM og Rho proteiner 20 Figur 9. Foreslået model for aktivering af NHE1 og ERM proteiner.. 20 Figur 10. Ion-transport systemer i cellevolumen regulering 23 Figur 11. En model for transportere der er involveret i RVI respons.. 24 Figur 12. Model af NHE1 proteinet. 27 Figur 13. EIPA struktur 29 Figur14. MAPK tre-trins modulet 30 Figur 15. En skematisk model for mamalian MAPK signalerings transduktionsveje. 32 Figur 16. En model for overlevelses- og dødssignaleringsveje 37 Figur 17. Arbejdsmodel for projekt A.. 38 Figur 18. Arbejdsmodel for projekt B.. 38 Figur 19. PCR metoden består af tre trin. 42 Figur 20. Fluorescens stadier.. 45 Figur 21. Stokes shift 45 Figur 22. Loadning af BCECF-AM indi celler 46 Figur 23. Excitation og emission spectra for BCECF.. 47 Figur 12. 445 nm/495 nm fluorescens ratio som funktion af ph i 49 Figur 25. Princippet bag CLSM... 54 Figur 26. Mekanismen bag RNA interference medieret silencing.. 60 Figur 27. OD signal som funktion af antallet af celler 63 Figur 28. OD signal som funktion af inkubationstid med MTT.. 64 Figur 13. Ekspression af NHE isoformer i ELA celler 69 Figur 30. Aktivering af NHE1 under celleskrumpning og volumen regulering.. 70 Figur 31. Ekspression af ERM og merlin proteiner i ELA celler 71 Figur 32. Lokalisering af ezrin proteiner og F-aktin under hyperton skrumpning.. 72 Figur 33. Co-lokalisering og fosforylering af ERM proteiner og F-aktin under osmotisk skrumpning. 73 Figur 34. Rho aktivering under hyperton skrumpning 74 Figur 35. Fosforylering af ERM proteiner sker uafhængigt af NHE1 tilstedeværelse 75 Figur 36. Knock down af ezrin 76 Figur 37. Knock down af ezrins betydning for NHE protein niveau i ELA celler. 77 Figur 38. Ezrins effekt på NHE1 aktivitet og volumenregulering.. 78 Figur 39. Ezrin knock-downs effekt på Rho aktivering.. 79 Figur 40. Effekten af hyperton skrumpning på cellulært indhold af F-aktin 80 9

Figur 41. Ezrins rolle i reorganisering af F-aktin under hyperosmotisk skrumpning.. 81 Figur 42. Effekten af osmotisk skrumpning på ELA cellers viabilitet i nærvær og fravær af EIPA... 82 Figur 43. Ezrin knock-down og hæmning af PI3Ks betydning for celle viabilitet... 83 Figur 44. Rho-ROCK vejens rolle i skrumpnings-induceret aktivering af NHE1 84 Figur 45. phs betydning for fosforylering af MAPKs.. 86 Figur 46. NHE1s effekt på skrumpnings-induceret aktivering af ERK og p38 MAPKs.. 88 Figur 47. Effekt af MAPKs hæmning på ELA cellers viabilitet 89 Figur 48. Arbejdsmodel for hypotese 1 og 2. 92 Figur 49. Model for projekt A 98 Figur 50. Arbejdsmodel for hypotese 3 og 4. 99 Figur 51. Model for projekt B 102 10

1 Formål Kort inden jeg påbegyndte specialearbejdet, havde man i Stine Falsig Pedersens laboratorium fundet, at ERM proteiner aktiveres af celleskrumpning i Ehrlich Lettre Ascites (ELA) celler. I dette speciale har hovedformålet været at klarlægge signaltransduktionsveje op- og nedstrøms for ERM proteiner efter celleskrumpning. Specifikt har jeg ønsket at teste følgende hypoteser: At skrumpnings-induceret aktivering af ERM proteiner, specielt ezrin, er et tidligt signal om celleskrumpning, og derved fungerer opstrøms for skrumpningsinduceret aktivering af volumenregulatoriske og celle-beskyttende mekanismer. Specifikt ønskede jeg at undersøge ezrins roller i (i) aktivering af Na + /H + exchangeren NHE1, (ii) skrumpningsinduceret F-aktin reorganisering, herunder Rho aktivering, og (iii) regulering af celleoverlevelse efter skrumpning via aktivering af en NHE1-Ezrin-PI3K-Akt/PKB overlevelsesvej. At skrumpningsinduceret aktivering af ERM proteiner er nedstrøms for aktivering af Rho-Rho kinase vejen. Desuden tydede tidligere studier i gruppen på, at aktivering af NHE1 kan lede til regulering af MAP kinase aktivitet, og i denne forbindelse ønskede jeg at teste følgende hypoteser: At skrumpnings-induceret aktivering af NHE1 kan være et opstrøms signal for regulering af MAP kinaserne ERK1/2, JNK1/2, og p38 MAPK, muligvis igennem effekter på intracellulær ph og/eller MEK1/2 eller MKK3/6 aktivitet. At disse MAP kinaser regulerer celleoverlevelse efter hyperosmotisk skrumpning 11

