Cripto-1 som en mulig biomarkør for glioblastoma multiforme

Transkript

1 School of Medicine and Health Fr. Bajers Vej 7D Aalborg Ø Telefon Fax Titel: Cripto-1 som en mulig biomarkør for glioblastoma multiforme Studie: Medicin med Industriel Specialisering og Medicin Projektperiode: 4. semester 2012 Afsluttet den 30/ Projektgruppe: Gruppe 415 Deltagere: Anders Rechter Christina Agerbæk Derosche Debbie Jørgensen Mette Henneberg Nielsen Pirathiv Kugathasan Rune Zimmer Nielsen Vejleder: Linda Pilgaard Antal anslag: Sideantal: 66 Bilagsantal: 6 d d d d d d Abstract: Glioblastoma Multiforme is the most prevalent and aggressive malignant brain tumor. Despite traditional and contemporary treatment, the prognosis of glioblastoma remains poor, as these treatments only provide palliative effects. In recent years, the discovery of cancer biomarkers has become a major focus in cancer research, in hope of novel cancer therapy-methods. Cripto-1 is a biomarker expressed in several cancer-types, and plays an important role in tumor progression, migration and metastasis. This study investigates, whether Cripto-1 is expressed in patients with glioblastoma, as well as, whether Cripto-1 could act as a novel target for treatment of the disease. We compare Cripto-1 levels in subjects suffering from glioblastoma with healthy subjects in order to investigate whether Cripto-1 is over expressed in glioblastoma. By isolating plasma from blood samples of these two groups, and then by testing for Cripto-1-levels using Sandwich-ELISA- and BCA, we were able to find higher expression of Cripto-1 in some of the patients. Through investigation of relevant literature and discussion of our results, we were able to conclude that it is likely Cripto-1 could be used as a novel target for treatment of glioblastoma in some patients. Ophavsret: Rapport og produkt benytter materialer som har ophavsrettigheder [1]

2 Indholdsfortegnelse Indledning... 4 Gliomer... 5 Glioblastoma Multiforme... 6 Diagnose af glioblastoma multiforme... 6 Patofysiologi... 7 Klassifikation... 9 Behandling af glioblastoma multiforme Biomarkører Biomarkører i cancer Biomarkører for glioblastomer Cripto Cripto-1 og cancer Cripto-1 i embryogenesen Signaleringsveje Epithel-Mesenchymal Transition EMT, cancer og Cripto Cripto-1 s rolle i udviklingen af cancer Cripto-1 s mekanismer i udviklingen af cancer Hypoksi Cripto-1 og Nodal-signalering Nodal i gliomet Problemformulering Cripto-1 som målrettet behandling af cancer Passiv immunisering Aktiv immunisering Antisense-terapi Teori og metode Forsøgspersoner Patient C13 anamnese Patient C16 anamnese Teori om Sandwich-ELISA Vores Sandwich-ELISA [2]

3 Teori om BCA Vores BCA Beregninger Resultater og analyse Diskussion Diskussion af resultater Diskussion af behandling af glioblastomer målrettet mod Cripto Konklusion Perspektivering Litteraturliste Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag [3]

4 Indledning I Danmark rammes årligt omkring 1000 mennesker af en hjernetumor. 50% af alle hjernetumorer er gliomer, som opstår ud fra hjernens gliaceller, og over halvdelen af gliomerne er af typen glioblastoma multiforme (1)(2). Glioblastoma multiforme er en meget aggressiv cancer-type, og hovedparten af alle patienter med denne form for tumor dør indenfor et år efter at diagnosen er stillet (3). Sygdommen kan på nuværende tidspunkt ikke kureres, og de tilgængelige behandlingsmetoder, der omfatter kirurgi samt stråle-og kemoterapi, har kun palliativ effekt. Der er derfor brug for nye, alternative behandlingsmetoder. I de senere år er der blevet forsket i, hvorledes det er muligt at benytte biomarkører i behandling af forskellige cancer-typer. Cripto-1 er et protein, som udvises i høj ekspression i flere forskellige cancertyper, og dette protein har betydning for cancercellernes proliferation, migration og invasion (4). Cripto-1 fungerer som en biomarkør for cancer, og dette gør sig muligvis også gældende i glioblastomer. Man vil i så fald kunne forestille sig, at Cripto-1 vil kunne være et mål for fremtidige behandlingsmetoder indenfor glioblastomer. Vi vil i dette projekt undersøge, hvorvidt Cripto-1 findes udtrykt i plasma fra patienter med glioblastomer. Dette vil vi undersøge ved at bestemme mængden af Cripto-1 i plasma fra 6 patienter, og sammenligne dette med mængden i raske forsøgspersoner. Til at bestemme mængden af Cripto-1, vil vi udføre en Sandwich-ELISA samt BCA, hvorved forholdet mellem Cripto-1 og den samlede mængde af protein i plasma findes. Ved hjælp af resultaterne fra vores forsøg, vil vi diskutere hvorledes Cripto-1 kan benyttes i målrettet behandling af glioblastomer. [4]

5 Gliomer I reviewet Epidemiology and molecular pathology of glioma (5), er det beskrevet, at der på verdensplan er stor forskel på incidensen af hjernetumorer, og at Danmark er blandt de lande, hvor incidensen er høj. I Danmark rammes omkring 1000 patienter årligt af en primær hjernetumor (1), og af disse udgør gliomer 50% som dermed er den hyppigst forekommende hjernetumor (6). Gliomer omfatter alle tumorer, som er dannet ud fra gliacellerne i hjernen og i medulla spinalis (7). Gliomer inddeles i tre undergrupper på baggrund af, hvilke celletyper de oprindeligt udvikles fra. Astrocytomer udvikles fra astrocytter, som er hjernens støtteceller og kan forekomme i de fleste områder i hjernen samt enkelte steder i medulla spinalis. Oligodendrogliomer udvikles fra oligodendrocytter og forekommer oftest i storhjernen. Ependymomer udvikles fra ependymcellerne, som beklæder hjerneventriklerne indvendigt. Ependymomer kan forekomme overalt i hjernen, og de metastaserer ofte til medulla spinalis gennem cerebrospinalvæsken (7). Astrocytomer udgør 50% af alle gliomer, og det er dermed den hyppigste af alle CNS-tumorer (7). Astrocytomer inddeles ifølge WHO i 4 stadier, baseret på histologiske karaktertræk, som bl.a. omfatter anaplastisk kerneatypi, mitotisk aktivitet, mikrovaskulær proliferation og vævsnekrose (8). - Stadie I: Pilocytiske astrocytomer - Stadie II: Diffuse astrocytomer - Stadie III: Anaplastiske astocytomer - Stadie IV: Glioblastoma Multiforme Stadie I og II anses for at være de mindst aggressive af astrocytomerne, og de rammer oftest børn, med en gennemsnitsalder på 12 år. Stadie III og IV er de mest aggressive former for astrocytomer, og rammer oftest voksne (7). For patienter med maligne hjernetumorer afhænger overlevelsesprognosen af alder og tumorens histologiske type. For patienter med astrocytomer i stadie II, er den gennemsnitslige overlevelsestid 5-6 år. I stadie III er den gennemsnitslige overlevelstid <3 år, mens den for stadie IV er <1 år (7). Overlevelsestiden for patienter med glioblastomer bekræftes af Figur 1. [5]

