Flowcytometri. - Princip og praksis. DHS kursus for yngre læger 2017

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Størrelse: px
Starte visningen fra side:

Download "Flowcytometri. - Princip og praksis. DHS kursus for yngre læger 2017"

Transkript

1 Flowcytometri - Princip og praksis DHS kursus for yngre læger 2017

2

3 Flowcytometri - princip celle Antigenet = Markøren som cellen undersøges for, påvises ved hjælp af fluorescens fra det konjugerede Fluorokrom

4 Markør undersøgelse KM PB CerebroSpinalVæske Pleuravæske Ascites PSH Biopsimateriale

5 Markør undersøgelse +/neg Kvantitet Mønster

6 Markør undersøgelse Differentiering Diagnose? Myeloid/lymfoid? CR/MRD Proliferation Blaster/aplasi

7 Flowcytometer (BD Facs Canto II)

8 FLOWCYTOMETRETS OPBYGNING Dual laser flowcytometre kan excitere fluorokromer med 2 bølgelængder og opnå (mindst) 4-farve-fluorescens. Moderne flowcytometre har flere lasere og kan derved opnå mindst 10 parametre. (FACSCalibur)

9 FLOWCYTOMETRETS OPBYGNING (8 farver 10 parametre)

10 LYSSPREDNING FSC ~ størrelse Laserlys SSC ~ Granulering Spredningen af laserlyset giver oplysning om cellens størrelse og kompleksitet incl. granula i cytoplasmaet. (NB: Dette er ikke fluorescens)

11 LYSSPREDNING Ved hjælp af lysspredningen kan cellerne i prøven adskilles i hhv lymfocytter og monocytter = mononucleære celler (MNC) samt granulocytter. Hver prik = en event = en celle : FSC-H FSC Normal knoglemarv Series Mean % 95% conf. limits Neutrophil Eosinophil Lymphocyte Monocyte 0,3 0-0,8 Erythrocyte (Winthrobe tabel 2.6)

12 Lysspredning og fluorescens Med lysspredningen kan man vurdere forholdet mellem de forskellige populationer og indkredse (gate) en population Med fluorescensen kan man undersøge den gatede populations linie-tilhørsforhold og Differentieringsgrad Fluorescensintensitet korrelerer til epitop-tæthed (CD20, osv.) Med et panel af relevante monoklonale antistoffer kan man identificere de enkelte celler i prøven

13 Linie-Ag vs differentierings-ag Differentieringsantigener identificerer cellens modningsgrad Linie-antigener Linieantigener: identificerer f.eks myeloide, T- eller B- cellelinier

14 GRANULOCYTOID Myelo- Blast differentiering Promyel. Myeloc. Metamyel. PMN s. From: Loken & Wells: Imunophenotyping, Ch. 6, 2000

15 Flowcytometri - linieag Specifikke linieantigener: Myeloid: cympo T-celle: CD3 B-celle: CD19 + cycd79a, CD10, og/eller cycd22

16 Forward/side scatter vs SSC/CD45-gating Forward/side-scatter Side-scatter/CD45 Neutrofile MNC Lymphocytter R1 Blastvindue R5 R2 Monocytter Neutrofile R3 R4 Plasmaceller

17 Flowcytometrisk markørundersøgelse: Immunfænotypning af malign hæmatologisk sygdom Diagnostik af hæmatologiske sygdomme følger så vidt muligt: WHO-klassifikationen: Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW (Eds) IARC Press, Washington 2008

18 Markør undersøgelse - analysen Mønster genkendelse! Referencebillede af det normale kende de normale andele af cellepopulationer og disses markørudtryk = fænotype. Identifikation af abnorme/maligne celler aberrant ekspression! Eks.: raske T-celler har altid CD2+, CD5+ og CD7+ udover CD3. Identifikation af få syge celler blandt mange normale. Identifikation af linie og differentiering. Undgå faldgruber!

19 Flowcytometri aberrans Aberrante (= afvigende) markører: Ekspression af antigener der ikke normalt findes på denne celletype. Eller manglende ekspression. Evt ekspression af antigener fra andre linier (ses hyppigst ved akutte leukæmier).

20 Præ-B ALL R2 R1 R5 R3 No gate G1=R1 R6 R4 Precursor _B- og T-neoplasierne - her vist som precursor B-ALL (CD19+,CD10+) - er blastære (ligger i blast-vinduet) og udtrykker blastære differentierings- Antigener (CD34, TdT).

21 Immunfænotypning af moden B- lymfoproliferativ sygdom CD-nr./ SmIg FMC c Diagnose CL/SLL (+) + -/+ + +/- -/+ - -/+ - + B-PLL / /+ + Follikulært NHL /- -/ Waldenström IgM / /+ - + MCL / / HCL Splenic marg.zone NHL / /- - +

22 MALIGNE B-CELLE SYGDOMME VEJLEDENDE DIAGNOSTISK HIERAKI CD19-POSITIV: B-LYMFOCYT LETKÆDE RESTRIKTION: LYMFOM CD5-POSITIV CD5-NEGATIV CD23-POSITIV CD23-NEGATIV CD10-POSITIV CD10-NEGATIV SMÅ STORE MCL SMÅ STORE SMÅ CLL PLL? Richter? FL DLBCL MALTOM? SMZL? LPL? FORKORTELSER: CLL: KRONISK LYMFATISK LEUKÆMI; PLL: PRO-LYMFOCYT LEUKÆMI; MCL: MANTLE CELLE LYMFOM; FL: FOLLIKULÆRT LYMFOM: DLBCL: DIFFUST STORCELLET B-CELLE LYMFOM MALTOM: MUCOSA ASSOCIERET LYMFOM; SMZL: SPLENISK MARGINALZONE LYMFOM: LPL: LYMFOPLASMACYTÆRT LYMFOM (WALDENSTRÖM).