2 Introduktion Da hyperosmotisk skrumpning inducerer flere cellulære respons, inklusiv aktivering af volumenregulatoriske iontransport proteiner, cytoskeletal re-organisering og celledød, har jeg i dette speciale ønsket at klarlægge, de mulige mekanismer der fører til disse begivenheder og derved ønsket at finde eventuelle volumen sensorer, der fører til aktivering af de førnævnte begivenheder, samt undersøge de signaler der fører til de/dens aktivering. Jeg har især arbejdet udfra at ezrin/radixin/moesin (ERM) proteiner, kan være involveret i disse begivenheder, idet det tidligere er vist, at ERM proteiner aktiveres under hyperosmotisk skrumpning (Di Ciano et al., 2002)(se afsnit 2.3). Min indledning er delt op således, at der først kort beskrives om begrebet bag en volumen sensor og derefter er mulige volumensensorer diskuteret, især er ERM proteiner og cytoskelettet vigtige effektorer i volumen sensing. Til sidst findes en generel beskrivelse af cellevolumen, samt dets regulering bl.a. gennem iontransporter proteinet Na + /H + exchangeren, isoform 1 (NHE1) og de mitogen aktiverede protein kinaser (MAPK). Desuden er enkelte aspekter af skrumpnings-induceret celledød undersøgt. 2.1 Volumen sensorer Ændringer i volumen-følsomme transportveje, som respons overfor cellevolumen ændringer, bliver medieret gennem følgende mekanismer; 1) en/flere volumen sensor(er), der opfanger volumen ændringen, 2) et signal dannet af volumesensoren, der viderebringer signalet om volumenændring, 3) transduktionsveje der fører signalet videre til de rette effektorer og 4) et antal effektorer, som f.eks. volumen-følsomme ion kanaler (Hoffmann EK & Dunham PB, 1995;Hoffmann EK & Pedersen SF, 1998). Disse er forsøgt beskrevet i den nedenstående teori. Deciderede volumen-sensorer er fundet i lavere organismer som f.eks. gær (Burg et al., 1996), mens en/flere egentlig(e) volumen sensor(er) i mammale celler endnu ikke er defineret (Hoffmann EK., 1997;Pedersen SF., 2006;S.F.Pedersen C.Varming, 2002). Mulige sensorer omfatter bl.a. cytosoliske mekanismer, der f.eks. kan være baseret på ændringer i ion-styrke. Ion-styrke kan påvirke volumen sensor(er), idet ani-isotonisk svulmning eller skrumpning ændrer den intracellulære koncentration af uorganiske ioner, hvilket påvirker ion-styrken i cellens cytoplasma, som derved aktiverer effektorer (f.eks. iontransport proteiner), der registrerer volumen ændringer (se afsnit 2.7) (Mongin AA & Orlov SN, 2001). Interaktioner mellem plasmamembran proteiner og cytoskelet komponenter, f.eks. ved osmotisk stress, kan også fungere som en evt. volumen-sensor, muligevis gennem ERM proteiner (se afsnit 2.3) (Hoffmann EK., 1997;Pedersen SF., 2006;S.F.Pedersen C.Varming, 2002). I dette speciale arbejdes der kun med cytoskelettet og dets interaktioner med 12

plasmamembranen og derfor er det kun dem, der beskrives nærmere, som værende en del af en eventuel volumensensor. 2.2 Aktin cytoskelettet Aktin cytoskelettet består af aktin filamenter, der dannes af polymeriserede globulære aktin molekyler, der sammen med et stort antal aktin bindende og associerede proteiner, danner det såkaldte aktin cytoskelet (Schmidt A & Hall MN, 1998). Aktin cytoskelettet associerer med plasmamembranen og denne association giver mekanisk stabilitet, opretholder cellens form og adhæsion og regulerer overflade protusioner, som lamellipodier og filopodier, der er fundamentale i cellens bevægelse (Denker SP og Barber, 2002). Aktin cytoskelettet er ligeledes essentielt for regulering af ionkanal og transport protein aktivitet, opretholdelse af cellevolumen, samt fordeling af integral-membran proteiner (Cantiello HF., 1997;Papakonstanti EA et al., 2000). En familie af vigtige proteiner, der kæder det aktin-baserede cytoskelet med plasmamembranen er ERM protein familien, der danner et reguleret netværk fra filamentøs aktin (F-aktin) i kortex til membran-proteiner på celleoverfladen (afsnit 2.3). Flere integrale membranproteiner, ankrer ligeledes aktin filamenter og det kortikale cytoskelet til plasmamembranen, bl.a. gennem ion-transport proteiner som Na + /K + -ATPasen, NKCC og NHE (Cantiello HF., 1997;Denker SP og Barber, 2002) (afsnit 2.6). Cytoskelettet er involveret i volumen regulering på flere niveauer. Det kan fungere som den instans, der genererer volumen ændringssignaler, det kan være en del af en hypotetisk volumen sensor, eller det kan aktivere effektorer, enten