Fra Bekendtgørelse om prøver og eksamen i erhvervsrettede uddannelser

Transkript

1 Sammenligning af FISH og Duo-CISH Fluorescerende og chromogen in situ hybridisering til detektion af translokationer i lymfomer ved brug af en break-apart probe Bachelorprojekt efterår 2009 Professionshøjskolen Metropol Projekt skrevet af: Laila Peitersen Eksperimenter udført af: Laila Peitersen og Saé Tournay Vejledere: Malene Bonné Meyer, Professionshøjskolen Metropol og Marianne Rasmussen, Patologiafdelingen Rigshospitalet 1

2 Fra Bekendtgørelse om prøver og eksamen i erhvervsrettede uddannelser BEK nr 782 af 17/08/ En eksaminand, der under en prøve skaffer sig eller giver en anden eksaminand uretmæssig hjælp til besvarelse af en opgave eller benytter ikke tilladte hjælpemidler, skal af uddannelsesinstitutionen bortvises fra prøven. Stk. 2. Opstår der under eller efter en prøve formodning om, at en eksaminand uretmæssigt har skaffet sig eller ydet hjælp, har udgivet en andens arbejde for sit eget eller anvendt eget tidligere bedømt arbejde uden henvisning, indberettes dette til uddannelsesinstitutionen. Bliver formodningen bekræftet, og handlingen har fået eller ville kunne få betydning for bedømmelsen, bortviser uddannelsesinstitutionen eksaminanden fra prøven. Stk. 3. Udviser en eksaminand forstyrrende adfærd, kan uddannelsesinstitutionen bortvise eksaminanden fra prøven. I mindre alvorlige tilfælde giver uddannelsesinstitutionen først en advarsel. Stk. 4. Uddannelsesinstitutionen kan i de i stk. 1-3 nævnte tilfælde under skærpende omstændigheder beslutte, at eksaminanden skal bortvises fra institutionen i en kortere eller længere periode. I sådanne tilfælde gives en skriftlig advarsel om, at gentagelse kan medføre varig bortvisning. Stk. 5. En bortvisning efter stk.1-3 medfører, at en eventuel karakter for den pågældende prøve bortfalder, og at eksaminanden har brugt en prøveindstilling, jf. 6, stk. 3 og 4. Stk. 6. En eksaminand skal ved aflevering af en skriftlig besvarelse med sin underskrift bekræfte, at opgaven er udfærdiget uden uretmæssig hjælp, jf. stk. 1 og 2. Undertegnede bekræfter hermed, at denne projektrapport er udfærdiget af mig, uden at udgive andres arbejde for mit og uden uretmæssig hjælp jf. ovenstående uddrag af eksamensbekendtgørelsen. Dato: Underskrift 2

3 Resumé Formålet med dette projekt er at undersøge, om Dakos Duo-CISH vil være lige så effektiv til at identificere translokationen t(8;14) (q24;q32) på lymfomvæv som Dakos Histology FISH Accesory kit, som nu bruges på Patologiafdelingen på Rigshospitalet. Dette blev undersøgt ved at analysere 14 vævsprøver fra patienter diagnosticeret med Burkitt Lymfom, hvor t(8;14) (q24;q32) er den mest almindelige translokation. Alle prøver blev først detekteret med FISH og derefter aflæst, og dernæst blev prøver fra samme patienter detekteret med DuoCISH og derefter aflæst. Til sidst blev resultaterne sammenlignet i forhold til, om de to metoder korrekt havde identificeret de translokationspositive og de translokationsnegative. Alle prøver blev talt af to studerende samt en erfaren bioanalytiker. Resultaterne viser, at 13 ud af 14 prøver blev talt ens af de tre tællere, samt at 13 ud af 14 prøver gav samme resultat med begge metoder. Da der blev analyseret så få prøver, kan der ikke konkluderes noget konkret ud af resultaterne, men resultaterne viser en klar tendens til, at begge metoder er lige effektive til at identificere translokationen t(8;14) (q24;q32) på lymfomvæv. Forord Dette projekt blev udført på Patologi Afdelingen på Rigshospitalet. Jeg vil gerne takke hele afdelingen for deres store hjælp til at besvare alle mine praktiske og filosofiske spørgsmål. En stor tak Dorte Holm for hendes hjælp til at skære væv til brug i dette projekt og til Sanni Petersen og Henrik Rossing Holm for hjælp og god vejledning til FISH-procedurerne. Til sidst vil jeg gerne takke mine vejledere for rigtig god og kompetent vejledning. Forsidebillede: FISH med MYC FISH DNA Split Signal Probe på tonsil-væv fra pilotforsøg. Billedet er taget gennem fluorescensmikroskop (Leica DM 6000B) ved 100x forstørrelse. 3

