Comparison of homozygous and heterozygous erythrocytes suspensions on titration of irregular antibodies and during storage at 4 degrees for 4 weeks.

Transkript

1 Sammenligning af homozygote og heterozygote erytrocytrocytsuspensioner ved titrering af irregulære antistoffer og ved opbevaring ved 4 grader i 4 uger. Comparison of homozygous and heterozygous erythrocytes suspensions on titration of irregular antibodies and during storage at 4 degrees for 4 weeks. Udarbejdet af bioanalytikerstuderende Olivia Buchwald Studienummer: ba11s116 Samarbejde med Tharisa Rajaguru K-vejleder Grethe Birschke, klinisk bioanalytikerunderviser i Immunologisk Klinik, Sygehus Sønderjylland Åbenrå. I-vejleder Francisco Mansilla Castaño Bioanalytikeruddannelsen UCSyd Esbjerg. Bioanalytikeruddannelsen UCSyd Esbjerg Perioden: 1 oktober til 16 december 2014 Anslag: 52,933 1

2 Indhold Forord... 3 Abstrakt... 4 Introduktion... 7 Formål... 7 Mål... 8 Problemformulering... 8 Teoretisk baggrund... 8 Materialer og metode Dataindsamling Databearbejdning Resultater Diskussion Perspektivering Konklusion Referencer Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag Bilag

3 Forord Denne rapport er udarbejdet i perioden oktober til december 2014, som besvarelse af et bioanalytiker professionsbachelorprojekt. Projektet tager udgangspunkt i titrering af irregulære antistoffer, som forårsager HDFN ved anvendelsen af homozygote og heterozygote testerytrocytsuspen sioner. Professionsbachelorprojektet bliver udført i Immunologisk Klinik, Sygehus Sønderjylland Åbenrå. Jeg vil gerne takke K-vejlederen Grethe Bischke, underviser Francisco Castaño Mansilla og de ansatte på Immunologisk Klinik, Sygehus Sønderjylland Åbenrå for hjælp og vejledning under udførelsen af projektet. Olivia Buchwald 3

4 Abstrakt Baggrund I Immunologisk Klinik, Sygehus Sønderjylland i Åbenrå, udføres titrering af irregulære anti- stoffer hos gravide. I 2013 begynder klinikken et samarbejde med Klinisk Immunologisk Afdeling, Odense Universitetshospital, hvor testerytrocytsuspensioner som afdelingen anvender, bliver remplaceret for testerytrocytsuspensioner, som fremstilles i Odense. Immunologisk Klinik, Sygehus Sønderjylland i Åbenrå, har endnu ikke afprøvet, hvilke af de nuværende testerytrocytsuspensioner er de mest optimale for at påvise irregulære antistoffer som fremkalder HDFN, da anvendelse af en svag heterozygot testerytrocytsuspesion kan have indflydelse på titerværdien. Problem Det ønskes at undersøge, hvilke testerytrocytsuspensioner der vil være de mest optimale for at påvise irregulære antistoffer, som fremkalder HDFN. Desuden vil der vurderes, om opbevaring af testerytrocytterne i Cellstab i 4 uger ved 4 C har indflydelse på titreringsresultater. Materiale og metoder Der anvendes 17 forskellige plasmaprøver med 11 forskellige irregulære antistoffer. Ligeledes benyttes 13 forskellige testerytrocytsuspensioner. Ved udførelsen af mastertitrering bruges forskellige titreringstrin. Testerytrocytsuspensionerne testes ved hjælp af IAT-teknik, hvor der afpipetteres 50 ϻl antigen og 25 ϻl antistof. Aflæsningsgraduering udføres manuelt, og resultaterne gradueres fra 4+, 3 ½ +, 3+, 2 ½ +, 2+, 1 ½ +, 1+ og -. Resultater Resultaterne viser ikke forskel mellem de homozygote og de heterozygote testerytrocytsuspensioner med flest antigenrepræsenterende. Stor forskel bliver kun vist ved nogle antistoffer. Endvidere har agglutinationsstyrkerne vist sig at være næsten ens mellem de nyfremstillede- og de 4 uger gamle testerytrocytsuspensioner. Konklusion Ud fra de opnåede resultater kan der konkluderes, at der kun ses stor forskel mellem de homozygote- og de heterozygote testerytrocytsuspensioner ved nogle homozygote testerytrozytsuspensioner. Det kan også konkluderes, at testerytrocytsuspensioner sagtens kan anvendes i op til 4 uger, efter at de er blevet fremstillet. 4

5 Undertegnede bioanalytikerstuderende bekræfter herved, at besvarelsen er udfærdiget uden uretmæssig hjælp, jf Bekendtgørelse om prøver i erhvervsrettede videregående uddannelser nr af 16/ kap Dato: Underskrift: 5

6 Alloimmunisering: at danne antistoffer rettet mod fosterets erytrocytter. Kliniske signifikante antistoffer: er de antistoffer, der kan forårsage destruktion af erytrocyt- ter. 6

7 Introduktion Blodtypen bliver bestemt i forhold til de antigener, der findes på erytrocytternes cellemembraner. Patientens egne antigener aktiverer ikke immunsystemet, men når et fremmed antigen kommer ind i kredsløbet aktiverer immunsystemet sig, og antistoffer mod det fremmede antigen dannes (1). Ved hæmolytisk sygdom hos fostre og nyfødte (HDFN) sker det samme, hvor den gravide kvinde begynder at danne antistoffer (irregulære antistoffer) rettet mod et fremmed antigen (erytrocytter fra fosteret). Det første tilfælde af HDFN bliver registreret i 1609 i Frankrig, men det er først i 1950 erne, at årsagen til denne sygdom kan konstateres. I 1970`erne begynder USA og UK med en antenatal profylakse, som inkluderer screening og RhD- immunprofylakse (2). I Danmark bliver disse to indført som en del af de anbefalinger af Sundhedsstyrelsen i 2009 (16). Implementering af denne profylakse, såsom tilbud af screentest, har hjulpet med at nedsætte antallet af fostre og nyfødte med svær HDFN. På trods af det er HDFN stadig en meget farlig sygdom, som er den største årsag til døden af fostre og nyfødte (2). Derfor er bestemmelsen af antistoftypen og kvantificering af det dannede antistof (i den gravide kvinde) af klinisk betydning. Kvantifikation af de dannede antistoffer gennem titreringsanalysen kræver anvendelse af de korrekte testerytrocytsuspensioner. I Danmark anvendes heterozygot testerytrocytsuspensioner, mens der i andre lande, såsom Australien, anvendes homozygote testerytrocytsuspensioner (3). Antistoffer, som anti-d, anti-e, anti-c,anti-k, er de irregulære antistoffer, der stadig forårsager mest HDFN(4,5,6), men der findes mange andre antistoffer, som også er kliniske signifikante, og som også er potentielt farlige. Formål Immunologisk Klinik, Sygehus Sønderjylland i Åbenrå, ønsker at vide hvilke testerytrocytsus- pensioner er de rette for at påvise forskellige irregulære antistoffer ved udførelse af en titeringsanalyse, således at der opgives den korrekte titerværdi til kliniker.tidligere er der blevet anvendt afdelingens egne testerytrocytsuspensioner. Her påviste en studerende og en bioanalytikerunderviser en titerværdi, som var 2 titertrin lavere end den sande værdi på anti-fy a fra en ekstern kvalitetskontrol fra Nequas. Grunden til dette var anvendelse af en svag heterozygot testerytrocytsuspension, hvorfor denne blev udskriftet med en heterozygot testerytrocytsuspension med flest antigenrepræsenterende. I begyndelsen af 2013 begyndte afdelingen et samarbejde med Klinisk Immunologisk Afdeling, Odenses Universitetshospital, hvor der hver måned bliver leveret testerytrocytsuspensioner. Det er et problem i Immunologisk Klinik, Sygehus Sønderjylland Åbenrå, 7