ved vesikel medieret indsætning i plasmamembranen, eller ved direkte interaktion med effektor proteiner ved plasmamembranen, f.eks. aktivering af iontransportere, der er involveret i RVI og RVD processer (Hoffmann EK & Pedersen SF, 1998;Mongin AA & Orlov SN, 2001). Når celler ændrer volumen ændrer de også form og derfor er volumen ændringer associeret med bevægelser af cytoskelettet (Sarkadi B & Parker JC, 1991). Pedersen og kollegaer fandt i 1998, at volumen ændringer fører til ændringer i EAT-cellers F-aktin indhold og/eller organisering (ved hhv. et fald og en stigning ved RVD og RVI respons) (Pedersen et al., 1999). Den osmotiske effekt på F-aktin kan derved påvirke det kortikale cytoskelet, ved at inducere mekaniske ændringer, der ændrer cytoskelettets organisering (Mills & Mandel, 1994;Hoffmann EK & Pedersen SF, 1998), således at F- aktin ændringer kan være et vigtigt led i kæden af events, der fører fra opfangning af cellevolumen ændring, til aktivering af volumen-regulatorisk osmolyt-transport (se(henson JH., 1999;Pedersen SF & Hoffmann EK, 2002). Aktin cytoskelettet er således vigtig ved signalering fra overfladen til det indre i cellen og er herved en integreret del af cellers signal-transduktionssystem. Celleoverflade receptorer kan aktivere aktin organisering, f.eks. gennem virkning fra de små Ras-relaterede GTPaser, Rac, Cdc42 og Rho (Rho familien), der er nøgleregulatorer i signaleringsveje der kæder ekstracellulære vækstsignaler til 13

samling og organisering af aktin cytoskelettet (Di Ciano et al., 2002;Hall A., 1994;Schmidt A & Hall MN, 1998), (se afsnit 2.4). 2.3 ERM Proteiner 2.3.1 ERM protein familien ERM protein familien består af 3 tæt relaterede proteiner, ezrin, radixin og moesin (se figur 1) (Sato et al., 1992). I vertebrater har ERM protein familien et højt niveau af aminosyre identitet (70-85 %), hvilket peger på at de kan stamme fra et fælles gen i lavere eukaryoter. Da ERM proteiner ikke findes i gær, tyder det på at de er udviklet specifikt i multicellulære organismer (Bretscher A et al., 2002). ERM proteiners N-terminale del er især højt konserveret (figur 1) og disse sekvenser findes ligeledes i aminoterminale ender af flere andre kortikale proteiner, inkl. human erythrocyte membranprotein bånd 4.1 protein (ca. 85 % identitet), hvilket indikerer at ERM protein familien er et medlem af bånd 4.1 superfamilien (Tsukita et al., 1994). Superfamilien af bånd 4.1 består af proteiner der deler homologi med et domæne, kaldet FERM domænet (four point one protein ezrin, radixin moesin, (Louvet-Vallee S., 2000;Tsukita S & Yonemura S, 1997), der findes i det N-terminale domæne af de fleste proteiner i superfamilien (Mangeat P et al., 1999). Der findes et ERM lignende protein, der er blevet identificeret som et tumorsupressor gen, (neurofibromatosis type 2) kaldet Merlin (moesin/ezrin/radixin-lignende protein) eller schwannomin. Merlin har høj sekvenshomologi (60 % aminosyre identitet i N-terminal, 49 % over hele proteinet) med de 3 ERM proteiner (Sato et al., 1992). Merlin har delvis overlappende funktioner med ERM proteinerne (Bretscher A et al., 2002;Vaheri A et al., 1997). Merlin proteiner har intet F-aktin bindingsdomæne i C- terminalen, men domænet kan stadig binde til FERM. Dette sker gennem Merlins interaktion med F- aktin, via aktin-bindende steder indenfor FERM domænet (Bretscher A et al., 2002;Gusella JF et al., 1999). At Merlins aminoterminale del er så homolog med ERM proteinernes, kan tyde på at Merlin kan konkurrere med ERM proteiner for deres membranbindingssted (Tsukita et al., 1994). Nedenfor ses en illustreret model, for ERM protein familien, samt Merlin og bånd 4.1 superfamilien procentvise aminosyre sekvens identitet mellem ezrin: 14