6 Figur 1 viser en oversigt over typer af gliomer, hvor der illustreres overlevelseschancerne indenfor 2 år efter diagnose, for både alder og histologiske undergrupper. Tallene er baseret på opfølgende undersøgelser af individer i USA diagnosticeret mellem 1973 og Ved hhv. atrocytoma NOS og malignant glioma NOS, henviser NOS (not otherwise specified) til, at der i disse tilfælde ikke er blevet taget hensyn til underklassifikationer (9), s Glioblastoma Multiforme Glioblastoma multiforme udgør 69% af alle gliomer (2), og det er den mest aggressive og prævalente type af hjernetumorer (10)(11). Prognosen er ringe, idet hovedparten af alle patienter dør af sygdommen inden for et år, selv med relevant behandling (3). Glioblastomers hastige progression, gør den til en af de mest frygtede former for cancer. Diagnose af glioblastoma multiforme Symptomerne på glioblastoma multiforme er ofte diffuse, og de kan inkludere hovedpine, kvalme og opkastning som følge af forhøjet intrakranielt tryk. Herudover kan der forekomme synsforstyrrelser, afasi, faldende bevidsthedsniveau samt epileptiske anfald (3) (12). De symptomer, som patienten oplever, er oftest relaterede til placeringen af tumoren. Tumoren giver ikke nødvendigvis patienten mærkbare gener, og den har derved mulighed for at vokse sig meget stor, inden diagnosen stilles. Patienter med bemærkelsesværdige symptomer får foretaget en CT-scanning, eventuelt efterfulgt af en MR-scanning for at bekræfte en tumor. Herefter udtages en biopsi, for at kunne stille den præcise diagnose på baggrund af histologiske vævssnit. [6]

7 Glioblastomer ses ikke som velafgrænsede, men er derimod diffust infiltreret i parenkymet. De er sammensat af tæt forbundne og lavt differentierede celler, som oftest er pleomorfiske astrocytære celler. Cancercellerne kan variere meget i form og størrelse, og de kan indeholde flere kerner. Cellerne har ofte høj kerne- og cytoplasma ratio og udviser livlig mitotisk aktivitet (11). På et tværsnit af tumoren ses grålige områder, der repræsenterer de levedygtige dele af tumoren, mens der også kan optræde gullige områder, hvori der ses vævsnekrose. Derudover ses der i nogle tilfælde mikrovaskulær proliferation. Normalt vil vævsnekrosen være placeret i centrum af tumoren, mens den mikrovaskulære proliferation vil være placeret perifert (3). For yderligere at kunne bekræfte diagnosen glioblastoma multiforme foretages ofte en glial fibrillary acidic protein- farvning (GFAP-farvning). GFAP er et protein, der normalt findes udtrykt i mange celler i CNS heriblandt astrocytter, og er denne farvning positiv i en prøve af tumorvæv, er der dermed tale om et astrocytom (13). Derudover undersøges nestin- og neurofilamentniveauet. Nestin er et protein, som næsten udelukkende udtrykkes under embryogenesen, og som senere erstattes af GFAP og neurofilamenter. Nestinekspression er tilbagevendende ved patologiske tilstande, herunder glioblastomer. En positiv GFAP-farvning og nestin-prøve samt en negativ prøve for neurofilamenter vil derfor kunne give yderligere indikation på, at der er tale om et astrocytom (14). Patofysiologi Der findes en række genetiske forandringer, som er involverede i udviklingen af både primære og sekundære glioblastomer, som vi i det følgende vil beskrive. Forskellen på primære og sekundære glioblastomer vil blive beskrevet under afsnittet klassifikationer. Som det gælder for alle cancertyper, opstår glioblastomer på baggrund af mutationer i DNA. Glioblastomer er kendetegnet ved øget celleproliferation, som bl.a. skyldes mutationer i gener og receptorer, herunder PDGFRα (Platelet-derived growth factor receptor-α) og EGFR (Epidermal growth factor receptor). PDGFRα er en tyrosinkinase-receptor, som ved binding til PDGF medfører mitose. Dette kompleks regulerer bl.a. proliferation, migration, invasion, differentiering og apoptose. EGF- EGFR-komplekset kontrollerer de samme mekanismer som PDGFRα-PDGF-komplekset. Der er dog den forskel, at EGF-EGFR-komplekset nedregulerer apoptose, mens PDGFRα-PDGF-komplekset virker opregulerende herpå (11)(12). Når EGF binder sig til EGFR på det ekstracellulære domæne, bliver AKT (protein kinase B) aktiveret, hvilket fører til celleproliferation og øget celleoverlevelse ved blokering af apoptose, jf. Figur 2 (2). Amplificering af EGFR- og PDGFRα forekommer i omkring 1/3 af alle glioblastomer, og det er påvist, at mutationer i EGFR forøger celleproliferation og invasion in vitro igennem aktivering af RAS-signaleringsvejen (7)(12). [7]

8 Figur 2 viser de vigtigste signaleringsveje, som er involverede i patogenesen af glioblastomer (2), s. 6. Derudover har mutationer af tumorsuppressor-gener stor betydning for glioblastomers udvikling. Et af de tumorsuppressor-gener, som er involveret i udvikling af glioblastomer er PTEN (phosphatase- og tensin-homolog). PTEN koder for et protein, som nedregulerer celleproliferation samt aktiverer apoptose, og det er næsten altid muteret i glioblastomer (12). PTEN, som er lokaliseret på kromosom 10q, regulerer PI3K/Akt-signaleringsvejen ved at inhibere PIP3-signalet til AKT, hvilket hæmmer celleproliferation, jf. Figur 2 (15). LOH (Loss of heterozygosity) refererer til forekomsten af alleltab på et kromosom, og i glioblastomer forekommer dette i 75-90% af tilfældene på kromosom 10q (12). Genet, som koder for proteinet p53, er ligeledes et vigtigt tumorsupressor-gen, som ofte er muteret i glioblastomer. p53 inducerer cellecyklus-arrest i G1/S-fasen som respons på DNA-skade. Herved kan skaden repareres, og i tilfælde af, at dette ikke kan lade sig gøre, induceres apoptose (11). Inaktivering af p53 sker enten ved mutationer direkte på p53-genet eller via amplificering af MDM2-genet, og det vil i begge tilfælde føre til øget celleproliferation (12). MDM2-genet er et protein, som er involveret i udviklingen af glioblastomer, idet det er hovedregulatoren af ekspression af p53-genet (6). p53 besidder flere vigtige cellulære processer, såsom cellecyklus-regulering, respons på cellulær DNA skade, kontrol af apoptose, celledifferentiering og nyvaskularisering (16). [8]

