Det genetiske aspekt ved udviklingen af marginal parodontitis

Transkript

1 Det genetiske aspekt ved udviklingen af marginal parodontitis Bacheloropgave 6. semester 2014 Udarbejdet af: Susanne Vigsø (7711) Maria Lynn Sembler-Møller (6011) Charlotte Thomsen (2711) Karina Beiter Lauridsen (1511) Vejleder: Palle Holmstrup Fagområde: Parodontologi, Københavns Universitet

2 Indholdsfortegnelse Resumé...3 Indledning...4 Sygdomsudviklingen i marginal parodontitis...5 Den direkte vævsdestruktion...7 Den indirekte vævsdestruktion...7 Tvillingestudie...8 Genetikkens betydning i den direkte vævsdestruktion...10 A.a. JP2- klon...10 Genetikkens betydning i den indirekte vævsdestruktion...10 Genpolymorfi...10 Cytokiner...13 Interleukin- 1: Et kluster af IL- 1A, IL- 1B og IL- 1RN med mulig sammenhæng med progression og sværhedsgrad af marginal parodontitis...13 Interleukin- 6 polymorfi...18 Interleukin- 10 polymorfi...19 Interleukin- 17 polymorfi...21 Receptor- ligandbinding...22 Fcγ- receptor polymorfi...22 Toll- like- receptor polymorfi...24 Konklusion...25 Abstract...27 Litteratur...28 Side 2 af 30

3 Resumé Marginal parodontitis er en multikausal sygdom. Plaquens mikrobielle sammensætning og organismens eget immunforsvar er medvirkende til den vævsnedbrydning, der ses ved marginal parodontitis. Undersøgelser gennem de sidste 40 år, har vagt opmærksomhed på genetikkens betydning for sygdomsudviklingen. I relation til den direkte vævsnedbrydning har koloniseringen af Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A.a.) serotype b hos individer fra nord- og nordvestafrika indikeret, at den genetiske forskel mellem etniciteter kan være afgørende for individets risiko for at udvikle marginal parodontitis. I relation til den indirekte vævsnedbrydning er det velkendt, at bl.a. cytokiner (interleukiner) samt receptorforbindelser (toll-like- og Fc-receptorer) i værtens immunrespons udgør en essentiel rolle. Specifikke genetiske forhold, som polymorfier af gener, der koder for ovennævnte faktorer, kan være med at til forårsage udvikling af sygdommen. I vores litteraturstudie har vi undersøgt associationen mellem specifikke polymorfier af generne, som koder for regulatoriske faktorer i værtens immunrespons i forbindelse med marginal parodontitis, og en øget risiko for at udvikle sygdommen. Man bør være kritisk overfor de forskellige undersøgelser, der konkluderer en sammenhæng mellem haplotype og sygdomsprogression. Vi konkluderer, hvis der forekommer en sammenhæng hos et individ, kan det blot anses for at være en risikofaktor. Med andre ord kan man ikke regne med, at tilstedeværelsen af en komposit genotype, vil føre til den samme fænotype hos alle individer. Side 3 af 30

4 Indledning Det er i dag alment kendt, at marginal parodontitis er en multikausal, irreversibel sygdom, der initieres af en reversibel gingivitis. De ætiologiske forhold er overordnet plaque, som akkumulerer på tandoverfladen. Plaquen inducerer et immunrespons, der medfører inflammation i gingiva. Immunresponset kan resultere i nedbrydningen af det parodontale bindevæv og knogle, i tilfælde af, at specifikke betingelser er opfyldt. Her kan være tale om den pågældende plaques mikrobielle sammensætning, medicinske sygdomme, livsstilsfaktorer og genetiske forhold. For år tilbage var overbevisningen den, at marginal parodontitis var en konsekvens af specifikke mikroorganismer på tandoverfladen, kendt som den specifikke plaquehypotese. I forlængelse heraf er relevante mikroorganismer fra den subgingivale plaque i 1998 blevet inddelt i komplekser på baggrund af tværgående associationsstudier (se figur 1). Mens bakterier fra hhv. det gule, Figur 1: Plaquekomplekset (45). lilla og grønne kompleks er associeret med sunde forhold, er bakterier fra det orange og røde plaquekompleks blevet forbundet med udviklingen af marginal parodontitis. En enkeltstående bakterie, Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A.a.) serotype b, har vakt særlig interesse, idet tilstedeværelsen af denne i den subgingivale plaque har været signifikant sammenfaldende med udviklingen af lokaliseret aggressiv parodontitis (24). Betydningen af den mikrobielle sammensætning, som risikofaktor for udviklingen af parodontal sygdom, er blevet undersøgt fra et genetisk synspunkt. Man har via longitudinelle DNA-baserede studier vist en forskel i kolonisering af en JP2-klon af bakterien A.a. serotybe b hos mennesker med nord- og nordvestafrikansk oprindelse (uddybes yderligere under afsnittet A.a. JP2 klon) (4). Denne dokumentation har beriget os med viden om, at genetiske forhold kan påvirke den direkte nedbrydningsproces. Genetik er læren om arvelighed, der blandt andet omfavner overførelse af en specifik genotype fra forældre til afkom, hvilket fænotypisk kan komme til udtryk. Marginal parodontitis er en kompleks sygdom med et genetisk aspekt (9), hvilket er bekræftet ved forskellige undersøgelser. I 1970 startede et studie med 480 mandlige te-plantage-arbejdere på Sri Lanka. Te-plantagearbejderne udgjorde en homogen gruppe med samme miljø, sociale faktorer og fravær af tandpleje. Side 4 af 30

5 Over 15 år registreredes fæstetab, gingival-, plaque-, gingival caries- og calculusindex på alle forsøgspersoner. På baggrund af undersøgelsen kom man frem til en stor individuel variation i progressionshastigheden af sygdom, på trods af te-plantage-arbejdernes fælles prædisponerende faktorer. Da grupperne i høj grad viste lighed i plaqueindex-score, vækkede den store individuelle forskel mistanke om, at genetiske faktorer kunne have en indflydelse (11). Denne opgave vil via et litteraturstudie undersøge genetikkens betydning for faktorer i hhv. den direkte og indirekte vævsnedbrydning ved udvikling af marginal parodontitis. Indledningsvis vil opgaven belyse, hvordan en kombination af plaquens mikrobielle sammensætning og organismens eget immunforsvar er medvirkende til den vævsnedbrydning, der ses ved marginal parodontitis. Det er velkendt, at bl.a. cytokiner (f.eks. interleukiner) samt receptorforbindelser (toll-like- og Fcγreceptorer) i værtens immunrespons udgør en essentiel rolle i vævsnedbrydningen. I opgaven vil interessefeltet indenfor disse faktorer være at undersøge udvalgte polymorfier, som kan være en risikofaktor i progressionen af marginal parodontitis. Vores empiri strækker sig tilbage fra 1970 og frem til i dag, og vi ønsker at belyse, hvordan man i denne årrække er blevet beriget med viden indenfor emnet. Således omfatter opgaven en grundlæggende forståelse af det genetiske aspekt i sygdomsbilledet af marginal parodontitis. Sygdomsudviklingen i marginal parodontitis I det følgende redegøres for fire faser, benævnt den initiale læsion, den tidlige læsion, den etablerede læsion og den fremskridende læsion, som beskriver udviklingen fra sunde parodontale forhold til marginal parodontitis. Afsnittet vil bidrage til et overblik over, på hvilke niveauer i sygdomsudviklingen genetikken kan have en indvirkning. Den sunde gingiva består af et keratiniseret oralt epitel og kontaktepitel. Kontaktepitelet er fæstnet Figur 2(5): Illustration af sund gingiva. til tandoverfladen vha. hemidesmosomer. Det underliggende bindevæv udgøres af et netværk af kollagene fibre, som bl.a. opretholder vævets form og støtter hemidesmosomernes fæste til tandoverfladen. Det dentogingivale pleksus forsyner epitelet med næringsstoffer og leukocytter. I den klinisk sunde gingiva forekommer en kontinuerlig tilstedeværelse af et begrænset antal inflammatori- Side 5 af 30

6 ske celler pga. de bakterier, der findes i mundhulen. Fra det dentogingivale pleksus trænger gingivalt ekssudat ud i den cervikale region. Flowet af ekssudat indgår i immunresponsets såkaldte 1. line of defense. Den initiale fase omfatter den inflammation, der fremkommer allerede indenfor 24 timer med plaqueakkumulering. Inflammationen indebærer vasodilatation af kar, stigning af det hydrostatiske tryk samt forekomst af intercellulære gaps imellem epitelcellerne i gingiva. Den forøgede permeabilitet medfører, at væske og proteiner trænger fra karrene ud i vævet. Ydermere ses en cellemigration af neutrofile granulocytter fra blodbanen til vævet, som faciliteres af tilstedeværelsen af kemotaktiske faktorer og forskellige adhæsionsmolekyler. Lymfocytter tilbageholdes i bindevævet ved kontakt med antigener, cytokiner eller adhæsionsmolekyler, og ankommer derfor med forsinkelse til det plaqueholdige kontaktepitel i forhold til de neutrofile granulocytter. Den tidlige fase er kendetegnet ved en rødme af gingiva grundet øget vaskularitet, stigning i antallet af neutrofile granulocytter og leukocytter, begyndende tab af kollagene fibre i bindevævet samt en sideløbende proliferation af basalcellerne i kontakt- og sulcusepitelet, som et forsøg på at opretholde barrieren mod de indtrængende bakterier. Proliferationen øger overfladearealet af den dermo-epidermale-grænse i form af epiteltappe, hvilket øger tilhæftningen mellem epidermis og dermis. Den etablerede fase er karakteriseret ved en dominans af plasmaceller, et øget flow af gingivalt ekssudat samt en yderligere vævsnedbrydning, der medfører, at den koronale del af kontaktepitelet mistes, hvilket i stedet genkendes som pocheepitel. Dette udgør en grobund for dannelsen af subgingival plaque. Den etablerede læsion kan forblive stabil i måneder til Figur 4(5): Illustration af den etablerede læsion. Figur 5(5): Illustration af parodontitis læsionen. år, men kan også vise sig at være mere progressiv og fortsætte til den fremskridende fase. Side 6 af 30

