TOP2A IQFISH pharmdx. Kode K udgave. Til in vitro diagnostisk brug Sættet indeholder reagenser til 20 analyser /

Transkript

1 / TOP2A IQFISH pharmdx Kode K udgave Til in vitro diagnostisk brug Sættet indeholder reagenser til 20 analyser. P04092DK_02/K s. 1/37

2 Indhold Tilsigtet anvendelse... 3 Resumé og forklaring... 3 Princip for proceduren... 4 Reagenser... 4 Medfølgende materialer... 4 Nødvendige materialer, der ikke medfølger... 5 Forholdsregler... 6 Opbevaring... 8 Klargøring af præparater... 9 Paraffinindstøbte snit... 9 BRUGSANVISNING A. Klargøring af reagens A.1 Forbehandlingsopløsning A.2 Stringent vaskebuffer A.3 Vaskebuffer A.4 Ethanolserie A.5 Pepsinopløsning B. Farvningsprocedure B.1 Bemærkninger til proceduren B.2 Behandling af vævsprøver før farvning B.3 Farvningsprotokol Kvalitetskontrol Fortolkning af farvning Begrænsninger Generelle begrænsninger Præstationskarakteristika Analytisk sensitivitet Analytisk specificitet Robusthedsundersøgelser Reproducerbarhed Reproducerbarhed Klinisk anvendelighed Pilotforsøg Bekræftende forsøg - DBCG 89D/TOP2A Forsøgsdesign Statistisk metode Resultater Diskussion og konklusion Fejlfinding Bilag Bilag Bilag Referencer Symbolforklaring Side P04092DK_02/K s. 2/37

3 Tilsigtet anvendelse Til in vitro diagnostisk brug TOP2A IQFISH pharmdx er beregnet til detektering af amplifikation og deletion (ændring i antallet af kopier) af TOP2A-genet ved hjælp af fluorescens in situ hybridiseringsteknik (FISH) på formalinfikserede, paraffinindstøbte vævsprøver fra human brystkræft. Deletion og amplifikation af TOP2A-genet tjener som en markør for dårlig prognose for brystkræftpatienter i højrisikogruppen. TOP2A-genamplifikation, detekteret af TOP2A IQFISH pharmdx analysen er tillige indiceret som en hjælp til at forudsige recidivfri overlevelse hos brystkræftpatienter i højrisikogruppen, der behandles med adjuverende epirubicin-baseret kemoterapi. Resultaterne fra TOP2A IQFISH pharmdx analysen er beregnet til brug som supplement til eksisterende klinisk og patologisk information. Resumé og forklaring TOP2A-genet koder for enzymet topoisomerase IIα (topo IIα), som katalyserer kløvning og samling af dobbeltstrenget DNA, hvilket fører til relaxering af DNA-supercoils. Type II topoisomeraser er essentielle enzymer, som omdanner topologiske former af DNA ved at lave forbigående dobbeltstrengede kløvninger i DNA'ets backbone (1). Disse enzymer spiller en vigtig rolle i en lang række grundlæggende, nukleære processer (2) herunder DNA-replikation, -transkription, -kromosomstruktur, -kondensering og -segregering (3). Topoisomerase IIα-genet, TOP2A, findes i 2 eksemplarer i alle normale diploide celler og er lokaliseret i kromosom 17q21 (4). TOP2A-genet spænder over et område på ca. 27,5 kb og indeholder 35 exoner, der koder for et 170 kda-protein (5). Topo IIα-proteinet er anerkendt som en proliferationsmarkør, og udtrykkelsen af topo IIα varierer i løbet af cellecyklussen både i normale celler og i cancerceller (6). Udtrykkelsen af topo IIα i brysttumorer korrelerer med Ki-67-udtrykkelsen (7-10). Der er ikke fundet noget enkelt forhold for topo IIα på protein- og genniveau (7, 9, 10). Kun 20% af tilfældene med overudtrykkelse af topo IIα-protein har TOP2A-genamplifikation, mens der i 93% af tilfældene med TOP2A-genamplifikation havde overudtrykkelse af topo IIα-protein (11). Der er tilsyneladende flere faktorer, som bidrager til overudtrykkelse af topo IIα, både den cancerspecifikke amplifikation og den forhøjede celleproliferationshastighed. Ki-67 og topo IIα-proteinerne udtrykkes parallelt, hvilket kan fortolkes som en bekræftelse af celleproliferationshastighedens indflydelse på udtrykkelsen af topo IIα, selv i tilfælde med TOP2A-amplifikation (12). Type II topoisomeraser er mål for antracykliner, såsom doxorubicin og epirubicin, som også betegnes topoisomerasehæmmere (13-15). HER2-status som prædiktiv markør for antracykliner er et kontroversielt emne, og det har været påpeget, at den biologiske basis for denne sammenhæng mangler. Det har desuden været diskuteret, om man i stedet skal se HER2 som en surrogatmarkør eller pseudomarkør for det reelle antracyklinmål, topoisomerase II (16-18). Det er blevet påvist, at antallet af kopier af TOP2A påvirker tumorens sensitivitet over for topoisomerasehæmmere (16-28). Den kliniske ydelse af Dako TOP2A FISH pharmdx Kit har været undersøgt i to forsøg, som blev gennemført af Danish Breast Cancer Cooperative Group (DBCG) i København (21, 29, 30). Det seneste forsøg (21, 30) rapporterer TOP2A-genamplifikation i cirka 10% af brystcancertilfældene og deletion med samme hyppighed, når både de HER2-positive og - negative tumorer medtages i forsøgene. Oprindeligt blev det antaget, at et anormalt antal TOP2A-genkopier, som et resultat af amplifikation eller deletion, var begrænset til HER2- amplificerede tumorer (16, 31). For nylig har man detekteret ændringer i antallet aftop2agenkopier i tumorprøver med normal HER2-genstatus (21, 23, 29, 30, 32, 33). P04092DK_02/K s. 3/37

4 I DBCG-forsøget fandt man TOP2A-ændringer i næsten 60% af de HER2-amplificerede primære brysttumorer, mens 20% af de TOP2A-anormale tumorer havde normal HER2-status (21, 23, 29, 30, 32). Forsøget er blevet bekræftet af et canadisk forsøg, der viste, at TOP2Agenstatus (amplifikation eller deletion) er en signifikant prædiktiv faktor for udbyttet ved behandling med epirubicin-baseret kemoterapi (23). Ca. 35% af patienterne i dette forsøg havde HER2-amplificerede tumorer, og der fandtes en statistisk signifikant forbindelse mellem HER2-status og TOP2A-afvigelser (23, 34). Langt de fleste undersøgelser af TOP2A-genafvigelser har været samstemmende med hensyn til den prædiktive værdi af TOP2A-analyser(21-25, 30), i modsætning til de mere uoverensstemmende resultater med HER2-analyser (35). Selvom HER2- og TOP2Agenet sidder i det samme amplikon, og visse undersøgelser har fokuseret på genernes coamplifikation (22, 24, 25), har DBCG 89D og andre forsøg vist, at generne skal ses uafhængigt af hinanden og analyseres hver for sig (10, 20, 21, 26-30). Princip for proceduren TOP2A IQFISH pharmdx indeholder alle nødvendige reagenser til udførelse af en FISHprocedure på rutinemæssigt behandlede, formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. Efter afparaffinering og rehydrering opvarmes prøverne i forbehandlingsopløsning efterfulgt af proteolytisk fordøjelse med pepsin. Efter opvarmningen og det proteolytiske forbehandlingstrin, benytter kittet en ikke-giftig, brugsklar FISH-probeblanding baseret på en kombination af PNA- (peptidnukleinsyre) (36) og DNA-teknologi. Denne probeblanding består af en blanding af Texas Red-mærkede DNA-kosmidkloner, der dækker i alt 228 kb af TOP2A-amplikonet og en blanding af fluoresceinmærkede PNA-prober, der er rettet mod centromerregionen af kromosom 17. Den specifikke hybridisering til de to målområder resulterer i dannelse af et distinkt rødt fluorescenssignal på hvert TOP2A-amplikon og et distinkt grønt fluorescenssignal ved hver centromerregion på kromosom 17. Efter en stringent vask monteres prøverne med Fluorescensmonteringsmedium indeholdende DAPI, hvorefter de dækkes med dækglas. Resultaterne fortolkes ved hjælp af et fluorescensmikroskop med egnede filtre (se Bilag 3). Cancercellerne lokaliseres og evalueres derefter med hensyn til TOP2A/CEN-17-signalforhold. Normale celler i det analyserede vævssnit tjener som intern positiv kontrol af forbehandlingens og hybridiseringens effektivitet. Se afsnittet Fortolkning af farvning for yderligere oplysninger. TOP2A IQFISH pharmdx, kode K5733 kan anvendes til manuel farvning. Reagenser Medfølgende materialer De anførte materialer rækker til 20 analyser (en analyse defineres som ét målområde på 22 mm x 22 mm). Antallet af analyser er baseret på anvendelse af 250 µl pr. objektglas af flaske 2A (5 8 dråber), 10 µl pr. objektglas af flaske 3 og 15 µl pr. objektglas af flaske 5. Opløsningerne i flaske 3 og flaske 5 er viskøse og skal muligvis centrifugeres kortvarigt i en mikrocentrifuge for at kunne opsamle al det leverede reagens. Sættet indeholder materialer til 10 individuelle farvningskørsler (fire separate kørsler, når pepsinnedsænkningsmetoden anvendes). TOP2A IQFISH pharmdx forsendes på tøris. Som en kontrol af at sættets komponenter ikke har været udsat for høje temperaturer under transporten, skal der stadig være tøris tilbage ved modtagelsen. Bemærk, at nogle af kittets komponenter kan være ufrosne. Dette vil ikke påvirke ydelsen af TOP2A IQFISH pharmdx. Flaske 1 Forbehandlingsopløsning (20x) 150 ml, koncentreret 20x MES (2-[N-morpholino]ethansulfonsyre)-buffer. P04092DK_02/K s. 4/37

5 Flaske 2A Flaske 2B Flaske 3 Flaske 4 Flaske 5 Flaske 6 Pepsin 4 x 6,0 ml, brugsklar Pepsinopløsning, ph 2,0; indeholder stabilisator og et antimikrobielt stof. Pepsindiluent (10x) 24 ml, koncentreret 10x Fortyndingsbuffer, ph 2,0, med et antimikrobielt stof. TOP2A/CEN-17 IQISH-probeblanding 0,2 ml, brugsklar Blanding af Texas Red-mærkede TOP2A DNA-prober og fluoresceinmærkede CEN-17 PNA-prober; leveret i IQISH-hybridiseringsbuffer. Stringent vaskebuffer (20x) 150 ml, koncentreret 20x SSC-buffer (natriumcitrat-saltvandsopløsning) med detergent (Tween20). Fluorescence Mounting Medium 0,4 ml, brugsklar Fluorescensmonteringsmedium med 500 µg/l DAPI (4,6-diamidin-2-phenylindol). Vaskebuffer (20x) 500 ml, koncentreret 20x Tris/HCl-buffer. Dækglasforseglingsmiddel 1 tube, brugsklar Opløsning til aftagelig forsegling af dækglas. BEMÆRK: Følgende kitreagenser: Forbehandlingsopløsning (20x), pepsin, pepsindiluent (10x), stringent vaskebuffer (20x), fluorescensmonteringsmedium, vaskebuffer (20x) og dækglasforseglingsmiddel kan frit ombyttes med de tilsvarende reagenser i Dako Histology FISH Accessory Kit, kode K5799. Nødvendige materialer, der ikke medfølger Laboratoriereagenser Destilleret eller deioniseret vand Ethanol, 96% Xylen eller xylenerstatninger Laboratorieudstyr Absorberende servietter Justerbare pipetter Kalibreret termometer til delvis nedsænkning (område: C) Kalibreret overfladetermometer (område: C) P04092DK_02/K s. 5/37