9 En anden tumorsuppressor, som optræder sent i udviklingen af astrocytomer er RB1(retinoblastoma 1), som er et protein, der kontrollerer progressionen fra G1 til S fasen i cellecyklus. RB1 har nær forbindelse med p14 ARF (CDKN2A alternate readning frame), og det fungerer normalvis som en inhibitor for MDM2-genet, jf. Figur 2. Tab af p14 ARF forekommer hyppigt i glioblastomer, og et tab af dette gen vil betyde overekspression af MDM2, som har en stor betydning for regulering af p53 genet (17). Tumorsuppressor-genet IDH1 har indirekte onkogenetisk virkning gennem angiogenese. Det kan muligvis, ved mutation, omdanne primære glioblastomer til sekundære glioblastomer. Derudover kan tumorsupressoren NF1 (neurofibromatose-1) ved mutation, have betydning for proliferation og cellevækst i tumoren (11). Klassifikation Glioblastomer kan inddeles i primære og sekundære glioblastomer, samt efter de gener de udtrykker. De gener, som er nævnt i det foregående afsnit, vil være større eller mindre udtrykt i underinddelingerne, og i udvikling af både primære og sekundære glioblastomer, vil nogle af generne have større betydning end andre i de forskellige stadier. De 4 underinddelinger De gener og receptorer, som har størst betydning for udvikling af glioblastoma multiforme er EGFR, PDGFR, p53 og NF1. Følgende undertyper er blevet identificeret på baggrund af de gener, som har betydning for glioblastomet (18). - Mesenchymal GBM: Er karakteriseret ved inaktivering af NF1,p53 og PTEN. - Klassisk GBM: Er karakteriseret ved EGFR amplificering. - Proneural GBM: Udtrykker overekspression af PDGFRα og mutationer i IDH1. - Neural GBM: Udtrykker gener som ligner dem man finder i normalt hjernevæv. [9]

10 Udover denne inddeling, inddeles glioblastomer i primære og sekundære glioblastomer. Figur 3 viser de genetiske forandringer, som fører til primære og sekundære glioblastomer. Til venstre vises udviklingen af primære glioblastomer, mens figuren til højre viser udviklingen af sekundære glioblastomer. Primære glioblastomer udvikles direkte fra den oprindelige celle, der også giver ophav til lavere stadier af astrocytomer, som herefter kan blive til sekundære glioblastomer. Glioblastomer kan opstå på baggrund af én af de ovennævnte mutationer eller i et samspil mellem flere. Procentsatserne, der står ud for de genetiske forandringer repræsenterer, i hvilket omfang mutationen er involveret i udviklingen af den givne type af glioblastomer (7) s. 2603, (19) s [10]

11 Primære glioblastomer Primære glioblastomer forekommer hyppigst hos ældre patienter (19), og de opstår direkte ud fra en oprindelig celle. Når diagnosen stilles, har der oftest ikke været forudgående symptomer i relation til lavere stadier af astrocytomer, idet tumoren udvikles på meget kort tid. Primære glioblastomer er karakteriseret ved EGFR-amplificering, PTEN-mutation, LOH på kromosom 10q og MDM2 amplificering (20). Det er oftest et samspil imellem disse faktorer, der medfører udviklingen af glioblastomet. Der kan desuden forekomme mutationer i p53, hvilket dog er hyppigst i sekundære glioblastomer (19). Sekundære glioblastomer Sekundære glioblastomer forekommer oftest hos yngre patienter (19), og de opstår fra lavere stadier af astrocytomer. Sekundære glioblastomer dannes bl.a. ved mutationer i IDH1 (21) og i p53 samt overekspression af PDGFR (20). Disse genetiske forandringer er forskelligt udtrykt, alt efter hvilket stadie af udviklingen, der er tale om, jf. Figur 3. De fleste genetiske forandringer forekommer i både primære og sekundære glioblastomer, hvor der dog er forskel på, hvor hyppigt de forekommer i hver type. Behandling af glioblastoma multiforme I det følgende afsnit beskrives de behandlingsmuligheder, der på nuværende tidspunkt er tilgængelige for patienter med glioblastomer. På trods af relevant behandling er det dog kun forventeligt at forlænge patientens levetid med 9-15 måneder (12). De tilgængelige behandlingsmetoder har derfor udelukkende palliativ effekt, og inkluderer almindeligvis først kirurgi og dernæst stråle- og kemoterapi (22). Kirurgi Operativ fjernelse af glioblastomet har ingen helbredende effekt, idet glioblastomet er infiltreret i det omkringliggende væv. Dog er kirurgien en vigtig faktor i forhold til at kunne bestemme diagnosen. Et argument for at benytte kirurgi er at forhindre tumorens udbredelse til parenkymet, og derved nedsætte risikoen for skade på resten af CNS. Desuden vil kirurgi have en palliativ effekt. Operation er ofte nødvendigt mere end én gang, idet glioblastomer er hurtigt voksende, med stor risiko for recidiv (23). Kemoterapi Kemoterapi er en farmakologisk behandling, hvor der behandles med cytostatika, som fungerer ved at nedsætte tumorcellers vækst igennem hæmning af DNA-syntesen, DNA-replikationen og proteinsyntesen (24). Formålet er altså, at reducere antallet af tumorceller mest muligt. Cytostatika udgør en bred gruppe af medikamenter, og de underinddeles i grupper af alkylerende [11]

12 stoffer, anti-metabolitter, proteinkinasehæmmere, topoisomerasehæmmere, antimitotika, monoklonale antistoffer og proteasehæmmere (24). Pga. blod-hjerne-barrieren er det vanskeligt at behandle glioblastomer med cytostatika, dog oplever nogle patienter større effekt end andre. Den gruppe af cytostatika, der oftest anvendes ved gliomer er alkylerende stoffer. I reviewet Management of malignant gliomas and primary CNS lymphoma: Standard of care and future directions (25) er temozolomide beskrevet som et eksempel på et forholdsvis nyt lægemiddel, som hyppigt er brugt i behandling af glioblastomer. Temozolomide er i stand til at krydse blod-hjerne-barrieren, idet det har lipofile egenskaber (26). Stråleterapi Stråleterapi inducerer DNA-skade i tumorcellerne, hvorved cellerne tvinges til enten at inducere apoptose eller at påbegynde reparation. Den ioniserende stråling påvirker H 2O-molekylerne i DNAstrengene, hvorefter disse danner frie radikaler (6). Selvom en kombination af disse behandlingsmetoder har en gavnlig effekt på de fleste cancere, har det ved glioblastomer ikke den nødvendige langtidsvirkende effekt. Det er derfor ideelt at undersøge mulighederne for at benytte biomarkører i forbindelse med behandling af glioblastomer som led i en ny behandling. Vi vil i det følgende gennemgå biomarkører generelt for derefter at se på, hvilke biomarkører der indtil nu er fundet for glioblastomer. Biomarkører Begrebet biomarkør kan defineres som; En karakteristik, som måles objektivt og vurderes som indikator for normale biologiske processer, patologiske processer eller farmakologiske effekter af en terapeutisk intervention (27), s Biomarkører er biologiske bestanddele eller stoffer, herunder gener, proteiner, enzymer og nukleotider, som kan findes i celler, serum, urin eller andre kropsvæsker. Biomarkører kan underinddeles efter typer eller funktioner, alt efter hvilken funktion de udøver i organismen (27): Typer: - Biometriske/antropometriske biomarkører markører der beskriver kroppens biologiske værdier, f.eks. blodtryk og abdominalomfang. - Proteiner/peptider udtrykt på cellerne. - Nukleinsyrer - herunder DNA, RNA og mikro-rna. - Cytologiske biomarkører markører der beskriver cellens form og funktioner. [12]