7 Den fremskridende fase adskiller sig fra foregående faser ved en have en udbredelse, der manifesterer sig lateralt og apikalt i bindevævet til tændernes egentlige ophængsapparatur i form af parodontale fibre og knogle (5). Den direkte vævsdestruktion Som nævnt indledningsvis omfatter vævsnedbrydningen en direkte og en indirekte del. Bakterierne i biofilmen er ansvarlige for den direkte del. De koloniserende bakterier vil via deres virulensfaktorer forsøge at invadere vævet, undvige og aktivere værtsforsvaret, samt destruere det omgivende væv. Sidstnævnte opnås ved at anaerobe og fakultativt anaerobe bakterier, som dominerer i den subgingivale plaque, producerer en række metaboliske toksiner (f.eks. iltholdige radikaler, svovlbrinte, ammoniak m.fl.) og enzymer (f.eks. kollagenase og hyaluronidase), der kan nedbryde netværket af kollagene fibre samt bestanddele i bindevævets grundsubstans (4). Helt konkret kan nævnes den gram-negative, fakultativt anaerobe A.a. som et eksempel på en bakterie med vævsdestruerende egenskaber, som ovenfor beskrevet. Tilmed evner A.a. at unddrage sig værtsforsvaret ved ekspression og udskillelse af leukotoksin (24). Den indirekte vævsdestruktion Samtidig med, at bakterierne selvstændigt udsender toksiner, som nedbryder vævet, vil kroppens eget immunsystem respondere herpå og ligeledes aktivere en inflammation. En konsekvens heraf kan være en yderligere vævsnedbrydning. Dette anses som den indirekte vej, der udgør den væsentligste rolle i vævsdestruktionen ved marginal parodontitis. Man taler hovedsageligt om fem veje til vævsnedbrydning som anført nedenfor. De fire første veje er medvirkende til nedbrydning af blødtvæv, mens den femte vej er medvirkende til nedbrydningen af knogle. 1. En del af immunforsvarets celler, heriblandt makrofager, har overfladereceptorer, som kan genkende fremmede patogener. Receptorerne benævnes toll-like receptors, hvis funktion er at genkende PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns), der sidder på patogenet. PAMPs er karakteristiske kendetegn på patogener, så som lipopolysakkarid på Gramnegative celler, peptidoglykan på Gram-positive celler eller tilstedeværelse af en kapsel. Receptor-ligandbindingen forårsager en aktivering af makrofagerne, der vil resultere i en udskillelse af proinflammatoriske cytokiner, herunder IL-1 (interleukin-1). Udskillelsen af cytokiner vil aktivere fibroblaster i bindevævet til syntese af MMP (Matrix Metallo Proteina- Side 7 af 30

8 se). MMP kan som gruppe nedbryde stort set alle bestanddele i bindevævet. Under normale forhold vil denne aktivitet reguleres af TIMP (Tissue Inhibitor of Metallo Proteinase). Hvis forholdet mellem MMP og TIMP ændres, vil en uhensigtsmæssig vævsnedbrydning kunne initieres. 2. Plasminogen omdannes til plasmin. Plasmin spalter peptidbindinger lokaliseret på overfladen af proteiner som fibrin og fibronektin. 3. De neutrofile granulocytter danner leukocyt elastase og kathepsin G. Disse produkter er proteinaser, der bl.a. spalter type IV kollagen, laminin og fibronektin. 4. Neutrofile granulocytter, makrofager og fibroblaster har alle en fagocyterende aktivitet. De ekstracellulære partikler, som fagocyteres, optages i lysosomer og nedbrydes. Under fagocytosen vil cellen automatisk frigive nogle af de substanser, som er med i nedbrydningsprocessen af det fagocyterede materiale. I blandt disse substanser er iltholdige radikaler og mindst 40 forskellige enzymer, herunder MMP8. Substanserne kan i det ekstracellulære miljø have en vævsnedbrydende virkning. 5. Proinflammatoriske cytokiner kan yderligere stimulere osteoklastaktivitet. På progenitorceller for osteoklaster sidder en receptor kaldet RANK. Denne receptor kan aktiveres af et cytokin fra TNF-familien, der benævnes RANKL. RANKL syntetiseres bl.a. af osteoblaster og T-lymfocytter. Ved receptor-ligandbinding differentierer progenitorcellen til en moden osteoklast. Osteoklasterne secernerer organiske syrer, som nedbryder knoglevævet. Knoglenedbrydningen, medieret af RANKL, kontrolleres af proteinet osteoprotegerin, der, på samme måde som RANKL, kan binde til RANK, men uden at dette fører til differentiering og dermed aktivering af osteoklaster. Cytokinpåvirkede osteoblaster kan frigive MMP, som formentlig opløser osteoid, og dette kan være en regulator af migrationen af osteoklaster. Desuden gælder det, at kathepsin K opløser kollagen i knoglevæv (4). Tvillingestudie Som nævnt indledningsvist blev der, efter fremvisning af resultaterne fra te-plantage-arbejderne i 1970, sat særligt fokus på genetikken som risikofaktor for udviklingen af marginal parodontitis. Et uddybende tvillingestudie, udført på 117 tvillingepar i 1991, havde til formål at undersøge hypotesen om en arvelig komponent af sygdommen. I undersøgelsen indgik 64 monozygote og 53 dizygote tvillingepar (bekræftet ved DNA-fingerprint) i en alder omkring 40 år. Side 8 af 30

9 Et tvillingstudie er et klassisk design, hvor man kræver, at forsøgspersonerne i alle tvillingpar har været udsat for samme miljømæssige påvirkninger i deres opvækst, og tilmed udnytter man, at monozygote tvillinger genetisk set er identiske, hvorimod dizygote tvillinger er forskellige. Dizygotiske tvillinger opstår som resultatet af en dobbelt ægløsning, hvorefter hvert æg fertiliseres af to forskellige sædceller. Rent genetisk svarer dizygote tvillinger derfor til et almindeligt søskendepar (25). Tvillingestudier kan give svar på det basale spørgsmål om, i hvor høj grad variationen af sygdomsrisiko i befolkningen kan tilskrives genetisk arvelighed eller miljø. Helt konkret var formålet med studiet at finde frem til, om sygdomsforekomsten hos monozygote tvillinger afspejler sygdomsforekomsten hos dizygote tvillinger. Ved en systematisk udvælgelse af forsøgspersonerne, sikrede man sig, at påvirkelige variabler, så som tobaksrygning, køn og mundhygiejne, var ligeligt fordelt hos henholdsvis de monozygote og dizygote tvillinger. Variationen af forsøgspersonernes sygdomsbillede spredte sig fra alt mellem sunde parodontale forhold til aggressiv parodontitis. Undersøgelserne omfattede måling af pochedybde, fæstetab, blødning ved pochemåling, plaquemængde samt graden af gingivitis. Studiet viste, at forskellen mellem monozygote tvillinger var 48-59% af forskellen mellem dizygote tvillinger. Herudfra kan udledes, at omkring 50% af patogenesen bag marginal parodontitis kan tilskrives en genetisk komponent. Undersøgelsen er dog kun meningsfuld, hvis de undersøgte tvillinger er repræsentative for resten af befolkningen, hvad angår graden af marginal parodontitis. Det blev bekræftet i undersøgelsen, at prævalensen for udvikling af marginal parodontitis hos tvillinger er lig med prævalensen i resten af befolkningen (4, 6). Undersøgelsen af te-plantage-arbejderne fra 1970 bekræftede, at en genetisk variation lå til grund for variation af sygdomsrisikoen. Tvillingestudiet fra 1991 bekræftede efterfølgende, at sygdomsvariationen delvist kan forklares ud fra arvelige faktorer ( 50%). Med den viden i ryggen har efterfølgende undersøgelser indenfor området forsøgt at beskrive nedarvingen på et mere detaljeret niveau. Angrebspunkter for den genetiske forskning har dels være fokuseret omkring koloniseringen med specifikke mikroorganismer, dels om polymorfi af gener, der koder for proteiner, som indgår i de vævsdestruktive processer. Side 9 af 30