Figur 14. ERM protein familie medlemmer (ezrin, radixin og moesin), merlin og bånd 4.1 protein. ERM proteiner består af 3 domæner, et globulært N-terminalt membran bindingsdomæne (FERM domæne eller N-ERMAD), efterfulgt af et forlænget a-helix domæne og et positivt ladet C-term aktin bindingsdomæne (C-ERMAD). Øverst i figuren ses bindings-partnere til ERM proteiner, nogle af disse er diskuteret i nedenstående afsnit. Den procentvise aminosyre sekvens identitet i forhold til ezrin er vist for hver N- og C terminale ende, indikeret på aminosyre niveau (Tsukita & Yonemura, 1999). I dette speciale fokuseres der på ERM protein familien, især ezrin. Ezrin er det mest studerede medlem af ERM protein familien og deler ca. 75 % primær sekvens identitet med de andre medlemmer af familien (Sato et al., 1992). Da der er så høj grad af homologi mellem ERM protein familie medlemmer, vil mange af de egenskaber der karakteriserer ezrin også være gældende for radixin og moesin (Bretscher et al., 1997). 2.3.2 ERM protein familiens fysiologiske funktioner Ezrin-radixin-moesin (ERM) proteiner er en familie af udbredte membranassocierede proteiner, der udfører en reguleret kædning mellem plasmamembran proteiner og (F-) aktin cytoskelet. ERM protein familiens sammenkædning mellem F-aktin og integrale membranproteiner ved celleoverfladen, er vigtig for cellers fundamentale funktioner, som bestemmelse af celleform, membranprotein lokalisering, membrantransport og signaltransduktion, hvilket betyder at ERM proteiner er essentielle i regulering af flere kortikale funktioner (Bretscher A et al., 2002;Bretscher A et al., 2000;Tsukita S & Yonemura S, 1997). Funktionel inaktivering af ERM proteiner har givet en idé om deres funktionelle roller. Eksperimenter med antisense oligonukleotider der er komplementære til ERM protein sekvenser, har vist at ERM protein familien har essentielle funktioner in vivo og in vitro, i celle-celle og celle-substrat adhæssion og mikrovilli dannelse, samt dannelse af andre F-aktin holdige strukturer (Saotome I et al., 2004), (Shaw et al., 1998). I celler (muse-epithel celler og thymoma celler) hvor et eller to ERM proteiner er undertrykt, er der ikke fundet nogle fænotypiske ændringer, hvilket tyder på at proteinerne kan komplementere hinanden (Bretscher A et al., 2000;Mangeat P et al., 1999;Tsukita S & Yonemura S, 1997;Tsukita et al., 1994). 15

2.3.3 ERM proteins lokalisering Immunoblotting og immunofluorescence microskopi har afsløret, at i de fleste dyrkede epithel- og fibroblastceller er alle tre ERM proteiner co-ekspresseret og co-lokaliseret i specialiserede regioner, hvor aktin filamenter er tæt associeret med plasmamembraner, som f.eks. i mikrovilli, i filopodier og ved cellecelle/celle-matrix adhæsionssteder (Bretscher A et al., 2002;Sato et al., 1992;Tsukita & Yonemura, 1999;Vaheri A et al., 1997). Ezrin er blevet oprenset fra cytoskelettet af intestinal mikrovilli og er til stede i aktinindeholdende overfladestrukturer i flere celletyper (Bretscher, 1983). Radixin findes ligeledes i mikrovilli i hepatocytter og i aktin indeholdende celleoverfladestrukturer. Moesin er blevet identificeret gennem dens evne til at binde heparin og findes ligeledes i celleoverfladestrukturer i dyrkede celler. Selvom mange dyrkede celler udtrykker alle 3 ERM proteiner er situationen anderledes i native væv (Bretscher A et al., 2000), idet ERM proteinerne udviser en vævsspecifik ekspression. Ezrin findes især i tarm, mave, lunger og nyrer, moesin findes i lunger og milt, mens radixin findes i lever og tarm (Louvet-Vallee S., 2000;Mangeat P et al., 1999). 2.3.4 Struktur af Ezrin ERM proteinerne indeholder et ca. 300 residue NH 2 terminalt domæne, der direkte kan interagere med cytoplasmatiske domæner af transmembran proteiner, som CD44, CD43, EBP50, ICAM I, II og III. N- terminalen kan ligeledes binde signaleringsmolekylet PIP 2 og Rho-GDI (en regulator af Rho). Efter dette domæne findes der en α-helix region, der er efterfulgt af en F-aktin bindende region (se figur 2), (Turunen et al., 1994;Reczek & Bretscher, 1998). 1 296 468-474 585 Figur 15. En strukturel model for ezrins opbygning. I figuren er C- og N-terminale bindingssteder illustreret. * markerer de bindingssteder, der menes at være masket, når ezrin ikke er aktiveret. Øverst er de forskellige domæners længde angivet som aminosyre-længde. Området fra 468-474 indeholder et polyprolin område, hvis funktion stadig er ukendt. (figuren er modificeret fra (Bretscher et al., 1997). 16