13 Funktioner: - Prædiktive biomarkører - Diagnostiske biomarkører - Prognotiske biomarkører I et review Cancer biomarkers: knowing the present and predicting the future (28) er der givet et overblik over biomarkørenes funktioner. Biomarkører er i stand til at berette om helbreds- og sygdomstilstande i en organisme, hvilket udnyttes i mange forskellige sammenhænge indenfor sundhedsvæsenet og i forskning. Biomarkører kan bl.a. benyttes prædiktivt til at stille tidlige diagnoser ved screening af bestemte sygdomme, samt til at bestemme sygdomsinddeling og patientklassificering. Derudover kan biomarkører benyttes til at forudbestemme, hvilken type behandling og medicin den enkelte patient vil have bedst udbytte af, og sidenhen monitorere effekten af behandlingen, samt sygdomsprogressionen. Biomarkører kan benyttes i mange aspekter indenfor sundhed og sygdom, og de er vigtige indenfor fremtidig diagnostik og behandling (27)(28). Biomarkører i cancer I et review Cancer biomarkers: Are we ready for the prime time? (29) nævnes, at en biomarkør indenfor cancer refererer til et stof, der enten er produceret af tumoren selv, eller et stof der er produceret af organismen som en respons på tumoren. Cancer-biomarkører har igennem de sidste årtier haft en stor indflydelse på håndtering af mange forskellige cancer-typer. [13]

14 Figur 4 Klassifikation af cancer-biomarkører (29) s. 192 I førnævnte review er også givet et overblik over klassifikationer af biomarkører. Figur 4 viser, at cancer-biomarkører overordnet kan inddeles efter hvilken type markør der er tale om, samt hvilke funktioner de udøver. Således refererer prognostiske biomarkører til markører, der kan fortælle noget om de forhold i tumoren, der har betydning for patientens prognose. Dette vil inkludere biomarkører, der eksempelvis kan afdække nekrotiske forhold i tumoren, samt invasivitet. Diagnostiske biomarkører refererer til biomarkører, der er karakteristiske ved specifikke cancer-typer, og som derfor vil kunne påvise den pågældende cancer-type i organismen. Disse inkluderer eksempelvis HPV (human papilloma-virus), som er tilstede i 90% af uterin- og cervixcancere. Prædiktive biomarkører kan udnyttes i valg af behandling og medicin. Et eksempel herpå er medikamentet Herceptin, som udelukkende benyttes i mamma-cancere, der viser overekspression af protein-biomarkøren Her2/Neu (human epidermal growth factor receptor 2), mens man benytter et andet medikament, hvis der ikke vises overekspression. Dermed benyttes Her2/Neu som en prædiktiv biomarkør for mamma-cancer. Cancer-biomarkører kan ligeledes inddeles efter type i DNA-, RNA-, protein- og glykogen- biomarkører. [14]

15 DNA- og RNA-biomarkører kan være proto-onkogener, eksempelvis ATM, p53 eller BRCA1, der alle, i muteret form, kan blive til onkogener. Derudover kan DNA-markørerne være målbare kromosomale afvigelser, som det ses ved bl.a. CML (kronisk myeloid leukæmi), som diagnosticeres på baggrund af biomarkøren brc-abl-genet. Protein biomarkører er vigtige markører, idet disse kontrollerer de fleste signaleringsveje i både den normale celle, og i cancercellen. Glykogen biomarkører, som involverer bl.a. glykoproteiner i cellemembranen, kan benyttes som potentielle biomarkører for cancer, idet disse ofte ændres strukturelt under malignitetsudvikling. Patologiske biomarkører refererer til enten virale eller bakterielle markører. Eksempler herpå er Epstein-barr-virusen, som er en biomarkør for både Burkitt s og Hodgkin s lymfom samt helicobactor pylori, som er associaceret med vetrikelcancer. Udover disse målbare stoffer kan cancer-biomarkører også klassificeres som de karakteristika, der ses ved andre diagnostiske metoder, såsom CT-scaninger og MR-scanninger (29). I reviewet Cancer biomarkers: Knowing the present and predicting the future (28) står der beskrevet, at der i dag benyttes DNA-microarray-teknikker og andre gen-teknologiske fremgangsmåder til at opspore og isolere cancer-biomarkørerne. Derudover benyttes typisk Sandwich-ELISA. Potentielle markører skal herefter gennemtestes for, at kunne komme i betragtning til brug i klinikken. Hertil benyttes bl.a. immunhistokemi til farvning af tumor-biopsier, for at undersøge virkningsmekanismerne for de forskellige biomarkører. Cancer-biomarkører er fortsat et stort forskningsområde, idet der heri foreligger store muligheder for at optimere diagnostik og behandling af cancer. De markører, der er i brug i dag inkluderer primært markører, der kan detektere tidlig sygdom samt monitorere tilbagevendende sygdomme. En af disse er PSA (prostate-specific-antigen), som er en af de mest anerkendte cancer-biomarkører. PSA benyttes i dag til effektiv screening af prostata-cancer i udsatte patientgrupper (30). Biomarkører for glioblastomer Biomarkører for glioblastomer er forskningsmæssigt stadig på et tidligt stadie (11). Dette skyldes primært, at patofysiologien for glioblastomer endnu ikke er fuldt forstået, samt det faktum, at sygdommen er hurtigt opstået samt meget aggressiv. Dette betyder, at det ofte ikke er muligt at monitorere sygdoms-progressionen over en længere periode. Målet med at identificere biomarkører for glioblastomer er derfor at detektere sygdommen på et tidligere stadie, samt at optimere behandlingsmulighederne. [15]