10 Genetikkens betydning i den direkte vævsdestruktion A.a. JP2- klon På baggrund af flere studier er der fundet geografiske forskelle i forekomsten af A.a. serotype b i relation til udviklingen af lokaliseret aggressiv parodontitis. En specifik klon af A.a. benævnes JP2. JP2-klonen ses udelukkende at kolonisere personer med nord- og nordvestafrikansk oprindelse. Karakteristisk for JP2-klonen er en forekomst af en 530 basepar deletion i promoterregionen ved genet, der koder for leukotoksin (24). En deletion er en form for mutation, der kan resultere i ekstra eller manglende aminosyrer i et protein. Deletioner er særligt skadelige, når antallet af ekstra eller manglende aminosyrer ikke er deleligt med tre, så nedstrømsregionen forrykkes (25). Deletionen har vist sig at resultere i en ti til tyve gange forøget produktion af leukotoksin, der netop gør denne klon særlig virulent. I starten af det 21. århundrede lavede man et longitudinelt studie med 700 skolebørn fra Marokko. Formålet med studiet var at undersøge, hvorvidt tilstedeværelsen af JP2-klonen kunne relateres til en øget risiko for udviklingen af den lokaliserede form for aggressiv parodontitis. Studiet viste, at individer koloniseret med JP2-klonen, havde det højeste gennemsnitlige fæstetab. Kun 17,4% af denne JP2-positive gruppe viste intet klinisk fæstetab. Gruppen af individer, der ikke var koloniseret med JP2-klonen, havde modsætningsvis det laveste gennemsnitlige fæstetab. Hos hele 79,4% af denne JP2-negative gruppe observeredes intet fæstetab (26, 5). Heraf kan sluttes, at der forekommer en association mellem kolonisering af JP2-klonen og udviklingen af lokaliseret aggressiv parodontitis hos den nord- og nordvestafrikanske befolkning. Det interessante bliver nu at undersøge, hvilke genetiske forhold, der gør, at kun individer fra specifikke geografiske områder kan koloniseres. Dette kan sandsynligvis tilskrives en bestemt genetisk sammensætning hos netop denne befolkningsgruppe frem for andre, men ingen forklaring er endnu fundet (43). Genetikkens betydning i den indirekte vævsdestruktion Genpolymorfi Der findes omtrentligt gener i det humane genom. DNA-sekvensen i gener kan have individuelle variationer. Lokalisationen af et gen på et kromosom kaldes et locus. Forekommer der to eller flere forskellige DNA-sekvenser på et givent locus, benævnes disse alleler. Når en specifik Side 10 af 30

11 allel findes hos over 1% af befolkningen, er der tale om en polymorfi, hvilket beskrives som en normalvariant. Typisk genfindes disse dog med en allelfrekvens på over 20% i befolkningen. Derimod defineres en mutation som enhver ændring i en DNA-sekvens, der varierer fra normalen med en frekvens på under 1%. Kombinationen af alleler på to eller flere loci på samme kromosom kaldes en haplotype. Genomet udgøres af dobbeltstrenget DNA med nukleotider adenin, guanin, cytosin og thymin som byggesten. Tre nukleotider i en specifik rækkefølge definerer et kodon, der i translationen koder for en bestemt aminosyre. Variationer i en allel involverer ændringer af nukleotid-rækkefølgen, hvilket kan medføre, at der nu kodes for en anden aminosyre (9). Polymorfierne fører ikke nødvendigvis til fænotypiske ændringer, idet én aminosyre kan relateres til mere end ét kodon. Aminosyrerækkefølgen i proteinet vil da være den samme. Denne form for polymorfi benævnes silent. Den mest almindelige form for polymorfi i det humane genom er en variant af et enkelt nukleotid, kaldet single nucleotid polymorphisms (SNPs). Forekommer der i proteinsyntesen en ændring af aminosyrerækkefølgen, kan det medføre en modificeret funktion. I samspil med miljømæssige faktorer, så som rygning, diæt eller mikrobielle faktorer, kan konsekvenserne blive forstærket. To individer kan derfor godt være bærer af den samme sygdomsmodificerende polymorfi, men, pga. miljømæssige påvirkninger samt sygdommens art, manifesterer sig kun som sygdom hos den ene person (9). Genetiske sygdomme bliver inddelt i 3 kategorier; kromosomal, simpel mendelsk sygdom og kompleks genetisk sygdom (10). Kromosomale forstyrrelser karakteriseres ved anormaliteter i struktur og antal af kromosomer (10). Simple mendelske sygdomme karakteriseres ved, at de kun findes hos 0,1% af befolkningen. Der er her tale om genetiske mutationer, som følger den klassiske nedarving autosomalt dominant, autosomalt recessivt eller x-bundet. Hvorvidt sygdom opstår, afhænger for denne kategori, ikke af miljømæssige faktorer. Komplekse genetiske sygdomme skyldes polymorfier, og er langt mere almindelige. Nedarvet genetisk variation kan ikke anses for at være ætiologi i en kompleks sygdom, men snarere en risikofaktor i samråd med en eller flere miljømæssige faktorer (10). Marginal parodontitis klassificeres som en kompleks genetisk sygdom. Dog er der lavet studier, som kategoriserer aggressiv parodontitis som en simpel mendelsk arvegang. Begrundelsen for denne kategorisering er fundet ved observering af flere familier, hvor aggressiv parodontitis er videregivet fra forældre til afkom. Side 11 af 30

12 I 1976 fandtes aggressiv parodontitis at være nedarvet X-bundet. Der sås ingen far til søn transmission, men størstedelen af de afficerede individer var kvinder. Efterfølgende kom det frem, at årsagen til, at den større mængde afficerede individer var kvinder, udelukkende var, at undersøgelserne var udført med en ulige kønsfordeling med overvægt af kvinder. Studier over den finske befolkning viste, at aggressiv parodontitis nedarves autosomalt recessivt, mens der hos nordamerikanske familier blev fundet, at sygdommen nedarves autosomalt dominant. Undersøgelserne reflekterer genetisk heterogenitet i aggressiv parodontitis. Samme form for varierende nedarving er også kendt fra sygdommen amelogenesis imperfecta. Aggressiv parodontitis kan ifølge ovennævnte studier karakteriseres som en simpel mendelsk sygdom, men ikke alle former for aggressiv parodontitis kan høre ind under denne klassifikation. Med forklaringsvaskeligheder i baghovedet, kan vi med fordel derfor fortsat anse marginal parodontitis som værende en kompleks genetisk sygdom. Herunder bemærkes desuden, at man aldrig taler om simpel mendelsk nedarving ved kronisk parodontitis (12). For at undersøge polymorfiers sammenhæng med marginal parodontitis anvendes ofte associationsanalyser (9). Figur 6(5): Faktorerne i tabellen indgår i vævsnedbrydningen ved marginal parodontitis. Der kan forekomme polymorfi i de gener der koder for disse faktorer. Polymorfier med betydning for marginal parodontitis er skematiseret i figur 6. Side 12 af 30

13 Fælles for generne er, at ekspressionen af dem har betydning for værtens immunrespons, idet de koder for henholdsvis cytokiner og receptorer, der indgår i signaltransduktionen under vævsnedbrydningsprocessen. Udvalgte gener (IL-1A, IL-1B, IL-6, IL-10, IL-17, Fcγ-receptor, toll-like receptor) har vakt særlig interesse, og vil i det efterfølgende blive belyst og diskuteret. Cytokiner Cytokiner er en overordnet gruppe af opløselige proteiner, der fungerer som intercellulære signalmolekyler. Cytokiner udskilles af immunceller fra både det innate og det adaptive immunforsvar. Funktionen af cytokiner er mangfoldig, idet de både kan initiere et immun- og inflammatorisk respons. Dette ses f.eks. ved den 1. vej i den immunafhængige nedbrydning. Desuden kan de regulere væksten og differentiering af celler, hvilket ses ved den 5. vej i den immunafhængige nedbrydning. Cytokiner omfatter en bred gruppe af proteiner, hvoriblandt interleukiner er en vigtig undergruppe. Interleukiner er primært involveret i den cellulære kommunikation mellem leukocytter og andre celler, så som fibroblaster, epitelceller og endotelceller (5). Af virkningsmekanismer findes der cytokiner med proinflammatoriske, antiinflammatoriske og regulatoriske egenskaber. Interleukin- 1: Et kluster af IL- 1A, IL- 1B og IL- 1RN med mulig sammenhæng med progres- sion og sværhedsgrad af marginal parodontitis. Interleukin-1 dækker over en familie på 11 ligandmedlemmer, der inddeles i 3 undergrupper. Disse undergrupper er inddelt efter længden af genernes precurser og probe for hver precursor. En af disse subgrupper omfatter IL-1α, IL-1β og IL-33, som udgør de længste proteinkæder med de længste prober i familien (28). Vi har valgt at fokusere på IL-1α og IL-1β, da disse er de mest undersøgte medlemmer af interleukin-1 familien. Generne, der koder for proteinerne IL-1α og IL-1β, er hhv. IL-1A og IL-1B lokaliseret i IL-1 genklusteret på kromosom nr. 2 (5). IL-1α og IL-1β er to forskellige molekyler, dog med mange funktionelle ligheder. Begge molekyler produceres af immunsystemets celler, så som makrofager, monocytter og dendritiske celler. IL-1α er primært en regulator af intracellulære begivenheder, samt mediator af lokal inflammation. IL-1β er primært et protein, som får sin pro-inflammatoriske virkning ekstracellulært fra. Desuden menes IL-1α at have en indflydelse på knogleresorption (30). Side 13 af 30