23 Lymfocyt analyse Rigshospitalet 2017

24 Flowcytometri med Euroflow/Infinicyte Adskillelse af clusters med 2 hhv 10 parametre

25

26 Euroflow Diagnose/Problemstilling PANEL 1 Tubes PANEL 2 Profil AIHA/Coombs pos. LST B-CLPD LST-Lim Akut Erythrocyt Leukæmi AML/MDS 1-7 AML Merge Akut Leukæmi ALOT Afhængig af fund. ALOT AML AML/MDS 1-4 AML Merge Amyloidose PCD + LST B-CLPD PCD-M + LST-Lim Anæmi AML/MDS 1-4 LST AML Merge APL (Akut promyelocyt Leukæmi) AML/MDS 1-4 AML Merge Aplastisk Anæmi (AA+SAA) AML/MDS 1-4 LST/PNH AML Merge Ascites SST Specifik for Diag SST B-ALL BCP-ALL B-ALL Merge Blastisk Plasmacytoid dendritcelle neoplasi AML/MDS 1-6 specielt glas 6 AML Merge Burkitt lymfom LST B-CLPD B-CLPD Merge CLL LST-Limited 3-5 B-CLPD LST Lim Merge CML AML/MDS 1-4 AML Merge CMML AML/MDS 1-4 AML Merge CSV ALL (B) BCP-ALL 1 Afh af evt Fænotype B-ALL CSV ALL (T) T-ALL 1 Afh af evt Fænotype T -ALL CSV NHL SST SST CSV Lymfoblast Lymfom BCP-ALL 1 Afh af evt Fænotype B-ALL Dendritceller/Plasmacytoide AML/MDS AML Merge DLBCL (Difust storcellet B-celle Lymfom) B-CLPD B-CLPD Merge Duncan Syndrom B-CLPD B-CLPD Merge Ny Paneloversigt

27 Flowcytometri med Euroflow/Infinicyte Single files Cluster analyse Merge files

28 Eksempel på panel (AML/MDS Euroflow Tube PacB PacO FITC PE PerCPCy5.5 PECy7 APC APCH7 Aim 1 HLADR CD45 CD16 CD13 CD34 CD117 CD11b CD10 Diagnosis and classification, neutrophilic maturation, PNH 2 HLADR CD45 CD35 CD64 CD34 CD117 CD300e (IREM2) CD14 Diagnosis and classification, monocytic maturation, PNH 3 HLADR CD45 CD36 CD105 CD34 CD117 CD33 CD71 Diagnosis and classification, erythroid maturation 4 HLADR CD45 NuTdT CD56 CD34 CD117 CD7 CD19 Aberrant expression of lymphoid markers, abnormal B lymphoid maturation 5 HLADR CD45 CD15 NG2 CD34 CD117 CD22 CD38 Aberrant marker expression, stem cells 6 HLADR CD45 CD42a and CD61 CD203c CD34 CD117 CD123 CD4 Diagnosis and classification of AML Megakaryocytic, basophilic, and plasmacytoid dendritic cell lineages 7 HLADR CD45 CD41 CD25 CD34 CD117 CD42b CD9 Characterization of megakaryoblastic leukemia, and systemic mastocytosis

29 Euroflow B-celle analyse med reference-images (MRD). Flere markører i samme glas Mere sofistikeret matematisk analyse Sammenligning med referencepopulation PCA = Principal Component Analysis Kalkulerede data

30 SVARAFGIVELSE: Svar består af en beskrivende del og en konklusion. Størrelse af populationer opgives som andel i procent af alle kerneholdige celler, med mindre andet er oplyst. Der svares i princippet kun på det, der er spurgt om. Eller - hvis velbegrundet - med et forslag til differentialdiagnose(-r). Eksempel: Fænotype: Knoglemarv med ca. 47% CD45neg., CD38++, delvis CD56+ atypiske plasmaceller med kappa letkæderestriktion. Konklusion: Plasmacelledyskrasi, foreneligt med Myelomatose. Svarer og evt supervisor anfører initialer og dato + evt. tlf.svar.

31 Markør analyse - god fornøjelse!

32 Infinicyt AML/MDS

33 Infinicyt Lymfom

34 Infinicyt Plasmacelledyskrasi

35 Case 1: Normal KM LST Cases Case 2: Normal PB LST (samme som ovenfor) Case 3: CLL Case 4: Nomal KM AML1-4 Case 5: AML (M0) Case 6: Præ B-ALL