4 Indholdsfortegnelse 1. Introduktion 1.1. Introduktion til emnet Problemformulering In situ hybridisering Fluorescens in situ hybridisering Chromogen in situ hybridisering Forbehandling af væv Demaskering Blokering af endogen enzymaktivitet Indstøbning, skæring, snitmontering og tørring Translokationsprober Aflæsning Materialer og metoder 2.1. Pilotforsøg Patientmateriale Vævsforbehandling Skæring af snit Forberedelser Afparaffinering Probepræparering, denaturering og hybridisering Kontrastfarvning Montering FISH DuoCISH Aflæsning af snit

5 3. Resultater 3.1. FISH DuoCISH Sammenligning af FISH og DuoCISH Diskussion 4.1. Resultater Metoder og optimering Konklusion Perspektivering Referencer Bilag A. Patientmateriale 40 Bilag B. Dako MYC FISH DNA Probe, Split Signal Bilag C. Dako Histology FISH Accesory Kit Bilag D. Dako DuoCISH

6 1. Introduktion 1.1. Introduktion til emnet Cancer bliver mere og mere udbredt i verden. Dette betyder, at det er vigtigt at kunne diagnosticere sygdommen tidligt, så prognosen bliver bedre og behandlingen så skånsom som muligt. Yderligere er det vigtigt at diagnosticere og behandle patienter korrekt, og derfor er det er nødvendigt med analysemetoder, som er præcise og følsomme, så man kan skelne mellem to relaterede typer cancer og diagnosticere så tidligt i sygdomsforløbet, at behandling er mulig. Disse analysemetoder kan blandt andet være at undersøge, om der er ændret optag af stoffer i organer, ændringer i geners produkter i form af over- eller underproduktion af visse proteiner eller genetiske ændringer på selve genomet. Én analysemetode til at detektere genetiske ændringer er in situ hybridisering. In situ hybridisering kan påvise DNA-sekvenser på genomet. Dette gøres ved at designe en probe til at binde komplementært til den sekvens, man er interesseret i, og yderligere mærke proben så den efterfølgende kan visualiseres. Denne metode bruges til at påvise forskellige cancertyper og undregrupperinger af specifikke cancertyper, da man kan undersøge ændringer i gensekvenser blandt andet i form af translokationer. Den mest anvendte visualiseringsmetode er fluorescerende in situ hybridisering (FISH), hvor proben mærkes med et fluorochrom, og derefter visualiseres dette i et fluorescensmikroskop. En nyere visualiseringsmetode er chromogen in situ hybridisering (CISH), hvor proben mærkes med et chromogen, og derefter visualiseres dette i et almindeligt lysfeltmikroskop. Der er publiceret mange artikler om brugen af CISH på mange typer cancer, men påvisning og visualisering af translokationer, der ses i forbindelse med lymfomer, er der ikke umiddelbart tilgængeligt materiale omkring. Rigshospitalet laver CISH på nogle vævstyper, såsom mammavæv, hvor HER2-status undersøges, men ikke på lymfomer. Derfor syntes vi at det kunne være interessant at undersøge, om der var produceret materialer til at påvise og visualisere chromogener på lymfomer, og det viser sig, at Dako netop har lanceret DuoCISH, som er en chromogen farvning. DuoCISH lægges ovenpå FISH-farvningen, og derefter kan både fluorochromer og chromogener visualiseres. Dako har i deres nyhedsbrev en artikel om DuoCISH afprøvet på Burkitt Lymfom [1]. 6