6 Dækglas (22 mm x 22 mm) Dako Hybridizer (kode S2450/S2451)* Varmeblok eller hybridiseringsovn* Fugtkammer til hybridisering* Pincet Stinkskab MikrocentrifugeObjektglas, Dako Silanized Slides, kode S3003, eller poly-l-lysin-coatede objektglas (se Klargøring af præparater) Farveskåle eller -bade Stopur (der kan måle intervaller på 2 15 minutter) Hvirvelmixer Vandbad med låg (der kan holde en temperatur på 37 (±2) C, 63 (±2) C og fra 95 C til 99 C) Mikrobølgeovn med mulighed for registrering, hvis der udføres forbehandling ved hjælp af en mikrobølgeovn (se B3. Farvningsprotokol. Trin 1: Forbehandling, Metode B) * Der kan anvendes varmeblok eller hybridiseringsovn til denaturering (66 (±1) C) og hybridisering (45 (±2) C) sammen med et fugtkammer til hybridisering. Mikroskopudstyr og -tilbehør Filtre til fluorescensmikroskop: DAPI og FITC/Texas Red dobbeltfilter eller FITC og Texas Red monofiltre se appendiks 3 for detaljer. Der skal anvendes et fluorescensmikroskop med en 100 watt kviksølvpære som lyskilde. Andre lyskilder anbefales ikke med disse filtre. Mappe til objektglas (papbakke til 20 objektglas med hængslet låg eller tilsvarende). Forholdsregler 1. Til in vitro-diagnostisk brug. 2. Må kun anvendes af uddannet personale. 3. Flaske 1, Pre-Treatment Solution (20x), kræver ikke faremærkning. Sikkerhedsdatablade (SDS) til professionelle brugere kan rekvireres. 4. Flaske 2A, Pepsin, indeholder 5-<10% propan-2-ol, 0,1-<0,3% pepsin A og 0,011- <0,1% 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-on og 2-methyl-2H-isothiazol-3-on. Flaske 2a er mærket: Fare H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Forårsager svære forbrændinger af huden og øjenskader. Kan forårsage allergisk hudreaktion. Bær beskyttelseshandsker. Bær øjenbeskyttelse eller ansigtsbeskyttelse. Bær beskyttelsestøj. VED INHALERING: Sørg for, at personen kommer ud i frisk luft og kan trække vejret frit. Ring omgående til en GIFTINFORMATION eller en læge. VED ORAL INDTAGELSE: Ring omgående til en GIFTINFORMATION eller en læge. Fremskynd IKKE opkastning. VED KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Alt forurenet tøj tages straks af. Skyl/brus huden med vand. Ring omgående til en GIFTINFORMATION eller en læge. VED KONTAKT MED ØJNENE: Ring omgående til en GIFTINFORMATION eller en læge. Opbevares under lås. Indholdet/beholderen bortskaffes i overensstemmelse med alle lokale, regionale, nationale og internationale bestemmelser. P04092DK_02/K s. 6/37

7 5. Flaske 2B, Pepsin Diluent (10x), indeholder 50-<75% propan-2-ol og 5-<10% 2-amino- 2-(hydroxymetyl)propan-1,3-diolhydrochlorid. Flaske 2B er mærket: Fare H225 H319 H336 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P533 P235 P501 Meget brandfarlig væske og damp. Forårsager alvorlig øjenirritation. Kan forårsage sløvhed eller svimmelhed. Bær beskyttelseshandsker. Bær øjenbeskyttelse eller ansigtsbeskyttelse. Holdes væk fra varme, varme overflader, gnister, åben ild og andre antændelseskilder. Rygning forbudt. Anvend eksplosionssikkert elektrisk, ventilations-, lys- og alt andet materialehåndteringsudstyr. VED INHALERING: Sørg for, at personen kommer ud i frisk luft og kan trække vejret frit. VED KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Alt forurenet tøj tages straks af. Skyl/brus huden med vand. Opbevares køligt. Indholdet/beholderen bortskaffes i overensstemmelse med alle lokale, regionale, nationale og internationale bestemmelser. 6. Flaske 3, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, indeholder 10-<25% ethylenkarbonat og 3- <5% natriumchlorid. Flaske 3 er mærket: Advarsel H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Forårsager alvorlig øjenirritation. Bær øjenbeskyttelse eller ansigtsbeskyttelse. Vask hænderne grundigt efter brug. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl grundigt med vand i adskillige minutter. Fjern kontaktlinser, hvis den tilskadekomne bærer kontaktlinser, og de er lette at fjerne. Fortsæt skylningen. 7. Flaske 4, Stringent Wash Buffer (20x), indeholder 10-<25% natriumchlorid og 10-<20% 2-amino-2-(hydroxymetyl)propan-1,3-diolhydrochlorid. Flaske 4 er mærket: H319 H315 P280 Advarsel P264 P305 + P351 + P338 Forårsager alvorlig øjenirritation. Forårsager hudirritation. Bær beskyttelseshandsker. Bær øjenbeskyttelse eller ansigtsbeskyttelse. Vask hænderne grundigt efter brug. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl grundigt med vand i adskillige minutter. Fjern kontaktlinser, hvis den tilskadekomne bærer kontaktlinser, og de er lette at fjerne. Fortsæt skylningen. 8. Flaske 6, Wash Buffer (20x), indeholder 10-<25% natriumchlorid og 10-<20% trometamol. Flaske 6 er mærket: H319 H315 Advarsel Forårsager alvorlig øjenirritation. Forårsager hudirritation. P04092DK_02/K s. 7/37

8 P280 Bær beskyttelseshandsker. Bær øjenbeskyttelse eller ansigtsbeskyttelse. P264 Vask hænderne grundigt efter brug. P305 + P351 + P338 VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl grundigt med vand i adskillige minutter. Fjern kontaktlinser, hvis den tilskadekomne bærer kontaktlinser, og de er lette at fjerne. Fortsæt skylningen. 9. Coverslip Sealant indeholder 100% naphtha (petroleum), let hydrobehandlet, og er mærket: Fare H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P235 P501 Meget brandfarlig væske og damp. Kan være livsfarligt, hvis det indtages og kommer i luftvejene. Giftig for vandlevende organismer, med langvarige virkninger. Bær beskyttelseshandsker. Bær øjenbeskyttelse eller ansigtsbeskyttelse. Holdes væk fra varme, varme overflader, gnister, åben ild og andre antændelseskilder. Rygning forbudt. Anvend eksplosionssikkert elektrisk, ventilations-, lys- og alt andet materialehåndteringsudstyr. Undgå udledning til miljøet. VED ORAL INDTAGELSE: Ring omgående til en GIFTINFORMATION eller en læge. Fremskynd IKKE opkastning. VED KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Alt forurenet tøj tages straks af. Skyl/brus huden med vand. Opbevares køligt. Indholdet/beholderen bortskaffes i overensstemmelse med alle lokale, regionale, nationale og internationale bestemmelser. 10. Prøver, før og efter fiksering, og alle materialer, der har været eksponeret for disse, skal håndteres som smittefarlige og skal bortskaffes under iagttagelse af passende forholdsregler (37). Pipetter aldrig reagenser med munden, og undgå, at hud og slimhinder kommer i kontakt med reagenser og prøver. Vask med rigelige mængder vand, hvis reagenser kommer i kontakt med overfølsomme områder. 11. Minimer mikrobiel kontaminering af reagenser for at undgå fejlagtige resultater. 12. Andre inkubationstider og -temperaturer eller -metoder end de angivne kan give fejlagtige resultater. 13. Andre vævsfikseringsmetoder og tykkelser på prøverne end de angivne kan påvirke vævsmorfologien og/eller signalintensiteten. 14. Undgå fordampning af TOP2A/CEN-17 IQISH Probe Mix under hybridisering ved at sikre tilstrækkelig luftfugtighed i hybridiseringskammeret. 15. Reagenserne er optimalt fortyndede. Yderligere fortynding kan medføre manglende effektivitet. 16. Brug passende personlige værnemidler for at undgå kontakt med øjne og hud. Se yderligere oplysninger i sikkerhedsdatabladet (SDS). 17. Kun rene farvningsskåle bør anvendes til pepsinnedsænkningsmetoden (trin 2, metode C). Opbevaring TOP2A/CEN-17 IQISH-probeblanding (flaske 3) skal opbevares mørkt ved -18 C. Alle øvrige reagenser kan opbevares mørkt ved 2 8 C. Alle reagenser tåler opbevaring i fryser. Frysning og optøning af reagenserne op til 10 gange påvirker ikke ydelsen. Det brugsklare pepsin, TOP2A/CEN-17 IQISH-probeblanding og fluorescensmonteringsmedium (flaske 2A, 3 og 5) kan påvirkes negativt, hvis de udsættes for varme. Efterlad ikke disse reagenser ved stuetemperatur. P04092DK_02/K s. 8/37

9 TOP2A/CEN-17 IQISH-probeblanding og fluorescensmonteringsmedium (flaske 3 og 5) kan påvirkes negativt, hvis de udsættes for kraftigt lys. Opbevar ikke disse komponenter og udfør ikke analysen i kraftigt lys, såsom direkte sollys. Sættet må ikke anvendes efter udløbsdatoen, der er stemplet på æsken. Hvis reagenserne opbevares under andre betingelser end de, der er specificeret i indlægssedlen, skal brugeren validere reagensernes ydeevne (38). Der er ingen synlige tegn på, at produktet kan være ustabilt. Det er derfor vigtigt at evaluere normale celler i det analyserede vævssnit. Kontakt straks Dakos tekniske service, hvis der observeres et uventet fluorescensmønster, som ikke kan forklares med variationer i laboratorieprocedurer, og der er mistanke om et problem med TOP2A IQFISH pharmdx. Klargøring af præparater Prøver fra biopsier skal behandles med henblik på at konservere vævet til FISH-analyse. Der skal anvendes standardmetoder til behandling af væv til immunhistokemisk farvning for alle præparater (39). Paraffinindstøbte snit Kun væv, der er konserveret i neutral, bufferjusteret formalin og indstøbt i paraffin, er egnet til brug. Prøver fra biopsier kan f.eks. skæres i blokke med en tykkelse på 3 eller 4 mm og fikseres i timer i neutral, bufferjusteret formalin. Vævssnittene skal derefter dehydreres i en gradueret serie af ethanol og xylen, efterfulgt af infiltrering med smeltet paraffin, hvis temperatur ikke må overstige 60 C. Korrekt fikserede og indstøbte væv kan holde sig uendeligt inden opskæring og montering på objektglas, hvis de opbevares køligt (15 25 C) (39, 40). Andre fiksativer er ikke egnede. Vævsprøverne skal skæres i snit med en tykkelse på 4 6 µm. Objektglassene, der er nødvendige til analyse af TOP2A-genamplifikation og bekræftelse af tilstedeværelse af tumor, skal klargøres samtidigt. Det anbefales at anvende mindst 3 serielle snit, 1 snit til bekræftelse af tilstedeværelse af tumor farvet med hæmatoxylin og eosin (H&E stain), 1 snit til analyse for TOP2A genafvigelse og 1 snit som backup. Det anbefales, at vævssnittene monteres på Dako Silanized Slides, kode S3003, SuperFrost Plus eller poly L lysin coatede objektglas. Prøverne skal analyseres inden for 4 6 måneder efter udskæringen, når de opbevares ved stuetemperatur (20 25 C) eller 2 år, hvis de opbevares ved 2 8 C. P04092DK_02/K s. 9/37

