AARHUS UNIVERSITET. Til Landbrug- og Fiskeristyrelsen

Transkript

1 AARHUS UNIVERSITET DCA NATIONALT CENTER FOR FØDEVARER OG JORDBRUG Til Landbrug og Fiskeristyrelsen Vedr. bestillingen: Redegørelse for kategorisering og bestemmelse på europæisk plan af kartoffelsorters resistens overfor Synchytrium endobioticum (kartoffelbrok). Landbrug og Fiskeristyrelsen har i bestilling dateret d. 29. februar 2016 bedt DCA Nationalt Center for Fødevarer og Jordbrug om levering af en redegørelse for kategorisering og bestemmelse på europæisk plan af kartoffelsorters resistens overfor Synchytrium endobioticum (kartoffelbrok). Besvarelsen er en del af et flerårigt forløb med delrapporter og afslutning efter nærmere aftale, og er udarbejdet af seniorforsker Bent J. Nielsen, Institut for Agroøkologi, Aarhus Universitet. Besvarelsen er udarbejdet som led i Aftale mellem Aarhus Universitet og Fødevareministeriet om udførelse af forskningsbaseret myndighedsbetjening m.v. ved Aarhus Universitet, DCA Nationalt Center for Fødevarer og Jordbrug, (punkt BP 208 i Aftalens Bilag 2, og P1.06 i Arbejdsprogram 2017 for Ydelsesaftale Planteproduktion, ). DCA Nationalt Center for Fødevarer og Jordbrug Lars Bødker Specialkonsulent Dato. 9. marts 2017 Direkte tlf.: Mobiltlf.: lars.bodker@dca.au.dk Afs. CVRnr.: Reference: lab Journal Venlig hilsen Lars Bødker Kopi til Innovation DCA Nationalt Center for Fødevarer og Jordbrug Aarhus Universitet Blichers Allé Tjele Tlf.: Fax: dca@au.dk

2 DCA Nationalt Center for Jordbrug og Fødevarer 9. marts 2017 Redegørelse for kategorisering og bestemmelse på europæisk plan af kartoffelsorters resistens overfor Synchytrium endobioticum (kartoffelbrok) 6. marts 2017 Bent J. Nielsen, Institut for Agroøkologi, Aarhus Universitet Indholdsfortegnelse 1. Baggrund 2. Indledning 3. Patotyper 4. Baggrund for resistens 5. Test for resistens mod kartoffelbrok 6. Forskning i kartoffelbrok 7. Forslag til liste over kartoffelsorter ned resistens mod kartoffelbrok 8. Sammendrag 10 Anbefalinger 11. Referencer 12. Appendiks 1 1. Baggrund Landbrugs og Fiskeristyrelsen (tidligere NaturErhvervstyrelsen) har bestilt en løbende redegørelse for kategorisering og bestemmelse på europæisk plan af kartoffelsorters resistens overfor Synchytrium endobioticum (kartoffelbrok). Bestillingen er ad hoc under emnet BP13: Generel rådgivning vedr. forekomst, udbredelse og diagnostik af planteskadegørere. AU anmodes om at identificere og følge det væsentligste europæiske arbejde omkring resistenskarakteristik og sortsudvikling for kartoffelbrok og komme med anbefalinger til en dansk liste med resistente sorter. Det er Fødevarestyrelsens Diagnostiske Laboratorium, der varetager og følger det europæiske arbejde omkring diagnostik af kartoffelbrok samt patotypebestemmelse. Der vil derfor i denne besvarelse blive lagt hovedvægt på at beskrive det væsentligste europæiske arbejde omkring resistenskarakteristik og sortsudvikling for kartoffelbrok. 1

3 Bestemmelse af patotype vil blive kort gennemgået som baggrund for forståelse af karakteriseringen af resistens. 2. Indledning Kartoffelbrok (Synchytrium endobioticum) forekom med større udbredelse fra slutningen af 1800tallet op til 1950erne og er siden kun set ved mindre udbrud. I nyere tid er angreb beskrevet fra 1981 og fra 2014, hvor der i 2014 blev set angreb i en mindre afgrænset mark i Jylland med produktion af stivelseskartofler (Anon, 2014a, b). Fundet og omfanget blev undersøgt nærmere, og jordprøver afslørede kartoffelbrok på flere marker, sandsynligvis fra vaskevand fra en stivelsesfabrik. Der blev i Midtjylland 2014 samlet set fundet brok på 216 ha fordelt på 25 marker på de tre bedrifter (Anon, 2015a). Fundet blev gjort omkring Sunds (Anon 2014c). Der blev iværksat en indsats i forhold til at afgrænse, bekæmpe og overvåge kartoffelbrok, herunder, at inficererede arealer båndlægges i forhold til kartoffelavl i en årrække. (Anon, 2015). Landbrugs og Fiskeristyrelsen udtog jordprøver omkring de angrebne marker, og der blev oprettet såkaldte bufferzoner med særlige regler for avl af kartofler. Der var ingen fund i 2015, men i november 2016 blev der igen fundet kartoffelbrok i en enkelt mark i Midtjylland med stivelseskartofler (Anon, 2016a). Kartoffelbrok er en EUkarantæneskadegører, og ved udbrud træder Landbrugs og Fiskeristyrelsens beredskabsplan for håndtering af udbrud i kraft. I planen indgår, at marker, der er smittede, båndlægges og der må ikke dyrkes kartofler i en årrække. Der etableres en bufferzoner om de smittede arealer, hvori der kun må dyrkes resistente kartoffelsorter og der udføres afgrænsende undersøgelse af jordprøver udtaget fra udvalgte marker omkring fundet (Anon, 2016b). EU kartoffelbrok direktivet (EU direktiv 69/464, Anon, 1969) angiver som vigtigste bekæmpelse anvendelse af sorter, der er resistente over for specifikke patotyper, især i bufferzonerne, der omgiver de inficerede arealer. Kravet til de resistente sorter, der må dyrkes i bufferzonen er, at de er resistente mod den fundne patotype. En sort betragtes som tilstrækkelig resistent mod en patotype, når sorten reagerer mod infektion af samme patotype i en grad således, at der ikke er risiko for sekundær infektion (Anon, 1969). Test for resistens er en biologisk undersøgelse med variation og usikkerheder, og det kan være vanskeligt præcist at afgøre det nøjagtige resistensniveau. I denne udredning vil metoder for bestemmelse af resistens blive gennemgået, og resultater fra forskelige undersøgelser vil blive sammenstillet. Der vil blive bragt et forslag til en dansk sortsliste med angivelse af hvilke soter, der kan betragtes som fuldt resistente mod de fremherskende patotyper. 3. Patotyper af kartoffelbrok Kartoffelbrok forekommer i forskellige patotyper (smitteracer). Indtil 1941 var det kun patotype 1 (den almindelige patotype D1), der var beskrevet. Gennem 2