7 Lymfomer udgår fra B- og T-lymfocytter og opstår i lymfeknuderne [2]. Maligne lymfomer kan inddeles i mange forskellige undergrupper, som adskiller sig fra hinanden i både klinisk udtryk og i den påkrævede behandling. Overordnet inddeles de i to hovedgrupper: Hodgkins lymfom (HL) og Non-Hodgkins Lymfom (NHL) [2, 3]. Mange lymfomer skyldes specifikke translokationer, og forskellige undertyper skyldes translokationer på forskellige kromosomer. Med in situ hybridisering kan man ved hjælp af forskellige typer prober påvise disse translokationer. En translokation er en mutation på kromosom-niveau, hvor to ikke-homologe kromosomer deles, enderne fusionerer og derved dannes et nyt kromosom, og der er stor sandsynlighed for, at mutationen fører til abnorm celle-opførsel. Dette skyldes blandt andet, at regulering af et gen ændres, hvis det flyttes, samt at når et kromosom deles, er der stor risiko for, at et gen deles og derved mister sin funktion [4]. Burkitt lymfom hører under NHL og består af modne B-celler. Alle Burkitt lymfomer indeholder en translokation, der involverer C-Myc-genet, og den mest almindelige C-Myc translokation er t(8;14) (q24;q32), hvilket betyder, at sekvensen fra position q24 på kromosom 8 bytter plads med sekvensen fra position q32 på kromosom 14. Denne translokation involverer genet IGH, og ses i 80 % af alle tilfælde af Burkitt Lymfom. C-Myc regulerer blandt andet cellevækst og apoptose og overudtrykkes ved Burkitt Lymfom [5, 6]. Det er derfor oplagt, at translokationer, der fører til Burkitt Lymfom, kan identificeres ved brug af en translokationsprobe ved ISH. Spørgsmålet er, om FISH eller CISH er mest velegnet til dette formål. Umiddelbart tyder det på, at CISH kunne have nogle fordele over FISH til at påvise translokationer. Fordele ved DuoCISH i sammenligning med FISH er, at der mikroskoperes med almindeligt lysfeltmikroskop, som er billigere end et fluorescens-mikroskop. Dette giver samtidig mulighed for at undersøge genstatus og morfologi på samme præparat. Yderligere kan der mikroskoperes ved en lavere forstørrelse, hvilket giver et bedre overblik over vævet. En anden fordel er, at præparaterne kan arkiveres på lige fod med almindelige præparater, hvilket vil sige ved stuetemperatur, og i meget lang tid, uden at signalerne forsvinder. FISHpræparater skal opbevares koldt, og signalet holder ikke længe. 7

8 En ulempe ved DuoCISH sammenlignet med FISH er, at der kræves flere behandlinger i analysen. Dette gør metoden mere tidskrævende end FISH [7]. Det vil derfor være interessant at undersøge, om translokationer, der involverer C-Myc-genet succesfuldt kan påvises ved CISH samt om chromogen visualisering af C-Myc-translokationer vil være lige så eller mere diagnostisk sensitiv som fluorochrom visualisering, i den forstand at begge metoder korrekt kan diagnosticere en translokation. Dette gøres ved at sammenligne resultater opnået ved brug af FISH og Dako s DuoCISH, med samme probe brugt. På denne baggrund er følgende problemstillinger opstillet: Er der overensstemmelse mellem de to metoder? Hvilke styrker har CISH-metoden i forhold til FISH-metoden og omvendt med henblik på vurdering af translokationer af C-Myc-genet? Vil CISH-analysen kunne stå alene til vurdering af translokationsstatus? Da det ikke er muligt at undersøge alle ovenstående punkter i denne opgave, er der valgt primært at fokusere på første punkt ved opbygning af forsøgsdesign, men at reflektere over de sidste to punkter i diskussion og perspektivering. Ud fra dette er følgende problemformulering valgt: 1.2. Problemformulering Er der overensstemmelse* mellem resultaterne opnået med Dako s Histology FISH og Dako s DuoCISH i form af deres evne til at påvise og visualisere translokationer på lymfomvæv med Dako s break-apart C-Myc probe på formalinfikseret paraffinindstøbt væv? *Med overensstemmelse og evne menes, om begge metoder kan producere samme resultat i forhold til translokationspositiv/ translokationsnegativ. 8