10 BRUGSANVISNING A. Klargøring af reagens Det anbefales at forberede nedenstående reagenser inden farvningen: A.1 Forbehandlingsopløsning Der kan forekomme krystaller i flaske 1, men de vil gå i opløsning ved stuetemperatur. Sørg for, at krystallerne er forsvundet, inden reagenset klargøres. Fortynd en tilstrækkelig mængde af flaske 1 (forbehandlingsopløsning 20x) 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kassér bufferen, hvis den er uklar. A.2 Stringent vaskebuffer Fortynd en tilstrækkelig mængde af flaske 4 (stringent vaskebuffer 20x) 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kassér bufferen, hvis den er uklar. A.3 Vaskebuffer Fortynd en tilstrækkelig mængde af flaske 6 (vaskebuffer 20x) 1:20 i destilleret eller deioniseret vand. Ubrugt fortyndet buffer kan opbevares ved 2 8 C i en måned. Kasser fortyndet buffer, hvis den er uklar. A.4 Ethanolserie Klargør 3 kar med henholdsvis 70%, 85% og 96% ethanol ud fra en 96% ethanolopløsning. Opbevar de tildækkede kar ved stuetemperatur eller ved 2 8 C, og brug dem til maks. 200 objektglas. Kasser opløsningerne, hvis de er uklare. A.5 Pepsinopløsning Der er kun brug for pepsinopløsning ved anvendelse af pepsinneddypningsmetoden (metode C). Klargør pepsinopløsningen som følger: Klargør 60 ml pepsinopløsning til en beholder med kapacitet til seks objektglas. Tilsæt 48 ml destilleret eller deioniseret vand ved stuetemperatur (20 25 C) til beholderen. Tilsæt 6 ml kold (2 8 C) pepsindiluent (10x) (flaske 2B) til beholderen. Tilsæt 6 ml kold (2 8 C) pepsin (flaske 2A) til beholderen. Sæt låg på beholderen, og lad pepsinopløsningen nå en temperatur på 37 (±2) C i et vandbad. Klargør 240 ml pepsinopløsning til en beholder med kapacitet til 24 objektglas. Tilsæt 192 ml destilleret eller deioniseret vand ved stuetemperatur (20 25 C) til beholderen. Tilsæt 24 ml kold (2 8 C) pepsindiluent (10x) (flaske 2B) til beholderen. Tilsæt 24 ml kold (2 8 C) RTU-pepsin (flaske 2A) til beholderen. Sæt låg på beholderen, og lad pepsinopløsningen nå en temperatur på 37 (±2) C i et vandbad. Når pepsinopløsningen har nået den fastsatte temperatur, skal den bruges inden for 5 timer. P04092DK_02/K s. 10/37

11 B. Farvningsprocedure B.1 Bemærkninger til proceduren Brugeren skal læse denne vejledning grundigt igennem og gøre sig fortrolig med alle komponenter inden brug (se Forholdsregler). Alle reagenser skal ækvilibreres til den rette temperatur inden brug som følger. Flaske 1, Den fortyndede forbehandlingsopløsning skal ækvilibreres til C hvis der anvendes vandbad til forbehandling (B3. Farvningsprotokol, Trin 1: Forbehandling, Metode A). Hvis der anvendes en mikrobølgeovn med mulighed for registrering til forbehandling (B3. Farvningsprotokol, Trin 1: Forbehandling, Metode B), skal den fortyndede forbehandlingsopløsning ækvilibreres til stuetemperatur C. Flaske 2A, Pepsin skal anvendes ved 2 8 C (B3, Farvningsprotokol, Trin 2: Metode A og B) og holdes koldt konstant. Flaske 2B: Pepsindiluent (10x) skal anvendes ved 2 8 C (B3, Farvningsprotokol, Trin 2: Metode C). Flaske 3, TOP2A/CEN-17 IQISH-probeblanding separerer i to faser, mens den opbevares ved -18 C. Før anvendelsen af flaske 3 skal det sikres, at der kun er én fase, ved at lade probeblandingen opnå stuetemperatur (20 25 C) efterfulgt af blanding. Optø flaske 3 ved stuetemperatur (20 25 C) i maksimalt 30 minutter (beskyttet mod kraftigt lys), og hvirvl derefter flasken grundigt i 15 sekunder ved 2500 rpm med en hvirvelmikser. Opbevar flaske 3 ved -18 C umiddelbart efter brug. Flaske 4, Én beholder skal ækvilibreres til stuetemperatur, en anden beholder skal ækvilibreres til 63 (±2) C forud for brugen. Flaske 5, Fluorescensmonteringsmedium kan anvendes ved en hvilken som helst temperatur fra 2 25 C. Flaske 6, Den fortyndede vaskebuffer skal ækvilibreres til stuetemperatur C. Dækglasforseglingsmidlet kan anvendes ved enhver temperatur fra 2 25 C. Alle trin skal udføres ved den angivne temperatur. Proceduren omfatter et antal dehydreringer efterfulgt af tørring af vævssnittene. Sørg for, at vævssnittene er helt tørre, inden der fortsættes til næste trin. Vævssnittene må ikke tørre under de andre proceduretrin. Hvis farvningsproceduren skal afbrydes, kan objektglassene opbevares i vaskebuffer efter afparaffineringstrinnet i op til 1 time ved stuetemperatur (20 25 C), uden at dette påvirker resultaterne. B.2 Behandling af vævsprøver før farvning Afparaffinering og rehydrering: Forud for analysens udførelse skal objektglassene med væv afparaffineres for at fjerne indstøbningsmediet, og rehydreres. Ufuldstændig fjernelse af paraffinen skal undgås. Rester af indstøbningsmediet vil medføre en øget uspecifik farvning. Dette trin skal udføres ved stuetemperatur (20 25 C). 1. Placer objektglassene i et xylenbad, og inkuber i 5 (±1) minutter. Udskift badene, og gentag én gang. 2. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i 96% ethanol i 2 (±1) minutter. Udskift badene, og gentag én gang. 3. Bank overskydende væske af, og anbring objektglassene i 70% ethanol i 2 (±1) minutter. Udskift badene, og gentag én gang. P04092DK_02/K s. 11/37

12 4. Bank overskydende væske af og anbring objektglassene i fortyndet vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.3) i mindst 2 minutter. Påbegynd farvningsproceduren som beskrevet i afsnit B.3, Trin 1, Forbehandling. Xylen- og alkoholopløsningerne skal udskiftes efter 200 objektglas eller færre. Der kan anvendes xylenerstatninger. BEMÆRK: Reagenserne og vejledningen i dette sæt er udviklet med henblik på at opnå en optimal ydelse. Yderligere fortynding af reagenser eller ændring af inkubationstemperaturen kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater. Forskelle i vævsbehandling og tekniske procedurer på brugerens laboratorium kan gøre analyseresultaterne ugyldige. B.3 Farvningsprotokol Trin 1: Forbehandling Forbehandlingen kan enten udføres ved hjælp af et vandbad som beskrevet under metode A) eller alternativt ved hjælp af en mikrobølgeovn med mulighed for registrering, som beskrevet under metode B). Metode A: Forbehandling med vandbad Fyld et farvningskar med den fortyndede forbehandlingsopløsning (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.1). Anbring farvningskarret med den fortyndede forbehandlingsopløsningen i et vandbad. Opvarm vandbadet og forbehandlingsopløsningen til C. Mål temperaturen i karret med et kalibreret termometer for at sikre den korrekte temperatur. Sæt låg på karret for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Sænk de afparaffinerede snit, der har stuetemperatur, ned i den forvarmede forbehandlingsopløsning i farvningskarret. Kontroller igen temperaturen og inkuber i 10 (±1) minutter, ved C. Tag hele karret med objektglassene op af vandbadet. Tag låget af, og lad objektglassene køle af i forbehandlingsopløsningen i 15 minutter ved stuetemperatur. Overfør objektglassene til en skål med fortyndet vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.3) i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad vævssnittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. BEMÆRK: Forbehandlingsopløsningen er kun beregnet til én anvendelse. Må ikke genbruges. Metode B: Forbehandling ved hjælp af mikrobølgeovn med mulighed for registrering Fyld et plastkar med fortyndet forbehandlingsopløsning ved stuetemperatur (20 25 C). Nedsænk de afparaffinerede snit i forbehandlingsopløsning, dæk karret med et låg med ventilationshuller, og placer det i mikrobølgeovnen. Aktiver kogepunktssensoren, og vælg et program, der kører i 10 minutter efter at temperaturen er nået op på kogepunktet*. Efter de 10 minutters inkubation tages karret med objektglas ud af ovnen, låget fjernes, og skålen lades henstå til afkøling i 15 minutter ved stuetemperatur. Flyt objektglassene over i en skål med fortyndet vaskebuffer, og lad dem ligge i blød i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. * Kravet om brug af en mikrobølgeovn med mulighed for registrering betyder, at ovnen skal have en sensor og programmer, som indledningsvis opvarmer forbehandlingsopløsningen til kogepunktet og derefter opretholder den krævede forbehandlingstemperatur (over 95 ºC), mens den forudindstillede tid tæller ned (10 (±1) minutter). På visse mikrobølgeovne med mulighed for registrering er det muligvis ikke muligt at indstille en valgfri nedtællingstid. Hvis ovnen kun har forudindstillede programmer, skal der vælges et program, som opretholder den krævede forbehandlingstemperatur (over 95 ºC) i mindst 10 (±1) minutter, hvorefter man skal stoppe programmet manuelt efter 10 (±1) minutter. BEMÆRK: Forbehandlingsopløsningen er kun beregnet til én anvendelse. Må ikke genbruges. Trin 2: Pepsin, brugsklar (RTU) eller pepsinopløsning Pepsininkubering kan udføres ved direkte anvendelse af RTU-pepsindråber på objektglassene enten ved stuetemperatur (20 25 C) (metode A) eller ved 37 C (metode B). Alternativt kan objektglassene neddyppes i en pepsinopløsning og inkuberes ved 37 (±2) C (metode C) P04092DK_02/K s. 12/37

13 Metode A) og metode B) Bank overskydende buffer af. Tør med en fnugfri klud (såsom en absorberende serviet eller et stykke gaze) omhyggeligt af rundt om prøven for at fjerne overskydende væske og holde reagenserne inden for det foreskrevne område. Tilsæt 5 8 dråber (250 µl) kold (2 8 C) pepsin (flaske 2A) for at dække prøven. Opbevar altid pepsin ved 2 8 C. Metode A: Pepsin, brugsklar - inkubering ved C Inkuber i 5 15 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). En inkubationstid på 5 15 minutter vil være passende for de fleste prøver, men den optimale inkubationstid kan afhænge af vævsfikseringen og/eller tykkelsen af prøven og skal bestemmes af brugeren. Bank overskydende pepsin af, og læg snittene i blød i fortyndet vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.3) i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. Fortsæt med dehydrering. Metode B: Pepsin, brugsklar - inkubering ved 37 C Placer prøven med pepsin på en varmeblok ved 37 C - f.eks. en Dako Hybridizer - og inkuber i 3 5 minutter. En inkubationstid på 3 5 minutter vil være passende for de fleste prøver, men den optimale inkubationstid kan afhænge af vævsfikseringen og/eller tykkelsen af prøven og skal bestemmes af brugeren. Bank overskydende pepsin af, og læg snittene i blød i fortyndet vaskebuffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. Fortsæt med dehydrering. Dehydrer vævssnittene gradvist med ethanol: 2 minutter i 70% ethanol, 2 minutter i 85% ethanol og 2 minutter i 96% ethanol. Lad vævssnittene lufttørre helt. Metode C: Pepsinopløsning - neddypning af objektglas i pepsinopløsning ved 37 C Sættet indeholder reagenser til fire separate kørsler (60 ml pepsinopløsning, lille beholder til seks objektglas) eller en enkelt kørsel (240 ml pepsinopløsning, stor beholder til 24 objektglas). Klargør pepsinopløsningen som beskrevet i afsnit A.5. Sæt låg på beholderen, og lad pepsinopløsningen nå en temperatur på 37 (±2) C i et vandbad. Sørg for, at temperaturen får tid til at stabilisere sig. Mål temperaturen i beholderen med et kalibreret termometer for at sikre en korrekt temperatur. Bank overskydende vaskebuffer af. Neddyp objektglassene i pepsinopløsningen ved 37 (±2) C. og inkuber i minutter. En inkubationstid på minutter vil være passende for de fleste prøver, men den optimale inkubationstid kan afhænge af vævsfikseringen og/eller tykkelsen af prøven og skal bestemmes af brugeren. Bank overskydende pepsinopløsning af, og læg snittene i blød i fortyndet vaskebuffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift vaskebufferen, og lad snittene ligge i blød i yderligere 3 minutter. Fortsæt med dehydrering. Dehydrer vævssnittene gradvist med ethanol: 2 minutter i 70% ethanol, 2 minutter i 85% ethanol og 2 minutter i 96% ethanol. Lad vævssnittene lufttørre helt. Trin 3: TOP2A/CEN-17 IQISH-probeblanding TOP2A/CEN-17 IQISH-probeblanding separerer i to faser, mens den opbevares ved -18 C. Før anvendelsen af flaske 3 skal det sikres, at der kun er én fase, ved at lade probeblandingen opnå stuetemperatur (20 25 C) efterfulgt af blanding. Optø flaske 3 ved stuetemperatur (20 25 C) i maksimalt 30 minutter (beskyttet mod kraftigt lys), og hvirvl derefter flasken grundigt i 15 sekunder ved 2500 rpm med en hvirvelmikser. Opbevar flaske 3 ved -18 C umiddelbart efter brug. P04092DK_02/K s. 13/37