4 forædlingsarbejde i første halvdel af det 20. århundrede var de fleste sorter resistente over for denne patotype. Siden er en lang række patotyper dukket op. De første fund blev gjort i det tidlige Østtyskland og nye fund er hovedsagelig gjort i Tyskland, Tjekkiet samt flere østeuropæiske lande. Paradoksalt nok er der ikke fundet nye patotyper i UK til trods for, at det første fund (patotype 1) blev gjort i England i 1876 (Langerfeld, 1984; Baayen et al. 2006) Patotype 2 (G1) og 3 (S1) blev fundet i Senere er patotyperne 4 (P1,1943), 9 (R1, 1950), 5 (K1,1951), 6 (O1,1952), 8 (F1, 1954) og 10 (E1, 1956) beskrevet. Seneste samlede beskrivelse fra 2006 viser 39 patotyper (Baayen et al., 2006). I EPPO området er det især patotype 1, 2, 6 og 18 der forekommer. Patotype 8 er beskrevet fra Tyskland, men med få udbrud og i mindre udstrækning end for patotype 2, 6 og 18 (Flath, 2017, pers. com). Patotype 8 er omtalt for et enkelt dansk isolat, som er testet i en tysk og polsk undersøgelse (Busse et al., 2017). Patotype 18 (T1) er først beskrevet fra Tyskland (1978) og siden fra Holland i 2001 (Baayen et al., 2006) samt fra Sverige (Listerlandet, Blekinge ved Sølvesborg, Nordin 2017, pers, com). I Holland forekommer patotype 1 kun i den sydøstlige del af landet, mens patotype 2, 6 og 18 forekommer i den nordlige og østlige del af landet (Anon, 2014d). De første fund af nye patotyper blev beskrevet efter lokaliteten fulgt af et løbenummer, f.eks. G1 i Giessübel. Navngivningen (kode system) er nu standardiseret og i dag (og i denne udredning) anvendes kun det almindelige nummersystem uden lokalitetsangivelsen. Der henvises til Baayen et al., 2006 for detaljer om patotyper. Bestemmelse Bestemmelse af patotyper foregår i dag ved brug af test på forskellige sorter (differentialsortiment). Der arbejdes på, at udvikle velegnede molekylærbaserede metoder, men indtil videre er der ikke udviklet brugbare metoder. Udgangspunktet er EPPO protokollen PM 7/28 (Anon, 2004), hvori indgår to metoder: Spieckermann metoden eller GlynneLemmerzahl metoden (Obidiegwu et al., 2014). Metoderne er nærmere beskrevet under afsnittet om resistens. De fleste EU lande anvender det samme differentialsortiment til at differentiere mellem patotyperne (tabel 1). Af de 10 anvendte sorter, som kan anvendes, er det kun fire sorter, der er kommercielt tilgængelige (Obidiegwu et al., 2014). 3

5 Tabel 1. Differentialsortiment til identifikation af patotyper af S. endobioticum (Obidiegwu et al., 2014). Med dette differentialsortiment kan der teoretisk karakteriseres 64 patotyper (2 6 ), men i praksis er det kun patotyperne 1, 2, 6, 8 og 18, der er fundet almindeligt udbredte. Patotype 6 og 8 adskiller sig kun ved deres reaktion mod sorten Delcora, og patotype 8 og 18 adskiller sig kun ved deres reaktion mod sorten Miriam. Bestemmelse af patotyper foregår i Europa hovedsageligt i Polen (IHAR), Holland (HLB) samt i Tyskland (JKI). I Tyskland foregår patotypebestemmelse sædvanligvis ved plantebeskyttelsesenhederne i de forskellige delstater, men JKI bistår og kan udføre testen (Flath, 2017, pers. com). Patotypebestemmelse foregår ved de samme enheder, som udføre resistenstest. Resistenstest omtales senere under afsnittet resistens. EPPO Der foregår i EPPO regi et standardiseringsarbejde, hvor EPPO protokollen revideres. Patotype 18 blev fundet i Holland , og der var på det tidspunkt også spørgsmål til forekomst af patotype 8 (baseret på egne hollandske differentialsortiment). Der er blandt de europæiske institutioner, som tester for resistens, en diskussion af identiteten af patotype 8. Patotype 8 og 18 anses for at være meget ens (Przetakiewicz, 2017, pers), og der er ikke er tilgængelige differentialsorter, som giver en entydig (clear cut) differentiering mellem P8 og P18 (+/ dannelse af broksvulster; Flath, 2017, pers. com.). EPPO protokollen for patotypebestemmelse PM 7/28 er for øjeblikket ved at blive revideret (Panel on Diagnostics in Mycology), og i den nye version forventes patotype 8 at blive taget op til diskussion (Leeuwen, 2017 pers. Com; Flath, 2017, pers.com). Den reviderede EPPO protokol forventes diskuteret ved panelets næste møde maj Baggrund for resistens Forædling mod kartoffelbrok var fra starten meget succesfuld, idet man benyttede sig af et dominant gen, der fuldstændig blokerede for udvikling og reproduktion af den først introducerede patotype 1 (D1). Udbredelse af sorter med denne resistens medførte, at kartoffelbrok blev næste udryddet i Europa og USA (Baayen et al., 2005). Men fra 1941 begynder der at dukke nye patotyper op, som er mere vanskelige at bekæmpe og udrydde end den oprindelige patotype (P1). Resistens mod 4

6 patotype 1 styres af et enkelt dominant gen, Sen1 (kromosom XI) muligvis i kombination med andre der modificerer eller undertrykker phenotypen. Undersøgelser med patotype 2, 6 og 18 tyder på, at resistens mod kartoffelbrok er et resultat af vekselvirkning mellem multiple loci (Sen loci) på mindst tre kromosomer, som afhænger af den genetiske baggrund (Obidiegwu et al., 2014b). Forædling af resistens mod de nye patotyper vanskeliggøres derfor af mangel på dominante major resistensgener og kun få sorter er fuldstændig resistente. 5. Test af resistens mod kartoffelbrok Forædling mod kartoffelbrok har som en afgørende forudsætning, at der kan foretages en sikker screening for resistens. Historisk blev dette udført på naturlig eller kunstig smittede arealer, men på grund af variation i vejrforhold, forskel i smittegrad og generel lav kapacitet, så foregår screening i dag ved anvendelse af test under laboratorieforhold. Der anvendes grundlæggende de samme metoder som for bestemmelse af patotyper (Obidiegwu et al., 2014): Spieckermann metoden: Smittemateriale er kompost med vintersporangier. GlynneLemmerzahl metoden: Infektion af unge spirer med zoosporer direkte produceret fra sommersporangier fra frisk brokvæv, der bringes i tæt kontakt med spirerne på enten hele kartofler eller afskårede knoldender. Marktest. En endelig test af resistens kan foretages i væksthus eller mark, men det udføres ikke i dag. I Tyskland og Holland anvendes GlynneLemerzahl metoden, da den (i Tyskland og Holland) anses for at være pålidelig og effektiv (Obidiegwu et al., 2014). I Holland anvendes Spieckermann metoden, hvor kompost med vintersporangie anvendes som inokulum. Da vintersporangierne ikke spirer så hyppigt og mere uregelmæssigt end sommersporangierne, giver det generelt et laver infektionstryk. Med Glynne Lemmerzahl metoden er infektionstrykket højere (frisk brokvæv med tusindvis af zoosporer frigjort på samme tid). Dette kan være forklaring på, hvorfor nogle sorter, der er testet som resistente i nogle undersøgelser, er modtagelige i andre undersøgelser med højere infektionstryk (Przetakiewicz, 2017, pers.com.). EPPO protokollen PM 7/28 (Annon, 2004) anbefaler begge metoder. Den oprindelige protokol er efterfølgende blev modificeret lidt af de enkelte laboratorier for eksempel med hensyn til om der benyttes hele eller afskårne kartofler, forbehandling af knoldene, inkubationstemperatur og tid (Obidiegwu et al., 2014). Reaktionstype på spiren beskrives i begge metoder efter samme skala (modificerede Langerfeld skala, Langerfeld et al, 1994), som beskrevet i tabel 2 og tabel 3. 5