14 IL-1α- og IL-1β-molekylernes proinflammatoriske virkning, sammen med det faktum, at koncentrationerne af disse er eleveret i det gingivale eksudat i forbindelse med marginal parodontitis, har vækket nysgerrigheden om en evt. sammenhæng mellem polymorfier af disse cytokiner og sygdomsudvikling (5). Kornman et. al. (1997) var den første til at undersøge og rapportere om polymorfier for IL-1 gener i relation til marginal parodontitis. Hans undersøgelse omhandlede personer over 35 år af kaukasisk afstamning (for at reducere den genetiske heterogenitet), der i øvrigt var raske. Disse personer blev inddelt i 3 grupper: individer uden parodontal sygdom, individer med moderat parodontal sygdom, og individer med generaliseret udtalt marginal parodontitis. Deltagerne fik taget en blodprøve, der gjorde det muligt at finde polymorfier i IL-1A genet ved position -889, IL-1B position -511 og +3953, IL-1RN gen intron 2 og TNF-A ved Alle polymorfierne blev undersøgt via PCR, visualiseret under ultraviolet lys og derefter kørt i en gelelektroforese. Resultaterne fra denne undersøgelse viste, at hos ikke-rygere med en svær grad af sygdom, var frekvensen af allelen med polymorfi IL-1A -889 og IL-1B højere, end hos de individer med hhv. moderat og let form for marginal parodontitis. Man fandt også en sammenhæng mellem polymorfien af IL-1B og raten af produktionen af IL-β proteinet. Ved homozygositet af denne allel fandtes en fire gange så høj koncentration af IL- 1β. Hos dem, som var negative for genotypen, sås den svære udgave af sygdommen først at opstå efter en alder på 60 år, mens man hos dem, der var positive for genotypen, opnåede den samme sværhedsgrad ved en alder før de 20 år. Det konkluderes på basis af de fundne resultater, at der findes en association mellem de specifikke polymorfier af IL-1 genet og en øget risiko for at udvikle svær marginal parodontitis. Undersøgelsen viste desuden en tydelig effekt af rygning, idet man hos en samlet gruppe af ikke-rygere og rygere med samme sværhedsgrad af sygdom, kun kunne påvise en genetisk nedarvning hos gruppen af ikke-rygere. Dette viser hvorledes rygning medvirker som en signifikant disponerende faktor, trods fravær af genetisk disponering (31). Siden Kornmans studie, har andre studier prøvet at finde samme sammenhæng indenfor den kaukasiske befolkning. I et studie fra 2001 undersøgte man 56 kaukasiske patienter, der havde en svær grad af parodontal sygdom med tidlig debut, sammenholdt med en kontrolgruppe, bestående af 56 raske individer. De samme polymorfier, som Kornman interesserede sig for, herunder IL-1A -889 og IL-1B +3953, blev undersøgt. Undersøgelsens konfidensintervaller viste, at prøvestørrelsen var tilpas stor til at konkludere, at der ikke fandtes en association mellem IL-1 polymorfi og marginal Side 14 af 30

15 parodontitis med tidlig debut. Derfor sætter artiklen spørgsmålstegn ved anvendeligheden af disse genetiske markører som en risikofaktor for udviklingen af marginal parodontitis. Artiklen forholder sig tilmed kritisk til den prøvestørrelse som Kornman anvendte. Ud af den gruppe med den svære grad af marginal parodontitis, var der kun 18 individer, som var ikke-rygere, og der argumenteres for, at prøvestørrelsen ikke var stor nok til, at konklusioner kunne drages. Desuden redegøres der i artiklen for, at man skal forholde sig kildekritisk til nyere undersøgelser, grundet en tendens til små prøvestørrelser. I dette studie er der til gengæld ikke taget hensyn til kontrolgruppens alder og rygestatus, hvilket ifølge artiklen ikke anses for at have nogen betydning, da DNA ikke ændres med alderen, og da antallet af rygere i kontrolgruppen var meget lille (36). Sammenhængen, som Kornman viste for den kaukasiske population, er sidenhen også blevet undersøgt i andre populationer. Et studie fra 2011 fokuserede på netop de samme polymorfier af IL-1A og IL-1B, men hos en gruppe af jordansk afstamning. Da det var hele IL-1 genklusteret, som den nyere undersøgelse arbejdede med, fandt de desuden frem til resultater vedrørende IL-1RN polymorfier, som vi i denne opgave ikke vil komme nærmere ind på. Formålet med studiet var at undersøge polymorfiernes sammenhæng med både kronisk og aggressiv parodontitis, modsat Kornman, der angiveligt kun arbejdede med kronisk parodontitis. Undersøgelsen omfattede 100 patienter med kronisk parodontitis, 80 med aggressiv parodontitis og 80 raske. Der bliver i artiklen redegjort for, at det er svært at finde associerede artikler, studiet kan sammenlignes med, idet de fleste undersøgelser har koncentreret sig om et enkelt gen i relation til enten kronisk eller aggressiv parodontitis. Undersøgelsen viste, at der ikke fandtes en sammenhæng mellem polymorfierne IL-1A -889 og IL- 1B og udviklingen af hverken kronisk eller aggressiv parodontitis hos den jordanske befolkningsgruppe (34). Studiet redegør for forskellige fejlkilder, som kunne være årsag til modstridende resultater. Kornmans forsøg fra 1997 viste netop, at det var sværhedsgraden af kronisk parodontitis, der var associeret med den kompositte genotype. Den jordanske undersøgelse omfattede kun syv patienter med svær kronisk parodontitis, mens resten havde en let til moderat form for kronisk parodontitis. Dette må kunne antages som en mulig grund til, at sammenhængen ikke kunne findes i dette studie. Forskerne bag den jordanske undersøgelse kommer endvidere selv med forslag til, hvorledes deres resultater bedre kan stemme overens med Kornmans resultater, hvilket for læseren giver anledning til det indtryk, at forskningen søger et fælles resultat indenfor IL-1 klusteret (34). Generelt bygger Side 15 af 30

16 denne undersøgelse på en meget lille prøvestørrelse med en mulig stor heterogenicitet, grundet forskellige etniciteter i den jordanske befolkning, hvilket gør, at repræsentativiteten af studiet kan vurderes som tvivlsom. Flere undersøgelser indenfor IL-1A og IL-1B polymorfier er udført på andre etniske grupper. Et studie fra 2011 undersøgte sammenhængen mellem IL-1A og IL-1B polymorfier og kronisk parodontitis på en indisk befolkningsgruppe. Undersøgelsen viste, at 31% af individerne med kronisk parodontitis havde den kompositte genotype med allel 2 fra begge polymorfier. Desuden viste det sig også, at 38% af kontrolgruppen, dvs. individer uden parodontal sygdom, ligeledes havde den kompositte genotype. Undersøgelsen måtte derfor konkludere, at den kompositte genotype ikke kunne opfattes som en risikofaktor for udviklingen af kronisk parodontitis. Undersøgelsen viste dog, at frekvensen af den kompositte genotype i den indiske forsøgsgruppe var lig frekvensen hos den kaukasiske race (Kornman). Dette viser tydeligt, at sammenhængen mellem miljøfaktorer og race har stor betydning for, om en disponerende genotype bliver udtrykt i fænotypen (32). En betydelig problematik ved dette studie er den relativt lille gruppe forsøgspersoner, undersøgelsen er lavet på. Det er i den forbindelse svært at kunne konkludere noget generelt om den indiske befolkning, når så lille en andel af befolkningen er repræsenteret. En andet studie fra 2012, omhandler en iransk gruppe i en alder fra år. Her undersøgte man sammenhængen mellem IL-B gen-polymorfier og generaliseret aggressiv parodontitis. Undersøgelsen omhandlede blot 26 individer med generaliseret aggressiv parodontitis og 25 raske individer. Resultaterne viste en positiv sammenhæng mellem den undersøgte genotype og udviklingen af marginal parodontitis. Det blev derfor konkluderet, at denne polymorfi øgede risikoen for at udvikle generaliseret aggressiv parodontitis hos individer i den iranske befolkning. Igen beskrives der i artiklen, at en ny undersøgelse, omfattende en større del af den iranske befolkning, kræves, for at påstanden kan valideres. Selve konklusionen læner sig op af tidligere studier, og man kan derfor diskutere, hvorvidt de ville være kommet frem til de samme konklusioner, blot ud fra deres egne resultater. (33) Som vist, er der mange undersøgelser, der indikerer, at der forekommer en variation hos forskellige etniciteter. Indenfor samme befolkningsgruppe forekommer der ligeledes variationer, hvad angår resultaterne for sammenhængen mellem IL-1 polymorfierne og progressionen af marginal parodontitis. Vi har kigget på en anden undersøgelse fra Indien, der udforsker sammenhængen mellem IL- 1A og IL-1B polymorfierne og udviklingen af kronisk parodontitis. Her fandt man frem til, at frekvensen af de to polymorfier var betydeligt højere hos de individer med svær grad af Side 16 af 30