9 1.3. In situ hybridisering In Situ Hybridisering (ISH) er en teknik, hvor specifikke prober hybridiserer til en målsekvens i cellens DNA eller RNA. Ved at mærke proben kan den derefter visualiseres på forskellige måder [8]. ISH kan påvise DNA og RNA i væv, celler og hele kromosomer, og benyttes til at undersøge gen-status i tumorer, herunder genamplifikationer, deletioner, kromosom-translokationer og aneuploidisme [7]. ISH består af fire overordnede områder: 1. Fiksering og demaskering. Fiksering gør, at celler bibeholder deres morfologi, og demaskering fjerner proteiner, og derved øger tilgængeligheden til DNA. Dette beskrives mere detaljeret nedenfor. 2. Probemærkning. Mærkning af probe kan være enten radioaktiv, fluorescerende eller chromogen. DNA-prober får indsat nukleinsyrer, som har fået tilført et mærke. Dette beskrives nærmere under afsnittet om FISH og CISH. 3. Denaturering og hybridisering. DNA og probe bliver begge denatureret, enten kemisk eller ved varme, hvor temperaturen hæves over DNAs smeltepunkt, hvilket afhænger af sekvensens længde og opbygning. Denne temperatur er stabil, og kan beregnes ud fra sekvensens struktur, men den kan ændres ved at tilsætte formamid, som nedsætter smeltepunktet. Dette giver en bedre morfologi. Efter denatureringen skal de to enkeltstrengede DNA-sekvenser hybridisere. Dette gøres ved at sænke temperaturen igen til en bestemt temperatur. Det er meget vigtigt at temperaturen er optimal, da for høj en temperatur giver få eller ingen hybrider, og en for lav temperatur giver uspecifikke hybrider, da genom-dna og probe DNA, som ikke er et komplet match, har mulighed for at hybridisere til hinanden her. Samtidig kan man regulere blandt andet formamidindholdet, da en højere formamidkoncentration destabiliserer umatchende hybrider. Man kan også gøre hybridiseringen mere specifik ved at nedsætte saltindholdet samt gøre proben længere, da dette minimerer muligheden for at to umatchende sekvenser kan hybridisere [8]. 9

10 4. Detektion. Først skal man fjerne ubundne reagenser, hvilket normalt gøres i en saltopløsning. Herefter kan man detektere hybriderne, hvis man bruger en direkte detektionsteknik, hvilket normalt bruges til FISH. Den mere almindelige indirekte teknik bruges til immunhistokemisk farvning, og her sættes et primært antistof på mærket på proben, et sekundært antistof bindes til det første og et detektionsmærke sættes på det sekundære antistof. Til sidst laves en kernefarvning og prøven kan mikroskoperes [8] Fluorescens in situ hybridisering FISH er i over 20 år blevet brugt til blandt andet at påvise specifikke DNA sekvensers tilstedeværelse og fravær på kromosomer [1]. FISH kan blandt andet laves på formalinfikserede paraffinindstøbte snit og visualiseres fluorescerende. Det foregår ved, at prober hybridiserer specifikt til en målsekvens i cellens DNA, hvorefter signalet fra en fluorochrommærket probe er synligt i et fluorescensmikroskop. Dette er illustreret i figur 1 [9]. Figur 1. Fluorescensmærkning. Denne figur viser DNA (grå strenge) bundet til komplementære prober (sorte strenge). Proberne er mærket med et rødt og et grønt fluorochrom [modificeret fra 1]. Fluorescens-mærkning er en proces, hvor man kovalent binder et fluorochrom til et andet molekyle for eksempel en nukleinsyre. Et fluorochrom er en komponent i et molekyle, som gør, at molekylet er fluorescerende. Det er en funktionel gruppe i molekylet, som vil optage energi ved en bestemt bølgelængde og udsende den igen ved en anden bølgelængde. mærkningen foregår normalt ved at bruge et reaktivt derivat af fluorochromet, som binder selektivt til en funktionel gruppe i målmolekylet [10]. Fluorescein isothiocyanat (FITC) og Texas Red er fluorochromer, som blandt andet bruges til at mærke hybridiserings-prober. 10