14 Tilsæt 10 µl TOP2A/CEN -17 IQISH-probeblanding (flaske 3) over midten af vævssnittet. Anbring straks et 22 mm x 22 mm dækglas over probeblandingen, og lad det sprede sig jævnt under dækglasset. Undgå luftbobler. Hvis der observeres luftbobler, fjernes de ved at slå forsigtigt på dækglasset med en pincet. Husk at opbevare flaske 3 ved -18 C umiddelbart efter brugen. Forsegl dækglasset med dækglasforseglingsmidlet ved at presse dette ud i en fuge langs kanten af dækglasset. Lad dækglasforseglingsmidlet overlappe dækglasset og objektglasset, så der dannes en forsegling rundt om dækglasset. Sørg for, at dækglasforseglingsmidlet dækker hele dækglassets kant. Klargør Dako Hybridizer* (kode S2450/S2451) til en hybridiseringskørsel. Sørg for, at Humidity Control Strips (kode S2452) er våde og optimale for brug. Start Hybridizer'en, og vælg et program, der: Denaturerer ved 66 C i 10 minutter efterfulgt af hybridisering ved 45 C i minutter. Placer objektglassene i Hybridizer en, sørg for, at låget er korrekt lukket, og start programmet. Der henvises til brugervejledningen til Dako Hybridizer for detaljerede oplysninger. *Instrumenter, der gør det muligt at opnå betingelser, der er identiske med de ovenfor beskrevne, kan anvendes til denaturering og hybridisering, f.eks. som beskrevet herunder: Placer objektglassene på en jævn overflade af metal eller sten (varmeblok eller på en blok i en hybridiseringsovn), der er forvarmet til 66 ±1) C. Denaturer i nøjagtigt 10 minutter. Anbring objektglassene i et forvarmet, hybridiseringsfugtkammer. Læg låg over kammeret, og inkuber ved 45 (±2) C i minutter. Bemærk, at en hybridiseringstemperatur på 37 C ikke er egnet til brug med proberne, der er indeholdt i dette sæt. Trin 4: Stringent vask Fyld to farvningskar med den fortyndede stringente vaskebuffer (se BRUGSVEJLEDNING, afsnit A.2). Det anbefales at bruge mindst 100 ml eller 15 ml pr. objektglas i hvert kar. Anbring det ene af farvningskarrene med fortyndet stringent vaskebuffer ved stuetemperatur i et stinkskab og det andet i et vandbad. Opvarm vandbadet og den fortyndede stringente vaskebuffer til 63 (±2) C. Sørg for, at temperaturen har stabiliseret sig. Sæt låg på karret for at stabilisere temperaturen og undgå fordampning. Mål temperaturen inde i skålen i vandbadet med et kalibreret termometer for at sikre den korrekte temperatur. Den stringente vaskebuffer indeholder detergent og kan blive turbid ved 63 C. Dette påvirker ikke ydelsen. Tag objektglassene ud af hybridiseringskammeret ved hjælp af en pincet eller handsker, fjern forsigtigt dækglasforseglingsmidlet og dækglassene, og placer objektglassene i forvaskekarret, der har stuetemperatur, et ad gangen. Placer ikke objektglassene i stringent vaskebuffer, før dækglassene er taget af. Så snart alle dækglas er fjernet, overføres objektglassene fra forvaskekarret med stuetemperatur til karret i det 63 (±2) C varme vandbad. Umiddelbart efter at have overført objektglassene til den 63 (±2) C varme beholder i vandbadet, skal timeren startes. Udfør stringent vask i nøjagtigt 10 minutter. Fjern objektglassene fra den fortyndede stringente vaskebuffer og læg snittene i blød i fortyndet vaskebuffer i 3 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Udskift den fortyndede Wash Buffer og lad snittene ligge i bufferen i endnu 3 minutter. Dehydrer vævssnittene gradvist med ethanol: 2 minutter i 70% ethanol, 2 minutter i 85% ethanol og 2 minutter i 96% ethanol. Lad vævssnittene tørre fuldstændigt. Trin 5: Montering Tilsæt 15 µl fluorescensmonteringsmedium indeholdende DAPI (flaske 5) til målområdet på objektglassene og læg et dækglas over. BEMÆRK: Objektglassene kan aflæses efter 15 minutter eller inden for 7 dage efter monteringen. Imidlertid kan der forekomme falmning, hvis objektglassene udsættes for lys eller P04092DK_02/K s. 14/37

15 høje temperaturer. For at minimere falmning skal objektglassene opbevares mørkt ved C. Kvalitetskontrol 1. Signalerne skal være klare, tydelige og nemme at evaluere. 2. Normale celler gør intern kontrol af farvningskørslen mulig. Normale celler bør indeholde 1 2 klart synlige grønne signaler, der indikerer, at CEN-17-PNA proben har hybridiseret godt til centromerregionen af kromosom 17. Normale celler skal ligeledes have 1-2 tydeligt synlige røde signaler, der indikerer, at TOP2A-DNA-proben har hybridiseret godt til TOP2A-målregionen. På grund af vævssektionering vil nogle af de normale celler indeholde færre end de forventede 2 signaler af hver farve. Normale celler, der undergår celledeling, kan have flere end de normale 1-2 signaler i hver farve. Hvis der ikke kan påvises signaler i normale celler, indikerer dette en analysefejl, og resultaterne skal betragtes som ugyldige. 3. Den nukleære morfologi skal være intakt under evaluering med et DAPI-filter. Talrige spøgelseslignende celler og en generelt dårlig kernemorfologi indikerer overfordøjelse af prøven, hvilket resulterer i tab af eller fragmentering af signaler. Sådanne prøver skal betragtes som ugyldige. 4. Forskelle i vævsfiksering, -behandling og -indstøbning på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt, hvilket gør det nødvendigt at gennemføre regelmæssige kontroller på laboratoriet. Fortolkning af farvning Evaluerbart væv Kun prøver fra patienter med invasivt carcinom bør testes. I tilfælde med carcinoma in situ og invasivt carcinom i samme præparat, skal kun det invasive område bedømmes. Undgå områder med nekrose og områder, hvor kernernes afgrænsning er tvivlsom. Tag ikke kerner med, der kræver subjektiv vurdering. Spring kerner med svag signalintensitet og uspecifik eller høj baggrund over. Brug DAPI-filtret til at kontrollere for jævn kernefarvning. Signaltælling: Lokaliser tumoren på det H&E-farvede objektglas, og evaluer det samme område på det FISH farvede objektglas. Scan adskillige områder med tumorceller for at tage højde for mulig heterogenesitet. Vælg et område, der har en god kernefordeling. Begynd analysen i øverste venstre kvadrant af det valgte område og tæl antallet af signaler inden for hver evalueret kernes nukleære grænse, idet der scannes fra venstre mod højre, i henhold til retningslinjerne herunder (se ligeledes Appendiks 3). Fokuser op og ned for at finde alle signalerne i de individuelle kerner. Tæl to signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er lig med eller mindre end diameteren af signalet, som kun ét signal. I kerner med høje niveauer af TOP2A genamplifikation, kan TOP2A-signalerne være placeret meget tæt på hinanden og danne en klynge af signaler. I disse tilfælde kan antallet af TOP2A-signaler ikke tælles, men må i stedet estimeres. Vær særlig opmærksom på de grønne signaler, da klynger af TOP2A-signaler kan dække de grønne signaler og gøre det umuligt at se dem. I tvivlstilfælde kontrolleres de grønne signaler ved anvendelse af et specifikt FITC-filter. Tæl ikke kerner uden grønne signaler. Tæl kun de kerner med, der indeholder et eller flere grønne referencesignaler. Optegn tallene i en tabel som vist i appendiks 2. P04092DK_02/K s. 15/37

16 Tællevejledning 1 Skal ikke tælles. Kerner overlapper, ikke alle kerneområder er synlige. 2 Tælles som to grønne signaler 3 To røde signaler, kerner, der kun har røde signaler, skal ikke scores 4 Tælles som 3 grønne og 12 røde signaler (klyngeestimering) 5 Tælles som 1 grønt og 1 rødt signal. To signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er lig med eller mindre end diameteren af signalet, tælles som et 6 Tælles ikke med (over- eller underfordøjede kerner). eller Manglende signaler i centrum af kernerne (donut-formede kerner). 7 Tælles som 2 grønne og 3 røde signaler. To signaler, der er af samme størrelse og adskilt med en afstand, der er lig med eller mindre end diameteren af signalet, tælles som et 8 Tælles som 1 grønt og 5 røde signaler 9 Tælles som 3 grønne (1 grøn ude af fokus) og 3 røde signaler 10 Klynge af røde signaler, der skjuler grønne signaler. Kontroller de grønne signaler med et specifikt FITC-filter, eller tæl ikke kernen med Signalerne kan enten scores med den konventionelle metode (41) eller med en alternativ tidsog arbejdsbesparende metode (21, 29). I stedet for den konventionelle metode til tælling af signaler i 60 kerner, scores der i alt 60 hændelser, hvor én hændelse er et rødt gensignal. Med denne alternative tællemetode scores et varierende antal kerner, indtil man når op på 60 røde TOP2A-signaler. De tilsvarende grønne CEN-17-signaler i de samme kerner registreres. Der skal mindst bedømmes 6 kerner. I normale prøver vil gennemsnitligt 35 kerner være tilstrækkeligt til at opnå 60 røde signaler. I amplificerede tilfælde medtages der 6-35 kerner. Selv i tilfælde med deletioner vil mindre end 60 kerner ofte være tilstrækkeligt. Om muligt tælles kernerne fra 3 markante tumorområder (42). Beregn TOP2A/CEN-17-forholdet ved at dividere det samlede antal røde TOP2A-signaler med det samlede antal grønne CEN-17- signaler. Prøver med et TOP2A/CEN-17-forhold over eller lig med 2 skal betragtes som havende TOP2A-amplifikation, og prøver med et TOP2A/CEN-17-forhold under 0,8 skal betragtes som havende TOP2Adeletion (18, 21, 29). Resultater ved eller tæt på cut-off (1,8 2,2 for amplifikationer og 0,7 0,9 for deletioner) skal tolkes med forsigtighed. Det anbefales at kontrollere, at scoringerne ikke omfatter en høj procentdel af normale kerner. Hvis forholdet ligger i en af de to tvivlsomme zoner, eller i tilfælde af usikkerhed, anbefales det, at scoringen af prøven verificeres med en ny scoring, der udføres af en anden person, som tæller kernerne fra yderligere 3 tumorområder og/eller i alt 60 kerner. Et kriterium for accept på P04092DK_02/K s. 16/37