7 Tabel 2. Klassifikation og gruppering af reaktionstyper ved test af resistens mod kartoffelbrok (Langerfeld og Stachewiez, 1994; Obidiegwu et al., 2014). Tabel 3. Klassifikation af reaktionstyper i hollandske og tyske resistenstest. Oversigt baseret på Anon 2004 (EPPO), Langerfeld og Stachewiez, 1994; Obidiegwu et al., 2014; Anon 2015b). Tabellen angiver hvordan de forskellige resistensklasser betegnes i de forskellige lande. EPPO Holland Tyskland Beskrivelse A R1 Resistant 1 Resistant RG1 Ekstremt resistent B R1 P Resistant 2 Resistant RG1 Resistent C R2 F Resistant 3 Resistant RG2 Svag resistent D S1 R Wenig vatbar WV. 1 af flere Rtyper 4 schwach anfällig Svag modtagelig E S2 I wenig vatbar/vatbar WV/V NL type IV 5 anfällig Ekstremt modtagelig tabel fortsat Resistensreaktioner A R1 Tidlige afværgenekroser, ingen tegn på dannelse af sorus B R1 Sene afværgenekroser, sorus delvis synlig, men umodne eller nekrotiserer før modenhed C R2 Meget sene afværgenekroser eller spredte infektioner, op til 5 modne sori D S1 Spredte infektioner, sori eller sorus felt ikkenekrotiseret E S2 Tæt infektionsfelt, mange modne sori. Tydelig tumordannelse (sorus er en kompakt ansamling af sporangier) Sorterne angribes i infektionsøjeblikket lige kraftigt af broksvampen, men svampens senere udvikling hæmmes i forskellig grad. Hos nogle sorter forekommer der slet ingen sekundær infektion, idet svampen (prosorus) hurtigt går til grunde, inden der dannes modne sporangier. Cellerne omkring den inficerede værtcelle og tilstødende celler danner en art sårvæv (nekrose), hvorefter værtcellen går til grunde (ekstrem resistente R1 i tabel 3). Fra ekstrem resistent er der forskellige grader af resistens, fra resistent med sene afværgenekroser (R1/B) til svag resistens med meget sene afværgenekroser (R2) (Mygind, 1957). Under inkubationen forekommer der nekrotiske striber i spirens længdevækst (Langerfeld og Stachewiez, 1994). Sorter, der i laboratorietesten viser nekroser omkring alle infektionsfoci eller sorter der undertiden danner op til fem modne sporangier spredt i plantevævet og som til sidst danner nekroser om all foci, forventes alle at være resistente under markforhold (Baayen et al., 2005). Risiko for sekundær infektion, og altså modtagelighed, sættes i tabel 2 og 3 ved mere end fem modne, ikkenekrotiske sporangier pr spire, dvs. at gruppe AC (resistensgruppe R1R2) karakteriseres som resistent. Hvis der dannes 6

8 mere end fem sporangier pr spire, benævnes sorten modtagelig og deles i svagt modtagelig (S1, D) eller stærkt modtagelig (S2, E), hvis der også dannes brokvæv (EPPO, 2004). Direktivet anbefaler ikke bestemte metoder men sætter et fytosanitært grænse med hensyn til risiko. Der kræves ikke fuldstændig resistens, men kun en resistens, der kan sikre, at der ikke kan forekomme sekundær infektion i afgrøden eller i efterfølgende afgrøder af samme sort. Det er således sortens evne til at forhindre svampen i at fuldende sin livscyklus og danne sekundære infektioner, der er afgørende. Ud fra et karantæne synspunkt deles sorterne i klasser: resistente og modtagelige (Baayen et al., 2005). Test for resistens udføres i Europa ved HLB, Holland. Test i Holland blev i sin tid udført af NVWA (Plant Protection), men de seneste mange (25) år, er testen udliciteret til HLB, og HBL står for den officielle hollandske test (under opsyn af NVWA). Som testmetode anvendes Spieckermann s metode (se ovenfor), men i dag kan forædlere vælge mellem Spieckermann eller GlynneLemerzahl metoden ved test af for patotype 1 (Boerma, 2017, pers. com). Sortsliste er publiceret Anon, 2017a ( Averis, Holland. Forædlingsfirma, der tester egne sorter ( Agrico, Holland. Forædlingsfirma, der tester egne sorter ( IHARPIB, Plant Breding and AcclimatizationInstitute, Polen. Udfører den officielle test efter GlynneLemerzahl metoden. Sortsliste er publiceret Anon 2017f. ( 20Quarantine%20Organisms%20) Julius KühnInstitut, Kleinmachnow (JKI), Tyskland. Udfører den officielle test i Tyskland efter GlynneLemerzahl metoden. Sortsliste er publiceret Anon, 2017e. 16_B6_Kartoffelsorten_Resistenz_Kartoffelkrebs.pdf SASA, Skotland. Er ansvarlig for den officielle test i UK. Der testes kun for resistens mod patotype 1, da det historisk kun har været denne type, der forekommer i UK. Sidste udbrud var i 1977 (Schlenzig, SASA, 2017 pers.com.) Det fremgår af ovenstående, at det både i Tyskland og Polen er de officielle myndigheder, der udfører resistenstesten, mens der i Holland også udføres 7