11 FITC er et derivat af fluorescein, og optager energi ved 494 nm og udsender energi ved 518 nm. Efter mærkning kan FITC derefter ses ved fluorescensmikroskopi som et grønt signal. Texas Red er et derivat af rhodamin, som er bundet til sulfonyl chlorid. Texas Red optager energi ved 596 nm og udsender energi ved 615 nm og ses i et fluorescensmikroskop som et rødt signal [11, 12]. Efter behandling af prøverne farves disse med 4', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) [9]. DAPI er en kernefarvning, der binder til minor grooves i DNA og fluorescerer blåt, og det bruges som standard i immunfluorescensmikroskopering [13] Chromogen in situ hybridisering Chromogen in situ hybridisering (CISH) er en nyere ISH metode, og den største forskel fra FISH er detektionssystemet, som i denne metode består af et chromogent signal [7]. Den første artikel, der foreslog CISH som alternativ til FISH blev udgivet i 2000, og efterfølgende er de to metoder blevet sammenlignet mange gange, og der er konsensus om, at der er stor overensstemmelse mellem dem [1]. Dako DuoCISH omdanner fluorescerende signaler til chromogene signaler ved at lave en immunhistokemisk reaktion ovenpå en FISH-farvning. Specifikke antistoffer, anti-fitc konjugeret med horse radish peroxidase (HRP) samt anti-texas Red konjugeret med alkalisk phosphatase (AP), binder til mærkningen på DNA-proben. Derefter tilsættes chromogener, som er substrat for enzymerne, og chromogenerne binder til og konverteres af enzymerne til røde og blå slutprodukter, se figur 2. 11

12 A B C Figur 2. chromogenmærkning. Denne figur viser DNA (grå strenge) bundet til komplementære prober (sorte strenge). A) proberne er mærket med et rødt og et grønt fluorochrom. B) anti-fluorochrom-antistoffer konjugeret med hver deres enzym (AP og HRP). C) chromogener binder specifikt til enzymer (rødt chromogen binder til AP og blåt chromogen binder til HRP) [Modificeret fra 1] Cchromogenerne skal passe til det enzym, der binder til proben. Fast Red er substratet for alkalisk phosphatase og en blå cyanin farve er substratet for horse radish peroxidase. Slutprodukterne kan efterfølgende ses i lysfeltmikroskop som røde og blå signaler [1, 14] Forbehandling af væv Før væv kan analyseres, skal det behandles. Det skal blandt andet fikseres, da ufikseret væv nedbrydes, lige så snart det fjernes fra dets blodforsyning. Dette betyder, at morfologien ændres, og det er derfor ikke muligt at diagnosticere. Når væv fikseres, er det primært proteinerne, deriblandt histonerne i DNA, der stabiliseres. Dette kan gøres reversibelt eller irreversibelt. Ved fiksering i formalin bibeholdes morfologien optimalt i forhold til mange andre fiksativer. 12

13 Formalin er et gelerende fiksativ, som binder proteiner sammen og derved danner et gelerende netværk. Samtidig bibeholdes konformationen af proteiner. Denne type fiksering binder til proteiners aminogrupper og blokerer derved for deres mulighed for at binde til blandt andet enzymer og antistoffer, og de bliver derved maskerede. Dette betyder, at immunhistokemisk farvning samt probebinding kan blive problematisk. Dog er bindingen mellem formalin og protein reversibel og vævet kan demaskeres [15] Demaskering Demaskering sørger for, at nukleinsyrerne bliver gjort tilgængelige for proben. Demaskeringen kan gøres enzymatisk eller ved varmebehandling, HIER (heat induced epitope retrieval). Underbehandling betyder, at der ikke er optimal tilgængelighed til DNA, og overbehandling kan føre til ødelæggelse af cellens nukleinsyrer samt dens overordnede morfologi. Samtidig afhænger enzymbehandlingstiden af fikseringstiden, idet jo længere vævet fikseres, des længere skal det enzymbehandles [8, 16]. Derfor er det også i dette trin vigtigt at have viden om fikseringsmiddel og tid, hvilket kan være svært på en afdeling, hvor fikseringstider for væv kan variere meget. Dette gør en standardisering af demaskering svær, da det afhænger af, at fikseringen bliver standardiseret. Samtidig afhænger enzymbehandlingstiden også af celletype, da nogle celletyper kræver længere behandlingstid end andre [16]. I nogle typer væv vil en enzymforbehandling ikke være nok til at demaskere nukleinsyrerne, og man kan derfor bruge andre kemikalier eller varmebehandling. Det er ikke helt sikkert, hvordan demaskeringen præcist foregår, men det menes, at histon-udtrækning fra kernen kan være en afgørende faktor [8, 16]. 13