17 ± 10% CV anbefales. Det endelige forhold skal beregnes på ny på baggrund af alle scoringer. I grænsetilfælde er en konsultation mellem patologen og den behandlende læge ønskelig. Begrænsninger Generelle begrænsninger 1. FISH er en flertrins diagnostisk proces, der kræver specialiseret uddannelse vedrørende valg af passende reagenser såvel som vævsselektion, -fiksering, -behandling og klargøring af FISH-objektglas og fortolkning af farvningsresultaterne. 2. FISH-resultaterne er afhængige af håndteringen og behandlingen af vævet inden farvning. Forkert fiksering, vask, tørring, opvarmning, sektionering eller kontaminering med andre væv eller væsker kan påvirke probehybridisering. Uoverensstemmende resultater kan skyldes forskelle i fikserings- og indstøbningsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævet. 3. For optimale og reproducerbare resultater skal objektglassene med vævsprøverne afparaffineres fuldstændigt. Fjernelsen af paraffin skal være fuldført ved begyndelsen af farvningsprocessen. (Se BRUGSANVISNING, afsnit B.2). 4. Der må kun anvendes temperaturkalibrerede vandbade, varmeblokke og hybridiseringsovne. Brug af andre typer udstyr kan resultere i fordampning af TOP2A/CEN- 17 IQISH-probeblanding under hybridiseringen, og skal valideres af brugeren. Præstationskarakteristika Analytisk sensitivitet Sensitiviteten af TOP2A/CEN-17 IQISH-probeblandingen blev undersøgt ved hjælp af 18 prøver af normalt, humant brystepitel. Forholdet mellem antallet af TOP2A-signaler og CEN-17-signaler blev beregnet baseret på en tælling af 60 kerner pr. prøve. TOP2A/CEN-17-forholdet for de 18 prøver af normalt, humant brystepitel var mellem 0,97-1,11. Analytisk specificitet TOP2A DNA-proberne i TOP2A/CEN-17 IQISH-probeblandingen er blevet endesekvenseret og kortlagt for at bekræfte en samlet dækning på 228 kb inklusive TOP2A-genet. CEN-17 PNA-proberne i TOP2A/CEN-17 IQISH-probeblandingen er blevet testet individuelt og i kombination for at bekræfte deres specifikke hybridisering til centromerregionen af kromosom 17. For at måle analysens evne til kun at identificere målsubstanserne TOP2A og CEN-17 uden interferens fra andre stoffer, blev der udført undersøgelser på vævsprøver af normalt, humant brystepitel ved hjælp af flaske 3 indeholdende hybridiseringsbufferen men uden probeblandingen. I alt 18 prøver blev evalueret for tilstedeværelse af signaler, der ikke var relateret til probeblandingen. Der blev ikke observeret detektion af andre kromosommål eller interferens med nært beslægtede stoffer i nogen af de 18 prøver. Robusthedsundersøgelser TOP2A IQFISH pharmdx analysens robusthed blev testet ved at ændre forbehandlingstiden, temperaturen og metoderne til opvarmning af forbehandlingsbufferen (mikrobølgeovn eller vandbad), pepsininkuberingstiden og - metoden (RTU-pepsin eller nedsænkning), denatureringstemperaturen og -tiden, hybridiseringstiden og tid og temperatur for den stringente vask. Der observeredes ingen betydende forskelle i resultater ved følgende eksperimentbetingelser: P04092DK_02/K s. 17/37

18 Forbehandling, metode A) Vandbad i 10 minutter kombineret med hver af temperaturerne 95 C, C og 99 C sammen med 9, 10 og 11 minutter ved C. Forbehandling, metode B) Mikrobølgeovn i 9, 10 og 11 minutter ved >95 C. Pepsinfordøjelse, metode A) med inkuberingstider på 5, 10 og 15 minutter ved stuetemperatur (20 25 C). Pepsinfordøjelse, metode B) med inkuberingstider på 3, 4 og 5 minutter ved 37 C). Pepsinfordøjelse, metode C) med inkuberingstider på 20, 25 og 30 minutter kombineret med hver af temperaturerne 35, 37 og 39 C. Denaturering i 10 minutter kombineret med hver af temperaturerne 65, 66 og 67 C sammen med 9, 10 og 11 minutter ved 66 C. Hybridiseringstid på 60, 90 og 120 minutter ved 45 C. Stringent vask i 10 minutter kombineret med hver af temperaturerne 61, 63 og 65 C sammen med 9, 10 og 11 minutter ved 63 C. Visse af tids- og temperaturkombinationerne ved tolerancernes yderste grænser resulterede i en let forringet kvalitet af vævsstrukturen, selv om der ikke observeredes nogen signifikant forskel i signalintensiteten. Farvningsproceduren til TOP2A IQFISH pharmdx byder på protokolvariabler for så vidt angår varme-forbehandling, pepsinfordøjelse og hybridiseringstid. Hver af de unikke kombinationer er blevet valideret med hensyn til TOP2A-genstatus. Valideringen blev udført på 10 FFPE-prøver af humant brystkarcinom for hver af de 12 mulige kombinationer. TOP2A FISH pharmdx Kit (K5333) blev brugt som reference. TOP2A/CEN-17-forholdet for hver enkelt af prøverne ses i figur 1. Krydstabuleringer mellem de 12 test og referencefarvningen viste en generel overensstemmelse for så vidt angår TOP2A-genstatus på 100% (10/10) med nedre og øvre tohalede 95% konfidensgrænser på henholdsvis 78,3% og 100%. Kappa-værdien var 1,00, og McNemars test viste fravær af bias (tohalet t-værdi på 1,00). P04092DK_02/K s. 18/37

19 Figur 1. Individuelle TOP2A/CEN-17-forhold for 10 humane brystkarcinomprøver farvet med de 12 mulige kombinationer af protokolvarianter med TOP2A IQFISH pharmdx (kode K5733) (test 1-12) og TOP2A FISH pharmdx Kit (kode K5333) reference (R). Den øverste vandrette linje viser cut-off-værdien på 2,0, og den nederste vandrette linje viser cut-off-værdien på 0,8. Reproducerbarhed Reproducerbarheden for TOP2A/CEN-17-forholdet blev undersøgt med TOP2A IQFISH pharmdx analysen ved hjælp af på hinanden følgende snit af ni humane brystkarcinomprøver enten med deleteret, normal eller amplificeret TOP2A-genstatus. Der blev testet tre snit af hver prøve i samme kørsel. Den gennemsnitlige variationskoefficient var 3% (område fra 1% til 4%) for TOP2A-deleterede prøver, 7% (område fra 2% til 10%) for normale TOP2A-prøver og 5,3% (område fra 4% til 7%) for TOP2A-amplificerede prøver. Der blev i alt testet fem på hinanden følgende snit af fire humane brystkarcinomprøver af forskellig tykkelse (3, 4, 5, 6 og 7 µm) med TOP2A IQFISH pharmdx. Den gennemsnitlige variationskoefficient for TOP2A/CEN-17-forholdet var 9,8% (område fra 6% til 13%). Reproducerbarhed TOP2A IQFISH pharmdx analysen blev testet for lot-til-lot- og observatør-tilobservatør-reproducerbarhed ved hjælp af tre lot af TOP2A IQFISH pharmdx og tre observatører. Reproducerbarheden blev testet på ni humane brystkarcinomprøver enten med deleteret, normal eller amplificeret TOP2A-genstatus. Den gennemsnitlige variationskoefficient lot-til-lot-reproducerbarhed var 3,7% for TOP2A-deleterede prøver (område fra 2% til 6%), 10,3% for normale TOP2A-prøver (område fra 10% til 11%) og 9,3% for TOP2A-amplificerede prøver (område fra 5% til 12%). Den gennemsnitlige variationskoefficient observatør-til-observatør-reproducerbarhed var 13,7% for TOP2A-deleterede prøver (område fra 7% til 17%), 7% for normale TOP2A-prøver (område fra 2% til 11%) og 12,7% for TOP2A-amplificerede prøver (område fra 10% til 15%). Klinisk anvendelighed Doxorubicin og epirubicin er antracykliner, som er blandt de mest anvendte antitumorlægemidler, og det er påvist, at topoisomerase IIα er det molekylære mål for disse stoffers farmakologiske virkning (14, 15). Doxorubicin og epirubicin har vist sig at være effektive ved en lang række forskellige maligniteter, herunder brystkræft, hvor de både anvendes til metastatisk sygdom og til adjuverende behandling (15). Ved adjuverende behandling af brystkræft har kliniske data vist, at kemoterapiregimer, der omfatter doxorubicin eller epirubicin, medfører en statistisk signifikant forbedring af overlevelsen sammenlignet med regimer uden antracyklin (43, 44). Antracykliners terapeutiske indeks er lavt, og den øgede virkning er på bekostning af en større toksicitet sammenlignet med andre kemoterapiregimer, f.eks. CMF (cyclophosphamid/methotrexat/5-fluorouracil) (19, 45). Udover den akutte toksicitet kan behandling med doxorubicin eller epirubicin medføre langsigtede bivirkninger med kardiotoksicitet og sekundær akut myeloid leukæmi (AML) (6, 15). Den behandlingsinducerede kardiomyopati er ofte irreversibel og kan udvikle sig til kongestiv hjerteinsufficiens flere måneder eller år efter afslutningen af behandlingen. Med henblik på at optimere den medicinske behandling med doxorubicin and epirubicin er det vigtigt, at lægerne har rådighed over værktøj til identifikation af de patienter, som med størst sandsynlighed kan drage fordel af behandlingen med doxorubicin og epirubicin. Den kliniske ydelse af Dako TOP2A FISH pharmdx Kit (kode K5333) har været undersøgt i to forsøg, som blev gennemført af Danish Breast Cancer Cooperative Group (DBCG) i København (21, 29, 30, 46). P04092DK_02/K s. 19/37

20 Pilotforsøg Den kliniske ydelse af TOP2A FISH pharmdx Kit er blevet evalueret i et pilotforsøg med prøver fra 120 brystkræftpatienter (29) i samarbejde med DBCG. I alt 20 tumorer havde ændringer i antallet af TOP2A-kopier, næsten ligeligt fordelt mellem amplifikationer (n=11) og deletioner (n=9). TOP2A-ændringerne blev ikke udelukkende fundet i HER2-positive tumorer, idet 4 tumorer (20% af de TOP2A-anormale tilfælde) var HER2-negative. Et forhold (røde signaler/grønne signaler) større end eller lig med 2 adskiller amplificerede fra normale tilfælde, mens et forhold under 0,8 er forbundet med gendeletion. Pilotforsøget viste, at 2 forskellige tællemetoder gav identiske resultater: Signalerne blev enten talt i 60 kerner, eller i alt 60 røde signaler blev talt sammen med de grønne signaler i de samme kerner. Sidstnævnte metode har den fordel, at det største antal celler vil blive talt i de deleterede og normale tilfælde, mens det laveste antal celler vil blive talt i de amplificerede tilfælde. Det er ofte nemt at identificere amplificerede tilfælde blot ved at se i mikroskopet, men de er mere tidskrævende at evaluere, hvis 60 kerner skal scores. Bekræftende forsøg - DBCG 89D/TOP2A Den kliniske ydelse af TOP2A FISH pharmdx Kit blev evalueret i større skala baseret på tumorprøver, som blev indsamlet prospektivt fra det adjuverende forsøg DBCG 89D (21, 30, 46, 47). Forsøgsdesign Det primære formål med DBCG 89D/TOP2A-forsøget var at undersøge, om TOP2A-genafvigelser (amplifikation eller deletion) kan tjene som prædiktiv markør for recidivfri og generel overlevelse hos brystkræftpatienter i højrisikogruppen, som man har til hensigt at behandle med adjuverende epirubicin-baseret kemoterapi. De prognostiske egenskaber ved TOP2A-genafvigelser og sammenhængen mellem TOP2A og HER2 blev undersøgt som sekundære formål. DBCG 89D-forsøget var designet som et åbent, prospektivt, randomiseret forsøg. Efter operation blev 980 præ- og postmenopausale kvinder med invasiv brystkræft i højrisikogruppen randomiseret til CMF eller CEF (cyclophosphamid/epirubicin/5-fluorouracil). Det primære effektresultat var RFS (recidivfri overlevelse) med OS (generel overlevelse) som sekundært endpoint. Til det biologiske underforsøg DBCG 89D/TOP2A blev der indsamlet vævsblokke fra de patienter, som havde deltaget i DBCG 89D-forsøget, fra forsøgscentrene med henblik på en centraliseret retrospektiv analyse for TOP2A- og HER2-genafvigelser (Dako HER2 FISH pharmdx Kit) samt HER2-overudtrykkelse (Dako HercepTest ). Vævsblokke fra 806 ud af de 980 patienter fra DBCG 89D-forsøget var til rådighed. For så vidt angår TOP2A- og HER2-genafvigelser blev forholdet beregnet som antallet af signaler for genproberne delt med antallet af signaler for centromer 17. Tilfældene blev scoret som HER2 eller TOP2A FISH-amplificerede, når forholdet var 2. Et forhold på < 0,8 blev betragtet som ensbetydende med TOP2A-deletion. TOP2A-status blev kategoriseret i følgende grupper: Deleteret: TOP2A/CEN-17-forhold < 0,8 Normal: 0,8 TOP2A/CEN-17-forhold < 2,0 Amplificeret: TOP2A/CEN-17-forhold 2,0 For HercepTest blev alle 1+, 2+ og 3+ positive prøver underkastet HER2 FISH analyse. Scoringen af HER2-positivitet (48) i forsøget var som følger: Positive: HercepTest=3+ eller HercepTest=2+ og FISH HER2-forhold 2,0 Negative: HercepTest=0,1+ eller HercepTest=2+ og FISH HER2-forhold < 2,0 Det kliniske forsøg (DBCG 89D) og det biologiske underforsøg (DBCG 89D/TOP2A) blev gennemført i henhold til Helsinki-deklarationen og godkendt af de lokale etiske komitéer. P04092DK_02/K s. 20/37