2.3.5 ERM proteiners funktionsmekanisme At der findes både plasmamembran-binding og aktin-bindingsdomæner i ERM proteinerne, tillader dem at fungere som plasmamembran/aktin filament krydsbindere (Tsukita et al., 1994;Turunen et al., 1994). Association mellem aktin filamenter og plasmamembran giver strukturel support til plasmamembranen og er en nøgle komponent i opretholdelse af celleform og regulering af dynamiske aktin remodelerings processer (Denker SP et al., 2000;Bretscher A et al., 2000). ERM proteiner bliver konformationelt reguleret, således at de i deres inaktive stadie har masket deres NH 2 - og COOH-ERM associations-domæner (N- og C-ERMADs) og derved findes i en auto-hæmningskonformation (Ivetic A & Ridley AJ, 2004;Reczek & Bretscher, 1998). Et eller flere signaler kan aktivere ERM proteiner, der herved eksponerer sine bindingsteder ved begge terminale ender, hvorved de bliver i stand til at fungere som crosslinkere lige under plasmamembranen (Bretscher A et al., 2002;Louvet-Vallee S., 2000;Tsukita S & Yonemura S, 1997;Tsukita et al., 1994). Inaktiv ERM findes i cytosolet, mens aktiveret ERM er membran-associeret og binder med integral membranproteiner via deres N terminale FERM domæne og med F-aktin via deres C- terminal, hvilket er illustreret i figur 3 (Ivetic A & Ridley AJ, 2004;Reczek & Bretscher, 1998;Tsukita et al., 1994). ERM protein familiens kædning til plasmamembranen gennem FERM domænet, sker på flere måder, enten direkte via deres kædning til den cytoplasmatiske hale af membranproteiner med enkelt transmembran domæner, som CD43, CD44 og I-CAM 1-3 (Barret et al., 2000), eller indirekte gennem adaptor molekyler, som EBP50 (ERM-Binding phosphoprotein 50)/NHE-RF (Na + /H + exchangeregulatorisk faktor) med flere transmembrane domæner (Bretscher A et al., 2000;Mangeat P et al., 1999). Nedenstående figur illustrerer den direkte og den indirekte aktiveringsmekanismen for ezrin. Figur 16. En model for ERM protein familiens kædning til plasmamembranen. ERM proteiner findes i et hvilende, monomerisk form hvori FERM/N-ERMAD domæner er associerede med C-ERMAD. a) Et eller flere signaler aktiverer ERM, løsner den auto-hæmmende konformation og rekrutterer dem til plasmamembranen b) Aktiveret ERM kan herefter være en del af mikrofilament-membran kædning ved direkte association med membran proteiner, eller c) indirekte gennem scaffolding molekyler som EBP50/NHE-RF (Modificeret fra (Bretscher A et al., 2002). 17

At ERM proteiner translokeres til plasmamembranen/det kortiakle cytoskelet under hyperosmotisk skrumpning, er yderligere bekræftet via CLSM billeder med antistof rettet mod ERM og fosforyleret ERM i ELA celler, udført af Barbera Darborg og Stine Falsig Pedesen (Barbara Vasek Darborg et al., 2005), se figur 4. Isoton 1 min hyp 5 min hyp ERM Fosforyleret ERM Figur 17. Aktivering af ERM proteiner ved hyperosmotisk stress. I forsøget har de udsat ELA celler for isoton eller hyperton ringer og derefter mærket for hhv. ERM og fosforyleret ERM proteiner. Som det ses findes ERM proteiner både i cytosol og i kortikale regioner under isotonicitet, mens de translokeres ERM proteiner til cellens periferi under skrumpning (Rasmussen M et al., 2007). 2.3.6 Regulering af ERM proteiner Aktivering af ERM proteiner, resulterer i unmasking af deres funktionelle bindingssteder og sker som tidligere nævnt gennem konformationelle ændringer, udløst af et eller flere signaler. 2 signaleringsveje menes at medvirke til aktivering af ERM proteiner in vivo og in vitro; fosforylering af et konserveret threonin residue i aktin bindingsstedet (Thr 567 (ezrin)/thr 564 (radixin)/thr 558 (moesin)) i C-terminalen (Matsui T et al., 1999) og interaktion af fosfatidyl-inositol(4,5)bisfosfat med FERM domænet (Hirao et al., 1996;Niggli V et al., 1995). Tilstedeværelse af fosfolipider unmasker generelt membranprotein og F-aktin bindingstederne, mens fosforylering svækker FERM/hale interaktioner, således at de to domæner ikke kan interagere igen, når proteinet først er aktiveret, mens (Pearson MA et al., 2000). Se nedenstående afsnit for yderligere forklaring. 18