14 1.8. Blokering af endogen enzymaktivitet Detektionsystemer til chromogene signaler består blandt andet af enzymer. Mange af disse enzymer, som peroxidase, findes naturligt i cellerne, og det er derfor vigtigt at blokere deres aktivitet, så der ikke kommer uspecifik binding mellem cellens egne enzymer og det mærkede substrat, der tilføres. Dette gøres ved at tilføre substrat for det givne enzym, som derved binder til og blokerer enzymet, så det ikke kan binde til det mærkede substrat. Substrat for peroxidase er hydrogenperoxid [16] Indstøbning, skæring, snitmontering og tørring Indstøbning, snitmontering og tørring er alle parametre, som ved de rette omstændigheder ikke har den store indflydelse på vævets morfologi og vigtigere, DNAs velbevarelse og tilgængelighed. Paraffin, som bruges til indstøbning, er kemisk inaktivt overfor vævet og er gennemtrængeligt overfor reagenser. Yderligere bliver vævet afparaffineret før yderligere behandling. Ved snitmontering skal man være opmærksom på, at snittet skal være kortest tid muligt i vandbad, da de her kan forurenes af blandt andet RNaser og bakterier. Efterfølgende tørring skal være på kortest mulige tid og ved lave temperaturer [15]. Skæring, og ikke mindst snittykkelse, har til gengæld stor betydning for, om demaskeringen kan foregå optimalt, og derfor om proben kan binde optimalt. For tykke snit betyder, at demaskeringsenzymerne ikke kan trænge igennem hele vævet, og derfor bliver ikke alle proteiner nedbrudt og DNA bliver derved ikke tilgængeligt for proben. Samtidig kan visualiseringen være svær, hvis snittene er for tykke, da der ses signaler i flere niveauer. Det er derfor svært at skelne cellegrænser, og derved svært at sikre, at man kun tæller en enkelt celle ad gangen [17] Translokationsprober Der findes to forskellige type prober til påvisning af translokationer; fusionsprober og breakapart prober (også kaldet split signal prober), se figur 3. 14

15 Figur 3. Fusionssignal og break-apart signal i en enkelt cellekerne. a) viser et fusionssignal, hvor der ved ingen translokation ses fire separate signaler, og ved translokation ses to separate signaler og et fusionssignal og b) viser et et break-apart signal, hvor der ved ingen translokation ses to fusionssignaler og ved translokation ses et fusionssignal og to separate signaler [18]. Fusionsproberne tilføres to forskellige farver, der binder til hvert af de to kromosomer, som indgår i translokationen, og i tilfælde af en translokation, vil de to signaler sidde tæt sammen og give et fusionssignal. Problemet med at bruge denne metode på væv er, at der er stor mulighed for, at det ene signal bliver skåret væk, når vævet skæres på mikrotom, og derved giver falsk-negative resultater [18]. Samtidig er der er en sandsynlighed for en translokation fra det ene kendte kromosom til et alternativt kromosom, i stedet for det kromosom, man normalt ser forbundet med denne translokation, og der vil derfor ikke opstå et fusionssignal. Ved mange sygdomme ses nemlig et hoved-translokatonskromosom, som hyppigst translokerer til ét bestemt kromosom, men hvor andre translokationskromosomer også forekommer mindre hyppigt [3]. Break-apart prober binder med hver sin farve på hver side af et eventuelt break point for translokationen på et af kromosomerne, og derved får man kun et enkelt signal, et split-signal, hvis translokationen er sket. Denne metode er mere velegnet til væv, da der vil komme et 15