16 I reviewet Glioblastoma biomarkers from bench to bedside, advances and limitations (11) er klassifikationen for glioblastom-biomarkører beskrevet. Inden for glioblastom-markører findes overordnet to typer; de genetiske biomarkører og serum-biomarkører. Genetiske markører er genprodukter, som enten udviser over- eller underekspression i glioblastomtumoren i forhold til det normale væv. Disse vil især være vigtige i forhold til at kunne stille mere præcise diagnoser. De genprodukter, som i dag er mest associerede med glioblastomer er bl.a. EGFR og p53. Serum-biomarkører, som er blevet identificeret i forbindelse med glioblastomer er fortrinsvis inflammatoriske molekyler relaterede til patofysiologien, heriblandt angiogenetiske vækst-faktorer (22). Derudover skal nævnes PDGFR, p53, TGFB2, MGMT, IDH1 og IL-10, som alle er vigtige biomarkører for glioblastomer, og som allerede nu spiller en rolle i både diagnosticering, prognose og behandling af sygdommen (11)(22). Alligevel er prognosen for glioblastomer ringe, og derfor forskes der hele tiden i at finde nye biomarkører for glioblastomer, og en af de markører, som man netop nu fokuserer på er Cripto-1. Cripto-1 I et review Role of Cripto-1 in stem cell maintenance and malignant progression (31) er givet et overblik over Cripto-1 s strukturelle opbygning. Cripto-1 (humant Cripto) er et protein, som er en del af EGF (epidermal growth factor)- og CFC (Cripto-1-FRL-1-cryptic)-familien (31). Strukturelt er Cripto-1 opbygget af forskellige domæner, som har hver deres forskellige funktioner, se Figur 5. Længst væk fra cellemembranen findes en signalsekvens, der sørger for at Cripto-1 bliver dannet på det ru endoplasmatiske reticulum og derefter bliver sendt til Golgi-apparatet, hvorefter det overføres til celleoverfladen. Herefter findes hhv. EGF-like- og CFC-domænet, som er vigtige i forhold til binding og igangsætning af forskellige signaleringsveje (31). Fæstnet til cellemembranen findes GPI (glycosyl-phosphatidyl-inositol)-ankeret. Dette er en kort hydrofobisk terminal, som dels kan være bundet til cellemembranen, og dels kan spaltes fra denne af GPI phospholipase D. Cripto-1 kan altså både fungere som et membranbundet protein samt et opløseligt protein (31). [16]

17 Figur 5 Figuren viser den strukturelle opbygning af Cripto-1. Her ses både den forankrede og den opløselige form (31) s Cripto-1 og cancer Cripto-1-mRNA findes i normale væv, men her er det kun til stede i meget små mængder. Til gengæld findes Cripto-1 i langt højere grad i flere typer af humane karcinomer, herunder i hhv. colon, mamma, ventriculus, pancreas, ovarii, cervix, testis, vesica urinaria, pulmones og endometrium, se Figur 6 (32). Det bør dog understreges, at der ikke er fundet forhøjede værdier af Cripto-1 i alle tilfælde inden for disse cancertyper. [17]

18 Figur 6 viser en oversigt over antallet af tilfælde, hvor der er fundet Cripto-1 protein i hhv. normalt væv, samt i cancervæv. På x-aksen er der angivet forskellige typer af cancer og y-aksen angiver, hvor mange procent af de testede væv, der indeholder Cripto-1. De grå søjler illustrerer, at der er fundet Cripto-1 i alle de anførte cancerformer, mens de hvide søjler viser, at der desuden er fundet Cripto-1 i flere af kroppens normale væv, dog er niveauet af Cripto-1 i det normale væv langt lavere end i cancervævet (32), s Studier har vist, at en høj ekspression af Cripto-1 i flere forskellige normale cellelinjer i høj grad øger cellernes evne til vækst og dannelse af kolonier(4). Desuden har et forhøjet niveau af Cripto-1 i epithelceller i mamma, samt karcinomceller i bryst eller livmoderhals hos mus vist sig at øge cellernes motilitet (33). Udover at øge proliferation, migration og invasion kan Cripto-1 også fremme dannelsen af vaskulære strukturer i humane umbilikale endothelceller (HUVECs) in vitro, og dette betyder, at Cripto-1 også kan have en angiogenetisk effekt. Dette underbygges af, at der i tumor xenografts med høj ekspression af Cripto-1, er observeret en øget vaskularisering (34). Ved længerevarende helicobacter pylori-infektion og atrofisk gastritis, som begge er risikofaktorer for ventrikel-karcinom, er der observeret øgede mængder af Cripto-1(35). Dette gør sig også gældende i colon-mucosa fra individer i familier med høj risiko for colon-karcinomer (36). Det ses altså, at der også findes en sammenhæng imellem Cripto-1 og disponerende faktorer. [18]

19 Cripto-1 i embryogenesen Cripto-1 er naturligt forekommende i embryogenesen, og det er vigtigt i forhold til en normal udvikling, herunder bl.a. udviklingen af hjertet, fastlæggelse af legemets akser (anterior/posterior) samt determinering af hhv. mesoderm og endoderm under gastrulationen (37). Signaleringsveje Figur 7 viser en række signaleringsveje, hvori Cripto-1 er involveret. Mange af signaleringsvejene opregulerer Cripto-1, men Cripto-1 spiller også en rolle i forbindelse med aktiveringen af enkelte signaleringsveje. Signaleringsvejene har deres individuelle funktioner, men samtidig er de i stand til at påvirke hinanden (31). Figur 7 viser en oversigt over en række signaleringsveje, som Cripto-1 er involveret i (31), s Nodal/Cripto-1-signaleringsvejen Nodal er en ligand, der binder til en receptor, som er opbygget af Aktivin type I (ALK 4/7) og Aktivin type II (ActRII). Begge disse Aktivin-receptorer er serin- og threonin-receptorkinaser. Cripto-1 fungerer som en co-receptor for bindingen mellem Nodal og dens receptor (38). Når Nodal/Cripto-1-signaleringsvejen er aktiveret er Aktivin-receptorerne i stand til at fosforylere proteinerne Smad2 og Smad3, som herefter binder til Smad4. Dette kompleks bevæger sig nu ind i nukleus, hvor det binder til DNA og øger transkriptionen af specifikke gener, herunder Cripto-1(38). [19]

