Diskussion af forsøgsdesign

Transkript

1 Diskussion af forsøgsdesign Baggrund Hypotese Formål Materialer & metoder Resultater Diskussion Konklusion Perspektivering Litteratur

2 Talent med bredde UFT dag 1 Næringsstofoptagelse UFT dag 2 Tarmkræft

3 UFT dag 1: Næringsstofoptagelse 17. september 2013 Praktisk øvelse med humane tarmceller i absorptionsmodel Tidsplan)for)dagen:) 9.10%9.30' 9.30%11.30' ' ' ' ' 11.30%12.00' 12.00%13.30' ' Velkommen'og'introduktion'til'dagens'program;'introduktion'om'forskningsteam,' baggrund'for'dagens'øvelse,'celledyrkningsmetoder,'analysemetoder'og' forsøgsdesign.'(spu,&tsk,&dsgn,&akn,&kbp)' Cellelaboratoriet:) %'Gennemgang'af'øvelsen'om'næringsstofoptagelse.(TSK,&SPU)' %'Billedoptagelse'af'Caco%2'tyktarmsceller'i'kulturflaske'og'2%kompartmentmodel.' (KBP)' %'Måling'af'differentiering'af'tarmepithel'(transepithel'modstand;'TEER)'i' absorptionsmodel'(2%kompartment'model)'(nb:'cellerne'er'opsat'inden'øvelsen).' (DSGN)' %'Fremstilling'og'tilsætning'af'næringsstofopløsninger'til'cellekulturer'i' absorptionsmodel'(nb:'der'laves'ikke'gcms'analyse'på'materiale'fra'de'aktuelle' plader).&(akn)' Frokost' Mødelokalet:) %'Orientering'om'analyse'af'næringsstofkoncentrationer'ved'GC%MS.(BHL)' %'Resultater,'data'bearbejdelse,'diskussion'og'formidling'af'resultater'' ' '(Nb:'Resultaterne'stammer'fra'allerede'gennemført'forsøg).'(TSK,&SPU)' 13.30%13.45' 13.45%14.30' Pause) Cellelaboratoriet:) %'Gentagelse'af'måling'af'celledifferentiering'(TEER)'efter'en'behandlingsperiode.' (AKN,&DSGN)' 14.30%15.00' Mødelokalet:) %'Opsamling'og'diskussion'af'dagens'øvelse.'(SPU,&TSK,&DSGN,&AKN,&KBP)

4 Introduktion til celledyrkningsmetoder Mavetarm-kanalen MKN-45 Human mave cancer IEC-6 Rotte tyndtarm FHs 74 Human tyndtarm IPEC-J2 Porcin tyndtarm PPEC Porcin primær epithel Caco-2 Human colon cancer HT29 Human colon cancer HT29-MTX Human colon cancer LoVo Human colon cancer HCT-116 Human colon cancer Sw-480 Human colon cancer Colo-320 Human colon cancer CCK-81 Human colon cancer FHC Human colon Prostata LnCaP Human prostata cancer PC-3 Human prostata cancer DU-145 Human prostata cancer Hud PCS 200 Human epidermale keratinocytter PFIC Porcine primære fibroblaster Mælkekirtelvæv MCF-7 Human bryst cancer MVLN Human bryst cancer MDA-MB-231 Human bryst cancer MCF-10a Human bryst MAC-T Bovine mælkekirtelepithel PCC Primære bovine udiff. epithel PCC-2 Primære bovine diff. epithel Knogle U2-OS Human osteosarcoma SAOS-2 Human osteosarcoma Nervevæv SH-SY5Y Human nerveceller Andre væv RAW Mouse makrofager BFIC Bovine primære fibroblaster LW1 Porcine embryo fibroblaster SGBS Humane adipocytter

5 Kortkædede fedtsyrer short-chained fatty acids (SCFA) Kortkædede fedstyrer (SCFA: Short-chain Fatty Acids) er en undergruppe af fedtsyrer med "haler" af 2-6 carbon-atomer Disse fedtsyrer fremkommer ved fermentering af kostfibre i colon (tyktarmen). Optagelsen af de kortkædede fedtsyrer foregår igennem de differentierede tarmcellers epithel. 5

6 Konc. af SCFA i tyktarm (estimeret) Jf. Maud et al., British Journal of Nutrition (2009) 102, (grise) [mm] K5 (fys) K4 K3 K2 K1 Acetat ,5 8,75 4,375 Propionat ,5 2,25 1,125 Butyrat ,5