21 Statistisk metode Det primære endpoint for forsøget var RFS, defineret som tiden fra randomisering til en hændelse eller fjernelse af patientdata. Det sekundære endpoint var OS, defineret som tiden fra randomisering til død eller fjernelse af patientdata. Virkningen af behandlingen med CEF i forhold til CMF på RFS og OS blev kvantificeret med hensyn til risiko for død, hvilket blev anslået ved hjælp af den proportionelle Coxrisikomodel. Den proportionelle Cox-risikomodel blev tilpasset i henhold til resultaterne af goodness-of-fit - procedurer og interaktionsundersøgelse, hvilket definerede den grundlæggende multivariat-coxmodel for analyse af RFS og OS Risikoforholdet (HR), 95% konfidensintervallet og p-værdien fra Wald-testen blev givet for hver kovariat og interaktionsterm i Cox-modellen. HR for behandling med CEF vs. behandling med CMF i hver TOP2A-undergruppe (og HER2-undergruppe) blev udledt fra resultaterne og vist med et Forrest-plot. Efter at den proportionelle Cox-risikomodel for RFS og OS var blevet tilpasset i henhold til resultaterne fra goodness-of-fit -procedurerne og interaktionsundersøgelserne, blev der udført 3 typer af sekundære analyser. Multivariatestimering i de 3 TOP2A-undergrupper: Deleteret, normal, amplificeret. Multivariatestimering i de 2 HER2-undergrupper: Negativ, positiv. SamLet multivariatestimering for alle patienter, inklusive TOP2A- og HER2- interaktion. Korrelationer mellem TOP2A-status og de kliniske og patologiske variabler, inklusive HER2-status, blev testet med χ2-test. Opfølgningstiden blev kvantificeret med en Kaplan-Meier-estimering af potentiel opfølgning. Der blev udført analyser for eventuel udvælgelsesbias med anvendelse af χ2-testen og logrank-testen. Patienter med manglende værdier (med undtagelse af receptorstatus) blev ekskluderet fra multivariatanalyserne i den proportionelle Cox-risikomodel. Resultater TOP2A-analysen var vellykket på 773 af de 806 (96%) brystkræftprøver. Tabel 1 viser den generelle fordeling af TOP2A-status blandt de egnede patienter. Der var amplifikation af TOP2A hos 92 (11,9%) af de 773 egnede patienter og deletion hos 87 (11,3%). Tabel 1. Fordeling af TOP2A-status TOP2A-status n (%) Deleteret 87 (11,3) Normal 594 (76,8) Amplificeret 92 (11,9) I alt 773 (100) Fordelingen af TOP2A-amplifikationer og -deletioner i relation til HER2-status vises i tabel 2. Tabel 2. Fordeling af HER2-status i relation til TOP2A-status HER2- status TOP2A N n (%) Deleteret n (%) Normal n (%) Amplificeret n (%) Negativ 527 (100) 26 (4,9) 487 (92,4) 14 (2,7) Positiv 246 (100) 61 (24,8) 107 (43,5) 78 (31,7) I alt 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) p-værdi χ 2 p< 0,0001 P04092DK_02/K s. 21/37

22 For så vidt angår HER2-status, blev der fundet flere TOP2A-afvigelser blandt de HER2-positive tumorer. TOP2A-afvigelser blev set i 139 (56,5%) af de 246 HER2- positive tumorer og i 40 (7,6%) af de 527 HER2-negative tumorer. 40 patienter (22,3%) med TOP2A-afvigelser ville således være blevet overset, hvis man kun havde analyseret de HER2-positive prøver. Fordelingen af TOP2A-afvigelser i relation til HER2 FISH-status vises i tabel 3. Som det var tilfældet med HER2-status, blev der også her fundet en signifikant korrelation med TOP2Astatus. Tabel 3. Fordeling af HER2 FISH-status i relation til TOP2A-status HER2 FISH TOP2A N n (%) Deleteret n (%) Normal n (%) Amplificeret n (%) Normal 539 (100) 31 (5,8) 493 (91,5) 15 (2,8) Amplificere 234 (100) 56 (23,9) 101 (43,2) 77(32,9) t I alt 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) p-værdi χ 2 p< 0,0001 Fordelingen af TOP2A-afvigelser i relation til HercepTest scoring vises i tabel 4. Som det var tilfældet med HER2-status, blev der også her fundet en signifikant korrelation med TOP2Astatus. Tabel 4. Fordeling af HercepTest scoring i relation til TOP2A-status TOP2A N n (%) Deleteret n (%) Normal n (%) Amplificeret n (%) (100) 11 (5,3) 192 (91,9) 6 (2,9) (100) 13 (5,1) 238 (92,6) 6 (2,3) HercepTes (100) 3 (3,9) 65 (83,3) 10 (12,8) t (100) 60 (26,2) 99 (43,3) 70 (30,6) I alt 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) p-værdi χ 2 p< 0,0001 Seks af de 773 patienter, for hvem der var TOP2A-data til rådighed, manglede kliniske data, hvilket udelukkede dem fra de multivariatanalyserne. For de patienter, for hvem der var TOP2A-analyseresultater til rådighed, var den potentielle opfølgningstid for RFS 9,4 år, og det tilsvarende antal hændelser var 371. Den gennemsnitlige, potentielle opfølgningstid for OS var 11,1 år, og antallet af hændelser var 336. Figur 2-4 viser Kaplan-Meier plottene for RFS med hensyn til de 2 behandlingsgrupper i hver af de 3 TOP2A-grupper. P04092DK_02/K s. 22/37

23 Figur 2. RFS for de CMF- og CEF-behandlede patienter med TOP2A-amplificerede tumorer Figur 3. RFS for de CMF- og CEF-behandlede patienter med normale TOP2A tumorer Figur 4. RFS for de CMF- og CEF-behandlede patienter med TOP2A-deleterede tumorer Både i den TOP2A-amplificerede og dentop2a-deleterede patientgruppe viste behandlingen med CEF sig at være overlegen i forhold til CMF. For de TOP2Aamplificerede patienter var forskellen signifikant (p=0,037). Der fandtes ikke en sådan forskel for patientgruppen med normal TOP2A. For det primære forsøgsendpoint (RFS) viste analyserne med den proportionelle Coxrisikomodel en signifikant prædiktiv værdi for TOP2A-genafvigelser (p=0,016). Patientgruppen med TOP2A-amplifikationer havde en relativ risikoreduktion på mere end 60%, når de blev behandlet med CEF, sammenlignet med CMF (HR=0,389, p- værdi=0,0017). Der blev ligeledes fundet en risikoreduktion for TOP2A-deletionerne, som dog ikke var statistisk signifikant (HR=0,608, p-værdi=0,0828). Figur 5 viser den relative effekt af CEF i hver af TOP2A- og HER2-undergrupperne med hensyn til RFS. P04092DK_02/K s. 23/37

24 Figur 5. Relativ effekt af CEF i hver af TOP2A- og HER2-undergrupperne på RFS (Forrest-plot) Der blev fundet lignende resultater for OS som for RFS, dog ikke signifikante (p=0,14). Patientgruppen med TOP2A-amplifikationer oplevede en risikoreduktion på mere end 50%, når de blev behandlet med CEF, sammenlignet med CMF (HR=0,485, p=0,0142). Som for RFS blev der fundet en ikke-signifikant risikoreduktion for TOP2Adeletioner (HR=0,678, p-værdi=0,155). Figur 6 viser den relative effekt af CEF i hver af TOP2A- og HER2-undergrupperne med hensyn til OS. P04092DK_02/K s. 24/37

25 Figur 6. Relativ effekt af CEF i hver af TOP2A- og HER2-undergrupperne på OS (Forrest-plot) Den prædiktive værdi af HER2-status blev ligeledes undersøgt, og dataene viste ingen signifikant effekt med hensyn til behandlingsinteraktioner, hverken for RFS eller OS. En analyse af fordelingen af TOP2A-afvigelserne med hensyn til baselinekarakteristika viste en signifikant forbindelse med flere af de godkendte histopatologiske, prognostiske faktorer. Desuden viste dataene, at andelen af kvinder med TOP2A-afvigelser steg med alderen, hvilket medførte en større hyppighed blandt postmenopausale kvinder end blandt præmenopausale kvinder. De univariate overlevelsesanalyser indikerede en negativ signifikant effekt på både RFS og OS, idet patienter med amplifikationer og deletioner havde en signifikant reduktion i overlevelse sammenlignet med patienter med normal TOP2A-status. Overlevelseskurverne indikerede ligeledes, at patienter med deletioner havde en endnu værre prognose end patienter med en amplificeret eller normal TOP2A-status. Figur 7 viser overlevelseskurverne for patienter med amplificeret, normal eller deleteret TOP2A-status. P04092DK_02/K s. 25/37

26 Figur 7. TOP2A-status i forhold til RFS og OS (N=767) Udover forbindelsen med de etablerede kliniske, prognostiske faktorer blev det påvist, at TOP2A-afvigelser havde en uafhængig prognostisk værdi. Ved hjælp af den proportionelle Cox-risikomodel blev det påvist, at en TOP2A-genafvigelse var associeret med en signifikant værre prognose, både med hensyn til RFS (p=0,0169) og OS (p=0,0118). Tabel 5 og 6 viser HR- og 95% konfidensgrænserne baseret på Coxmodellen for RFS og OS. P04092DK_02/K s. 26/37