17 kronisk parodontitis, i forhold til de raske individer. Prævalensen for den kompositte genotype var for undersøgelsen på 16,66%, hvilket er lavere end den prævalens på 29,1%, som Kornman fandt i sin undersøgelse (35). I lighed med mange andre undersøgelser spiller det en stor rolle for de fundne resultater, at prøvestørrelsen er for lille til at kunne repræsentere en hel befolkning, hvilket nemt kan medføre modstridende resultater, således som vi også har set det med de to studier i den indiske befolkning (35,32). Efterfølgende er der gennemført flere meta-analyser, som prøver at samle stof til en fælles konklusion vedrørende de mange studier af IL-1A og IL-1B. Den følgende artikel repræsenterer en sådan meta-analyse fra Artiklen fokuserer på spørgsmålet: Er specifikke IL-1 gen variationer associeret med kronisk parodontitis eller progressionen af parodontitis i hvide voksne? For at undersøge dette, opstilles forskellige kriterier, som skal være opfyldt, for at et givent studie kan medinddrages. Dette resulterede i 27 brugbare studier. 19 af studierne viste, at der var en sammenhæng mellem IL-1A -889 og IL-1B En lille andel af studierne fulgte patienter i 5-14 år og fandt også en signifikant association imellem sygdomsprogression og IL-1 haplotypen. Otte studier viste, at IL-1 haplotypen ingen effekt havde. De fleste af studierne var meget små (<200), hvilket artiklen også bearbejder som en signifikant fejlkilde. Ud af de 27 studier, havde kun seks studier en prøvestørrelse på >200, mens kun én af disse seks undersøgelser, havde en størrelse på >1000. Dette spiller en væsentlig rolle, når resultaterne af studierne skal vurderes. Ved undersøgelser med prøvestørrelser på >100 fandt man en frekvens af den kompositte genotype på mellem 26-44%, hvilket stemmer overens med det, der originalt er rapporteret for hvide (Kornman 1997). Meta-analysen tager selv problemet op om fejlkilder. Forskellige prøvestørrelser, heterogenitet i befolkningen og forskellige etniciteter, er tre reelle bud, som alle kan være medvirkende til de meget modstridende og til tider lidt uklare resultater, der er fundet omkring IL-1 genpolymorfier i sammenhæng med sværhedsgraden af marginal parodontitis. I artiklen redegøres der for forslag til, hvad vi i fremtiden skal være opmærksomme på, når der undersøges sammenhænge med genpolymorfier (44): 1) Fremtidige studier skal kunne validere alle deres informationer. 2) Studierne skal fokusere på en specifik fænotype for marginal parodontitis, f.eks. progressionen af kronisk parodontitis i den voksne befolkning. Den kliniske fænotype skal endvidere beskrives i detaljer, så dette tillader sammenligning på tværs af studier. Side 17 af 30

18 3) Rygning, niveau af bakteriel plak, systemiske sygdomme og brugen af medikamenter af betydning for parodontal sygdom, skal beskrives i detaljer og inkorporeres i analysen. En tilpas størrelse af populationen skal evalueres, for at disse faktorer kan fortolkes korrekt. 4) Fremtidige studier, som er tilstrækkelige med henblik på allel-frekvenser, bør evaluere rollen af IL-1 genetiske faktorer i ikke-hvide populationer. 5) Studier, som omhandler IL-1's genetiske effekter i marginal parodontitis, skal levere en viden om strukturen af haplotypen og funktionelle genvarianter i IL-1 genklusteret (44). I artiklen konkluderes, at der ses en statistisk signifikant association mellem IL-1 genvariationer og sværhedsgraden og progressionen af marginal parodontitis. Der konkluderes derfor, at hvis man har haplotypen, indikerer dette en forøget risiko for kronisk parodontitis i den hvide befolkning (44). Denne meta-analyse tager højde for mange af de problemer, man har fundet indenfor undersøgelser af IL-1 genpolymorfier. Hovedpunkter og konklusioner underbygges i artiklen med god evidens, da alle de anvendte artikler til analysen er nøje udvalgt via relevante inklusions- og eksklusionskriterier. Artiklen giver derfor et realistisk bud på en overordnet opsamling af de resultater, der er fundet over længere tid. Selvom der godt kan konkluderes, at der ses en sammenhæng mellem haplotype og sygdomsprogression i den hvide befolkning, kan dette kun anses som en risikofaktor. Det kan ikke antages, at tilstedeværelsen af den kompositte genotype vil føre til den samme fænotype i alle individer. Som før beskrevet, ses det, at alle de artikler, vi har beskæftiget os med, omhandlende IL-1, har anvendt en prøvestørrelse, der ikke har været stor nok til, at studiet har kunnet generaliseres til en hel befolkning. De forskellige artikler viser også, at etnicitet spiller en rolle for, om genotypen medfører sygdom. De mange modstridende resultater, opnået hos forskellige befolkningsgrupper, må altså forventes at kunne forklares ud fra de beskrevne fejlkilder. Artiklerne viser også, hvor kompleks en sygdom marginal parodontitis er, idet både miljø og individets arv spiller en stor rolle i udviklingen af sygdommen. Interleukin- 6 polymorfi I gruppen af interleukiner findes det immunregulatoriske interleukin-6, med både pro- og antiinflammatoriske egenskaber. Under bakteriæmi, forårsaget af forudgående depuration hos parodontitispatienter, menes indholdet af cytokiner i plasma at blive forhøjet. Dette er blevet undersøgt i et studie fra 2006 omhandlende danske parodontitispatienter. Her fandt man, at plasmaniveauet af IL- Side 18 af 30

19 6 var øget op til 8 timer efter bakteriæmiens opståen. Translokationen af bakterier fra den parodontale poche, kan muligvis føre til et systemisk inflammatorisk respons (1). Det har endvidere været undersøgt, hvorvidt IL-6 kunne spille en rolle i udviklingen af marginal parodontitis. En meta-analyse samler resultatet af syv forskellige studier omhandlende bærere af en IL-6 G (-174) C polymorfi og denne gruppes risiko for udvikling af kronisk parodontitis. De fandt ingen signifikant risiko forbundet med denne polymorfi (19). Interleukin- 10 polymorfi Interleukin-10, IL-10, er endnu et immunregulatorisk cytokin, der ligeledes må anses for at være involveret i inflammatorisk betingede sygdomme som marginal parodontitis, idet cytokinet med dets virkning har en inflammationsmodificerende rolle (15, 5). Den egentlige virkning kan inddeles i en nedregulering af monocytproducerede proinflammatoriske cytokiner, som f.eks. IL-1α, samt en stimulering af antistofproduktion med en beskyttende effekt (17). Det gen, som koder for IL-10, er lokaliseret til kromosom 1q Der er beskrevet tre forskellige SNP'er i promotorregionen, som menes at kunne influere på ekspressionen og dermed sekretionen af IL-10. Disse SNP'er er lokaliseret til positionerne: med en G/A substitution, -819 med C/T substitution og -592 med C/A substitution (18). I 2001 undersøgte et japansk studie den mulige association mellem de tre IL-10 promotorpolymorfier og en udvidet form for kronisk inflammatorisk parodontal sygdom. Der fandtes ingen signifikant forskel på patient- og kontrolgruppen, hvad angår sammenhængen mellem polymorfier og udvikling af kronisk parodontitis. Der fandtes dog en betydelig forskel i frekvenser af de specifikke haplotyper hos den japanske befolkning, sammenlignet med den kaukasiske befolkning (17). Hvorvidt den etniske forskel er af afgørende betydning, når det gælder sygdomstilbøjelighed på baggrund af disse polymorfier, kan anskueliggøres ved sammenhold af nyere studier på kaukasiske befolkningsgrupper. I et longitudinelt studie med 252 australske voksne omhandlende kronisk parodontitis, fandt man en sammenhæng mellem personer med haplotypen ATA/ACC eller ACC/ACC i genet kodende for IL- 10 og en reduceret sygdomsprogression. I denne undersøgelse viste der sig omkring 20% færre pochedybder 4mm sammenlignet med individer uden denne genotype, men som i stedet havde ATA/ATA polymorfien, og det blev heraf konkluderet, at genotypen for IL-10 måtte have en indflydelse på progressionen af parodontal sygdom (15). Side 19 af 30

20 Et andet studie viste en sammenhæng mellem tilstedeværelsen af omtalte polymorfier og udviklingen af både kroniske og aggressive former for marginal parodontitis. Her fremgik det, at haplotypen ATA/ACC havde en signifikant sammenhæng med en reduceret risiko for kronisk parodontitis, samtidig med at ATA/ATA associeres med en øget tilbøjelighed for aggressiv parodontitis (18). I et nyere, større studie om IL-10- og ANRIL-genets association med marginal parodontitis, har man undersøgt forskellige befolkningsgrupper, forskellige gener, samt associationen med både kronisk og aggressiv parodontitis. Treogtyve gener blev analyseret i en to trins case-kontrol associationsanalyse. I det første trin blev 600 tyske patienter med aggressiv parodontitis undersøgt, sammenholdt med en kontrolgruppe på 1448 tyske individer. Her fandt man en association med en variant af IL-10 genet. For at replicere associationen med dette gen, undersøgte man 164 hollandske patienter med aggressiv parodontitis for samme association. Her fandt man samme signifikante sammenhæng, som man havde fundet hos de tyske patienter. Studiet blev gentaget hos en ny gruppe af patienter med aggressiv parodontitis (105 syge, 482 raske) med tysk og østrigsk oprindelse. Ingen association blev fundet i dette studie. Herefter blev associationen yderligere undersøgt på tyske individer med kronisk parodontitis, med det formål at konstatere, om den samme association kunne findes ved kronisk parodontitis. Dette studie fandt ingen speciel indikation for en sammenhæng mellem IL-10 polymorfi og kronisk eller aggressiv parodontitis. Dog fremkom der en association mellem ANRIL-genet, som vi ikke vil komme nærmere ind på. Artiklen er baseret på et studie foretaget på en stor forsøgsgruppe. Dette giver os en god indikation på, at konklusionen er sandsynlig. I artiklen beskrives dog også mulige fejlkilder, som kan give ophav til det negative resultat. Her kan nævnes en mulig begrænsning af studiets statistical power, hvilket kan føre til, at associationer er blevet overset. Dette argumenteres der imidlertid imod, idet studiet netop har øget den statistical power ved at anvende personer med tidlig debut af sygdom, og med en stærk fænotype. Generelt kan sværhedsgraden og alder for debut af sygdom være en god indikation for tilstedeværelsen af en bestemt genotype. I sammenhæng med dette kan de falsk negative resultater i dette studie ikke forklare den manglende association, da dette studie har anvendt patienter med en svær grad af sygdom og tidlig debutalder. Yderligere er undersøgelsen gennemført på en større forsøgsgruppe end i tidligere forsøg. En anden vigtig underbyggende faktor for troværdigheden er, at studiet er baseret på individer, som etnisk set er homogene og fuldstændig sammenlignelige med individerne i kontrolgruppen. En anden mulighed for et falsk negativt resultat kunne være, at studiet er baseret på en befolkningsgruppe, hvor højrisiko varianter ikke findes. Side 20 af 30