8 når det endnu ikke er afprøvet om de nuværende udvalgte testerytrocytsuspensioner er de mest optimale, idet anvendelse af en svag heterozygot testerytrocytsuspension kan have indflydelse på titerværdien. Mål Målet med projektet er at undersøge, hvilke testerytrocytsuspensioner der vil være de mest optimale for at påvise irregulære antistoffer, som fremkalder HDFN ved udførelse af en titreringsanalyse. Desuden vil der vurderes, om opbevaring af testerytrocytterne i Cellstab i 4 uger ved 4 C har indflydelse på titreringsresultater. Problemformulering Hvorledes påvirkes titreringsresultaterne for de udvalgte kliniske betydningsfulde antistoffer, som kan forårsage mild til svær HDFN, når der anvendes testerytrocytsuspensioner uden at tage hensyn til antigenmængde, og når der anvendes heterozygote testerytrocytsuspensioner opbevaret i Cellstab ved 4 grader i 4 uger? Teoretisk baggrund HDFN Hæmolytisk sygdom hos fostre og nyfødte (HDFN) er en sygdomstilstand, hvor fosterets eller barnets erytrocytter hæmolyseres (destrueres) (7). Den gravides immunsystem er som regel tolerant over for fosterets blodtype, men, hvis den gravides blodtype er uforligelig med fosterets blodtype, vil den gravides immunsystem danne irregulære antistoffer rettet mod fosterets erytrocytter. Denne uforligelighed kan give anledning til anæmi, og i det værste tilfælde kan fostret død (2). Udover uforligelighed mellem den gravide og fosteret, kan dannelsen af irregulære antistoffer ske på grund af tidligere blodtransfusioner (9). 8

9 Antistofdannelsen Placenta er opbygget som en barriere mellem den gravide og fosteret. Selv om funktionen af placenta kun er at fremme overførelse af nærigstoffer og immunitet (IgG antistoffer) fra den gravide og affaldsstoffer fra fosteret, kan der ske en udveksling af erytrocytter fra fosteret til den gravide (10). Dette sker, fordi membranen i placentaen, som adskiller fosterets blod fra den gravides blod, er opbygget som en meget tynd membran (11). Denne membran kan meget let briste, og når dette sker, kan fosterets blod passere inde i det maternelle kredsløb. Da fosterets erytrocytter har et andet antigen på membranoverfladen, bliver de betragtede som fremmede antigener af gravides immunsystem. Dette giver anledning til antistofdannelse hos den gravide, rettet mod fosterets erytrocytantigener (10). Når gravides immunsystem for første gang møder fosterets erytrocytter, begynder den gravides immunsystem at danne antistoffer af klasse IgM, som derefter bliver remplaceret af antistoffer af type IgG. IgM antistoffer er højmolekylære, og derfor er det ikke muligt for dem at passere placenta (12). Dette primære antistofsvar varer fra nogle dage til nogle måneder, og dannelsen af antistoffer er ikke så kraftig. Problemet opstår ved et sekundært antistofsvar. Da den gravides immunsystem allerede har produceret memory-celler, som genkender det pågældende antigen, er denne respons meget hurtigere og kraftigere mod fosterets erytrocytter (13). Fig.1 Viser immunisering af en gravid kvinde, hvor der er uforligelighed mellem mor og barnet (14). 9

10 Blodtypeantistoffer Der findes naturligt forekomne (regulære antistoffer) og irregulære antistoffer (immune antistoffer). Regulære antistoffer dannes som respons af kroppens immunsystem ved kontakt med stoffer, der findes i miljøet. Irregulære antistoffer dannes ved blodtransfusioner, graviditet og indsprøjtning (13). Antistoffer der kan forårsage hæmolytisk sygdom hos barnet Der findes 50 forskellige antistoffer, der kan forårsage hæmolytisk sygdom hos foster og nyfødte (15). Antistoftyper, der forårsager mest HDFN, er anti-d, anti-e, anti-c og anti-k (4,5,6,9), mens tilfælde af HDFN på grund af irregulære antistoffer anti-m (4,28) og anti-s (29) er meget sjældne. Dette sker fordi, ved alloimmunisering med disse antistoffer(anti-m, anti-s) dannes næsten altid IgM immunoglobuliner. Desuden er disse immunoglobuliner betragtet som kolde antistoffer, da deres optimale temperaturer for at binde sig til antigener på erytrocytternes membranoverflade er 4 C. Derfor er anti-m og anti-s antistoffer vurderet til at være insignifikante. Alligevel er der nogle tilfælde, hvor der dannes immunoglobuliner af type IgG eller af begge typer (IgG og IgM). I det tilfælde bliver anti-m (26) og anti-s (30) antistoffer signifikante. Antistoffer, som anti-k, anti-c, anti Fy a, anti-d, anti-e, anti-jk a, anti-kp a, anti-c, anti-m, anti-s, anti-s, er de antistoffer, som detekteres mest i Immunologisk klinisk, Sygehus Sønderjylland Åbenrå, og som forårsager en mild til svær HDFN. I Danmark tilbydes alle gravide kvinder i 6. til 10. graviditetsuge en blodtypebestemmelse. Desuden tilbydes der også en screentest for irregulære antistoffer, der kan forårsage HDFN. Hvis screentest giver et positivt resultat (af den gravide), bliver fosterets og barnefaderens fænotype bestemt. Endvidere foretages der en titrering af den gravides plasma med henblik på kvantificering af det dannede irregulære antistof. Gravide kvinder, som er RhD- negative, får også et ekstra tilbud i uge 25, hvor det undersøges om de gravide har dannet irregulære antistoffer. Desuden er der i Danmark indført en RhD immunprofylakse, som tilbydes til alle de gravide, som er RhD- negative, og som har født eller bærer et barn, der er RhD-positiv, men som ikke selv har dannet anti-d. Profylaksen tilbydes til alle de RhD- negative kvinder i graviditetsuge 29, og ved fødsel (inde 48 timer), hvor de får ϻg anti-d immunoglobulin. Denne slags tilbud gælder også for alle de gravide, der aborterer mellem uge 8 og 20, og som heller ikke har dannet anti-d (16). 10