20 Wnt/β-catenin-signaleringsvejen Wnt er en ligand, som aktiverer receptorerne, LRP-5/6 og Frizzled. Dette fører til en stabilisering af β- catenin, som translokerer til cellens nukleus, hvor det binder til DNA. Wnt/β-catenin-signaleringsvejen øger ekspressionen af Cripto-1 ved at påvirke dennes promoter (39). Derved er Cripto-1 i stand til at regulere sin egen ekspression, hvilket lader sig gøre, fordi Cripto-1 kan fungere som co-receptor for Wnt, og herved danne et kompleks bestående af Cripto-1, Wnt, Frizzled receptoren (Fzd7) og Glypican-4. Dette stabiliserer β-catenin, som er en del af Wnt/β-catenin-signaleringsvejen (31). Nodal/Cripto-1-signaleringsvejen kan påvirke Wnt/β-catenin-signaleringsvejen, idet Smad2 fra Nodal/Cripto-1-signaleringsvejen er i stand til at aktivere Wnt/β-catenin-signaleringsvejen (40). Notch-signaleringsvejen Notch er en receptor, som sidder i cellemembranen. Liganderne til disse receptorer sidder også i cellemembranen, således at der kan forekomme binding mellem Notch på én celle og dens ligand på naboceller (31). Ved binding af en ligand bliver det intracellulære domæne (ICD) af Notch fraspaltet, hvorefter det translokerer til cellens nukleus. I nukleus danner det et kompleks med CSL (CBF-1, supressor of hairless og Lag-1), som bindes til DNA og regulerer gentranskriptionen (31). Cripto-1 har indflydelse på dannelsen af Notch. Notch transporteres fra det ru endoplasmatiske reticulum til Golgi-apparatet og herfra videre til cellemembranen. Spaltning af det ekstracellulære domæne af Notch, mens Notch sidder på Golgiapparatet, øger sensitiviteten af Notch, hvorved det altså lettere binder til dets ligand (31). Hypoksi og HIF Som respons på hypoksi aktiverer transkriptionsfaktoren HIF (hypoxia inducible factor) nogle specifikke gener der skal hjælpe cellen. Der findes to typer, HIF-1 og HIF-2. HIF-1 består af to underenheder, en HIF-1α og en HIF-1β. Hypoksi stabiliserer HIF α -, som ellers nedbrydes, hvis der er ilt til stede. HIF-1α danner et kompleks med HIF-1β, og komplekset transporteres til nukleus, hvor det binder til specifikke promotor-regioner, HREs (hypoxia responsive elements), hvorved ekspressionen af Cripto-1 øges (31). Epithel-Mesenchymal Transition EMT (epithel-mesenchymal-transition) er en proces, hvor epithelceller omdannes til mesenchymale celler(32). Processen foregår under embryogenesen, herunder i gastrulationen, hvor epiblastens epithelceller undergår EMT, der resulterer i en adskillelse af cellerne, og de omdannes herved til [20]

21 mesodermale celler. De mesodermale celler migrerer gennem og væk fra primitivstriben.(41)(42). I forhold til cancer er det observeret, at der her foregår processer, som i høj grad minder om EMT(43). Under EMT sker der forskellige ændringer med cellerne, herunder reduceres ekspressionen af E- cadherin, mens ekspressionen af N-cadherin øges. I det normale væv er epithelceller bundet til hinanden gennem tætte intercellulære forbindelser. Disse forbindelser udgøres af det transmembrane adhæsionsmolekyle, E-cadherin, som intracellulært binder til β- og γ-catenin. Hele dette kompleks binder så til α-catenin, der binder til aktin, som udgør en del af cytoskelettet, se Figur 8 (44). Figur 8 viser, hvordan celler hænger sammen vha. af bestemte adhæsionsmolekyler. a Cadheriner, b Cateniner, c Aktin cytoskelet, d Integrin-receptorer, e Kollagen, f Fibronectin, n Nukleus. (6), s N-cadherin er et mesenchymalt adhæsionsmolekyle, og dets funktion i forbindelse med cancer behandles i et senere afsnit. Endnu et karakteristisk træk ved EMT er en øget ekspression af vimentin, som er en særlig form for cytoskelet-molekyle, som udtrykkes i mesenchymale celler (45). EMT, cancer og Cripto-1 Det er allerede nævnt, at processer, der minder om EMT, spiller en rolle i forhold til cancer. Reduktionen af E-cadherin er vigtig, idet det har en funktion i forhold til tumorprogression og [21]

22 metastase. I mange typer af karcinomer ses det, at et fald i ekspressionen af E-cadherin fører til en mere invasiv og udifferentieret cancer (46). Stigningen af N-cadherin under EMT er vigtig i forhold til cancercellers evne til invasion. Et studie har vist, at N-cadherins invasive egenskaber skyldes en N-cadherin-medieret interaktion mellem cancerceller og parenkym (47). Det er påvist, at der findes en øget ekspression af vimentin i forskellige humane karcinomer. Desuden er overekspression af vimentin sat i forbindelse med en øget invasion og motilitet af cellerne i humane cervicale cancere in vitro. Det har vist sig, at Cripto-1 er i stand til at øge motiliteten af epithelceller, netop ved at øge vimentin-ekspressionen (48). En øget Cripto-1-ekspression har vist sig, at have en sammenhæng med en mere aggressiv EMT. Dette er underbygget af forsøg med mus inficerede med MMTV (mouse mammary tumour virus), en virusinfektion der står i forbindelse med en øget mængde udtrykt Cripto-1, hvor de afficerede celler ses at undergå EMT. Ved forsøget blev der observeret en nedsat ekspression af E-cadherin samt en øget ekspression af N-cadherin i vævet. Desuden blev der observeret øget celledeling ved tilstedeværelsen af cyklin-d1, som i cellecyklus er vigtig i forhold til overgangen mellem G 1- og S-fasen, samt øget ekspression af vimentin (49). Ved overekspression af Cripto-1 i tumorvæv ses en øget EMT, hvorved hele adhæsionskomplekset, der holder cellerne sammen, mister sin styrke, og der opstår grundlag for invasion og migration (50). Cripto-1 s rolle i udviklingen af cancer Det er tidligere nævnt, at der er observeret øgede værdier af Cripto-1 i flere typer af humane cancere, og det vil derfor være relevant at se nærmere på, hvilken rolle Cripto-1 spiller i forhold til udviklingen af cancer. Cripto-1 s egenskaber i udviklingen af cancer er undersøgt i en række in vitro- samt in vivo-forsøg. In vitro-forsøg har vist, at en overekspression af Cripto-1-cDNA i fibroblaster fra rotter var i stand til at inducere vækst i disse celler. Dette underbygges af, at der i andre in vitro forsøg er påvist en øget ekspression af Cripto-1 i celler, der af forskellige onkogener var omdannet til cancerceller (51). I det første forsøg, der viste en Cripto-1-afhængig hyperplasi og tumorvækst i brystkirtler hos mus, blev der brugt MMTV til at fremkalde overekspression af Cripto-1. Nullipara transgene mus udviste en øget forgrening og dilation af brystgangene samt alveolerne. Hos multipara transgene mus [22]