7 UFT Dag1 - Morfologi af celler i kulturflaske September 2013

8 UFT Dag1 Tarmceller i 2-kompartment model, parametre og analysemetoder Tarmceller i 2-kompartment model: SCFA koncentration ved GC-MS TEER ved Millicell ERS måling Tarmside Blodside

9 Fremgangsmåde Billedoptagelse 9

10 Fremgangsmåde Måling af differentiering af tarmepithel 10

11 Fremgangsmåde Fremstilling og tilsætning af næringsstofopløsninger til cellekulturer i absorptionsmodel 11

12 TEER measured September 2013

13 TEER-målinger 13

14 UFT Dag1 - Diskussion af resultater, data og formidling AI Assay 2 Acetat Propionat Butyrat Behandling Tid (t) Lumenside Blodside Lumenside Blodside Lumenside Blodside 1K1 0 4,615 0,035 1,035-0,009 0,548-0,001 [mmol/l] 2K1 4 4,305 0,445 0,963 0,113 0,398 0,040 3K1 24 3,714 1,213 0,717 0,274 0,053 0,037 4K2 0 8,714 0,035 2,146-0,009 1,059-0,001 5K2 4 8,276 0,529 1,970 0,175 0,868 0,073 6K2 24 7,172 1,956 1,548 0,602 0,320 0,160 7K3 0 17,248 0,035 4,297-0,009 2,097-0,001 8K3 4 16,872 0,825 4,043 0,309 1,814 0,151 9K ,953 3,599 3,210 1,156 1,042 0,456 10K4 0 34,184 0,035 8,385-0,009 4,059-0,001 11K4 4 31,580 1,285 7,662 0,467 3,437 0,282 12K ,233 6,232 5,950 2,008 2,429 0,922 13K5 0 64,782 0,035 15,016-0,009 7,681-0,001 14K5 4 60,064 2,018 14,450 0,665 6,971 0,361 15K ,176 32,706 3,089 11,497 1,410 6,048 Acetat K1 Lumen K1 Blod K2 Lumen K2 Blod K3 Lumen K3 Blod

15 UFT dag 2: Tarmkræft 1. oktober 2013 Praktisk øvelse med tarmceller i kultur September 2013 Tidsplan for dagen: Velkommen og introduktion til dagens program; baggrund for dagens øvelse, celledyrkningsmetoder, analysemetoder og forsøgsdesign.(spu, TSK, DSGN, AKN, KBP) Cellelaboratoriet: - Gennemgang af øvelsen om tarmkræft. (SPU, TSK) - Billedoptagelse af normale celler og kræftceller i kultur (IEC- 6, Caco- 2, HT29- MTX, MCF- 7, MAC- T). (DSGN) - Trypsinering af celler og opsætning af assay. (AKN, KBP) - Fremstilling af opløsninger til behandling (FCS og etoposide) og tilsætning til plade med celler, som har inkuberet 24 timer (Nb: vi måler effekter efterfølgende fredag). (AKN, KBP) Frokost Cellelaboratoriet: - Iagttag celler, der har været behandlet med FCS og etoposide i 72 timer, i mikroskop. Noter synlige effekter. (Nb: Pladerne er sat op 72 timer før øvelsen). (DSGN) - Mål effekter af FCS og etoposide- behandlinger fluorometrisk i plader hvor der er tilsat Alamar Blue opløsning (Nb. Alamar Blue opløsning er tilsat 2 timer inden øvelsen). (SPU) Fremstilling af materiale til klasseforsøg: - Tarmceller (kontrol) eller behandlet med etoposide i 6- brønds plade skrabes og overføres til rør (Nb: det materiale, der skal benyttes på uddannelsesstedet er fremstillet tidligere og udleveres) (KBP) Pause Mødelokalet: (SPU, TSK, DSGN, AKN, KBP) - Resultater, data bearbejdelse, diskussion og formidling af resultater - Opsamling og diskussion af dagens øvelse, evt.

16 UFT Dag 2 Baggrund for øvelsen Fakta: Hver 3. dansker bliver ramt af kræft inden 75 år Der findes over 200 forskellige kræftformer Årsagen til kræft er ofte et samspil mellem arv og miljø (kost, livsstil, motion mm.)