27 Tabel 5. HR for RFS inklusive TOP2A- og behandlingsinteraktion Variabel p-værdi HR 95% KI Menopause 0,0576 Præ Post 1 (0,99 1,60) 1,26 Tumorstørrelse <0,0001 pr. øgende cm 1,15 (1,09 1,22) Positive <0,0001 lymfeknuder ,01 4,16 (1,39 2,91) (2,88 6,02) TOP2A-status Deleteret Normal Amplificeret HER2-status Negativ Positiv 0,0169 0,2998 1,66 1 1,56 (1,12 2,45) (1,00 2,42) 1 1,15 (0,88 1,49) Tabel 6. HR for OS inklusive TOP2A- og behandlingsinteraktion Variabel p-værdi HR 95% KI Menopause 0,0124 Præ Post 1 1,37 (1,07 1,75) Tumorstørrelse <0,0001 pr. øgende cm Positive lymfeknuder TOP2A-status Deleteret Normal Amplificeret HER2-status Negativ Positiv <0,0001 0,0118 0,0519 1,16 (1,10 1,23) 1 2,62 5,50 1,82 1 1,37 (1,70 4,04) (3,58 8,45) (1,22 2,71) (0,87 2,16) 1 1,31 (1,00 1,72) Når HR erne for de forskellige variabler i tabel 5 (RFS) arrangeres efter den prognostiske værdi, ser listen således ud: antal positive lymfeknuder > TOP2A-status > menopausal status > HER2- status og tumorstørrelse. Denne rækkefølge viser, at antallet af positive lymfeknuder er den variabel, som har den største prognostiske virkning, efterfulgt af TOP2A-status, menopausal status, tumorstørrelse og HER2- status. Hvis rækkefølgen blev gentaget for OS (tabel 6), var der lignende resultater som for RFS, hvilket indikerer en kraftig prognostisk værdi af TOP2A-status. Den prognostiske værdi af HER2-status blev ligeledes undersøgt, og de univariate overlevelsesanalyser indikerede en signifikant negativ effekt på både RFS og OS, idet HER2- positive patienter havde en reduktion i overlevelse sammenlignet med patienter med normal HER2-status. Den primære analyse af RFS med anvendelse af den proportionelle Cox- P04092DK_02/K s. 27/37

28 risikoregressionsanalyse viste ingen signifikant effekt af HER2-status. Da analysen blev gentaget for OS, var resultatet, at den positive HER2-status havde en signifikant negativ effekt på overlevelsen. Diskussion og konklusion DBCG 89D/TOP2A-forsøget har påvist en signifikant prædiktiv og prognostisk værdi af TOP2A-genafvigelserne. På baggrund af sammenligningerne med HER2-status kan det konkluderes, at HER2-status og TOP2A-status ikke er indbyrdes udskiftelige, hverken for den prædiktive eller den prognostiske værdi. TOP2A er det molekylære mål for epirubicins farmakologiske virkning, og forsøget har vist, at en TOP2A-genafvigelse (især amplifikationer) er en nyttig prædiktiv markør for responsen på epirubicin. Antracyklinbaseret kemoterapi med doxorubicin eller epirubicin er en af de mest effektive behandlinger til brystkræft. Disse stoffer har imidlertid signifikante akutte og langsigtede, alvorlige bivirkninger, f.eks. kardiotoksicitet og leukæmi. Komparativ undersøgelse af TOP2A FISH pharmdx Kit og TOP2A IQFISH pharmdx Dako TOP2A IQFISH pharmdx (kode K5733) er blevet sammenlignet med Dako TOP2A FISH pharmdx Kit (kode K5333) i en sammenlignende undersøgelse af 80 brystvævsprøver af humant brystkarcinom. Krydstabulering af TOP2A-genstatus opnået med de to analyser gav en generel overensstemmelse på 100% med nedre og øvre grænser for 95% konfidensintervallet på 96,9% og 100%. Kappa-værdien var 1. P04092DK_02/K s. 28/37

29 Fejlfinding Problem Sandsynlig årsag Forslag til afhjælpning 1. Ingen eller svage signaler. 1a. Sættet har været udsat for høje temperaturer under transport eller opbevaring. 1a. Kontroller opbevaringsbetingelserne. Kontroller, om der stadig var tøris i pakken ved modtagelsen. Kontroller, at flaske 3 har været opbevaret mørkt ved -18 C. Kontroller, at flaske 2A og 5 har været opbevaret ved maks. 2 8 C, og at flaskerne har været opbevaret mørkt. 1b. Mikroskopet virker ikke rigtigt. - Ukorrekt filtersæt - Forkert lampe - Kviksølvpæren er for gammel - Snavsede og/eller revnede kollektorlinser - Uegnet immersionsolie 1b. Kontroller mikroskopet og sørg for, at de anvendte filtre er egnede til anvendelse sammen med kittets fluorokromer og at kviksølvlampen er den rigtige og ikke er blevet anvendt ud over den forventede levetid. (Se appendiks 3). I tilfælde af tvivl kontaktes leverandøren af mikroskopet. 1c. Falmede signaler 1c. Undgå langvarig undersøgelse under mikroskopet, og minimer eksponeringen for kraftigt lys 2. Ingen grønne signaler 3. Ingen røde signaler. 1d. Ukorrekte forbehandlingsbetingelser. 1e. Fordampning af probeblanding under hybridisering. 2a. Ukorrekte betingelser for stringent vask. 3a. Ukorrekte forbehandlingsbetingelser. 1d. Sørg for at anvende den anbefalede forbehandlingstemperatur og -tid. 1e. Sørg for tilstrækkelig fugtighed i hybridiseringskammeret. 2a. Sørg for at anvende den anbefalede temperatur og tid for stringent vask og at fjerne dækglas inden udførelse af stringent vask. 3a. Sørg for at anvende den anbefalede forbehandlingstemperatur og -tid. 4. Områder uden signal 4a. Probevolumen er for lille. 4a. Sørg for, at probevolumen er stor nok til at dække området under dækglasset. 4b. Der er opstået luftbobler under tilsætning af probeblanding eller montering. 4b. Undgå luftbobler. Hvis der observeres luftbobler, bankes disse forsigtigt væk med en pincet. P04092DK_02/K s. 29/37

30 5. Overdreven baggrundsfarvning 5a. Ukorrekt vævsfiksering. 5a. Sørg for kun at anvende formalinfikserede, paraffinindstøbte vævssnit. 5b. Paraffinen er ikke helt fjernet. 5b. Følg proceduren for afparaffinering og rehydrering beskrevet i afsnit B.2. 5c. For lav temperatur for stringent vask. 5d. Langvarig eksponering af det hybridiserede snit for kraftigt lys 5c. Sørg for, at temperaturen for stringent vask er 63 (±2) C 5d. Undgå langvarig undersøgelse under mikroskopet, og minimer eksponeringen for kraftigt lys. 6. Dårlig vævsmorfologi 6a. Ukorrekt pepsinbehandling. 6a. Overhold de anbefalede pepsininkubationstider. Se afsnit B.3, Trin 2. Sørg for at håndtere Pepsin ved den korrekte temperatur. Se afsnit B Kraftig grøn autofluorescens på objektglasset herunder i områder uden FFPE-væv 6b. Ukorrekte forbehandlingsbetingelser kan medføre et uklart eller tåget udseende. 6c. For langvarig pepsinbehandling eller en meget tynd snittykkelse kan føre til forekomst af spøgelsesceller eller "donut"- celler. 7. Brug af udløbne eller ikkeanbefalede glasobjektglas 6b. Sørg for at anvende den anbefalede forbehandlingstemperatur og -tid. 6c. Forkort Pepsin inkubationstiden. Se afsnit B.3, Trin 2. Sørg for, at snittykkelsen er 4 6 µm. 7. Kontroller, at det belagte glasobjektglas (Dako Silanized Slides, kode S3003 eller poly-l-lysinbelagte objektglas) ikke har overskredet udløbsdatoen. BEMÆRK: Hvis problemet ikke kan henføres til en eller flere af ovenstående årsager, eller hvis forslagene til afhjælpning ikke løser problemet, kontaktes Dakos tekniske serviceafdeling for yderligere hjælp. P04092DK_02/K s. 30/37

31 Bilag 1 TOP2A IQFISH pharmdx, kode K5733 Protokolcheckliste Farvningskørslens log-id: Dato for kørslen: TOP2A IQFISH pharmdx, K5733 Lot: Prøve-ID: Udstyrs-ID: Dato for fortynding/udløb af 1 x vaskebuffer (flaske 6 fortyndet 1:20): / Vævet fikseret i neutral, bufferjusteret formalin Ja Nej Trin 1: Forbehandling Dato for fortynding/udløb af forbehandlingsopløsning (flaske 1 fortyndet 1:20) / Målt temperatur af forbehandlingsopløsning (95 99 C) Forbehandling (10 minutter) og afkøling (15 minutter) Vask i vaskebuffer (flaske 6 fortyndet 1:20) (2 x 3 minutter) Trin 2: Pepsin Varighed af pepsinbehandling (flaske 2) ved 37 C eller Varighed af pepsinbehandling (flaske 2) ved stuetemperatur eller Varighed af pepsinneddypning ved 37 (±2) C Vask i vaskebuffer (flaske 6 fortyndet 1:20) (2 x 3 minutter) Dehydrer objektglas (3 x 2 minutter) i graduerede serier af ethanol og lufttør Trin 3: TOP2A/CEN-17 IQISH-probeblanding Tilsæt probeblanding (flaske 3), læg dækglas på og forsegl med dækglasforseglingsmiddel Målt denatureringstemperatur (66 ±1 C) Denaturering i 10 minutter Målt hybridiseringstemperatur (45 ±2 C) Hybridisering natten over (beskyt mod lys) Trin 4: Stringent vask Dato for fortynding/udløb af stringent vaskebuffer (flaske 4 fortyndet 1:20) / Målt temperatur af stringent vaskebuffer (63 ±2 C) Stringent vask (10 minutter) efter fjernelse af dækglas Vask i vaskebuffer (flaske 6 fortyndet 1:20) (2 x 3 minutter) Dehydrer objektglas (3 x 2 minutter) i graduerede serier af ethanol og lufttør Trin 5: Montering Tilsæt 15 µl fluorescensmonteringsmedium (flaske 5) og læg dækglas på C minutter minutter minutter C C C Kommentarer: Dato og underskrift, tekniker: P04092DK_02/K s. 31/37

32 Bilag 2 TOP2A IQFISH pharmdx, kode K5733 Scoringsskema Dato for kørslen: TOP2A IQFISH pharmdx, K5733 Lot: Prøve-ID: Farvekørsels-log-ID: Kerne nr. TOP2A -score CEN-17 -score Kerne nr. TOP2A -score CEN-17 -score Kerne nr. TOP2A -score CEN-17 -score I alt (1-20) I alt (21-40) I alt (41-60) Til bestemmelse af TOP2A/CEN-17-forholdet tælles antallet af TOP2A-signaler og antallet af CEN-17-signaler i enten 60 kerner eller antallet af kerner, som er påkrævet for at nå 60 TOP2A-signaler (se afsnittet Fortolkning af farvning). Divider det samlede antal TOP2A-signaler med det samlede antal CEN-17-signaler. Hvis TOP2A/CEN-17- forholdet er borderline (0,7 0,9 eller 1,8 2,2), tælles prøven igen, og forholdet genberegnes baseret på alle talte celler. Antal talte celler TOP2A-signaler CEN-17-signaler TOP2A/CEN-17-forhold TOP2A-gendeletion (Forhold < 0,8) Normal TOP2A-genstatus (0,8 Forhold < 2) TOP2A-genamplifikation Forhold 2) Dato og underskrift, tekniker: Dato og underskrift, patolog: Kommentarer: P04092DK_02/K s. 32/37