2.3.6.1 Regulering af ERM proteiner via PIP 2 I 1994 fandt Tsukita og kollegaer, at moesin co-precipiteres sammen med CD44 i Baby Hamster Kidney celler (BHK), samt at ERM proteiner generelt co-lokaliserer med CD44 i mikrovilli i BHK- og i L celler fra mus (Tsukita et al., 1994). Hirao og kollegaer (1996) fandt yderligere, at den N-terminale del af ERM binder direkte til det cytoplasmatiske domæne af CD44, mens fuldlængde (inaktiv) ERM kun binder, under lave salt koncentrationer eller ved tilstedeværelse af fosfoinositider, specielt PIP 2 (Hirao et al., 1996). ERM proteiner indeholder bindingssteder for PIP 2 (Niggli V et al., 1995), hvilket kan forklare deres afhængighed af PIP 2 tilstedeværelse for deres aktivering. PIP 2 er en vigtig second messenger i regulering af flere aktin-cytoskeletale dynamiker, idet PIP 2 binder og regulerer funktionen af mange aktin-bindende proteiner (Aspenstrom P., 1999;Hirao et al., 1996). Andre studier har fundet, at det cellulære nivaeu af PIP 2 stiger under osmotisk skrumpning i flere celletyper, samt at den skrumpningsinducerede translokation af ezrin til plasmamembranen ikke ses, når plasmamembranen er depleteret for PIP 2, hvilket indikerer at den skrumpnings-inducerede stigning i PIP 2 er det signal, der initierer skrumpnings-induceret ERM protein fosforylering (Barret et al., 2000;Fievet et al., 2004;Hirao et al., 1996;Rasmussen M et al., 2007). 2.3.6.2 Regulering af ERM proteiner gennem fosforylering Fosforylering af det konserverede threonin residue i ERM proteinernes C-terminal, er vigtig for ERM proteinernes krydsbindingsaktivitet, idet det generelt menes, at fosforylering af dette threonin residue, stabiliserer den aktive konformation af ERM proteiner, ved at hindre interaktion mellem deres N- og C terminale domæner, efter deres aktivering (Fievet et al., 2004;Hayashi et al., 1999;Tsukita S & Yonemura S, 1997). Flere Ser/Thr protein kinaser er ligeledes impliceret i regulering af ERM protein funktion gennem fosforylering af C terminalens konserverede threonin residue. Disse inkluderer bl.a. protein kinase C (PKC) og den ste20 relaterede Nck-interacting kinase (NIK), der fosforylerer ERM proteiner in vitro og/eller in vivo. Rho kinase medierer også ERM protein fosforylering in vitro (Matsui T et al., 1999;Tsukita S & Yonemura S, 1997), men det er kontroversielt om den spiller en rolle in vivo (Ivetic A & Ridley AJ, 2004;Nakamura N et al., 2000), eller om involvering af Rho i ERM protein aktivering sker gennem en anden Rho effektor nemlig fosfatidyl-inositol 4-fosfat-5 kinase (PI4P5K), der hæver det cellulære niveau af PIP 2 (Rasmussen M et al., 2007;Matsui T et al., 1999). Rhos rolle i fosforylering/aktivering af ERM er yderligere diskuteret i afsnit 2.5. 19

2.3.7 Inaktivering af ERM proteiner ERM protein inaktiveres ved defosforylering og resulterer i translokation af proteinet til cytoplasmaet (se (Louvet-Vallee S., 2000). ERM proteinerne inaktiveres ligeledes ved nedregulering af aktiveringssignaler (Tsukita & Yonemura, 1999), samt af myosin fosfatase der er en del af myosin-bindings subuniten af myosin fosfatasen. Denne fosfatase kan interagere med moesin og derved de-fosforylere moesin ved T558 in vitro (Ivetic A & Ridley AJ, 2004). 2.4 Rho GTPaser 2.4.1 Små GTP bindende proteiner Små GTP-bindende proteiner er monomere G proteiner, med en molekylær vægt på ml 20 og 40 kda. Der er blevet identificeret mere end 100 forskellige små G proteiner i eukaryote celler, fra gær til mennesker. Proteinerne kan inddeles i underfamilier, der strukturelt kan klassificeres i mindst 5 familier: Ras, Rho, Rab, Sar1/Arf og Ran, (Yoshimi Takai & Takuya Sasaki and Takashi Matozaki, 2001). Generelt regulerer Ras familien af GTPaser signaleringsevents, der fører til ændringer i gen-transkription, Rab og Arf familien kontrollerer dannelse, fusion og bevægelse af vesikel transport mellem membranafdelinger i cellen, mens Ran GTPaser regulerer både mikrotubuli organisering og nucleocytoplasmatisk protein transport (Sasaki T & Takai Y, 1998;Yoshimi Takai & Takuya Sasaki and Takashi Matozaki, 2001). I dette speciale er der kun arbejdet med Rho og det er derfor kun den, der nærmere vil blive beskrevet. Rho GTPaser inkluderer 14 forskellige familie medlemmer i mammale celler (Rac 1-3, Cdc42, TC10, RhoA-E, G, H og Rnd1 og 2), hvoraf de bedst karakteriserede er Cdc42, Rac og RhoA (Aspenstrom P., 1999). Rho/Rac/Cdc42 underfamilien (Rho familien) regulerer både cytoskelet reorganisering og gen ekspression. Rac regulerer lamellipodie dannelse og membran ruffling og cdc42 regulerer filopodium dannelse (Hall A., 1994), mens Rho fungerer som centrale regulatorer af organisering af aktin