17 UFT Dag 2 Baggrund for øvelsen Tyktarmskræft er en kræftform, der udvikler sig som følge af forandringer i slimhindecellerne i tyktarmen. Forekomst af tyktarmskræft Tyktarmskræft kan opstå hele livet, men især efter 50-års alderen. Der er cirka nye tilfælde om året i Danmark. Sygdommen er lige så hyppig hos mænd som hos kvinder. Årsager Overvægt, alkohol og type 2 sukkersyge medfører en øget risiko for at udvikle tyktarmskræft. Men i nogle tilfælde er tyktarmskræft arvelig. Tyktarmen er cirka centimeter lang. Gennem tyndtarmen (5-6 m lang) optager kroppen næringsstoffer fra maden. Tyktarmen er fortsættelsen af tyndtarmen og fortsætter ned til endetarmen, som udgør de nederste 15 centimeter af tarmen. Screening for tarmkræft Alle personer i alderen år bliver fra 2014 tilbudt screening for tarmkræft hvert andet år. Undersøgelser viser, at screening for tarmkræft kan nedsætte dødeligheden af sygdommen. I dag bliver sygdommen opdaget sent hos 60 procent af patienterne, fordi symptomerne først giver sig til kende sent i sygdomsforløbet.

18 UFT Dag 2 Baggrund for øvelsen Hvad er kræftceller Celler der vokser ude af kontrol med resten af kroppens celler Forårsaget af gentagne mutationer i normale celler Nyrekræftceller. Farvet scanningsbillede af kræftceller (pink) fra en nyretumor. Kræftceller deler sig hurtigt og danner ofte klumper (tumorer) som kan invadere og ødelægge omliggende væv. Cellerne har dannet trådlignende cytoplasmatiske projektioner fra overfladen. Behandlingomfatter kirurgisk fjernelse af det syge væv eventuelt kombineret med kemoterapi. Forstørrelse: x1300 ved 6x7cm størrelse.

19 UFT Dag 2 Baggrund for øvelsen Behandling af kræft Operation: Hovedparten af alle kræftpatienter (60 pct.) bliver opereret. Ved operationen (kirurgisk behandling) skæres det kræftsyge væv eller organ væk, eventuelt sammen med lymfeknuder i nærheden. Strålebehandling: Strålerne (som regel røntgenstråler) virker ved at påvirke kræftcellernes arvemateriale, så de enten dør eller holder op med at dele sig. Målet er at give en stråledosis stor nok til at ramme kræftcellerne uden at skade sundt væv. Men strålehandling påvirker udover kræftcellerne også kroppens normale celler, og det er denne påvirkning, der kan give bivirkninger. Ved at give behandlingen over mange gange, får de normale celler tid til at reparere sig selv. Normale celler er mere robuste og bedre til at reparere skader end kræftcellerne, og derfor kommer de fleste normale celler sig efter bestrålingen. Kemoterapi: Behandling med stoffer, der standser cellers deling på forskellig måde. Kemoterapi påvirker ikke kun kræftcellerne, men også kroppens normale celler. Det er denne påvirkning, der kan give bivirkninger som hårtab, kvalme og problemer med slimhinderne. Der findes mange forskellige typer kemoterapistoffer, og de kaldes cytostatika eller cellegifte. Cytostatika angriber især de celler, der deler sig hurtigt, sådan som kræftceller gør. Anti-hormonbehandling: Brystkræft og livmoderkræft stimuleres af det kvindelige kønshormon østrogen. Prostatakræft er afhængig af det mandlige kønshormon testosteron. Ved hormonfølsomme kræfttyper kan man fjerne eller dæmpe kroppens produktion af hormon så kræftcellernes vækst ikke stimuleres og sygdommen vil udvikle sig langsommere. Andre behandlingsformer er immunterapi, genterapi og stamcelletransplantation.

20 UFT Dag 2 Baggrund for øvelsen Kemoterapi dræber hurtigt-delende celler ved apoptose Kemoterapi Kerne-kondencering DNA fragmentering Denne proces medieres ved aktivering af caspase-3

21 UFT Dag 2 Baggrund for øvelsen Etoposide Etoposide er et kræfthæmmende stof som binder og inaktiverer enzymet topoisomerase II så spaltning og samling af hhv. dobbelt- og enkeltstrenget DNA ikke kan forekomme. Etoposide blokerer cellecyklus I S-fasen og G2- fasen og inducerer apoptose.