16 signal uanset hvordan vævet er skåret, i og med sandsynligheden for at skære lige i break point for en translokation er meget lille [18]. En ulempe ved break-apart proben er at man ikke kan se hvilket kromosom, det brudte kromosom binder til, og dette gør det sværere at undergruppere sygdommen [3]. Når man skal vælge probe er det altså vigtigt at have gjort sig klart, hvad man er interesseret i at finde: hvis man vil finde translokationer af et bestemt kromosom, hvor man ikke er interesseret i, hvilket kromosom, det translokerer til, skal man vælge break-apart proben. Her vil man finde alle translokationer af dette gen, men ikke translokationskromosom. Hvis man omvendt vil finde translokationer med et bestemt kromosom, hvor translokationskromosomet også er vigtigt, skal man vælge fusionsproben. Denne vil ikke finde alle translokationer, kun translokationer til det kromosom, man er interesseret i. C-Myc-proben fra Dako er en break-apart translokationsprobe, som binder opstrøms og nedstrøms for translokationens breakpoint. Den ene probe er mærket med Texas red (rød farve) og binder på telomeren på kromosomet mens den anden probe er mærket med FITC (grøn farve) og binder på centromeren på kromosomet [19] Aflæsning Den valgte C-myc-probe er en break-apart probe, hvilket betyder, at der ved en translokation vil ses enten et fusionssignal og to forskellige separate signaler eller i meget sjældne tilfælde, ved translokation af begge homologe kromosomer i samme kerne, to sæt forskellige separate signaler. En rask celle vil vise to fusionssignaler. Ud over dette er der en række regler for, hvordan man tæller signalerne: Afstanden mellem to separate signaler skal svare til minimum diameteren af to signaler, for at cellen kan betegnes translokeret. Signalerne må ikke være udflydende, men skal være runde og have nogenlunde samme diameter. Celle- og kerneafgrænsningerne skal være tydelige, så der ikke er tvivl om, at det kun er en enkelt celle, der tælles, se figur 4 [20]. 16

17 Overlappende kerner, skal ikke tælles To fusionerede signaler, translokationsnegative Overopløst kerne, skal ikke tælles Et fusioneret signal og to split-signaler, translokationspositive Udtværet signal, skal ikke tælles Figur 4. Aflæsningsguide til break-apart translokationsprober. Denne figur viser de forskellige typer signaler, der kan ses i en kerne ved brug af en break-apart probe, og hvordan de skal aflæses [Modificeret fra 20]. 17

18 2. Materialer og metoder 2.1. Pilotforsøg Begge metoder (FISH og DuoCISH ) blev testet på tonsiller for at sikre rutine i protokollerne og maskinerne. HE-farvninger blev lavet og der blev der testet, om det var muligt at køre FISH færdigt, og først derefter lægge CISH på, som producenten sagde man kunne, men ikke anbefalede. Dette gjorde vi for at undersøge, om det kunne lade sige gøre, i tilfælde af problemer i processen. Der blev testet, om Hæmatoxylin eller Mayers sure Hæmalun gav det bedste resultat som kernefarvning i forhold til de signaler, DuoCISH giver, og vi foretrak Mayers sure Hæmalun, da denne giver en lysere blå kernefarvning, og derved træder signalerne tydeligere frem Patientmateriale Der blev udtrukket en liste fra Rigshospitalets Patologisystem Logica med patienter diagnosticeret med Burkitt Lymfom siden Disse patienter blev slået op i Logica for at undersøge, om der var patientmateriale nok. Der blev fundet i alt 14 patienter diagnosticeret med Burkitt Lymfom, hvor 9 patienter FISH-positive, 1 patient var FISH-negativ og 4 patienter, hvor der ikke var lavet FISH. Vævstyper varierede, se tabel 3 og bilag A. Alle patienter blev slået op i vævsanvendelsesregisteret for at sikre, at det var tilladt at bruge patientmaterialet. RH-numrene på patienterne blev skrevet i vilkårlig rækkefølge, så det ikke var muligt at se, hvilke patienter, der var positive og negative, og derefter blev de tildelt et bogstav fra A-O, eksklusiv L. Dette blev gjort for at blinde forsøget, så der ikke ville opstå bias ved tællingen Vævsforbehandling Da alt patientmaterialet var fra arkiv, er fiksering og indstøbning sket i henhold til afdelingens rutineprotokoller og ikke optimeret i forhold til væv og FISH/CISH. På afdelingen bliver lymfatisk væv fikseret i rutineprogram på lige fod med andet væv. Det vil sige, at det kører program 1 (hverdage) eller program 2 (weekender) på VIP 300, hvor hele processen tager cirka 19 timer. Fiksering i 4 % neutral buffet formaldehyd (10 % formalin) starter, når præparatet fjernes fra patienten og fortsætter, når det er udskåret. Præparater fra 18