9 resistenstest ved forædlingsfirmaer. Henvisning til de officielle lister fra Tyskland, Holland og Polen er angivet under referencer. I Danmark får LKF Vandel udført deres screeningstest for resistens overfor kartoffelbrok ved enten IHAR, Polen eller HLB, Holland (Olsen, 2017, pers.com.). Det har ikke været muligt at identificere andre steder, hvor der aktivt foregår test af resistens. I Sverige sendes sorterne til Holland. I Frankrig var det tidligere INRA, der stod for testen (patotype 1), men det stoppede i begyndelsen af 2000tallet. Kartoffelbrok anses ikke for problem i Frankrig, og der er ikke gjort fund i nyere tid. (Didier, 2017, pers.com.) Patotype 8 og patotype 18 Der testes med patotype 1, 2, 6 og 18. Patotype 8 indgår ikke de officielle tyske eller hollandske undersøgeler. I Tyskland har man vurderet, at patotyperne 8 og 18 er så nært beslægtede (som beskrevet i afsnittet om patotyper), at de er svære at adskille dem i test. Da P18 dukkede op i Tyskland blev det besluttet ikke at teste med P8 mere (Flath, 2017). Patotype 8 og 18 adskiller sig kun ved deres reaktion mod sorten Miriam (tabel 1). Sorten Miriam danner svulster i marktest mod patotype 18, men ikke mod patotype 8. Men i laboratorietesten, hvor infektionstrykket er højere, kan Miriam være modtagelig mod begge patotyper (Przetakiewicz, 2017, pers.com.). Da identiteten af patotype 8 er diskutabel, så vil den antageligvis udgå af den fremtidige EPPO protokol (se ovenfor). Sorter der er beskrevet som resistente over for patotype 18 anses sædvanligvis også for at være resistente over for patotype 8 (Leeuwen, 2017, Flath, 2017, Przetakiewicz, 2017, pers. com) eller med meget lille forskel (Boerma, 2017 pers. Com). Det har ikke været muligt, at finde undersøgelser, hvor sorterne er testet for specifik resistens mod patotype 8. Der er kun fundet oplysninger om resistens mod patotype 8 i polske undersøgelser af få sorter (Appendiks 1 1, Przetakiewicz, 2017, pers. com) EPPO Der har tidligere været udført sammenlignende studier af de to metoder, Spieckermann eller GlynneLemerzahl, og samme resultat blev opnået med begge. Senest fra 2007 med patotype 1 (Przetakiewiez og Kopera, 2007), men det har ikke været muligt at finde sammenlignende undersøgelser med test af de nye smitteracer. Flath et al. (2014) udførte ringtest af patotype 1, 2, 6 og 18 mellem fem laboratorier (JKI, IHAR, HLB, AGRICO og AVERIS) med GlynneLemmerzahl metoden på EPPO differentialsortimentet. Resultaterne var stort et identiske, men for patotype 2 og 6 blev der på sorterne Desire, Delcora og Miriam fundet forskellige resultater. Det blev konkluderet, at der var behov for en harmonisering af testmetoderne og se på et nyt differentialsortiment. Dette arbejde er nu taget op i EPPO regi. Der er ikke en særlig EPPO standard for test af resistens. For øjeblikket er resistenstest beskrevet i EPPO PM 7/28 (som egentlig er en standard for diagnostik herunder patotypebestemmelse). 8

10 EPPO har besluttet at udarbejde en særlig guidelinie for test af resistens. Det vides ikke, hvornår dette arbejde er færdigt, og der går flere år før en ny guideline er gældende. 6. Forskning i kartoffelbrok Der foregår for øjeblikket kun en begrænset, aktiv forskningsindsats vedr. kartoffelbrok i Europa. Ved Wageningen foregår et PhD projekt om identifikation af patotyper med molekylære metoder (Leeuwen, 2017, pers com). Ved JKI starter i juli 2017 et nyt nationalt projekt med udvikling af effektive diagnostiske værktøjer (patogen og vært) med molekylære markører (Flath, 2017 pers com) Tidligere var der en del aktivitet vedr. kartoffelbrok i Euphresco og CORNET projekterne, som nu er afsluttet. Et nyt CORNET projekt forventes ansøgt (Polen, Tyskland og Holland) med henblik på standardisering af resistenstest samt testmetoder i forædling (Flath, 2017, pers. com) 7. Liste over kartoffelsorter med resistens mod kartoffelbrok Appendiks 1 indeholder oplysninger om resistens mod kartoffelbrok, som er indsamlet fra de officielle hollandske (Anon 2017a), tyske (Anon 2017e) og engelske sortslister. Den engelske sortsliste indeholder dog kun resulter med patotype 1. Der er desuden anvendt oplysninger fra LKF Vandel, som får testet sorter ved IHAR eller HLB. LKF Vandel anvender karakterskala 19, hvor 9 er fuld resistens, 8 er enkelte observationer og 7 er flere observationer (Olsen, 2017, pers com). LKF Vandels oplysninger indgår derfor i den danske sortsliste, men kun i de tilfælde, hvor resistenskarakteren er 9 (fuld resistens). De samlede angivelser fra LKF Vandel fremgår af appendiks 1. Nogle få sorter er testet ved IHAR i Polen (appendiks 1) og sorter testet som resistente (kategori R1R2) er medtaget i danske forslag. Ud over disse officielle angivelser af resistente sorter, så har hollandske myndigheder publiceret lister med sorter, der kan dyrkes i såkaldte sikkerhedszoner uden for selve bufferzonen (Anon, 2014d; omtales efterfølgende som zonelister ). I Holland er der krav om, at der i bestemte områder med øget risiko for spredning kun dyrkes sorter med et givent resistensniveau over for de patotyper, der forekommer i zonen (forebyggende foranstaltning). Sorterne er angivet i liste D (patotype 1; Anon 2017b) liste O (patotype 2/6; Anon 2017c), og liste T (patotype 18; Anon 2017d) i appendiks 1. Der er lavet lister for de forskellige områder, og i et område kan det f.eks. være sorter i gruppe 56 eller højere, der må dyrkes. De hollandske regler for dyrkning af sorter med resistens mod patotype 2 og 6 er identiske, derfor er listerne slået sammen (Liste O, 2/6 appendiks 1). Oplysninger i disse zonelister er med angivelse 9

11 af resistensniveau 10: volledig resistent (total resistent), 98: hoog veldresistent (høj markresistens), 7: matig veldresistens (moderat markresistens) samt 65: matig vatbar (moderat modtagelig). Det er forsøgt at få en direkte oversættelse af disse resistensniveauer til EPPO skalaen (tabel 23), men NVWA har ikke givet svar på dette. HLB oplyser, at niveau 10 (volledig resistent, total resistent) svarer fuldt resistente sorter (R1R2 i tabel 23) og er samme niveau som sorter på den officielle sortsliste (Boerma, 2017, pers com). Sorter på zonelisten med karakter 9 svarer til svagt modtagelig (S1 eller hollandske R i tabel 1) og vil danne få, små svulster (Boerma, 2017, pers com). Disse sorter (eller lavere kategorier) er således ikke fuldt resistente efter definitionen givet i tabel 23. Sorter med angivelse karakteren 10 er medtaget i forslag til danske liste, mens sorter med karakter 9 eller lavere ikke er medtaget. I udredningsarbejdet er der også modtaget informationer om karakterer for resistens fra danske forhandlere af kartofler (AKV, KMC, Karmark, Thorsens, Scanax). For de flestes vedkommende er der anvendt samme kilder som ovenfor, men med angivelse af flere resistensklasser. For nogle forhandlere, er der anvendt resultater fra test udført af egne moderfirmaer eller ved HLB. Det er ikke lykkedes at få verificeret disse oplysninger og oplysningerne er derfor ikke medtaget i forslaget til danske liste. For mange af sorternes vedkommende, er resistenskarakteren dog dækket af oplysninger fra de officielle tyske og hollandske lister. Oplysninger fra firmaerne fremgår af appendiks 1 med forklaring under tabellen. Ud over disse oplysninger er der også indhentet oplysninger fra Sverige om de sorter der dyrkes i området med kartoffelbrok (Listerlandet i Blekinge med patotype 18; Knutson, 2017, pers com). Forslag til dansk liste Forslag til en dansk liste med angivelse af fuld resistens er angivet i tabel 4. Grundlaget er, som nævnt ovenfor, at sorterne er angivet på den officielle tyske, hollandske eller engelske liste. Derudover er medtaget de sorter, som derudover er nævnt med kategori 10 i de hollandske zonelister samt sorter, der er karakteriseret med karakter 9 (fuld resistens) i opgivelser fra LFK Vandel eller testet resistente i polske undersøgelser ved IHAR. 10