33 For scoringsvejledning: Se Fortolkning af farvning. Bilag 3 TOP2A IQFISH pharmdx, kode K5733 Specifikationer for fluorescensmikroskop Dako anbefaler følgende udstyr til anvendelse sammen med TOP2A IQFISH pharmdx, K5733: 1. Mikroskoptype Epifluorescensmikroskop. 2. Pære 100 watt kviksølvlampe (hold regnskab med brændetiden). 3. Objektiver Til screening af vævene kan der anvendes fluorescens tør 10x eller fluorescens olieimmersion 16x objektiver. Til højeffektsforstørrelse og bedømmelse af signaler kan der kun anbefales fluorescens olieimmersion objektiver, f.eks. 100x. 4. Filtre Filtrene udformes individuelt til specifikke fluorokromer og skal vælges derefter. Dako anbefaler anvendelse af et specifikt DAPI-filter i kombination med et højkvalitets Texas Red/FITC dobbeltfilter. DAPI-filter. Texas Red/FITC-dobbeltfilter. Texas Red og FITC enkelte filtre kan anvendes til bekræftelse. Fluorokrom Excitationsbølgelængde Emissionsbølgelængde FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filtre er specifikke for hver mikroskoptype, og anvendelsen af de korrekte filtre er altafgørende for fortolkningen. Kontakt mikroskopleverandøren eller den lokale Dako-repræsentant for yderligere detaljerede oplysninger. 5. Olie Ikke-fluorescerende olie. Forholdsregler En kviksølvlampe på 50 watt anbefales ikke. Rhodaminfiltre kan ikke anvendes. Tripelfiltre anbefales ikke. Et mikroskop, der ikke er optimeret, kan medføre problemer, når de fluorescerende signaler aflæses. Det er vigtigt, at lyskilden ikke er udløbet, og at den er korrekt rettet ind og fokuseret. Brugerne bør sætte sig ind i og følge anbefalingerne fra kviksølvlampens producent. Mikroskopet bør vedligeholdes og kviksølvlampen justeres inden fortolkning af resultater. Man skal bestræbe sig på at udsætte prøven for så lidt af excitationslyset som muligt for at minimere fluorescensens falmen. Vi anbefaler, at De diskuterer opsætningen af Deres mikroskop med producenten, eller læser litteraturen, inden De påbegynder in situ fluorescenshybridiseringen. P04092DK_02/K s. 33/37

34 Referencer 1. Wang JC. Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective. Nat Rev Mol Cell Biol 2002;3: Austin CA, Marsh KL. Eukaryotic DNA topoisomerase II beta. Bioessays 1998;20: Roca J. The mechanisms of DNA topoisomerases. Trends Biochem Sci 1995;20: Tsai-Pflugfelder M, Liu LF, Liu AA, Tewey KM, Whang-Peng J, Knutsen T, et al. Cloning and sequencing of cdna encoding human DNA topoisomerase II and localization of the gene to chromosome region 17q Proc Natl Acad Sci U S A 1988;85: Sng JH, Heaton VJ, Bell M, Maini P, Austin CA, Fisher LM. Molecular cloning and characterization of the human topoisomerase IIalpha and IIbeta genes: evidence for isoform evolution through gene duplication. Biochim Biophys Acta 1999;1444: Smith K, Houlbrook S, Greenall M, Carmichael J, Harris AL. Topoisomerase II alpha coamplification with erbb2 in human primary breast cancer and breast cancer cell lines: relationship to m-amsa and mitoxantrone sensitivity. Oncogene 1993;8: Petit T, Wilt M, Velten M, Millon R, Rodier JF, Borel C, et al. Comparative value of tumour grade, hormonal receptors, Ki-67, HER-2 and topoisomerase II alpha status as predictive markers in breast cancer patients treated with neoadjuvant anthracycline-based chemotherapy. Eur J Cancer 2004;40: Nakopoulou L, Lazaris AC, Kavantzas N, Alexandrou P, Athanassiadou P, Keramopoulos A, et al. DNA topoisomerase II-alpha immunoreactivity as a marker of tumor aggressiveness in invasive breast cancer. Pathobiology 2000;68: Durbecq V, Desmed C, Paesmans M, Cardoso F, Di Leo A, Mano M, et al. Correlation between topoisomerase-iialpha gene amplification and protein expression in HER-2 amplified breast cancer. Int J Oncol 2004;25: Mueller RE, Parkes RK, Andrulis I, O'Malley FP. Amplification of the TOP2A gene does not predict high levels of topoisomerase II alpha protein in human breast tumor samples. Genes Chromosomes Cancer 2004;39: Callagy G, Pharoah P, Chin SF, Sangan T, Daigo Y, Jackson L, et al. Identification and validation of prognostic markers in breast cancer with the complementary use of array-cgh and tissue microarrays. J Pathol 2005;205: Cardoso F, Durbecq V, Larsimont D, Paesmans M, Leroy JY, Rouas G, et al. Correlation be tween complete response to anthracycline-based chemotherapy and topoisomerase II-alpha gene amplification and protein overexpression in locally advanced/metastatic breast cancer. Int J Oncol 2004;24: Hande KR. Topoisomerase II inhibitors. Cancer Chemother Biol Response Modif 2003;21: Tewey KM, Rowe TC, Yang L, Halligan BD, Liu LF. Adriamycin-induced DNA damage mediated by mammalian DNA topoisomerase II. Science 1984;226: Hortobagyi GN. Anthracyclines in the treatment of cancer. An overview. Drugs 1997;54 Suppl 4: Järvinen TA, Tanner M, Rantanen V, Barlund M, Borg A, Grenman S, et al. Amplification and deletion of topoisomerase IIα associate with ErbB-2 amplification and affect sensitivity to topoisomerase II inhibitor doxorubicin in breast cancer. Am J Pathol 2000;156: Coon JS, Marcus E, Gupta-Burt S, Seelig S, Jacobson K, Chen S, et al. Amplification and Overexpression of Topoisomerase IIalpha Predict Response to Anthracycline-based Therapy in Locally Advanced Breast Cancer. Clin Cancer Res 2002;8: Di Leo A, Gancberg D, Larsimont D, Tanner M, Jarvinen T, Rouas G, et al. HER-2 amplification and topoisomerase IIalpha gene aberrations as predictive markers in nodepositive breast cancer patients randomly treated either with an anthracycline-based therapy or with cyclophosphamide, methotrexate, and 5-fluorouracil. Clin Cancer Res 2002;8: P04092DK_02/K s. 34/37

35 19. Di Leo A, Cardoso F, Durbecq V, Giuliani R, Mano M, Atalay G, et al. Predictive molecular markers in the adjuvant therapy of breast cancer: state of the art in the year Int J Clin Oncol 2002;7: Park K, Kim J, Lim S, Han S. Topoisomerase II-alpha (topoii) and HER2 amplification in breast cancers and response to preoperative doxorubicin chemotherapy. Eur J Cancer 2003;39: Knoop AS, Knudsen H, Balslev E, Rasmussen BB, Overgaard J, Nielsen KV, et al. Retrospective analysis of topoisomerase IIa amplifications and deletions as predictive markers in primary breast cancer patients randomly assigned to cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil or cyclophosphamide, epirubicin, and fluorouracil: Danish Breast Cancer Cooperative Group. J Clin Oncol 2005;23: Tanner M, Isola J, Wiklund T, Erikstein B, Kellokumpu-Lehtinen P, Malmstrom P, et al. Topoisomerase IIalpha gene amplification predicts favorable treatment response to tailored and dose-escalated anthracycline-based adjuvant chemotherapy in HER-2/neu-amplified breast cancer: Scandinavian Breast Group Trial J Clin Oncol 2006;24: O'Malley F, Chia S, Tu D, Shepherd L, Levine M, Huntsman D, et al. Prognostic and predictive value of topoisomerase II alpha in a randomized trial comparing CMF to CEF in premenopausal women with node positive breast cancer (NCIC CTG MA.5). Journal of Clinical Oncology, 2006 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement): Press MF, Mass RD, Zhou JY, Sullivan-Halley J, Villalobos IE, Lieberman G, et al. Association of topoisomerase II-alpha (TOP2A) gene amplification with responsiveness to anthracycline-containing chemotherapy among women with metastatic breast cancer entered in the Herceptin H0648g pivotal clinical trial. In: ASCO Annual Meeting; Abstract No Slamon D, Eiermann W, Robert N, al. e. Phase III randomized trial comparing doxorubicin and cyclophosphamide followed by docetaxel (AC-T) with doxorubicin and cyclophosphamide followed by docetaxel and trastuzumab (AC-TH) with docetaxel, carboplatin and trastuzumab (TCH) in HER2 positive early breast cancer patients: BCIRG 006 study. Breast Cancer Res Treat 2005; 94: S5 (Abstr 1). 26. Harris L, Dressler L, Cowan D, Berry D, Cirrincione C, Broadwater G, et al. The role of HER- 2 + Topo IIa Amplification in predicting benefit form CAF dose escalation CALGB ASCO Annual Meeting; Abstract no Park K, Han S, Gwak GH, Kim HJ, Kim J, Kim KM. Topoisomerase II-alpha gene deletion is not frequent as its amplification in breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2006;98(3): Villman K, Sjostrom J, Heikkila R, Hultborn R, Malmstrom P, Bengtsson NO, et al. TOP2A and HER2 gene amplification as predictors of response to anthracycline treatment in breast cancer. Acta Oncol 2006;45: Olsen KE, Knudsen H, Rasmussen BB, Balslev E, Knoop A, Ejlertsen B, et al. Amplification of HER2 and TOP2A and deletion of TOP2A genes in breast cancer investigated by new FISH probes. Acta Oncol 2004;43: Knoop A, Knudsen H, Balslev E, Rasmussen B, Overgaard J, During M, et al. TOP2A aberrations as predictive and prognostic marker in high-risk breast cancer patients. A randomized DBCG Trial (DBCG89D). In: Journal of Clinical Oncology, ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement), 2006: Järvinen TAH, Tanner M, Bärlund M, Borg Å, Isola J. Characterization of Topoisomerase IIα Gene Amplification and Deletion in Breast Cancer. Genes Chromosomes Cancer 1999;26: Jarvinen TA, Liu ET. Topoisomerase IIalpha gene (TOP2A) amplification and deletion in cancer--more common than anticipated. Cytopathology 2003;14: Bofin AM, Ytterhus B, Hagmar BM. TOP2A and HER-2 gene amplification in fine needle aspirates from breast carcinomas. Cytopathology 2003;14: P04092DK_02/K s. 35/37

36 34. Pritchard KI, Shepherd LE, O'Malley FP, Andrulis IL, Tu D, Bramwell VH, et al. HER2 and responsiveness of breast cancer to adjuvant chemotherapy. N Engl J Med 2006;354: Sledge GW, Jr. Is HER-2/neu a predictor of anthracycline utility? No. J Natl Cancer Inst Monogr 2001: Nielsen KV, Müller S, Poulsen TS, Gabs S, Schonau A. Combined Use of PNA and DNA for Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). In: Nielsen PE, editor. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. 2 ed. Norfolk: Horizon Bioscience; p Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN ]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule C, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: Mosby Company; Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer 2001;92: Ellis IO, Bartlett J, Dowsett M, Humphreys S, Jasani B, Miller K, et al. Best Practice No 176: Updated recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol 2004;57: Poole CJ, Earl HM, Hiller L, Dunn JA, Bathers S, Grieve RJ, et al. Epirubicin and cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil as adjuvant therapy for early breast cancer. N Engl J Med 2006;355: Group EBCTC. Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and 15-year survival: an overview of the randomised trials. Lancet 2005;365: Kelleher M, Miles D. 21. The adjuvant treatment of breast cancer. Int J Clin Pract 2003;57: Jørgensen JT, Nielsen KV, Ejlertsen B. Pharmacodiagnostics and Targeted Therapies - A rational approach for individualizing medical anti-cancer therapy in breast cancer. Oncologist 2007;12: Ejlertsen B, Mouridsen HT, Jensen MB, Andersen J, Cold S, Edlund P, et al. Improved outcome from substituting methotrexate with epirubicin: Results from a randomised comparison of CMF versus CEF in patients with primary breast cancer. Eur J Cancer 2007;43: Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003;16: P04092DK_02/K s. 36/37

37 Symbolforklaring Katalognummer Temperaturbegrænsning Lotnummer Medicinsk produkt til in vitro diagnostik Må ikke udsættes for sollys (se afsnittet om opbevaring) Anvendes senest Se brugsanvisningen Indeholder tilstrækkeligt materiale til <n> tests Producent GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler) GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler) GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler) GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler) GHS-farepiktogram (se afsnittet om forholdsregler) Revision Produceret af: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Danmark Tlf Fax P04092DK_02/K s. 37/37