cytoskelettet i mange celletyper og er vigtige regulatorer af aktin polymerisering og myosin aktivitet, to vigtige drivende kræfter for det aktin-baserede cytoskelets bevægelse (Ridley AJ & HallA, 1994). Specifikt ser det ud til at Rho spiller en vigtig rolle i at styrke det kortikale cytoskelet, ved at facilitere perifer de novo F-aktin samling og ved at inducere translokation af kortaktin, et protein der fremmer aktin polymerisering og stabiliserer nyligt genereret aktin netværk (Ciano-Oliveira et al., 2003;Lewis et al., 2002). De fleste små G proteiner findes spredt i mammale celler og næsten alle celler har Ras, Rho, Rab, Sar1/Arf og Ran familier ekspresseret, selvom ekspressions niveauer af deres 20

medlemmer kan variere fra en celletype til en anden (Yoshimi Takai & Takuya Sasaki and Takashi Matozaki, 2001). 2.4.2 Rho som molecular switches Som andre G proteiner cycler små G-proteiner mellem et GDP-bundet inaktivt og et GTP-bundet aktivt stadie. Et opstrømssignal stimulerer dissociation af GDP fra den GDP bundne form, hvilket er efterfulgt af binding af GTP, der fører til en konformationel ændring af en effektor-bindingsregion, således at denne region interagerer med nedstrøms effektorer (Sasaki T & Takai Y, 1998;Yoshimi Takai & Takuya Sasaki and Takashi Matozaki, 2001). Denne mekanisme tilader GTPaser at cycle mellem en aktivt GTP bundet og en inaktivt GDP bundet konformation. Der findes mindst 3 typer af regulatorer for små G-proteiner (se figur 5). 1) GDP/GTP exchange protein (GEP), der stimulerer omdannelse fra den GDP-bundne form til den GTP-bundne form, 2) Guanine nucleotid dissociation inhibitorer (GDIs), der hæmmer denne reaktion og 3) GTPaseaktiverende proteiner (GAPs), der stimulerer omdannelse af den GTP-bundne form til den GDP-bundne form. I cytosolet danner Rho/Rac/Cdc42 protein et komplex med GDI og opretholder derved en GDPbunden inaktiv form. Den GDP bundne form bliver frigivet fra GDI ved en endnu ukendt mekanisme og bliver derefter omdannet til den GTP bundne form vha. GEP. Den GTP bundne interagerer herefter med nedstrøms effektorer, hvirefter den GTP bundne form omdannes til den GDP-bundne form, hvilket fører til dannelsen af et kompleks med GDI og det returnerer til cytosolen (Lewis et al., 2002;Yoshimi Takai & Takuya Sasaki and Takashi Matozaki, 2001). Gennem denne cyclus af aktivering og inaktivering, vil små G proteiner fungere som molecular switches, der transducerer opstrøms signaler til nedstrøms effektorer (Aspenstrom P., 1999;Ciano-Oliveira et al., 2003;Ivetic A & Ridley AJ, 2004;Sasaki T & Takai Y, 1998;Yoshimi Takai & Takuya Sasaki and Takashi Matozaki, 2001). Figur 18. Regulering af Rho-GTPase cyclen. 3 klasser af proteiner regulerer denne cycel. I ustimulerede celler er Rho- GTPaser opretholdt i et inaktivt stadie i cytoplasmaet, via binding til Rho-GDI. Flere RhoGDIs regulerer cyclingen af rho mellem membranen og cytoplasmaet (Yixian Zheng, 2004). Dissociation af Rho-GDI fra Rho, kan f.eks. ske gennem fosforylering eller interaktion med aktiverede og udfoldede ERM proteiner. Membran rekrutering og interaktion med RhoGEFs inducerer exchange af GDP for GTP på RhoGTPaserne. Når Rho-GTPaser er bundet til GTP kan den interagere og derved aktivere nedstrøms effektorer (f.eks. ROCK eller Rho-kinase). RhoGAPs inaktiverer RhoGTPaser ved at øge deres GTPase aktivitet, hvilket resulterer i accelereret hydrolyse af GTP til GDP (Yoshimi Takai & Takuya Sasaki and Takashi Matozaki, 2001). 21

Det hastighedsbegrænsende trin i GDP/GTP udvekslings reaktionen er dissociation af GDP fra den GDP bundne form (Bhattacharya M et al., 2004;Yoshimi Takai & Takuya Sasaki and Takashi Matozaki, 2001). Denne reaktion er langsom og stimuleres derfor af en regulator, kaldet GEP eller GEF (guanine nucleotide releasing factor), hvis aktivitet ofte er reguleret af et opstrøms signal. GEP interagerer først med den GDP bundne form og frigiver bunden GDP, hvilket danner et kompleks mellem små-g proteiner og GEP. GEP udskiftes herefter af GTP og danner derved den GTP bundne form. GDP/GTP udvekslings reaktioner fra Rho/Rac/Cdc42 proteiner bliver yderligere reguleret af en anden type af regulator, kaldet Rho-GDI. Denne type regulator hæmmer både basal og GEP-stimuleret dissociation af GDP fra den GDP-bundne form og opretholder små-g proteinet i den GDP bundne form. Rho GDI har større substrat specificitet end GEPs og GTPase aktiverings proteiner (GAPs) og de er aktive i alle Rho/Rac/Cdc42 proteiner (Yoshimi Takai & Takuya Sasaki and Takashi Matozaki, 2001). 