12 Tabel 4. Oversigt over kartoffelsorter med angivelse af resistens mod kartoffelbrok (Synchytrium endobioticum) patotype 1, 2, 6, 8 og 18. Listen er forslag til angivelser på dansk sortsliste, hvor R angiver fuld resistens svarende til EPPO klassifikation R1 R2 (ingen risiko for sekundær opformering i marken). Detaljer er angivet i appendiks 1. (fortsat) (fortsat) Navn P1 P2 P6 P8 P18 Navn P1 P2 P6 P8 P18 Navn P1 P2 P6 P8 P18 7four7 R Euroviva R Red Fantasy R Actaro R R Excellency R Red lady R Afra R Exquisa R Red Sonja R Agata R Fakse R Regina R Almonda R Fidelia R Ribera R Alouette R Figaro R Ricarda R Altus R Finessa R Rikea R Alwara R Folva R Roberta R Amanda R R FriesLänder R Rodriga R Anouk R Gala R Rosara R Antina R Gandawa R R R R Royal R Arosa R Glorietta R Rumba R Artemis R Granada R Salome R Augusta R Gunda R R Saprodi R R R Avano R R R Hamlet R Sarion R R Avarna R R Hermes R Satina R Aveka R Isabelia R Saturna R Avenance R Jaerla R Sava R Aventra R R Jelly R Scarlet R R R Avenue R Jutlandia R Secura R Aviala R Kardal R Senna R Aviron R Karelia R Seresta R R R R Axenia R Kiebitz R Sieglinde R Axion R R R Kuba R R R R Signum R R Bellarosa R Kuras R Simphony R R R Bellinda R Labella R Skawa R Belmonda R Lady Britta R Smaragd R Berber R Lady Claire R Solara R Bernadette R Lanorma R Solist R Canasta R R R Laperla R Sorentina R Caprice R Leandra R R Spunta R Captiva R Leyla R Stayer R Cardinia R Linzer Delikat R Stefanie R R R R Carolus R Ludmilla R Stratos R Cimega R Madeira R Supporter R Colette R Maris Peer R Thor R Connect R Mariska R Tivoli R R R R Constantina R R R R Masai R Velox R Coronada R Mascha R Verdi R Cronos R Melody R Vineta R Damaris R Mette R R R Wotan R Danuta R Miranda R Zuzanna R Dartiest R R R R Musica R Desiree R Nadine R Ditta R Nandina R Eldena R Nicola R Energie R Novano R R R R Estima R Oleva R R Estrella R Omega R Eurobona R R Otolia R R R R Eurobravo R R Oxania R Euroflora R Penni R Eurogrande R Perline R Euroking R Piccolo Star R Euroluna R Pirol R Euronova R R Preciosa R Europrima R Puccini R Euroresa R Queen Anne R EuroStarch R Raja R Eurotango R Ramona R Eurotonda R R R Ranomi R 11

13 De sorter, som er nævnt som fuldt resistente i forslaget til den danske liste, vil således være de sorter, som kan dyrkes i bufferzonen. Sorter, der specifikt er testet som resistente mod patotype 18, fremgår af tabel 5 ( R ). I appendiks 1 er angivet oplysninger fra flere kartoffelfirmaer, og her er flere sorter angivet som resistente mod patotype 18. I nogle tilfælde kommer oplysningerne antageligvis fra de hollandske zonelister med karakteren 98 (høj markresistens). Ud fa de indhentede oplysninger svarer dette niveau ikke til EPPO definitionen af resistens (R1R2, tabel 23), og de er således ikke medtaget i forslaget til den danske liste. Men beskyttelsen mod kartoffelbrok kan være høj ved karakteren 98, og i den udstrækning firmaerne kan dokumentere et tilstrækkeligt beskyttelsesniveau (svarende til R1R), kan nye sorter efterfølgende optages. Tabel 5. Oversigt over kartoffelsorter med angivelse af resistens mod patotype 18. Sammendrag fra tabel 4 og appendiks 1. Sorter med fuld resistens R er forslag til dansk sortsliste. Sorter der på hollandske zonelister er anført med høj markresistens er angivet med karakter 98. Detaljer er angivet i appendiks 1. Fuld resistens "høj markresistens" 9 "høj markresistens" 8 Avarna R Aventra 9 Actaro 8 Canasta R Signum 9 Altus 8 Constantina R Supporter 9 Axion 8 Dartiest R Festien 8 Eurotonda R Euroviva R Gandawa R Gunda R Kuba R Novano R Otolia R Saprodi R Sarion R Seresta R Stefanie R Som det fremgår af tabel 4, er der ikke mange sorter, der specifikt er testet resistente mod patotype 8. Kun sorterne Otolia (oplysninger fra IHAR) samt Tivoli (Vandel) er beskrevet som værende resistent. Som beskrevet under afsnit om test for resistens, forventes det, at sorter der er beskrevet som resistente over for patotype 18 også er 12

14 resistente over for patotype 8 (Leeuwen, 2017, Flath, 2017, Przetakiewicz, 2017, pers. com) eller med meget lille forskel (Boerma, 2017 pers. Com). 8. Sammendrag Landbrugs og Fiskeristyrelsen har anmodet om en løbende redegørelse på europæisk plan af kartoffelsorters resistens over for kartoffelbrok. AU er anmodet om at identificere og følge det væsentligste europæiske arbejde omkring resistenskarakteristik og sortsudvikling for kartoffelbrok og komme med anbefalinger til en dansk liste med resistente sorter. Kartoffelbrok er en EUkarantæneskadegører, og ved udbrud træder en beredskabsplan for håndtering af udbrud i kraft bl.a. med etablering af en bufferzone omkring de smittede arealer, hvori der kun må dyrkes resistente kartoffelsorter. Efter EU kartoffelbrok direktivet (EU direktiv 69/464), anses en sort som tilstrækkelig resistent mod en patotype, når sorten reagerer mod infektion af samme patotype i en grad således, at der ikke er risiko for sekundær infektion. Bestemmelse af patotyper foregår i dag ved brug af test på forskellige sorter (differentialsortiment). Der arbejdes på, at udvikle velegnede molekylærbaserede metoder, men indtil videre er der ikke udviklet brugbare metoder. Udgangspunktet er EPPO protokollen PM 7/28. Bestemmelse af patotyper foregår i Europa hovedsageligt i Polen (IHAR), Holland (HLB) samt i Tyskland (JKI). I EPPO området er det især patotype 1, 2, 6 og 18, der forekommer. Patotype 8 er beskrevet fra Tyskland, men med få udbrud og i mindre udstrækning end for Patotype 2, 6 eller 18. Der er blandt de europæiske institutioner, som tester for patotyper, en diskussion af identiteten af patotype 8. Patotype 8 og 18 anses for at være meget ens, og EPPO protokollen for patotypebestemmelse PM 7/28 er for øjeblikket ved at blive revideret af Panel on Diagnostics in Mycology. I den nye version forventes patotype 8 ikke at være med. Den reviderede EPPO protokol forventes diskuteret ved panelets næste møde maj Forædling mod resistens vanskeliggøres af mangel på dominante major resistensgener mod de nye patotyper, og kun få sorter er fuldstændig resistente. Resistens mod de nye patotyper er et resultat af vekselvirkning mellem multiple loci Sen loci) på mindst tre kromosomer (Resistens mod patotype 1 styres af et enkelt dominant gen, Sen1). Ved test for resistens anvendes grundlæggende de samme metoder som for bestemmelse af patotyper. IHAR og JKI anvender GlynneLemmerzahl metoden, hvor der anvendes zoosporer direkte produceret fra sommersporangier fra frisk brokvæv. Denne metode anses for den mest pålidelige, da sorter, som beskrives som resistente efter denne metode, er testet ved højt infektionstryk. 13