21 Dette studie er dermed et eksempel på, hvordan forsigtighed i forståelsen af genetiske associationer er vigtig, og der kræves yderligere validering, når der rapporteres om genetiske risikofaktorer (14). Interleukin- 17 polymorfi Interleukin-17, IL-17, er et cytokin, der spiller en rolle i rekrutteringen af neutrofile granoulocytter og frigivelsen af inflammatoriske mediatorer. IL-17 dannes og frigives af specialiserede CD4+ T- celler kaldet Th-17. Disse anses for at være proinflammatoriske celler, netop pga. produktionen af IL-17A og IL-17F cytokinerne. Th-17 og IL-17 er fundet i sammenhæng med en række autoimmune og inflammatoriske sygdomme, såsom reumatoid arthritis, inflammatoriske tarmsygdomme og ikke mindst i parodontale sygdomme. I sidstnævnte har man specielt fundet en sammenhæng mellem koncentrationen af IL-17 og den kroniske parodontitis. Hos patienter med kronisk parodontitis fandtes en øget koncentration af IL-17 i det gingivale eksudat, men selve mekanismerne herfor er endnu ukendt (20). Der er endvidere fundet forhøjede koncentrationer af IL-17 generelt i de væv, hvor der sker knogleresorption (21). Allel-variationer i gener, kodende for cytokiner, medfører ofte en enten højere eller lavere produktion af disse molekyler (22), og det er derfor en relevant tanke, at polymorfi af IL-17-genet kan være årsag til den øgede koncentration under reumatoid arthritis, inflammatoriske tarmsygdomme og kronisk parodontitis. I en norsk undersøgelse fra 2008 blev den eleverede mængde af IL-17 i de inflammerede led ved reumatoid arthritis sat i fokus. Her undersøgtes 5 SNP'er, hvor en moderat sammenhæng mellem IL-17A G197A og den høje koncentration af IL-17 i de inflammerede led hos de norske patienter blev fundet (23). I en brasiliansk undersøgelse fra 2012 var formålet at undersøge de polymorfier, som tidligere var blevet associeret med enten autoimmune eller inflammatoriske sygdomme, set i forhold til kronisk parodontitis. Helt konkret udtog man gingivale vævsprøver fra 30 brasilianske patienter med kronisk parodontitis. Dette blev gjort med henblik på, at undersøge sammenhængen mellem IL-17A G197A og IL-17F C7488T polymorfier og kronisk parodontitis. De 30 patienter, som undersøgelsen omhandlede, blev udvalgt med henblik på en fælles klinisk sygdomsudvikling. Eksklusionskriterierne indebar bl.a. brug af antibiotika eller anti-inflammatoriske midler indenfor en periode på et halvt år, eller ved forekomst af aggressiv parodontitis. Side 21 af 30

22 Derudover anvendte man en kontrolgruppe bestående af 30 raske individer med sunde parodontale forhold, der var køns- og alderssvarende til gruppen med kronisk parodontitis. Deltagerne blev ikke inddelt efter etnicitet og race pga. den betydelige raceblanding i den brasilianske befolkning. Via ELISA måltes koncentrationerne af IL-17A i vævsprøverne, og ved DNA-analyse af blodprøver fra de 60 deltagere udførtes genotypeanalyser. Resultaterne viste, som forventet, en forøget koncentration af IL-17 i de parodontale væv hos individerne med kronisk parodontitis i forhold til kontrolgruppen. Niveauet af IL-17A og IL-17F var begge eleveret i vævsprøverne, men kun IL-17A havde en højere koncentration i serumprøverne. Derudover viste det sig, at frekvensen af genotypen IL- 17A G197A hos patienterne med kronisk parodontitis afveg fra frekvensen hos de raske individer. Hos raske individer var frekvenserne for IL-17A polymorfien GG=59,26%, GA=14,81%, AA=25,92%, mens frekvenserne hos individerne med kronisk parodontitis var hhv. GG=20%, GA= 30% og AA=50%. Undersøgelsen kunne derfor, som den første, vise en sammenhæng mellem polymorfi af IL-17A genet, specielt SNP'en, der involverer allel A, og kliniske og inflammatoriske parametre i parodontal sygdom. Der fandtes, som nævnt, en eleveret koncentration af IL-17A i serum og væv hos de allel A-bærende individer med kronisk parodontitis (20). IL-17's rolle i udviklingen af parodontal sygdom er et relativt nyt interessefelt. Der er derfor ikke foretaget mange undersøgelser endnu, som kan påvise sammenhæng mellem IL-17 polymorfier og udviklingen af marginal parodontitis, og om denne evt. er afhængig af førnævnte faktorer, såsom etnicitet. Undersøgelser som denne over en brasiliansk befolkningsgruppe på blot 60 personer, kræver derfor supplement fra flere eller blot større undersøgelser. Receptor- ligandbinding Fcγ- receptor polymorfi Fcγ-receptorer er overfladeproteiner på vigtige immunrelaterede celler, heriblandt B-lymfocytter, dendritiske celler, NK-celler, makrofager, neutrofile granulocytter og mastceller. Strukturen af et antistof udgøres af en varierende Fab-del og en konstant Fc-del. Fab-delen er et domæne, der kan binde inficerede celler eller patogener, mens Fc-delen kobles til Fc-receptorer. Karakteristisk for Fcγ-receptorer er deres affinitet til antistoffet immunoglobulin G (IgG). Dette antistof udgør 75-80% af immunoglobulinerne i plasma, og er derfor den mest dominerende type (37). Side 22 af 30

23 Fcγ-receptorerne underinddeles i tre grupper ud fra deres affinitet overfor Fc-delen af immunoglobulin G (IgG). Type I (FcγRIa og b) har en høj affinitet, mens type II (FcγRIIb og c) og III (FcγRIIIa og b) har en lav affinitet (38). FcγRIIIa har en medium affinitet. FcγR/IgG-komplekset udgør bindeleddet mellem den humorale og cellulære del af immunforsvaret, hvilket er interessant i forbindelse med modtagelighed overfor parodontal sygdom. IgG fungerer som en opsonin ved at fremme fagocytering af patogenet enten direkte eller indirekte. Den direkte eliminering sker ved koblingen mellem IgG og en Fcγ-receptor på overfladen af en fagocyterende celle. Den indirekte eliminering sker ved kobling mellem IgG og en Fcγ-receptor på en antigenpræsenterende celle, hvilket medfører en aktivering af cytotoksiske T-celler og NK-celler (38). Funktionelle bi-alleliske polymorfier er blevet identificeret på forskellige Fcγ-receptorer med lav affinitet for IgG, heriblandt FcγRIIa og FcγRIIIb. Undersøgelser viser, at en substitution af arginin til histidin på lokalisation 131 (R131H) i genet kodende for FcγRIIa hos neutrofile granulocytter, vil influere mærkbart på dens affinitet for IgG. Dette skyldes, at Fcγ-receptorer med genotypen histidin frem for arginin binder mere effektivt til IgG, hvilket resulterer i en tre gange så høj rate af fagocytering og en syv gange så høj baktericid aktivitet (38, 39). Endvidere findes der to allotyper for FcγRIIIb på neutrofile granulocytter, herunder neutrofil antigen 1 (NA1) og 2 (NA2). Der er dokumenteret betydeligt lavere IgG-medieret fagocytoseaktivitet for individer med NA2/NA2 genotyper end NA1/NA1. Dette er fundet i et studie udført på en brasiliansk forsøgsgruppe. NA2/NA2 genotypen fandtes med en meget højere frekvens hos gruppen med aggressiv parodontitis, end hos den sunde kontrol gruppe. Andre studier på andre befolkningsgrupper har vist samme association, mens der ligeledes kan findes studier som ikke kunne påvise denne association. Da prævalensen af Fcγ-genotyper varierer mellem grupper med forskellig etnisk baggrund, er det svært at sammenligne forskellige studier. Prøvestørrelsen spiller igen en vigtig rolle, da denne i det brasilianske studie er lille, og derfor skal resultaterne fortolkes med forsigtighed. Det er også svært at definere typen af marginal parodontitis i den syge forsøgsgruppe, og derfor kan studier være svære at sammenligne (39). Sammenfattet betyder det, at en placering af arginin på lokalisationen 131 i FcγRIIa-genet og/eller genotypen NA2/NA2, bevirker en reduceret fagocyterende funktion. Dette nedsætter værtens barriere imod bakterieinvasionen. Til gengæld vil den indirekte nedbrydning af det parodontale væv, ved frigørelsen af toksiske substanser under fagocytose, stige (4. vej i den indirekte vævsnedbrydning). Fcγ-receptor polymorfi kan derfor have en relevant sammenhæng med udviklingen af marginal parodontitis. Side 23 af 30