11 Koncentrationsbestemmelse af irregulære antistoffer og titerværdien Koncentrationen af irregulære antistoffer hos den gravide kan have indflydelse på udvikling af HDFN. Formålet med koncentrationsbestemmelse af irregulære antistoffer er ikke at undersøge, hvilke slags HDFN fosterets udvikler, men derimod at være sikker på, hvornår man skal begynde at monitorere den gravide. Koncentrationen af disse antistoffer kan bestemmes gennem titerværdien (17, 27). Titerværdien er den reciprokke værdi af den største fortynding, hvor antistoffet kan påvises (23). Denne værdi anvendes også for at undersøge om dannelse af disse antistoffer er steget. (17). En stigning på 3 titreringstrin eller mere betragtes som signifikant (23), men i Immunologisk Klinik, Sygehus Sønderjylland Åbenrå, anses for en stigning på 2 signifikant. Scoreværdi Ved at beregne scoreværdier, kan man undersøge antallet af reaktioner mellem antigener og antistoffer (27). Beregningen udføres ved at nummerere hver reaktionsstyrke fra titreringsresultaterne, hvorefter disse summeres. Summen af disse repræsenterer scoreværdien. Scoreværdien betragtes signifikant, når forskellen mellem 2 test giver 10 eller mere i differencen (23). Titreringsanalyse Titrerins princip er en semi-kvantitativ metode som anvendes for at bestemme koncentrationen af antistoffer i plasma, eller for at sammenligne reaktionsstyrke mellem forskellige testerytrocytsuspensioner(23). Dette udføres i en søjleagglutinationsteknik (DiaMed gelkort) igennem en indirekte antihumanglobulin teknik (IAT). Analysen er delt i 2 faser. I den første fase bliver plasma fortyndet med fosfatbufferet saltvand (PBS) i forskellige koncentrationer 12 gange. I den anden fase bliver den fortyndede plasma undersøgt for en udvalgt testerytrocytsuspension med kendt antigensammensætning ved en indirekte antihumanglobulin teknik (18). Ved titrering af et antistof med flere testerytrocytsuspensioner anbefales der at bruge en mastertitrering, da anvendelsen af større mængder antistoffer giver mere præcision end små mængder (23). Indirekte antihumanglobulin teknik (IAT) IAT er en teknik, som anvendes til identifikation af antistoffer af type IgG, hvor der anvendes lav ionstyrke saltvand. Teknikken anvendes i Immunologisk Klinik, Sygehus Sønderjylland Åbenrå, og udføres i et LISS Coombs søjleagglutinationskort. Formålet med at anvende IAT efter at der er blevet påvist irregulære antistoffer, er at kvantificere den korrekte antistofkoncentration hos den gravide. 11

12 Teknikken deles i 2: Først bliver den fortyndede plasma og den valgte erytrocytsuspension afpipetteret i gelkorten, og det inkuberes i 15 minutter. I den anden del af teknikken centrifugeres gelkorten i 10 minutter (19). Søjleagglutinationskort og centrifugation Søjleagglutinationskort anvendes for at påvise antistof/antigen reaktioner. Hver brønd indeholder gel, hvor der er bundet antihumanglobulin (AHG) til. Ved en IAT og efter erytrocytterne bindes til IgG antistoffer (første del af IAT teknik) skal søjleagglutinationskort centrifugeres. Centrifugering hjælper med at afkorte afstand mellem erytrocytterne (13). Centrifugering tillader, at AHG binder sig til de sensibiliserede erytrocytter, og derfra dannes agglutination. Under centrifugering, virker gelen som et filter hvor erytrocytter, der ikke er bundet til IgG antistoffer, passerer gelen. De agglutinerende erytrocytter tilbageholdes på toppen af gelen (betragtes som en positiv reaktion), mens de ubundne erytrocytter holdes i bunden af brønden (betragtes som en negativ reaktion) (13, 21). erytrocytter negativ gel Positiv Fig 2 viser et positiv og negativ reaktion fra et søjleagglutinationskort. Zygositet Erytrocytternes zygositet er genomisk bestemt. Der findes heterozygote og homozygote erytrocytter, hvor de homozygote erytrocytter har flere antigener på membranoverfladen, mens de heterozygote har færre. Derfor bliver de homozygote testerytrocytsuspensioner kendetegnet på grund af dosiseffekten, da disse giver kraftigere resultater end de heterozygote. (20). 12

13 Endvidere er der variation på det antal antigener, der findes i erytrocytternes cellemembran fra den ene gravid til en anden. Faktorer der har indflydelse på agglutinationsstyrke Antallet af antigener på erytrocytternes cellemembran sikrer ikke en optimal agglutination. Affinitet mellem antistoffer og antigener, temperaturen, ph, ionstyrke af fysiologisk saltvand, afstand mellem erytrocytter og forholdet mellem antigen og antistof koncentration er vigtige for at antigen og antistof kan binde sig. Affiniteten Antistofs affinitet viser, hvor godt et antistof er til at binde sig til et antigen. Affiniteten forbedres med tiden, hvor antistoffer, der dannes ved et primære antistofsvar, ikke har så høj affinitet, som dem der bliver dannet ved sekundære antistofsvar (22). Inkubation, ph og lav ionstyrke saltvand (LISS) Kliniske signifikante antistoffer er betragtet som varmeantistoffer, hvor den optimale temperatur for antigen-antistof-reaktion sker bedst ved 37 C. Erytrocytmembranen er negativ ladet, og vil i saltvandsmiljø være omgivet af en positiv sky omkring erytrocytterne. Ved at anvende LISS sænkes antallet af de frie Na + og Cl - ioner fra saltvandet. Dette hjælper med at afkorte afstanden mellem antigener og antistoffer, og dermed får antistofferne en nemmere adgang til erytrocytternes antigener. Desuden giver LISS mulighed for at sænke den normale inkubationstid mellem antigener og antistoffer fra 30 til minutter (23). En anden vigtig faktor er antigen- og antistofmængden. Ved et overskud af antigener vil der være mange antistoffer, der ikke bindes til antigener, mens der ved et overskud af antistoffer ikke vil være antigener nok, som antistoffer kan binde sig til (23). Agglutination reaktion er også påvirket af ph, hvor de fleste agglutination sker bedst mellem 6,5 og 7,5, ved undtagelse af anti-m som viser stærkere reaktionsstyrker ved ph lavere end 6,5 (13). 13

14 Ionic sky Erytrocytters ladning erytrocyt Fig 3 viser en skematisk repræsentation af ionic-sky konceptet, hvor antistofferne får en lettere adgang til antigener på erytrocytternes cellemembran. Materialer og metode Metode Dette bachelorprojekt er baseret på praktisk laboratoriearbejde og litteraturstudier. Der bliver ikke fundet nogen forskningsartikel, som handler om den samme undersøgelse, som laves her. Derfor er de anvendte originalartikler efter systematiske søgning fundet på PubMed med udgangspunkt i HDFN, og de enkelte irregulære antistoffers navne: anti-k, anti-s, anti-s, anti-d, anti-m, anti-e, anti-c, anti-c, anti- Jk a, anti-kp a og anti-fy a. Materialer Til titreringsanalysen anvendes 17 forskellige plasmaprøver: *2 anti-e (fra 2 forskellige patienter) *3 anti-k (fra 3 forskellige patienter) *1 anti-jk a *2 anti-fy a (fra 2 forskellige patienter) *1 anti- Kp a * 1 anti-c *1 anti-s *1 anti-c *3 anti-d (fra 3 forskellige patienter) *1 anti-s *1 anti-m 14