15 EU direktivet anbefaler ikke bestemte metoder men sætter et fytosanitært grænse med hensyn til risiko. Der kræves ikke fuldstændig resistens, men kun en resistens, der kan sikre, at der ikke kan forekomme sekundær infektion i afgrøden eller i efterfølgende afgrøder af samme sort. Det er således sortens evne til at forhindre svampen i at fuldende sin livscyklus og danne sekundære infektioner, der er vigtig. En sort betragtes således som tilstrækkelig resistent mod en patotype, når sorten reagerer mod infektion af samme patotype i en grad således, at der ikke er risiko for sekundær infektion. Ud fra et karantæne synspunkt deles sorterne i to klasser: resistente (EPPO R1R2) og modtagelige (EPPO S1 og lavere) Test for resistens udføres i Holland ved HLB samt ved forædlingsfirmaerne Averis og Agrico. I Polen ved IHARPIB (Plant Breding and AcclimatizationInstitut), og i Tyskland ved Julius KühnInstitut, Kleinmachnow (JKI). SASA, Skotland, der er ansvarlig for den officielle test i UK, tester kun for resistens mod patotype 1. Test for resistens udføres med patotype 1, 2, 6 og 18. Patotype 8 indgår ikke de officielle tyske og hollandske undersøgelser. Da identiteten af patotype 8 er diskutabel (som nævnt under patotyper), så vil resistenstest for patotype 8 antageligvis udgå af den fremtidige EPPO protokol. Sorter der er beskrevet som resistente over for patotype 18, anses sædvanligvis også for at være resistente over for patotype 8, men der er ingen publiceret evidens. På baggrund af blandt andet ringtest blev det konkluderet, at der var behov for harmonisering af testmetoderne og se på et nyt differentialsortiment. Der er ikke en særlig EPPO standard for test af resistens. For øjeblikket er resistenstest beskrevet i EPPO PM 7/28 (som egentlig er en standard for diagnostik herunder patotypebestemmelse). EPPO har besluttet at udarbejde en særlig guideline for test af resistens, men det vides ikke, hvornår dette arbejde er færdigt. Der foregår for øjeblikket kun en begrænset forskningsindsats vedrørende kartoffelbrok i Europa. Ved Wageningen foregår et PhD projekt om identifikation af patotyper med molekylære metoder. Ved JKI startes der juli 2017 et nyt nationalt projekt med udvikling af effektive diagnostiske værktøjer (patogen og vært) med molekylære markører. Et nyt fælles projekt (CORNET, Polen, Tyskland og Holland) forventes ansøgt med henblik på standardisering af resistenstest samt testmetoder i forædling. 9. Anbefalinger Sortsliste: I tabel 4 bringes en forslag til liste over danske kartoffelsorter med angivelse af resistens mod kartoffelbrok patotype 1, 2, 6, 8 og 18. Sorter der er medtaget på listen har fuld resistens svarende til EPPO klassifikation R1R2 (EU direktiv resistens: ingen risiko for sekundær opformering i marken). 14

16 Klassificering af sorter fra LKF Vandel vil blive diskuteret til den næste reviderede sortsliste med henblik på præcisering af karaktererne 8 og 7 (NB denne klassificering er anderledes end den der anvendes i de hollandske zonelister ) Sorter der specifikt er testet som resistente mod patotype 18 fremgår af tabel 5 ( R ). Men beskyttelsen mod kartoffelbrok kan være høj ved karakteren 98 i de hollandske zonelister, og i den udstrækning firmaerne kan dokumentere og begrunde tilstrækkelig resistens (svarende til R1R), så kan nye sorter efterfølgende optages. Europæisk netværk: AU har interesse i at følge og evt. deltage i europæisk forskningsarbejde vedr. identifikation af patotyper med molekylære metoder. I den forbindelse vil der blive taget kontakt til Wageningen og JKI. Et nyt fælles projekt kommer måske i gang mellem Polen, Tyskland og Holland vedr. standardisering af resistenstest samt testmetoder i forædling. AU har for nærværende ikke aktivitet vedrørende test for resistens, men undersøger muligheden for observatørstatus for at følge arbejdet. I EPPO regi diskuteres revidering af protokol for patotypebestemmelse. Diagnostisk Laboratorium deltager i dette arbejde, men AU kunne eventuelt deltage som observatør. Der er ikke en særlig EPPO standard for test af resistens. EPPO har besluttet at udarbejde en særlig guideline for test af resistens, og AU vil forsøge at medvirke som observatør. Løbende redegørelser: De tyske og hollandske sortslister opdateres hvert år (formodentlig martsapril) og revideret dansk sortsliste med eventuelle nye oplysninger vil blive udfærdiget af AU efterår 2017 og Herefter aftales ny plan for udredningsarbejdet. Der vil blive indhentet oplysninger fra danske repræsentanter og forædler med henblik på opdatering af sortslistes angivelse af resistente sorter. 10. Referencer Andrivon, Didier INRA, LE RHEU Cedex, France, Pers com. Anon (1969) Council Directive 69/464/EEC on control of potato wart disease. Off J Eur Commun L323/1 Anon 2004 EPPO Standards 7/28. Synchytrium endobioticum: diagnostic protocols for regulated pests. OEPP/EPPO Bull. 2004;34:

17 Anon 2014a Kartoffelbrok fundet i mindre mark. NaturErhvervstyrelsen, 11 september Anon 2014b Marker låst under kartoffelbrok. NaturErhvervstyrelsen, 12 september Anon 2014c Eksport af kartofler konsekvenser efter fund af kartoffelbrok i Sunds. NaturErhvervstyrelsen, 29 oktober Anon 2014d WRATZIEKTE VERORDENING. NVWA, 1 december 2014 [Hollandsk forordning om dyrkning af sorter med særlige resistensklasser i definerede områder] Anon 2015b Wratziekte uitvoeringsprotocol resistentieonderzoek aardappelwratziekte. NVWA, 19 juni 2015 [Hollandsk protokol for test af resistens] Anon 2015a Fund af kartoffelbrok på deponimarker. NaturErhvervstyrelsen, 20 februar Anon 2016a Nyt fund af kartoffelbrok i Midtjylland. NaturErhvervstyrelsen, 14 november Anon 2016b Opfølgning på nyt fund af kartoffelbrok NaturErhvervstyrelsen, 9 december Anon 2017a Wratziekte Toegelaten aardappelrassen met resistentie tegen wratziekte. Staatscourant, 11930, 9 marts 2016 [Hollandske sortsliste med angivelse af sorter med resistens mod kartoffelbrok] 16

18 Anon 2017b Wratziekte Resistentieniveau van aardappelrassen tegen fysio 1 (D1). NVWA, 1 april [Hollandske zoneliste D (P 1) med sorter og resistensklasser mod patotype 1] kteresistentieniveauvanaardappelrassentegenfysio1d1 Anon 2017c Wratziekte Resistentieniveau van aardappelrassen tegen fysio 2/6 (G1/O1) NVWA, 1 juli [Hollandske zoneliste O (P 2/6) med sorter og resistensklasser mod patotype 2 og 6] Anon 2017d Wratziekte Resistentieniveau van aardappelrassen tegen fysio 18 (T1). NVWA, 1 juli [Hollandske zoneliste T (P18) med sorter og resistensklasser mod patotype 18] Anon 2017e Julius KühnInstitut Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen Bekanntmachung von Kartoffelsorten mit Resistenz gegen Kartoffelkrebs (Synchytrium endobioticum) und Kartoffelzystennematoden (Globodera rostochiensis und Globodera pallida). JKI, 6. Juni 2016 [Tyske sortsliste med angivelse af resistens mod kartoffelbrok] B6_Kartoffelsorten_Resistenz_Kartoffelkrebs.pdf Anon 2017f VARIETIES ADMITTED TO THE POLISH NATIONAL LIST (NLI) [Polsk sortsliste med angivelse af resistens] Baayen HP, Bonthuis H, Withagen JCM, Wander JGN, Lamers JL, Meffert JL, Cochius G, van Leeuwen GCM, Hendriks H, Heerink BGJ, van Den Boogert PHJF, van De Griend P, Bosch RA. (2005) Resistance of potato cultivars to Synchytrium endobioticum in field and laboratory tests, risk of secondary infection, and implications for phytosanitary regulations. EPPO Bull. 2005;35(1):9 23. Baayen R, Cochius G, Hendriks H, Meffert J, Bakker J, Bekker M, van den Boogert P, Stachewicz H, van Leeuwen G. (2006) History of potato wart disease in Europe a proposal for harmonisation in defining pathotypes. Eur J Plant Pathol. 2006;116:

19 Ballvora A, Flath K, Lübeck J, Strahwald J, Tacke E, Hofferbert HR, Gebhardt C. (2011) Multiple alleles for resistance and susceptiblity modulate the defence response in the interaction of tetraploid potato (Solanum tuberosum) with Synchytrium endobioticum pathotypes 1, 2, 6 and 18. Theor Appl Genet. 2011;123: Boerma, Margriet (2017), HLB, WIJSTER, Holland. Pers com Busse, F.; Bartkiewicz, A.; TerefeAyana, D.; Niepold, F.; Schleusner, Y.; Flath, K.; SommerfeldtImpe, N.; Lübeck, J.; Strahwald, J.; Tacke, E.; Hofferbert, H.R.; Linde, M.; Przetakiewicz, J.; Debener, T. (2017): Genomic and Transcriptomic Resources for Marker Development in Synchytrium endobioticum, an Elusive but Severe Potato Pathogen. Phytopathology 107(3): Flath, Kerstin (2017), Julius KühnInstitut (JKI), Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen. Pers. Com. Knutsson, Henrik (2017), Lyckeby Starkelse, Sverige. Pers com. Langerfeld E (1984) Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. Zusammenfassende Darstellung des Erregers des Kartoffelkrebses anhand von Literaturberichten. Mitteilungen aus der Biologischen Bundesanstalt für Land und Forstwirtschaft, Berlin Dahlem 219:1 142 Langerfeld E, Stachewicz H. (1994) Assessment of varietal reaction to potato wart (Synchytrium endobioticum) in Germany. EPPO Bull. 1994;24: Langerfeld E, Stachewicz H, Rintelen J. (1994) Pathotypes of Synchytrium endobioticum in Germany. EPPO Bull. 1994;24: van Leeuwen, Gerard (2017) Netherlands Food and Consumer Product Safety Authority, NVWA. Pers.com Mygind H. (1957) Kartoffelbrok. En samlet oversigt. Statens Plantetilsyn. Oplysende skrifttrække. Statens Plantetilsyn, København. 58pp. Nordin, Karin, Jordbruksverket, Sverige. Pers com. Obidiegwu J, Flath K, Gebhardt C (2014) Managing potato wart: a review of present research status and future perspective. Theor Appl Genet 127: Obidiegwu J, Flath K, Gebhardt C (2014b) Managing potato wart: a review of present research status and future perspective. Theor Appl Genet 127(4): Olsen, Jens Kristian (2017) LKF Vandel, pers com Przetakiewicz, Jaroslaw (2017) Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Państwowy Instytut Badawczy, Radzików, Błonie. Pers com. 18

20 Przetakiewicz J. Assessment of the resistance of potato cultivars to Synchytrium endobioticum (Schilb.) Per. In Poland. Bull. 2008;38: Przetakiewicz J, Kopera K. Comparison of the usefulness of GlynneLemmerzahl and Spieckermann methods to assess resistance of potato (Solanum tuberosum L.) to Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. Pathotype 1 (D1) in mass tests. Biuletyn Instytutu Hodowli i Aklimatyzacji Roslin. 2007;243: Schlenzig, Alexandra (2017) Plant Biosecurity and Inspections Science and Advice for Scottish Agriculture (SASA), Edinburgh Pers com. 19