24 Toll- like- receptor polymorfi Toll-like receptorer tilhører den transmembrane familie, der kaldes pattern recogniation receptors. Receptorerne udtrykkes på overfladen af celler i det innate immunsystem, hvilket giver dem evne til at genkende særlige molekylære mønstre (PAMPs) på overfladen af invaderende mikroorganismer. Således kan celler fra det innate immunsystem diskriminere imellem mikroorganismer og værtens egne celler (5). I dag kendes mindst 10 humane toll-like receptorer. Særligt toll-like receptor 2 (TLR2) og toll-like receptor 4 (TLR4) ses udtrykt på overfladen af immunforsvarets celler i det gingivale væv (41). TLR4 er særligt associeret med genkendelse af endotoksinet, lipopolysakkarid, på overfladen af Gram-negative celler, imens TLR2 er associeret med genkendelse af forskellige overfladevarianter, så som peptidoglykaner og lipoproteiner (42). Der forekommer to almindelige polymorfier af TLR2, hvor der hhv. ses en substitution af arginin til glutamin på lokalisation 753 (Arg753Gln) og en substitution af arginin til tryptofan på lokalisation 677 (Arg677Trp). Ligeledes findes der to polymorfier på genet kodende for TLR4, hhv. en substitution af asparginsyre til glycin på lokalisation 299 (Asp299Gly), og theronin til isoleucin på lokalisation 399 (Thr399Ile) (42). Polymorfi i disse loci kan påvirke udseendet af toll-like receptorens ekstracellulære domæne, hvilket kan bevirke en ringere affinitet til PAMPs og derved en reduceret inflammationsrespons. I et studie foretaget på 245 forsøgspersoner med tyrkisk herkomst undersøgtes, om der forekom en sammenhæng mellem genpolymorfierne og udviklingen af generaliseret aggressiv parodontitis. Man foretog blodprøver på 90 patienter med generaliseret aggressiv parodontitis, og på 155 personer med sunde parodontale forhold. Ved hjælp af PCR blev de pågældende loci med polymorfi på henholdsvis TLR2 og TLR4 analyseret. Resultaterne viste ingen signifikant forskel mellem fordelingen af TLR2 og TLR4 genotyperne, samt frekvensen af alleler, mellem forsøgspersoner med generaliseret aggressiv parodontitis og forsøgspersoner med sunde parodontale forhold. Der er dog ikke fundet andre forsøg med den tyrkiske befolkning, som kan understøtte dette studies fund. I et tysk studie blev TLR2 allelen undersøgt, og der blev heller ikke fundet nogen statistisk forskel mellem kontrolgruppen og patienter med kronisk parodontitis. Frekvensen af den undersøgte allel i det tyrkiske studie stemmer godt overens med den frekvens, der er blevet fundet i forsøg med hvide individer. Dog er studiet ikke i stand til, at kunne påvise, at der er denne mangel på association mellem TLR2 og TLR4 og patienter med aggressiv parodontitis. Årsagen er, at studiet ikke havde evidens nok, og derfor kunne komme med falsk negative resultater (42). Vi kan igen henvise til den lille prøvestørrelse som en forklaring på dette. Side 24 af 30

25 Konklusion Siden 1991 har tvillingestudiet gjort det klart, at genetikken spiller en rolle ved udviklingen af marginal parodontitis (6). Efter dette fund steg interessen for det genetiske aspekt. Dette har ført talrige undersøgelser, involverende genetiske polymorfier for immunologiske faktorer, receptorer, samt kolonisering af specifikke mikroorganismer, med sig. Med hensyn til det genetiske aspekt i koloniseringen af specifikke mikroorganismer, har vi fokuseret på bakterien A.a. Undersøgelser fandt en association mellem koloniseringen af en specifik klon af A.a, JP2-klonen, og udviklingen af lokaliseret aggressiv parodontitis. Det er anerkendt, at denne association i høj grad kan tilskrives genetiske forhold (26,5). Dog er det stadig ukendt i dag, hvilke genetiske forhold, der gør, at kun individer fra specifikke geografiske områder koloniseres med denne klon (43). Af genetiske polymorfier for inflammatoriske faktorer, er IL-1 genklusteret et af de mest undersøgte til dags dato. Her har man fundet association mellem sværhedsgraden af marginal parodontitis og polymorfierne IL-1A -889 og IL-1B (31,44), samt en association mellem tilstedeværelsen af kronisk parodontitis og polymorfierne IL-1A og IL-1B (33,35). For begge positive associationer ses modstridende resultater (36, 34, 32). Gener kodende for andre interleukiner, hhv. IL-6, IL-10 og IL-17, viser ligeledes modstridende resultater. Studier over polymorfi af IL-6 kunne ikke vise association med udvikling af marginal parodontitis (19). Studier over IL-10 finder frem til modstridende resultater (15,18,14), mens en undersøgelse over IL-17 polymorfi viser en association (20). Opsummerende er der modstridende indikationer på, hvor meget betydningen af polymorfi af gener kodende for cytokiner, kan tilskrives det genetiske aspekt i udviklingen af marginal parodontitis. Vores sidste fokuspunkt var overordnet receptor-ligandbinding. Studier om Fcγ-receptorer viste, at affiniteten for IgG var ændret ved specifikke genpolymorfier (38,39). Dette kan medføre et modificeret værtsforsvar mod indtrængende bakterier. Studier over toll-like-receptorer viste ingen association mellem polymorfi og marginal parodontitis (42). Vi konkluderer, at årsagen til modstridende resultater i genetiske associationsstudier er multifaktoriel. Blandt andet er studier, der er lavet på forskellige etniske populationer, meget svære at sammenligne. Dette skyldes store variationer af gener i individer med forskellig etnisk baggrund. Vi ved, at rygning er en vigtig determinant for udviklingen af marginal parodontitis. Derfor spiller det en rolle ved undersøgelserne, om individerne har været opdelt i ikke-rygere og rygere. Side 25 af 30

26 En anden vigtig faktor, der beskrives i de fleste artikler som værende en signifikant grund til de mange modstridende fund, er, at det er meget forskelligt i hvert enkelt studie, hvordan kronisk og aggressiv parodontitis defineres. F.eks. vil de individer, der i et studie diagnosticeres med aggressiv parodontitis, i andre studier diagnosticeres med en svær grad af kronisk parodontitis. Dette vanskeliggør sammenligningen af forskellige studier. Desuden er et gennemgående problem, at mange af studierne kræver validitet fra en undersøgelse på en større gruppe individer. Vi mener derfor, at de meget små prøvestørrelser, spiller en signifikant rolle i fremkomsten af de mange modstridende resultater. De cytokiner og receptorforbindelser, som vi i opgaven har valgt at beskæftige os med, spiller alle en essentiel rolle i værtsforsvaret mod patogener. Rent teoretisk vil ændringer i ekspressionen af disse gener, i form af polymorfi, føre til et modificeret immunrespons. Hvorfor dette ikke er tilfældet, når man i undersøgelser finder en fraværende association med sygdomsprogression af marginal parodontitis, må skyldes, at organismen selv kompenserer for den genetiske ændring. Marginal parodontitis er en multifaktoriel, kompleks sygdom, og vi må konkludere, at genetiske studier har svært ved at kortlægge en specifik genetisk faktor som årsag til udvikling af sygdom. Vi må derfor erkende, at genpolymorfier kun kan fortælle om en mulig risiko for udviklingen af marginal parodontitis, da alle individer reagerer, trods evt. samme genotype, med et forskelligt immunrespons på bakterieakkumulering. Side 26 af 30

27 Abstract Periodontitis is a multi-causal disease. The microbial composition in the plaque and the hosts own immune defense plays a major role in the destruction of tissue seen in periodontitis. Studies throughout the last 40 years have brought attention towards the genetic aspects of the progression of periodontitis. The colonization of A.a serotype b in individuals with North- and Northwest African origin indicates that the genetic difference among ethnicities can be a risk factor towards the development of periodontitis. It is also known that cytokines (interleukins), toll-like-receptors and Fcγreceptors plays a significant role in the tissue destruction that occurs in Periodontitis. The cytokines and the receptors are a part of the hosts own immune response. As previously mentioned gene polymorphisms that codes for the factors can play a big part in the terms of developing periodontitis. Multiple studies concludes that there is an association between a specific gene polymorphism and the risk of developing periodontitis. Though it is important to be careful in interpretation of these studies, because of the many conflicting results found in different populations and different sample sizes. Our report clarifies that when an association between a specific polymorphism and illness progression has been made, it can only be seen as a risk factor in developing periodontitis. Our final conclusion must be, that even though many studies have been carried out, and associations have been found, conflicting results have also appeared, and the presence of a certain composite genotype will not lead to the development of periodontitis in all individuals. Side 27 af 30