15 Apparatur ID-Incubator 37S11, DiaMed-ID, Micro typing System (for søjleagglutinationskortene) Centrifuge DiaMed-ID Micro Typing, (til centrifugering af søjleagglutinationskortene) Universal 320 Zentrifugen Hetticg (til centrifugering af plasmaprøverne) Køleskabet POKKA SBS-13893, 04 C (til opbevaring af testerytroctsuspensioner) Fryse: Sanyo ULTRA LOW SBS-17082, -80 C (til opbevaring af plasmaprøver) Lyskasse: DANUBIA Reagenser: PBS Fosfatbufferet saltvand ph 7,0 Vidalglas Finn pipette ϻl, Labsystems 4500 Transferpipetten 1ml, Sarstedet Pipetspidsen ept.i.p.s. Standard ϻl Eppendorf Tips, Eppendorf AG Finnpipette 5-50 ϻl, Thermo Electron Finnpipette ϻl, Thermo Labsystems ID-card LISS/Coombs, Lot nr / / Testerytrocytsuspensioner: Nr. 4, 6, 8, 11, 5, 10, 7, 2, 9, 3 (nyfremstillede) Nr. 3, 10, 2, 9, 4,5, 6, 8, 11, 7, opbevaret I Cellstab ved 4 C i 30 dage 15

16 Screentesterytrocytter ІІ, ІІІ, І (nyfremstillede) ІІ, ІІІ, І opbevaret i Cellstab ved 4 C i 30 dage. Dataindsamling Til forsøget bliver der udvalgt 17 forskellige plasmaprøver med forskellige irregulære antisto- ffer (kliniske antistoffer), som er fra Region Syddanmark og England. Disse prøver udvælges i forhold til de mest påviste kliniske vigtige irregulære antistoffer hos gravide kvinder i Immunologisk Klinik, Sygehus Sønderjylland Åbenrå, som kan give anledning til intrauterin transfusion. For nærmere identifikation får alle patientprøver et tal med korresponderende antistofnavn: Patient prøve nr antistof anti-c anti-d anti-d anti-d anti-e anti-e anti-c anti-k anti-k Patient prøve nr antistof anti-k anti- Fy a anti- Fy a anti-m anti-jk a anti-s anti-s Anti-Kp a Før den praktiske del af projektet udføres, undersøges hvordan mastertitreringen bliver udført i Immunologisk Klinik, Sygehus Sønderjylland Åbenrå. Dette vil hjælpe med at planlægge den praktiske del af projektet, såsom udnyttelsen af plasmaprøverne og søjleagglutinationskortene (gelkortene). Der bliver også indsamlet empiri om forskellige aflæsningsgradueringer. Dette er nødvendigt for at have en tydelig og klar beskrivelse af, hvordan man graduerer de forskellige titreringsresultater. Desuden skulle det hjælpe med at standardisere gradueringsresultaterne, så der bliver registreret med den samme fortolkning. Ud fra panelskemaet med forskellige testerytrocytsuspensioner (bilag 1, side 43) bliver der valgt forskellige homozygote og heterozygote testerytrocytsuspensioner, der har kliniske vigtige antigener, for hver plasmaprøve. 16

17 Før man begynder med de to forsøg, bliver der lavet et lille pilotprojekt for at optimere evnen til at udføre en mastertitrering især for at undgå unødvendigt spild af plasma. Her vælges antistoffet anti-d patient nr. 3 med titerværdi på 128. Problemformuleringen besvares ved at udføre en mastertitrering af plasmaprøver fra de udvalgte irregulære antistoffer. Plasmaet fortyndes i forholdene 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64; 1:128, 1:256,1:512, og derefter foretages en IAT for at undersøge titerværdien af de forskellige kliniske vigtige antistoffer. Projektet bygger på to forsøg. I det første forsøg titreres de udvalgte irregulære antistoffer med de forskellige udvalgte heterozygote testerytrocytsuspensioner, som har været opbevaret i Cellstab i 4 uger ved 4 C. Her vurderes om opbevaring af de testerytrocytsuspensioner har indflydelse på titreringsresultaterne. Ved det andet forsøg undersøges, om antigenmængden har indflydelse på titreringsresultaterne, når der anvendes nyfremstillede (dvs. fremstillet 4 dage før mastertitreringen udføres) heterozygote og homozygote testerytrocytsuspensioner. Mastertitrering af de forskellige irregulære antistoffer bliver udført af 2 bioanalytikerstuderende. Under den praktiske del af opgaven er man opmærksom på: titerværdier fra de irregulære antistoffer (bilag 2,side 44), da det bliver taget i betragtning under udførelsen af IAT, så man ikke kommer til at bruge flere end det nødvendige antal brønde i gelkortene. søjleagglutinationskortene (gelkortene) og fosfatbufferet saltvand (PBS) bliver inspiceret, før de bliver anvendt, som Transfusionsmedicinske standarder (TMS) anbefaler (16). opbevaring af testerytrocytsuspensioner ved 4 C. at tø plasma op før centrifugering. plasmaprøver centrifugeres ved 4300 g i 8 minutter, før man begynder at udføre de forskellige mastertitreringer. at fjerne fibrin fra plasmaprøverne efter centrifugering. hver bioanalytiker skal manuelt udføre aflæsninsgraduering af søjleagglutinationskortene fra den mastertitrering, som den bioanalytikerstuderende selv har udført. at følge analyseproceduren fra Qualiware it-systemet fra Immunologisk Klinik, Sygehus Sønderjylland Åbenrå, under udførelsen af mastertitreringen, hvor der er oplyst rækkefølgen af proceduren (bilag 3, side 45-46). 17

18 Ved beregning af plasmaprøven til hver mastertitrering, er man opmærksom på de antal testerytrocytsuspensioner, der skal anvendes til hvert irregulært antistof, da det er vigtigt at have nok fortyndet plasma for udførelsen af IAT. Ved afpipettering af PBS og plasmaprøven anvendes forskellige mængder (bilag 4,side 47), men man er opmærksom på, at der skal være en 1:1 koncentration ved det første glas i fortyndingsrækken. Når man er færdig med at fortynde plasmaet og med at mærke søjleagglutinationskortene, udføres der en manuel indirekte antiglobulintest (IAT). Aflæsningsgraduering af søjleagglutinationskortene udføres manuelt ifølge Qualiware itsystemet i Immunologisk Klinik, Sygehus Sønderjylland Åbenrå. Resultaterne gradueres med positiv reaktion 4 (++++), 3 ½ +++(+), 3(+++), 2 ½ ++(+), 2 (++), 1 ½ +(+), 1 +, og negativ reaktion(-) (bilag 5, side 49). Kravet for at afgive en titreringsværdi er, at der skal være mindst 2 negative reaktioner til sidst. Mastertitrering af de forskellige antistoffer Der udføres en masteritrering for hvert enkelt antistof. Titreringstrin bestemmes i forhold til det enkelte antistof titerværdi plus 3 trin. PBS og plasmaprøve (antistoffet) bestemmes efter de antal erytrocytsuspensioner, der skal anvendes i IAT til hvert enkelt antistof. Første forsøg: holdbarhed af testerytrocytsuspensioner (4 uger gamle) anti-d prøve 2,3 og 4. Til patient 4 og 3 med anti-d mærkes der 10 glas med henholdsvis 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 512. Til patient 2 med anti-d mærkes kun 5 glas fra 1:1 til 1:16 pga. antistoffets titerværdi (bilag 3,45-46). Der afpipetteres 100 ϻl PBS i glas 1:2 til 1:512 i de afmærkede glas fra patient 4 og 3, og fra 1:2 til 1:16 fra patient 2. Derefter afpipetteres 100 ϻl anti-d i glassene mærket 1:2 (fra alle 3 patienter med anti-d), og prøvematerialet resuspenderes 4 gange. Efterfølgende udføres der en halveringstitrering til sidste glas, hvor der afpipetteres 100 ϻl fra et glas til et andet. Plasmaet bliver dermed halveret i forhold til det foregående glas. 18