19 hele dagen samles og sættes i VIP en, hvor det kun fikserer et minut i formalin (15 min i weekender), og derefter ca. 7 timer i alkohol. Det vil sige, at der ikke er en standard tid for fikseringen, da dette afhænger af, hvornår præparatet modtages Skæring af snit Der blev af en rutineret bioanalytiker skåret 6 snit på 1 m på en Jung slædemikrotom (Leica) af hver af de 14 blokke, der blev tildelt numrene 1-6 (for eksempel A1, A2, A3 og så videre). Snittene blev lagt på SuperFrost Plus-glas (Thermo Scientific). Alle 1-snittene blev HEfarvet, alle 2-snittene blev FISH-farvet og alle 3-snittene blev DuoCISH -farvet. 6-snittene blev brugt som negative kontroller, hvor der i stedet for probe blev lagt probebuffer og vand på. 4- og 5-snittene blev gemt i tilfælde af, at nogle af forsøgene senere skulle laves om, se figur 5. Glassene blev sat i Function Line varmeskab (Heraeus) ved 60 ºC i 30 min. Snittene lufttørres natten over og opbevares i derefter i køleskab. 19

20 Blok A A1 HEfarvning A2 FISH A3 DuoCISH A4 Ekstra A5 Ekstra A6 Negativ Kontrol Figur 5. Oversigt over fordeling af snit. Denne figur viser et eksempel på, hvordan blokke og glas blev navngivet, så forsøget ville være blindet. Den første blok blev navngivet A. Der blev skåret 6 snit af hver blok, et til HE-farvning (A1), et til FISH (A2), et til DuoCISH (A3), to ekstra i tilfælde af at et forsøg skulle laves om (A4 og A5) samt et til negativ kontrol (A6). 20

21 2.5. Forberedelser FISH Pre-Treatment Solution x20 fortyndes 1:20 i ionbyttet vand. Wash-buffer x20 fortyndes 1:20 i ionbyttet vand. Stringent Wash Buffer x20 fortyndes 1:20 i ionbyttet vand. DuoCISH Alle reagenser opbevares i køleskab, og alle på nær Red Chromogen tilpasses stuetemperatur inden brug. Wash-buffer fortyndes 1:20 med ionbyttet vand. Red Chromogen solution laves maksimum 20 min før brug ved at blande 1 ml Red chromogen buffer + 10 l chromogen. Blue Chromogen solution laves minimum 30 min før brug ved at bland 1ml Blue Substrate Buffer + 75 l Blue Chromogen. Kontrastfarve blandes i et 1:5 forhold af Mayers sure Hæmalun (Region H Apoteket) og ionbyttet vand. Alle ufortyndede reagenser opbevares i køleskab eller fryser. Alle procedurer, bortset fra mikrobølgeovn og varmebad, foregår i stinkskab Afparaffinering Efter 30 min i varmeskab afparaffineres snittene, først i Tissue Clear og derefter i alkohol. Efterfølgende vaskes snittene i Wash Buffer Probepræparering, denaturering og hybridisering Probe tilføres snittene. Dækglassene forsegles med cykellim. Snittene inkuberes i Hybridizer Stat Spin (Dako) ved program 3 (denaturering 82 C i 5 min, hybridisering 45 C) natten over Kontrastfarvning DuoCISH farves med hæmatoxylin og skylles med vand. 21