28 Litteratur Metode: MeSH søgning: Periodontitis, Chronic periodontitis, Genetics, Immunology. MeSH søgning: Periodontitis, Aggressive periodontitis, Genetics, Immunology. (1) Forner L, Neilson CH, Bendtzen K, Larsen T, Holmstrup P. Increased plasma levels of IL-6 in bacteremic periodontitis patients after scaling. J Clin Periodontol 2006; 33: (2) Anne Havemose - Poulsen. Behandling af aggressiv marginal parodontitis. Tandlægebladet 2011; 115 nr. 10: (3) Andreas Stavropaulos, Palle Holmstrup, Eva Karring, Anne- Havemose Poulsen. Parodontale sygdommes klassifikation. Tandlægebladet 2011; 115 nr. 9: (4) Palle Holmstrup, Jesper Reinholdt, Anne Havemose. Aspekter af marginal parodontitis patogenese. Tandlægebladet 2011; 115 nr. 9: (5) Jan Lindhe. Clinical periodontology and implant denistry. Blackwell Munksgaard 2008; 1, 5. edition: 216, , 296, 289, , , 339. (6) Michalowicz Bryan S. et al. Evidence of a Substantial Genetic Basis for Risk of Adult Periodontitis. J. Periodontol 2000; 71: (8) Brett, P. M., Zygogianni, P., Griffiths, G. S., Tomaz, M., Parkar, M., D Aiuto, F. & Tonet- ti, M. Functional gene polymorphisms in aggressive and chronic periodontitis. Journal of Dental Research 84; 2005: (9) D.F. Kinane, T.C. Hart. Genes and gene polymorphisms associated with periodontal disease. CROBM november 2003; 14 nr. 6: (10) Chai L, Song Y-Q, Leung WK. Genetic polymorphism studies in periodontitis and Fcγ- receptors. J Periodont RES 2012; 47: (11) Löe H, Anerud A Boysen H, Morrison E. Natural history of Perodontal diease in man: Rapid, moderate and no loss of attachment in Sri Lankan laborers 14 to 46 years of age". Journal Clinic Periodontal 1986 May; 13. (12) Hua- Hong Chien, Thomas C. Hart. Do X-linked diseases affect periodontal health?. Periodontology 2000; 61: (14) Schaefer AS., Bochenek G., Manke T, Nothnagel M, Graetz C, Thien A, Jockel- Scneider Y, Harks I, Staufenbiel I, Wijmenga C, Eberhard J, Guzeldemir- Acakanat E, Cine N, Folwaczny M, Noack B, Meyle J, Eickholz P, Trombelli L, Scapoli C, Nohutcu R, Bruckmann C, Doerfor C, Jepsen S, Loos BG, Schreiber S. Validation of reported genetic risk factors for periodontitis in a large-scale replication study. J Clin Periodontoligy 2013; 40: Side 28 af 30

29 (15) Cullinan MP, Westerman B, Hamlet SM, Palmer JE, Faddy MJ, Seymour GJ, Middleton PG, Taylor JJ. Progression of periodontal disease and interleukin-10 gene polymor- phism. J Periodontal Res 2008;43: (17) Yamazaki K, Tabeta K, Nakajima T, Ohsawa Y, Ueki K, Itoh H, Yoshie H. Interleukin-10 gene promoter polymorphism in Japanese patients with adult and early-onset periodontitis. J Clin Periodontol 2001; 28: (18) Hu KF, Huang KC, Ho YP, Lin YC, Ho KY, Wu YM, Yang YH, Tsai CC. Interleukin-10 (-592 C A) and interleu- kin-12b ( A C) gene polymorphisms and the interleukin-10 ATA haplotype are associated with perio- dontitis in a Taiwanese population. J Periodontal Res 2009; 44: (19) Ayala Stabholz, W. Aubrey Soskolne & Lior Shapira. Genetic and environmental risk factors for chronic periodontitis and aggressive periodontitis. Periodontology 2000; 53: 2010, (20) Jôice Dias Corrêa et al. Association between Polymorphisms in Interleukin-17A and -17F Genes and Chronic Periodontal Disease. Mediators of Inflammation, Volume 2012 (2012), Article ID (21) Kadkhodazadeh M, Ebadian AR, Amid R, Youssefi N, Mehdizadeh AR. IL-17 gene polymorphism is associated with chronic periodontitis and peri-implantitis in Iranian patients: a cross-sectional study. Immunological investigations 2013; 42: (22) M. L. Laine, W. Crielaard, and B. G. Loos. Genetic susceptibility to periodontitis. Periodontology ; 58 nr. 1: (23) G. B. N. Nordang, M. K. Viken, J. E. Hollis-moffatt et al.. Association analysis of the interleukin 17A gene in Caucasian rheumatoid arthritis patients from Norway and New Zealand. Rheumatology 2009; 48 nr. 4: (24) Dahlén, Gunnar Dahlgren, Ulf Fiehn, Nils-Erik Olsen, Ingar. Oral Microbiology and Immunology. 2012;1:99: (25) Lynn B. Jorde, John C. Carey, Michael J. Bamshad. Medical genetics. Mosby Elsevier 2010; edition: (26) Haubek, Dorte; Ennibi, Oum-Keltoum; Poulsen, Knud; Væth, Micael; Poulsen, Sven; Kilian, Mogens. Risk of Aggressive Pariodontitis in adolecent carriers of the JP2 clone of Aggregatibacter (Actinobacillus) Actinomycetemcomitans in Marocco: a prospective longitudinal cohort study. The Lancet 2008; 371: (28) Charles A. Dinarello. Overwiew over the Interleukin-1 family of ligands and receptors. Seminars in immunology November 22; (30) Nikolopoulos et. al.. Cytokine Gene Polymorphisms in Periodontal Disease; a Meta-Analysis of 53 Studies Including 4178 Cases an 4590 Controls. J Clin. Periodontol 2008; 35; (31) Kornman KS., Crane A., Wang H-Y., di Giovine FS, Newman MG, Pirk FW, Wilson Jr. TG, Higginbottom FL, Duff GW. The Interleukin- 1 Genotype as a Severity Factor in Adult Periodontal Disease. J Clin Side 29 af 30

30 Periodontol 1997; 24: (32) R. Gayathri., Abdul Vhab Saadi, K. Mahalinga Bhat, Subraya G. Bhat, Kapaettu Satyamoorthy. Allele, Genotype, and Composite Genotype Effects of IL-1A and IL-B Polymorphisms for Chronic Periodontitis in an Indian Population. Indian journal of dental research 2011; 22: 612. (33) Golnaz Ayasi, Miral Pirayesh, Kheirollah Yari. Analysis of Gene Polymorphisms and its Association With Generalized Aggressive Periodontitis Disease. DNA and Cell biology 2013; 32: (34) Jumana A. Karasneh, Khansa T. Ababneh, Anas H. Taha, Muna S. Al-Abbadi, Wer Ollier. Investeigation of The Interleukin-1 Gene Cluster Polymorphisms in Jordanian Patients With Chronic and Aggressive Periodontitis. Archives of oral biology 2011;56: (35) PM. Archana, A. Arif Salman, T. S. S. Kumar, PK. Saraswathi, KH Panishankar, P. Kumarasamy. Association Between Interleukin-1 Gene Polymorphism And Severity Of Chronic Periodontitis In a South Indian Population Group. Indian society of periodontology 2012; 16: (36) Hodge PJ, Riggio MP, Kinane FF: Failure to detect an association with IL1 genotypes in European Caucasians with generilised early onset periodontitis. J. Clin Periodontol 2001; 28: (37) Annebirthe Bo Hansen, Hans Christian Kjeldsen, Elling Ulvestad, Geir Thue. Immunoglobuliner. Lægehåndbogen: (38) Chai L, Song Y-Q, Leung WK. Genetic polymorphism studies in periodontitis and Fcc receptors. J Periodont Res 2012; 47: (39) C. de Souza, Rodrigo; V. Colombo, Ana Paula. Distribution of FcgRIIa and FcgRIIIb Genotypes in Patients With Generalized Aggressive Periodontitis. J Periodontol Juli 2006; 77 Nr. 7: (41) Gwan Gyu Song, Jae-Hoon Kim, Young Ho Lee. Toll-like receptor (TLR) and matrix metalloproteinase (MMP). Polymorphisms and periodontitis susceptibility: a meta-analysis. Mol Biol Rep. 2013; 40: (42) Gu lnur Emingil, Afig Berdeli, Haluk Baylas, Buket Han Saygan, Ali Gu rkan, Timur Ko se, and Gu l Atilla. Toll-Like Receptor 2 and 4 Gene Polymorphisms in Generalized Aggressive Periodontitis. J Periodontol 2007; 78 nr 10: (43) Haubek, Dorte. The highly leucotoxic JP2 clone of Aggregatibacter actinomycetemcomitans: evolutionary aspects. APMIS suppl Sep; 130: (44) Nadeem Y. Karimbux, Veeral M. Saraiya, Satheesh Elangovan, Veerasatpurush Allaredy, Taru Kinnunen, Kenneth S. Kornman og Gordon W. Duff. Interleukin- 1 Gene Polymorphisms and Chronic Periodontitis In Adult Whites: A Systematic Review And Meta- Analysis. J periodontol 2012 November; 83: (45) 1) Side 30 af 30