19 anti-e, anti-kp a, anti-s, anti-s anti-c og anti-c Til anti-e, anti-kp a, anti-s, anti-s anti-c og anti-c anvendes 100 ϻl plasma og 100 ϻl PBS. Der vælges titreringstrin fra 1:1 til 1:32 til anti-s. 1:1 til 1:512 til anti-c 1:1 til1:256 anti-e (patient 6). 1: til 1:256 til Kp a. 1:1 til 1:512 til anti-e (patient 5). 1:1 til 1:164 til anti-s. 1:1 til 1:128anti-c Glassene mærkes med de korresponderende titreringstrin fra hvert enkelt antistof. Derefter afpipetteres 100 ϻl plasma fra hvert antistof i glassene med mærket 1:2 og prøvematerialet resuspenderes 4 gange. Efterfølgende udføres der en halveringstitrering til sidste glas, hvor der afpipetteres 100 ϻl fra et glas til et andet. anti-m, anti-k, anti-fy a Til anti-m, anti-k, anti-fy a anvendes 200 ϻl plasma og 200 ϻl PBS. Der bliver valgt titreringstrin fra: 1:1 til 1:256 til anti-m, 1:1 til 1:128 til anti-k (patient 8), 1:1 til 1:256 til anti-k ( patient 9), 1:1 til 1:128 til anti-k ( patient 10), 1:1 til 1:256 til Fy a (patient 12) 1:1 til 1:512 til anti-fy a ( patient 11). Glassene mærkes med de korresponderende titreringstrin fra hvert enkelt antistof. Derefter afpipetteres 200 ϻl plasma fra hvert antistof i glassene med mærket 1:2 og prøvematerialet resuspenderes 4 gange. Efterfølgende udføres der en halveringstitrering til sidste glas, hvor der afpipetteres 200 ϻl fra et glas til et andet. anti-jk a Til anti-jk a anvendes 200 ϻl plasma og 200 ϻl PBS. Titreringstrin for anti- Jk a vælges fra 1:1 til 1:16. Glassene mærkes med de korresponderende titreringtrin. Derefter afpipetteres 200 ϻl plasma til glas med mærket 1:2 og prøvematerialet resuspenderes 4 gange. Efterfølgende udføres der en halveringstitrering til sidste glas, hvor der afpipetteres 200 ϻl fra et glas til et andet. 19

20 Til forsøg 2, hvor der undersøges om antigenmængden på erytrocytternes cellemembran har indflydelse på titerværdien, med de nyfremstillede testerytrocytsuspensioner. Til anti-e, anti-kp a, anti-s, anti-s, og anti-c anvendes 200 ϻl plasma og 200 ϻl PBS. Til anti-c anvendes 125 ϻl plasma og 125 ϻl PBS. Til anti-d anvendes 100 ϻl plasma og 100 ϻl PBS. Til Jk a bruges 200 ϻl plasma og 200 ϻl PBS. Til anti-k, anti-m og anti-fy a anvendes 200 ϻl plasma og 200 ϻl PBS. Titreringstrin til mastertitrering af de enkelte antistoffer er de samme, som der bliver valgt i det første forsøg. Fremgangsmåde er også den samme som i det første forsøg. IAT Søjleagglutinationskortene mærkes med prøvenummer, antistoftypen og brøndene mærkes med titreringstrin. Der afpipetteres 50 ϻl 0,8% Cellstab testerytrocytsuspension i hver brønd i søjleagglutinationskortene. Derefter afpipetteres 25 ϻl plasma fra titreringsrækken (det fortyndede plasma) bagfra. Søjleagglutinationskortene inkuberes i 15 min. ved 37 C. Derefter centrifugeres søjleagglutinationskortene i 10 min. Aflæsningsgraduering af agglutinationsstyrke foregår manuelt mod en lyskasse og søjleagglutinationskortene aflæses fra begge sider. Da sundhedsstyrelsen i Danmark giver tilladelse til at anvende blodkomponenter til testning (16), og patienternes navne og CPR-nr bliver ikke brugt, har dette forsøg ikke nogle etiske dilemmaer. I projektet er man opmærksom på kvalitetssikring af de forskellige procedurer og håndtering af de forskellige reagenser og apparaturer. Databearbejdning De opnåede resultater fra mastertitreringer, såsom de beregnede scoreværdier for hver enkelt antistof, bliver opsummeret i søjlediagrammerne, hvor rådata af disse forefindes i (bilag 6, side 50-54). I de forskellige søjlediagrammer kan aflæses scoreværdier på y-aksen og titerværdier på x-aksen. For hvert antistof laves et søjlediagram, hvor de graduerede titerværdier af antistoffer fra hver af de udvalgte testerytrocytsuspensioner, præsenteres ved siden af hinanden. I det tilfælde, hvor der er 2 eller 3 antistoffer af den samme type, opsummeres resultaterne af disse antistoffer i et søjlediagram. Titerværdierne aflæses ud fra skemaet graduering af agglutination i søjleteknik (bilag 5, side 49) fra Qualiware it-system fra Immunologisk Klinik, Sygehus Sønderborg Åbenrå, som viser positive reaktioner (4+, 3 ½ +, 3 +, 2 ½ +, 2 +, 1 ½ +, 1 +, 0,5 +) og negativ 20

21 reaktion (-). Scoreværdier beregnes ud fra de opnåede agglutinationsstyrker, hvor disse bliver summeret i forhold til Technical Manual (bilag 7, side 55) (23). Agglutinationsstyrke Scoreværdi Et stort bånd af agglutinerede erytrocytter klart adskilte erytrocyt-populationer, hvor den +++(+) 11 øverste population danner et diffust bånd Store agglutinater med 2 klart adskilte erytrocyt populationer Mellem til store agglutinater i hele søjlens udstrækning ++(+) 9 Mellem agglutinater i hele søjlens udstrækning Mellem til små agglutinater i hele søjlens udstrækning +(+) 7 Små agglutinater + 5 Meget få synlige agglutinater (+) 2 Ingen agglutination - 0 Resultater Ved de forskellige resultater bliver der fundet ud af, hvilke testerytrocytsuspensioner er de mest optimale for at titrere de udvalgte irregulære antistoffer. Desuden bliver der undersøgt, om de 4 uger gamle testerytrocytsuspensioner giver store variationer i resultaterne i forhold til de nyfremstillede testerytrocytsuspensioner. 21