21 Appendiks 1. Oversigt over kartoffelsorter med angivelse af resistens mod kartoffelbrok (Synchytrium endobioticum) patotype 1, 2, 6, 8 og 18 (AU, 2017) Brok DK liste (1): Forslag til angivelser på dansk sortsliste. R angiver fuld resistens svarende til EPPO klassifikation R1R2 (ingen risiko for sekundær opformering i marken) Efterfølgende kolonner er forskillige sotslister (som beskrevet under tabellen). Angivelser her er taget fra pågældende firma eller institution Brok DK liste 1) NL ) NL zonelister 3) DE 4) UK 5) SE 6) Polen 7) LKF Vandel 8) Solana 9 KMC 10) AKV 11) ystofte 1 Karmark 13) Thorsens 14) Navn (D) 2/6 (O) 18 (T) 18 1 (D1) 2(g1) 6(O1) 8(F1) 18(T1) Europlant 05GOU2 06LAP2 (9) 7four7 R Actaro R R R R R R R Adora Afra R 10 1 Agata R 1 10 Agila / Agria 9 6 / Alegria / Alexandra / Alizee Allians / Allstar Hr R R Almonda R 1 10 / 1 Alouette R 1 10 Altus R / R1 S1 S2 S2 S2 R R R R R HR r Hr Alwara R 10 1 Amado / modt Amanda R R , 6 1,6 Ampera 7 9 Andrea / Anouk R 1 10 Antina R Antonia / Anuschka / Arielle 8 Arosa R Artemis R 1 10 Ascott 97 Asparges r Augusta R 10 1 Aurion 17 Avano R R R , 2 R1 S1 S1 S1 S1 Hr Hr Hr Hr Avarna R R R R2 (R1) (R2) (R1) R1 R R R R R Hr Hr Hr Hr Hr Aveka R / HR HR R Avenance R 1 10 R R R Hr Hr Aventra R R / R R R R R Hr Hr Hr Hr Avenue R 1 10 R Hr Aviala R Hr Aviron R Hr Hr Axenia R 1 Axion R R R R1 S1 S1 S1 S1 R R R R R HT HR HR Baccara / Ballerina (9) r/m Belana / Bellarosa R Bellinda R 10 / Belmonda R

22 Beo / Berber R 7 1 Bernadette R 10 1 Bigrossa / Bintje 6 Blå Congo Borwina / Burana / BUY 1 r/r Camilla / Campina / Canasta R R R r Caprice R 1 Captiva R Cara Cardinia R 1 Carolus R 1 10 Caruso / Catania 9 / Cerisa Charlotte Cilena / Cimega R 9 r/m Colette R 10 1 Concordia / Connect R Constance D1 Constantina R R R R , 6 NL1(10), 2, 18 (10) Coronada R 9 1 Corsa Cronos R r/m Cumbica / Damaris R 1 Danuta R 1 Dartiest R R R R / R Hr Hr Hr Hr Hr Desiree R Ditta R Eldena R 10 1 D1 Elfe / D1(10), 2/6 (4) Endeavour 8 D1(10), 2/6 (8) Energie R Hr Hr r Erika D1(9), 2/6(7) Estima R Estrella R 10 1 Eurobona R R / Hr Hr Hr 1(10), 6(7) Eurobrava Eurobravo R R , 2 1(10), 6(10), [8] Euroflora R (10), 6(6) Eurogrande R R Hr? 1(10) [8] Euroking R 1 1(10); [8] Euroluna R Hr Hr 1(10), [8] Euronova R R (10), 6(8) Europrima R 10 1 Hr 1 Euroresa R 1 Hr EuroStarch R

23 Eurotango R (10), 6(9) Eurotonda R R R R R ( R ) Hr Hr Hr 1(10), 2(10), 18(10); [8] Euroviva R 9 10 / R R R ( R ) R Hr Hr Hr H Hr 1 (10), 2/6 (9), 18(10), fysio 8 Excellency R 1 10 Exquisa R Fakse R 9 r Festien / R R R R R Hr Hr Hr Hr Hr Fidelia R 1 Figaro R 1 1 Finessa R 10 1 Flavia / Folva R 10 9 r Fontane 6 8 Francisca / Freya / FriesLänder R 1 10 Gala R 10 1 Gandawa R R R R , 2, 6, 18 R1 R2 S1 S1 S1 Hr Hr Hr Hr Hr Georgina / Glorietta R GOF8 Granada R 1 1 Granola / Gunda R R Hamlet R 9 5 r Hanna Hannibal Hansa 8 9 Hermes R 10 Inova 9 Isabelia R 1 10 / 1 Isabella Ivetta / Jaerla R 1 10 Jelly R 10 1 D1 Jurata / D1 Jutlandia R 9 r Kardal R R Hr Karelia R 1 Kennebec Kiebitz R 10 1 King Edward Krone / Kuba R R R R , 2, 6, 18 R R1 R1 R1 S1 S1 R R R R Hr Hr Hr Hr Hr Kuras R / R Hr r KWS Labella R Lady Britta R (10) 2/6 (4) Lady Claire R (10) 2/6 (8) Lady Rosetta 9 1(9) 2/6 (7) Lanorma R ,6* Lap2 Laperla R Laura / Leandra R R D1, D6 22

24 Leyla R Liliana / Lilly / 1* Linata r Linzer Delikates R 1 10 Liva r Lombardo D1 Ludmilla R Lunarossa Madeira R Madison 9 / Magda Marabel / Mariola / Maris Peer R 1 Mariska R 1 10 Masai R Mascha R 1 Maya r Melba / Melody R 1 10 Merida / Mette R R R r/r Milva / Mirage Miranda R Monique / Moniqui Musica R 1 10 / Nadine R 1 Nandina R Natascha / 1* Nicola R Novano R R R R / R1 R2 S1 S1 S1 R R R R Hr Hr Hr Hr Hr Oleva R R R Hr r/m Omega R Opal / 1* Osira / Osiris / Otolia R R R R 1, 6, 18 R1 S1 R1 R1 R1 D1, NL6,8,18 (all10) Ottowa Oxania R 1 Pelikan Penni R 1 Perline R 1 10 Piccolo Star R 1 10 Pirol R 10 1 Preciosa R 1 Priamos / Princess / Puccini R 1 1 Quadriga / Queen Anne R 1 1 Rafaela / Raja R

25 Ramona R 1 1 Ranomi R 1 10 Red Fantasy R 10 1 D1 Red lady R Red Sonja R Regina R D1 Reviera Ribera R 1 10 / D1 Ricarda R 1 D1 Rikea R Roberta R 1 10 / Rodriga R Romera / Romie Rosalind / Rosara R Royal R r/r Rumba R Salome R 1 10 / Sandrin / Saprodi R R R / R R R Hr Hr Hr Hr Hr Sarion R R / R R ( R ) ( R ) R Hr Hr Hr 7 Hr Sarpo Mira Satina R Saturna R R Sava R r Scarlet R R R / R R R ( R ) ( R ) Hr Hr Hr 9 5 Secura R Senna R r/m Serafina / Seresta R R R R / R R1 S1 R2 S1 S1 R R R R R Hr Hr Hr Hr Hr Sibu / Sieglinde R 1 10 Signum R R S1 R R R ( R ) Hr Hr Hr R Simphony R R R / Hr Hr Hr Hr 8 Skawa R 10 Hr Smaragd R 1 9 / R R R ( R ) Hr Hr Hr Hr Hr Sofista 9 7 / Hr Hr Hr Hr 7 Solara R 1 10 / Solen Solist R 1 10 / Soraya / Sorentina R 1 D1 Spunta R 1 10 Stayer R 1 10 Hr Stefanie R R R R , 2, 6, 18 Stratos R / R ( R ) ( R ) Hr Hr Hr Sunshine Supporter R / R ( R ) ( R ) R Hr Hr Hr Hr Hr Suzan / Svenja / Thalessa / Thor R 9??? R r/r Tivoli R R R R (9) r Toluca 24