2.4.3 Aktivering og effektorer af Rho GTPaser Signalering fra celleoverfladereceptorer til Rho proteiner, sker gennem f.eks. tyrosinreceptor kinaser og G-protein koblede proteiner (Hall A., 1994). Aktiveringen af Rho proteiner kan ligeledes ske gennem LPA, mitogener, integrin aktivering (Bishop AL & Hall A, 2000), (Pedersen et al., 2002), eller gennem vækstfaktorer som PDGF, EGF og insulin (Burridge K & Wennerberg K, 2004;Pedersen et al., 2002). Rho familien af GTPaser bliver stimuleret/aktiveret af hyperosmotisk stress (Tilly BC et al., 1996) (hvilket jeg også finder i dette speciale, se afsnit 4.3), samt ved en stigning i den intracellulære ion-styrke (i kidney proximal tubule (LLC-PK1) celler) (Ciano-Oliveira et al., 2003;Lewis et al., 2002). Osmotisk stress kan virke ved at ændre konformationen af overfladereceptorer for vækst faktorer og cytokiner og derigennem subverte deres tilknyttede signaleringsveje. Derved kan disse receptorer, som er kendte regulatorer af Rho familien af GTPaser, virke som potentielle osmosensorer (C.Di Ciano-Oliveira et al., 2006;DeMali KA et al., 2003). Der findes et hav af formodede nedstrøms effektorer for Rho (se figur 6). Blandt disse er Rho kinase (p164rokα og p160rokβ/rock isoformer), myosin light chain kinase (MLCK), protein kinase C (PKC) og p38 MAPK, der alle aktiveres af osmotisk stress og alle er vigtige modulatorer af organisering af det aktin-baserede cytoskelet (Pedersen SF & Hoffmann EK, 2002). ROCK (en serine/threonin protein kinase), også kaldet ROKa/Rho-kinase regulerer dannelse af stress fibre og fokale adhæsioner. Den fosforylerer mange substrat proteiner, som MLC fosfatase, LIM-kinase og ERM familien(takaishi K et al., 2000;Yoshimi Takai & Takuya Sasaki and Takashi Matozaki, 2001). Andre Rho effektorer inkluderer Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) og Phosphatinositol-4-phosphat 5 kinase (PI4P5 kinase), der er en del af den Rho-medierede F-aktin reorganisering (Pedersen et al., 2002). PI4P5 kinase fører til dannelse af PIP 2, der er en særlig vigtig regulator af den Rho inducerede aktin re- 22

organisering, idet den binder til GEFs af Rho familien og derved påvirker aktiviteten af flere aktinbindende proteiner in vitro, derfor er det muligt, at ved at øge niveauet af PIP 2, kan Rho inducere aktin polymerisering in vivo (Ridley AJ & HallA, 1994;Stossel, 1989;Zigmond SH., 1996). Det er ligeledes vist at p160 Rho-associeret kinase (p160rock) kan være involveret i aktivering af NHE1 (Tominaga T et al., 1998). Andre studier har dog fundet det modsatte, at NHE1 aktivitet sker uafhængigt af Rho-kinase (C.Di Ciano-Oliveira et al., 2006). Figur 19. Rho aktivering og effektorer. Signalering fra celleoverfladereceptorer til Rho proteiner, sker gennem f.eks. tyrosinreceptor kinaser og G-protein koblede proteiner. Nedstrøms for Rho findes et hav af effektorer, der kan regulere organiseringen af det aktin baserede cytoskelet. Figuren illustrerer nogle enkelte eksempler. 2.5 Reciprok regulering imellem Rho og ERM proteiner 2.5.1 Rho aktivering regulerer ERM protein aktivering Flere studier har peget på, at Rho aktiverer ERM proteiner. Det er bl.a. fundet at Rho-GDI co-lokaliseres sammen med ERM/CD44 komplekser i MDCK, Cos7- og i BHK celler in vitro. Da ERM proteiner ikke kan danne kompleks med CD44 før de er aktiveret, indikerer fundet af Rho-GDI i komplekset at Rho er involveret i aktiveringen af ERM proteinerne (Hirao et al., 1996;Tsukita et al., 1994). Ligeledes har forsøg med permeabiliserede BHK celler in vivo vist, at ERM proteiners association med CD44 (og derved deres aktivering) svækkes, når der ikke er Rho tilstede, mens associationen blev fremmes af tilstedeværelse af Rho, hvilket yderligere indikerer, at Rho er involveret i aktivering af ERM proteiner (Hirao et al., 1996;Takahashi K et al., 1998). Selvom Rho aktivering kan inducere ERM protein aktivering in vivo, kan aktiveringsmekanismer muligvis også være moduleret gennem andre Rho effektor 23