22 scoreværdi scoreværdi Resultater af anti-k antistof Resultater af mastertitrering med 3 anti-k antistoffer: prøver 8, 9 og anti-k Prøve 9 1 Prøve 10 Prøve titerværdi 10 Fig 4 viser titerværdi på x-aksen og scoreværdi på y-aksen. 1 suspension 4, 4 uger gammel. 6 suspension 8, nyfremstillet 2 suspension 4, nyfremstillet 7 suspension 11, 4 uger gammel. 3 suspension 6, 4 uger gammel. 8 suspension 11, nyfremstillet. 4 suspension 6, nyfremstillet. 9 screentest II, 4 uger gammel. 5 suspension 8, 4 uger gammel. 10 screentest II, nyfremstillet. Resultater af anti-d antistof Resultater af mastertitrering med 3 anti-d antistoffer: prøver 2, 3 og anti-d Prøve 2 Prøve 4 Prøve titerværdi Fig.5 viser titerværdi på x-aksen og scoreværdi på y-aksen. Ved negative reaktion i diagrammet vises der ingen søjle. 1 suspension 3, 4 uger gammel. 4 screentest suspension III, nyfremstillet. 2 suspension 3, nyfremstillet. 5 en homozygot suspension 5. 3 screentest suspension III, 4 uger gammel. 22

23 scoreværdi scoreværdi Resultater af anti-fy a antistof Resultater af mastertitrering med 2 anti-fy a antistoffer: prøver 12 og Prøve 12 anti-fya titerværdi Prøve Fig 6 viser viser titerværdi på x-aksen og scoreværdi på y-aksen. 1 suspension 2, 4 uger gammel. 7 suspension 9, 4 uger gammel. 2 suspension 2, nyfremstillet. 8 suspension 9, nyfremstillet. 3 suspension 5, 4 uger gammel. 9 suspension 11, 4 uger gammel. 4 suspension 5, nyfremstillet. 10 suspension 11, nyfremstillet. 5 suspension 7, 4 uger gammel. 11 homozygot suspension 4 6 suspension 7, nyfremstillet Resultater af anti-e antistof Resultater af mastertitrering med 2 anti-e antistoffer: prøver 6 og Prøve 6 anti-e 1 Prøve titerværdi Fig 7 viser titerværdi på x-aksen og scoreværdi på y-aksen. 1 suspension 3, 4 uger gammel. 5 screentest I, 4 uger gammel. 2 suspension 3, nyfremstillet. 6 screentest I, nyfremstillet. 3 suspension 10, 4 uger gammel. 7 homozygot suspension 5. 4 suspension 10, nyfremstillet 23

24 scoreværdi scoreværdi Resultater af anti-c antistof Resultater af mastertitrering med anti-c antistof: prøven anti-c 1 Prøve titerværdi Fig 8 viser titerværdi på x-aksen og scoreværdi på Y-aksen. 1 suspension 8, 4 uger gammel. 5 screentest III, 4 uger gammel. 2 suspension 8, nyfremstillet. 6 screentest III, nyfremstillet. 3 screentest I, 4 uger gammel. 7 homozygot suspension 7. 4 screentest I, nyfremstillet. Resultater af anti-kp a antistof Resultater af mastertitrering med anti-kp a antistof: prøven anti-kpa titerværdi Prøve Fig 9 viser titerværdi på x-aksen og scoreværdi på y-aksen. 1 suspension 2, 4 uger gammel. 4 suspension 3, nyfremstillet. 2 suspension 2, nyfremstillet. 5 suspension 9, 4 uger gammel. 3 suspension 3, 4 uger gammel. 6 suspension 9 nyfremstillet. 24

25 scoreværdi scoreværdi Resultater af anti-jk a antistof Resultater af mastertitrering med anti-jk a antistof: prøven Prøve 14 anti-jka titerværdi Fig 10 viser titerværdi på x-aksen og scoreværdi på y-aksen. 1 suspension3, 4 uger gammel. 6 suspension 5, nyfremstillet. 2 suspension 3, nyfremstillet. 7 screentest III, 4 uger gammel. 3 suspension 4, 4 uger gammel. 8 screentest III, nyfremstillet. 4 suspension 4, nyfremstillet. 9 homozygot suspension 7. 5 suspension 5, 4 uger gammel. Resultater af anti-m antistof Resultater af mastertitrering med anti-m antistof: prøven Prøve 13 anti-m titerværdi Fig 11 viser titerværdi på x-aksen og scoreværdi på y-aksen. 1 suspension 2, 4 uger gammel. 7 screentest II, 4 uger gammel. 2 suspension 2, nyfremstillet. 8 screentest II, nyfremstillet. 3 suspension 3, 4 uger gammel. 9 screentest III, 4 uger gammel. 4 suspension 3, nyfremstillet. 10 screentest III, nyfremstillet. 5 suspension 9, 4 uger gammel. 11 homozygot suspension 7. 6 suspension 9, nyfremstillet. 25

26 scoreværdi scoreværdi Resultater af anti-s antistof Resultater af mastertitrering med anti-s: prøven titerværdi Fig 12 viser titerværdi på x-aksen og scoreværdi på y-aksen. anti-s Prøve suspension 4, 4 uger gammel. 5 screentest I, 4 uger gammel. 2 suspension 4, nyfremstillet. 6 screentest I, nyfremstillet. 3 suspension 5, 4 uger gammel. 7 homozygot suspension 2. 4 suspension 5, nyfremstillet Resultater af anti-s antistof Resultater af mastertitrering med anti-s antistof: prøven Prøve 16 anti-s titerværdi 7 Fig 13 Viser titerværdi på x-aksen og scoreværdi på y-aksen. 1 suspension 4, 4 uger gammel. 5 screentest I, 4 uger gammel. 2 suspension 4, nyfremstillet. 6 screentest I, nyfremstillet. 3 suspension 5, 4 uger gammel. 7 homozygot suspension 10 4 suspension 5,nyfremstillet. 26