23 observerede man multifokale hyperplasier, og omkring 33% af disse mus udviklede sidenhen papillære adenokarcinomer(52). Cripto-1 s mekanismer i udviklingen af cancer I det tidligere afsnit om EMT er det nævnt, at EMT spiller en rolle i forhold til bl.a. metastase, og at Cripto-1 er i stand til at øge EMT. I forhold til signaleringsvejene for Cripto-1, se Figur 7, er der mange af disse, der opregulerer ekspressionen af Cripto-1, og desuden er flere af disse aktive i udviklingen af cancer (31). Cripto-1 kan fungere som en ligand for Glypican-1, se Figur 7. Binding af Cripto-1 til Glypican-1 fører til fosforylering af protoonkogenet, c-src, som findes i cytoplasma. c-src er i stand til at aktivere MAPK- og PI3K/Akt-signaleringsvejene, og dette fører til celleproliferation samt øget cellemotilitet og overlevelse. c-src er nødvendig for at Cripto-1 kan inducere in vitro celle-transformation af brystepithel fra mus, og dette indikerer altså, at en ukontrolleret aktivering af c-src af Cripto-1 kan være vigtig i forhold til tumorgenese (53). Som nævnt fungerer de forskellige signaleringsveje ikke uafhængigt af hinanden. Cripto-1 kan på denne måde regulere både Wnt/β-catenin- og Notch-signaleringsvejene. Det er observeret, at netop disse signaleringsveje kan have en ændret aktivitet ved cancer, og det formodes derfor, at kommunikationen mellem Cripto-1 og signaleringsvejene kan være af vigtig betydning i forhold til udviklingen af cancer. Således er der i humane cancere en opregulering af ekspressionen af Notchreceptorer og deres ligander. Dette vides at gælde for karcinomer og lymfomer i bl.a. pulmones, colon, renes og pancreas (54). Hypoksi Cripto-1 har vist sig at kunne fremme dannelsen af vaskulære strukturer in vitro, og Cripto-1 menes derfor at kunne have en angiogenetisk effekt i tumorer. Som tidligere nævnt kan Cripto-1-ekspressionen reguleres direkte af HIF, og det er altså muligt, at de hypoksiske tilstande, som findes i voksende tumorer, øger ekspressionen af Cripto-1, hvorved der opstår en større tumorvaskularisering (54). Cripto-1 og Nodal-signalering Nodal-signalering har vist sig at være involveret i invasion samt i dannelsen af kolonier og metasatser i et malignt melanom (55). Cripto-1 fremmer Nodals signalering på to forskellige måder. Udover at fungere som en co-receptor for Nodal, hvilket gør bindingen mellem Nodal og ALK4 lettere og dermed øger effekten af Nodal, [23]

24 påvirker Cripto-1 også mængden af Nodal. Cripto-1 har en rolle i Nodal syntesen, hvor Cripto-1 hjælper med at kløve proteiner, som senere syntetiseres til Nodal (55). På denne måde har Cripto-1 altså en dobbeltfunktion, idet det både fungerer som en co-receptor for Nodal og samtidig øger mængden af Nodal. Dette har altså vist sig at bidrage til dannelsen af metastaser og invasion af det maligne melanom (55). Nodal i gliomet Det har vist sig, at Nodal spiller en rolle i forhold til udviklingen af gliomer, og der er fundet en sammenhæng imellem mængden af Nodal og gliomers egenskaber (56). Celler fra hjernetumorerne oligodendromer, astrocytomer og glioblastomer udtrykker mere Nodal end celler fra almindeligt hjernevæv (56). Som allerede nævnt findes der en sammenhæng imellem Cripto-1 og Nodal, bl.a. er Nodal i stand til at opregulere ekspressionen af Cripto-1. Dette er med til at gøre Cripto-1 til et interessepunkt i forskning af glioblastomer. [24]

25 Problemformulering Vi ved fra ovenstående, at Cripto-1 findes i flere forskellige cancertyper, og vi ønsker at undersøge, om dette også gør sig gældende for glioblastomer. Dette leder os hen til følgende problemformulering: Findes der øgede værdier af Cripto-1 i blodet fra patienter med glioblastomer, og hvilken konsekvens måtte dette have på fremtidige behandlingsmuligheder? For at besvare problemformuleringen vil vi undersøge relevant litteratur omkring emnet. Ved at udføre en Sandwich-ELISA samt en BCA, vil vi undersøge indholdet af Cripto-1 i plasma fra patienter med glioblastomer. Dette vil vi sammenligne med Cripto-1-indholdet i plasma fra kontrolpersoner. Vi vil ud fra forsøgsresultaterne diskutere, hvilke konsekvenser forhøjede Cripto-1-værdier måtte have i forhold til fremtidige behandlingsmuligheder af glioblastomer. Cripto-1 som målrettet behandling af cancer I de seneste år er der forsket i, hvordan Cripto-1 kan benyttes i målrettet behandling af cancer. Immunterapi er en vigtig indgangsvinkel til nye behandlingsmetoder af cancer, idet konventionelle behandlinger såsom stråle- og kemoterapi har sine begrænsninger. Tidligere studier har vist, at tumorvækst bl.a. er afhængig af resistente cancerstamceller beliggende dybt i tumoren (57). Idet cancercelle-overflader kun afviger en smule fra normale celler, ser immunsystemet ikke disse som fremmede, og reagerer derfor ikke på dem (58). Det er derfor essentielt at kunne identificere specifikke biomarkører på disse stamceller, for at kunne udvikle behandlingsmetoder, der involverer både passiv og aktiv immunisering (58). Cripto-1 har vist sig at repræsentere en biomarkør for cancerceller, som udviser stamcelle-karakteristika (57). Cripto-1 udvises i stor ekspression i mange humane tumorer, mens der udvises lav ekspression i normalt væv. Derudover er det vist, at Cripto-1 kan genkendes af antistoffer og cytotoxiske T-celler under de rette forudsætninger (32). Det er tidligere nævnt, at EGF-like- og CFC-domænerne er essentielle for Cripto-1-signalering. Dette betyder, at det først og fremmest er disse regioner, som er interessante i forhold til at kunne målrette Cripto-1 i behandling af cancer (32). De behandlingsmetoder involverende Cripto-1, der i de seneste år er blevet forsket i, omhandler primært passiv og aktiv immunisering, samt muligheden for at benytte antisense-terapi. [25]

26 Passiv immunisering Passiv immunisering foregår ved overførelse af antistoffer andetstedsfra til organismen. Under forskning med Cripto-1, er hybridomteknikken med brug af monoklonale antistoffer mod Cripto-1- antigener, den mest udbredte teknik (32). Princippet bag hybridomteknikken er at isolere antistof-producerende lymfocytter fra en Cripto-1- immuniseret mus. Disse fusioneres med fremdyrkede cancerceller fra myelomer, hvorved der dannes hybridomceller med dobbelt kromosomantal. Disse hydridomceller kan herefter dele sig og producere identiske monoklonale antistoffer så længe det ønskes (59). De monoklonale antistoffer er nu udelukkende specifikke for Cripto-1, og de kan ved binding til epitopen føre til flere forandringer i cancercellen (32). Antistofferne kan ved binding aktivere kroppens eget immunsystem til at anse Cripto-1-antigenet for fremmed, og derfor angribe det. Andre monoklonale antistoffer virker ved at bindes til EGF-like- og CFC-domænerne eller Aktivin- Cripto-1-co-bindingen, og forhindre dennes signaleringsvej, hvorved Cripto-1 s virkningsmekanismer forstyrres. Dette vil bl.a. føre til reduceret celleproliferation og dermed tumorvækst, både in vitro og in vivo på mus (32)(60). Binding af antistoffer til receptorer på Cripto-1 kan desuden føre til inhibering af Cripto-1-medierede MAPK/Akt-signaleringsveje (60). Aktiv immunisering Aktiv immunisering foregår ved at benytte antigener tilført udefra, således at organismen selv producerer antistoffer (32). Der foreligger ingen konkrete resultater på aktiv immunisering med Cripto-1-antigener, selvom forskning viser, at både B-og T-hjælper-celler kan udnyttes i immuniseringen, såvel som at det sandsynligvis er EGF-like-domænet, der kan målrettes immunisering (32). Antisense-terapi Ved antisense-terapi isoleres en sekvens fra syntetisk modificeret Cripto-1-DNA. Sekvensen vil bindes til mrna produceret af gensekvensen, som ultimativt vil inaktivere genet, idet mrna skal være enkeltstrenget for at kunne blive syntetiseret videre. Cripto-1-proteinet vil dermed ikke blive dannet. Den syntetiserede sekvens, i dette tilfælde den region, der koder for EGF-like- og CFC-domæner, betegnes en antisense-oligonukleotid. Sekvens-specifikke oligonukleotider er succesfuldt blevet brugt til at nedregulere Cripto-1 ekspression i flere forskellige cancere in vitro på mus (54). [26]