22 UFT Dag 2 Celledyrkningsmetoder Cellebaserede modeller Suspension, adhæsion, 2-kompartment, co-kultur Tarmside Blodside

23 UFT Dag 2 Cellebaserede modeller Mavetarm-kanalen MKN-45 Human mave cancer IEC-6 Rotte tyndtarm FHs 74 Human tyndtarm IPEC-J2 Porcin tyndtarm PPEC Porcin primær epithel Caco-2 Human colon cancer HT29 Human colon cancer HT29-MTX Human colon cancer LoVo Human colon cancer HCT-116 Human colon cancer Sw-480 Human colon cancer Colo-320 Human colon cancer CCK-81 Human colon cancer FHC Human colon Prostata LnCaP Human prostata cancer PC-3 Human prostata cancer DU-145 Human prostata cancer Hud PCS 200 Human epidermale keratinocytter PFIC Porcine primære fibroblaster Mælkekirtelvæv MCF-7 Human bryst cancer MVLN Human bryst cancer MDA-MB-231 Human bryst cancer MCF-10a Human bryst MAC-T Bovine mælkekirtelepithel PCC Primære bovine udiff. epithel PCC-2 Primære bovine diff. epithel Knogle U2-OS Human osteosarcoma SAOS-2 Human osteosarcoma Nervevæv SH-SY5Y Human nerveceller Andre væv RAW Mouse makrofager BFIC Bovine primære fibroblaster LW1 Porcine embryo fibroblaster SGBS Humane adipocytter

24 UFT Dag 2 - Øvelsen Morfologi og billedoptagelse af normale celler og kræftceller Normale celler: Normale IEC-6 tyndtarmsepithelceller fra rotte MAC-T yver-epithelceller fra ko Kræftceller: Caco-2 humane tyktarmsepithelceller HT-29-MTX humane tyktarmsepithelceller (goblet) MCF-7 humane brystepithelceller Cancer

25 UFT Dag 2 - Cellebaserede modeller, parametre og analysemetoder Celler på bund af 96-brønds plader: Celler behandlet med vækst-stimulerende opløsning (FCS) og kemoterapeutikum (etoposide) Cellevækst måles ved Alamar Blue fluorometri (mitochondrie-aktivitet) Cellevækst kan også måles ved PicoGreen fluorometri (DNA mængde)

26 UFT Dag 2 - Diskussion af resultater, data og formidling FHs74Int IPEC FHC Flat HCT-116 HT-29 Caco-2 Rounded

27 UFT Dag 2 - Diskussion af resultater, data og formidling Mikroskopisk vurdering af effekt af behandlinger Celler behandlet med FCS og etoposide i 72 timer 0.6% FCS 10% FCS Etoposide Kontrol - Næsten konfluent lag Voksende - Konfluent lag Apoptotisk - Kondenseret kromatin - Fragmenteret kerne

28 UFT Dag 2 - Diskussion af resultater, data og formidling Morfologi af normale celler og kræftceller

29 September 2013 UFT Dag 2 - Diskussion af resultater, data og formidling Vækst af normale celler og kræftceller i kultur

30 Fremgangsmåde Billedoptagelse 30

31 Fremgangsmåde Trypsinering af celler og opsætning af assay 31

32 Fremgangsmåde Fremstilling af opløsninger til behandling og tilsætning til plade med celler 32

33 UFT Dag 2 - Diskussion af resultater, data og formidling Cancerceller adskiller sig ved: Morfologi (klumper) Vækst (> normale celler) Vokser uden vækstfaktorer/serum Bliver ved med at vokse i tilstedeværelse af vækstfaktorer/serum (ingen kontakt-inhibering) Aldres ikke (bliver ved med at dele sig) Mangler apoptose regulering ved DNA beskadigelse Aneuploidy (kromosomændringer) Anaerob metabolisme (glykolyse) medfører laktat dannelse der stimulerer tumorvækst

34 UFT Dag 2 - Diskussion af resultater, data og formidling Assay 103 Caco- 2 AlamarBlue Plade 1 FCS 0 0,625 1,25 2, middel sem Fluorocens Assay 103 Caco- 2 FCS kurve AlamarBlue 0 0,625 1,25 2, %FCS Plade 2 Etoposide 0 0, middel sem Fluorocens Assay 103 Caco- 2 Etoposide kurve AlamarBlue 0 0, µm Etoposide

35 UFT Dag 2 - Diskussion af resultater, data og formidling PicoGreen Plade 3 FCS 0 1,25 2, middel sem Fluorocens Assay 103 Caco- 2 FCS kurve PicoGreen ,25 2, % FCS Plade 4 Etoposide 0 0, middel sem Fluorocens Assay 103 Caco- 2 Etoposide kurve PicoGreen 0 0 0, µm Etoposide