27 scoreværdi Resultater af anti-c antistof Resultater af mastertitrering med anti-c antistof: prøven anti-c titerværdi Prøve 1 Fig 14 Viser titerværdi på x-aksen og scoreværdi på y-aksen. 1 suspension 8, 4 uger gammel. 5 screentest III, 4 uger gammel. 2 suspension 8, nyfremstillet. 6 screentest III, nyfremstillet. 3 screentest I, 4 uger gammel. 7 homozygot suspension screentest I, nyfremstillet Resultater af agglutinationsstyrker af de nyfremstillede og de 4 uger gamle testerytrocytsuspensioner med antistoffer: anti-m, anti-e prøve 5, anti-k prøve 8, 9 og 10, anti-s, anti-s og anti-d prøve 2,4 og 4. Resultater af anti-d, prøve 2 Resultater af mastertitrering af anti-d antistof prøve 2 gennem en graduering af reaktionsstyrker ved forskellige titreringstrin. Heterozygote testerytrocytsuspensioner opbevaret i Cellstab i 4 uger 1:1 1:2 1:4 1:8 Scoreværdi Nr Nr. III Heterozygote testerytrocytsuspensioner opbevaret i Cellstab i 8 dage 1:1 1:2 1:4 1:8 Nr Nr. III homozygot testerytrocytsuspension opbevaret i Cellstab i 8 dage 1:1 1:2 1:4 1:8 Nr. 5 +(+) Fig 15 viser de forskellige aflæsningsgradueringer af homozygoten, de nyfremstillede og de 4 uger gamle heterozygote testerytrocytsuspensioner 27

28 Resultater af anti-e prøve 5 Resultater af mastertitrering af anti-e antistof prøve 5 gennem en graduering af reaktionsstyrker ved forskellige titreringstrin. Heterozygote erytrocytsuspensioner 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Scoreværdi opbevaret i 4 uger Nr Nr (+) Nr. I Heterozygote erytrocytsuspensioner 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 opbevaret 8 dage Nr. 3 ++(+) Nr (+) (+) Nr. I Homozygot erytrocytsuspension 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 opbevaret i 8 dage Nr (+) Fig 16 viser de forskellige aflæsningsgradueringer af homozygoten, de nyfremstillede og de 4 uger gamle heterozygote testerytrocytsuspensioner. Resultater af anti-k prøve 8 Resultater af mastertitrering af anti-k antistof prøve 8 gennem en graduering af reaktionsstyrker ved forskellige titreringstrin. Heterozygote 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 Scoreværdi erytrocytsuspensioner opbevaret i 4 uger Nr. 4 ++(+) Nr. 6 ++(+) ++ +(+) Nr. 8 ++(+) ++ +(+) Nr (+) ++ +(+) Nr. II ++(+) Heterozygote 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 erytrocytsuspensioner opbevaret i 8 dage Nr. 4 ++(+) (+) Nr. 6 ++(+) (+) Nr. 8 ++(+) ++ +(+) (+) Nr (+) ++ +(+) (+) Nr. II ++(+) ++ +(+) (+) Fig 17 viser de forskellige aflæsningsgradueringer af de nyfremstillede og de 4 uger gamle heterozygote testerytrocytsuspensioner 28

29 Resultater af anti-k prøve 10 Resultater af mastertitrering af anti-k antistof prøve 10 gennem en graduering af reaktionsstyrker ved forskellige titreringstrin. Heterozygote testerytrocytsuspensioner 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Scoreværdi opbevaret i 4 uger Nr. 4 ++(+) ++ +(+) Nr. 6 ++(+) ++ +(+) Nr. 8 ++(+) ++ +(+) Nr (+) ++ +(+) Nr. II ++(+) Heterozygote testerytocytsuspensioner 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 opbevaret i 8 dage Nr. 4 ++(+) ++ +(+) Nr. 6 ++(+) ++ +(+) Nr. 8 ++(+) ++ +(+) Nr (+) (+) Nr. II ++(+) ++ +(+) (+) Fig 18 viser de forskellige aflæsningsgradueringer af de nyfremstillede og de 4 uger gamle heterozygote testerytrocytsuspensioner. Resultater af anti-s prøve 15 Resultater af mastertitrering af anti-s antistof prøve 15 gennem en graduering af reaktionsstyrker ved forskellige titreringstrin. Heterozygote testerytrocytsuspensioner 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 Scoreværdi opbevaret i 4 uger Nr. 4 +(+) Nr Nr. I Heterozygote testerytrocytsuspensioner 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 opbevaret i 8 dage Nr. 4 +(+) (+) Nr. 5 + (+) Nr. I ++ (+) homozygot testerytrocytsuspension opbevaret i 8 dage Nr. 2 ++(+) Fig 19 viser de forskellige aflæsningsgradueringer af homozygoten, de nyfremstillede og de 4 uger gamle heterozygote testerytrocytsuspensioner. 29

30 Resultater af anti-d, prøve 4 Resultater af mastertitrering af anti-d antistof prøve 4 gennem en graduering af reaktionsstyrker ved forskellige titreringstrin. Heterozygote testerytrocytsuspensioner opbevaret i Cellstab i 4 uger 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 Scorværdi Nr (+) Nr. III ++(+) ++(+) Heterozygot testerytrocytsuspensioner opbevaret i Cellstab i 8 dage 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 Nr (+) Nr. III ++ +(+) (+) homozygot testerytrocytsuspension opbevaret i Cellstab i 8 dage 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 Nr (+) ++(+) ++ (+) - 48 Fig 20 viser de forskellige aflæsningsgraduering af homozygoten, de nyfremstillede og de 4 uger gamle heterozygote testerytrocytsuspensioner. Titreringstrin 1:128 som giver negative resultater ved alle testerytrocytsuspensioner bliver ikke vist her. Resultater af anti-m prøve 13 Resultater af mastertitrering af anti-m antistof prøve 13 gennem en graduering af reaktionsstyrker ved forskellige titreringstrin. Heterozygote erytrocytsuspensioner 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Scoreværdi opbevaret i 4 uger Nr Nr Nr. 9 ++(+) Nr. II ++ +(+) Nr. III (+) Heterozygote erytrocytsuspensioner 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 opbevaret i 8 dage Nr (+) ++ +(+) (+) - 36 Nr (+) Nr. 9 +(+) (+) Nr. II Nr. III +(+)

31 scoreværdi scoreværdi Homozygot testerytrocytsuspension opbevaret i 8 dage Nr (+) (+) (+) 50 Fig 21 viser de forskellige aflæsningsgradueringer af homozygoten, de nyfremstillede og de 4 uger gamle heterozygote testerytrocytsuspensioner. Titreringstrin 1:64 og 1:128, som viser negative resultater ved alle erytrocytsuspensioner bliver ikke vist her. Resultater for at bekræfte hvilke testerytrocytsuspensioner, der giver højere titer- og scoreværdier ved antistofferne: anti-k, anti-kp a, anti-fy a, anti-jk a, anti-s og anti-s. Resultater af mastertitrering med anti-k antistof fra prøven anti-k titerværdi Prøve 10 suspension 11 suspension 4 Fig 22 viser titerværdi på x-aksen og scoreværdi på y-aksen. Resultater af mastertitrering med anti-kp a antistof Prøve 17 anti-kpa titerværdi suspension 2 suspension 3 Fig 23 viser titerværdi på x-aksen og scoreværdi på y-aksen. 31

32 scoreværdi scoreværdi scoreværdi Resultater af mastertitrering med anti-s antistof Prøve titerværdi anti-s suspension 4 suspension I (screentest) Fig 24 viser titerværdi på x-aksen og scoreværdi på y-aksen. Resultater af mastertitrering med anti-fy a antistof anti-fya titerværdi Prøve 12 Fig 25 viser titerværdi på x-aksen og scoreværdi på y-aksen. suspension 9 suspension 2 Resultater af mastertitrering med anti-s antistof Prøve titerværdi anti-s suspension 4 suspension I (screentest) Fig 26 viser titerværdi på x-aksen og scoreværdi på y-aksen. 32