27 Der forelægger endnu ingen resultater fra forsøg, som viser om disse tre behandlingsmetoder målrettet mod Cripto-1, kan benyttes i behandling af glioblastomer. Teori og metode Formålet med vores forsøg er at undersøge indholdet af Cripto-1 i plasma fra patienter med glioblastomer. Dette vil vi sammenligne med Cripto-1-indholdet fra kontrolpersoner, som vi i dette forsøg antager som værende raske individer. Derudfra vil vi kunne diskutere, om der findes et øget indhold af Cripto-1 hos patienter med glioblastomer. For at kunne anvende plasma er dette, ved centrifugering, blevet isoleret fra det øvrige blod. Dette er udført ud fra en protokol, som er vedlagt som bilag 1. Koncentrationen af Cripto-1 i plasmaprøverne er bestemt ved en Sandwich-ELISA (protokol samt katalog er vedlagt som bilag 2). Det er imidlertid interessant at sammenligne disse resultater med plasmaprøvens samlede proteinkoncentration, idet en generelt højere proteinkoncentration vil kunne forklare et øget indhold af Cripto-1. Til bestemmelse af den samlede proteinkoncentration i plasmaprøverne anvendes metoden BCA (protokol vedlagt som bilag 3). Disse to tests, Sandwich- ELISA og BCA, vil tilsammen gøre os i stand til at bestemme Cripto-1-koncentrationen i forhold til den samlede proteinkoncentration i plasmaprøverne. Vi har været tre hold, der uafhængigt af hinanden har udført dette forsøg, og vi sammenkobler til sidst resultaterne. Forsøgspersoner Vi har haft prøver fra 7 forskellige patienter, hvoraf de 6 har haft glioblastomer, se Tabel 1. Den sidste patient har været indlagt med, hvad man troede var et glioblastom, men det viste sig at det var et metastaseret malignt melanom. Fra to af patienterne, C13 og C16, har vi modtaget en blodprøve udtaget i forbindelse med operation af det oprindelige glioblastom (a), samt en blodprøve udtaget i forbindelse med recidivet (b). Hver blodprøve analyseres to gange af to forskellige hold, således at der i alt analyseres 4 gange på hver blodprøve. Udover disse blodprøver anvendes 5 kontrolprøver fra raske forsøgspersoner. Disse blodprøver er udtaget fra bloddonorer samt fra personer med relation til Aalborg Universitet. [27]

28 Patient Dato Køn Årstal Diagnose Information C13a Kvinde 1957 GBM Højre occipitallap C13b GBM, recidiv Højre occipitallap C16a Mand 1968 GBM Højre frontallap C16b Marts 2012 GBM, recidiv Højre frontallap C Mand 1940 Malignt melanom Venstre temporallap C Kvinde 1951 GBM Højre frontallap C Mand 1972 GBM Højre occipital- C Kvinde 1985 GBM - C Mand - GBM - Tabel 1 viser information om hver af de 7 patienter. /parietallap Patient C13 anamnese Patient C13 er en kvinde, som inden indlæggelsen har oplevet 14 dages tiltagende dårligt syn. En CTscanning af cerebrum giver mistanke om en tumor i højre occipitallap, og dette bekræftes senere ved en MR-scanning, som ses på Figur 9, A. Tumoren fjernes kirurgisk, og der følger et ukompliceret postoperativt forløb. Patienten behandles efterfølgende med stråle- og kemoterapi, men ved efterfølgende kontrol ses et recidiv, som ses på Figur 9, C. Dette recidiv fjernes også kirurgisk, og resultater fra den postoperative kontrol ses på Figur 9, D. [28]

29 Patient C16 anamnese Patient C16 er en mand, som i en måned op til indlæggelsen plages af hovedpine. En scanning af cerebrum viser en tumor i højre frontallap, se Figur 10, A. Denne tumor behandles kirurgisk uden komplikationer, men i det postoperative forløb opstår der infektion ved knoglepladen. Dette forsinker patientens onkologiske behandlingsforløb. 3 måneder efter operationen oplever patienten, at hovedpinen forværres, samtidig med et fald i bevidstheden. Figur 9 Figurerne viser resultater fra MR-scanninger fra forsøgsperson C13. A: Glioblastom i højre occipitallap B: Postoperative kontrol C: Recidiv i højre occipitallap D: Postoperative kontrol En MR-scanning viser et recidiv, se på Figur 10, C, og det er ikke muligt at fjerne dette kirurgisk. Patienten forsøges behandlet med stråle- og kemoterapi. [29]

30 Figur 10 viser resultater fra MR-scanning af forsøgsperson C16. A: Glioblastom i højre frontallap B: Postoperativ kontrol C: Recidiv i højre frontallap Teori om Sandwich-ELISA Følgende vil omhandle principperne bag udførslen af en Sandwich-ELISA, som er en metode, der benyttes til at detektere antigener i en opløsning. Ved Sandwich-ELISA benyttes antistoffers mulighed for specifik binding, til at påvise tilstedeværelsen af et bestemt stof (61). Til Sandwich-ELISA benyttes en plade med brønde, hvor hver brønd er i stand til at binde uspecifikt. Den uspecifikke binding benyttes til at binde Capture Antibody, et antistof udviklet til at reagere specifikt mod det stof, som skal påvises med prøven (61). Efter binding af Capture Antibody benyttes en opløsning med højt proteinindhold til at forsegle eventuelle frie uspecifikke bindingssteder i brøndene. Dette gøres for at sikre, at der ikke er flere uspecifikke bindingssteder i brøndene, hvor antistoffet ikke allerede har bundet sig. Når der tilsættes en prøve af den opløsning, der skal testes for, vil stoffet, givet at det er til stede i prøven, bindes af Capture-antibody, som er indlejret i brønden (61). Detection Antibody tilsættes derefter brøndene, og dette vil binde specifikt med stoffet, der testes for. Foruden at hæfte til det stof der testes for, har Detection Antibody desuden til funktion at tjene som tilhæftningssted for det enzym, som efterfølgende tilsættes. Enzymet er i stand til at fremkalde en farvereaktion, hvis en bestemt blanding af kemikalier tilsættes (61). [30]