33 scoreværdi Resultater af mastertitrering med anti-jk a. 8 6 Prøve 14 anti-jka 4 2 suspension 3 suspension III (screentest) titerværdi Fig 27 viser titerværdi på x-aksen og scoreværdi på y-aksen. Diskussion Resultaterne præsenteres i forskellige søjlediagrammer, hvor resultaterne af mastertitreringen af hvert irregulært antistof illustreres gennem score- og titerværdier. Dette giver et bedre overblik af hvilke testerytrocytsuspensioner, der giver højere, og hvilke der giver lavere score- og titerværdier. Holdbarhed af de nyfremstillede og de 4 uger gamle testerytrocytsuspensioner undersøges gennem de gradueret resultater, som præsenteres i forskellige tabeller. Kontroller Da der anvendes forskellige søjleagglutinationskort med forskellige lot numre, bliver søjleagglutinationskortene kontroleret hver gang, man begynder at anvende et nyt lot nummer. Resultaterne har ikke vist variationer ved anvendelse af de forskellige søjleagglutinationskort med forskellige lot numre. Diskussion af metoden Før man begynder med at titrere de første irregulære antistoffer, bliver der samlet empiri om mastertitrering gennem it-systemet fra Immunologisk Klinik, Sygehus Sønderjylland Åbenrå. Desuden bliver der lavet en tabel med hvert enkelt antistofs prøvenummer og rekvisitionsnummer. Dette bruges som en ekstra kontrol, da der er risiko for at forveksle plasmaprøverne, fordi 33

34 der findes nogle plasmaprøver, der har den samme antistoftype. I tabellen er der også registreret titerværdier af hvert enkelt antistof. Selvom mængden af plasma og PBS bliver beregnet for hver eneste mastertitrering, før man begynder at udføre begge forsøg, kommer man 2 gange til at mangle fortyndet plasma. Den ene gang ved afpipettering af prøve 13 og den anden gang ved prøve 5 med de nyfremstillede testerytrocytsuspensioner. Derfor, før man begyndte med forsøgene, skulle man udføre én eller 2 mastertitreringer, hvor man anvendte 5 eller 6 forskellige testerytrocytsuspensioner for at være sikker på, hvor meget plasma man skulle anvende. Selvom nogle resultater fra mastertitreringer viser de angivne titerværdier fra Immunologisk Klinik, Sygehus Sønderjylland Åbenrå (bilag 8, side 56) er det ikke alle antistoffer, der opnår de angivne titerværdier. Dette skaber analyseusikkerhed ved mastertitreringen, da der kunne ske nogle fejl ved fortyndingen af plasma eller ved afpipettering af testerytrocytsuspensioner. Derfor udføres der 2 gange en mastertitrering af disse. Disse to mastertitreringer kunne undgås, hvis man havde udført en titrering af hvert enkelt antistof, før man begyndte med det endelige forsøg. Derefter kunne man fastlægge titerværdierne for alle 17 antistoffer. Diskussion af resultater Selv om der forventes at få højere scoreværdier ved alle de homozygote testerytrocytsuspensioner, på grund af dosiseffekten, ses kun højere scoreværdierne ved anti-s (prøve 16), anti-m (prøve 13), anti-jk a (prøve 14), og anti-c (prøve 7). Dosiseffekten gør sig også bemærket ved anti-m, anti-jk a og anti-s titerværdier, da de giver højere titerværdier end de heterozygote testerytrocytsuspensioner. De modsatte resultater vises ved prøverne 3,5, og 6, hvor højere scoreværdier ses ved de heterozygote testerytrocytsuspensioner med flest antigenpræsenterende. Antistof anti-d prøve 2 viser meget lave titer- og scoreværdier ved alle testerytrocytsuspensioner. Det kan tyde på, at antistoffet har en meget lav affinitet. Resultaterne af prøver 11, 12, 2, 4 og 15 viser ikke nogen betydelig forskel mellem de homozygote- og heterozygote testerytrocytsuspensioner, mens resultaterne af prøve 1 ved suspension 8 og 11 giver det samme score- og titerværdi. De mest optimale testerytrocytsuspensioner Formålet med dette projekt, er at finde de mest optimale testerytrocytsuspensioner for de udvalgte irregulære antistoffer (kliniske vigtige antistoffer), som forårsager HDFN. De meste optimale heterozygote testerytrocytsuspensioner, der indeholder erytrocytter med flest antigener på, bliver lette at identificere, da titer- og scoreværdier af disse, i forhold til de homozy 34

35 gote testerytrocytsuspensioner, er næsten ens. Desuden foretages der en ekstra mastertitrering af disse antistoffer, hvor bestemte erytrocytsuspensioner viser højere eller ens resultater i forhold til de testerytrocytsuspensioner, der anbefales at bruge i Immunologisk Klinik, Sygehus Sønderjylland Åbenrå (bilag 8, side 56). Ved valget af de meste optimale testerytrocytsuspensioner for de udvalgte irregulære antistoffer, bliver score- og titerværdier taget i betragtning. Resultaterne viser at: testerytrocytsuspension nummer 9 er den mest optimal for anti-fy a antistof testerytrocytsuspension nummer 4 er den mest optimal for anti-k antistof. testerytrocytsuspension nummer III er den mest optimal for anti-jk a antistof. testerytrocytsuspension numre 4 og I er de mest optimale for anti-s antistof. testerytrocytsuspension nummer I er den mest optimal for anti-s antistof. testerytrocytsuspension nummer 3 er den mest optimal for anti-kp a antistof. For de andre antistoffer kan det bekræftes, at de anbefalede testerytrocytsuspensioner i Immunologisk Klinik, Sygehus Sønderjylland i Åbenrå, er de meste optimale til antistoftitrering. De nyfremstillede og de 4 uger gamle testerytrocytsuspensioner Ved beregning af scoreværdier for anti-d (prøve 4 og 2) og anti-k (prøve 10 og 8) kan man se en lille smule højere agglutinationsstyrke ved de 4 uger gamle suspensioner end ved de nyfremstillede testerytrocytsuspensioner, men forskellene er ikke signifikante. Signifikante forskelle mellem de nyfremstillede- og de 4 uger gamle testerytrocytsuspensioner bliver fundet ved anti-e (prøve 5) ved suspension 10, anti-d (prøve 3) suspension 3, anti-s suspension I og anti-m suspensioner III, II og 9. Desuden viser anti-m, anti-e og anti-s højere titerværdier (ved de førnævnte suspensioner) ved de gamle testerytrocytsuspensioner end ved de nye. Resultaterne fra de andre prøver viser ikke nogen signifikant forskel (bilag 6, side 50-54). ph måling af de anvendte testerytrocytsuspensioner De målte ph-værdier mellem de nyfremstillede- og de 4 uger gamle testerytrocytsuspensioner viser ikke større forskelle i de målte resultater (bilag 9, side 57). 35