PLATELIA M. PNEUMONIAE IgM 1 plade 96 72781 PÅVISNING AF IgM ANTI-MYCOPLASMA PNEUMONIAE I HUMANT SERUM MED ENZYMIMMUNOANALYSE 881132 2013/11 1. KLINISK VÆRDI Mycoplasma pneumoniae er en af de vigtigste etiologiske årsager til atypisk lungebetændelse hos børn og unge, hvor udbredelsen er størst for børn i skolealderen. Den biologiske diagnose er baseret på serologi. Forekomsten af IgM-antistoffer, som viser sig og forsvinder igen før IgG-antistofferne, muliggør en direkte diagnosticering af en akut infektion ud fra den første serumprøve. Forekomsten af eller en markant stigning i titeren for IgG-antistofferne mellem to prøver, der er indsamlet med et interval på omtrent to uger, påviser en infektion, der er opstået for nylig eller er under udvikling. 2. ANALYSEPRINCIP Platelia M. pneumoniae IgM er en test til påvisning af anti- M. pneumoniae IgM i humant serum ved immunenzymatisk teknik hvor IgM antistofferne bindes til den faste fase. Fortyndet prøveserum og kalibratorer afpipetteres i mikrotiterplader belagt med antistoffer mod humane gamma-kæder og inkuberes. Under den første inkubationsperiode bindes IgM-antistoffer i prøven til den faste fase. Efter inkubation fjernes IgG og andre serumproteiner ved vask. Peroxidasemærket M. pneumoniae-antigen tilsættes og mikrotiterpladerne inkuberes igen. Indeholder prøven M. pneumoniae IgM-antistoffer vil disse under anden inkubationsperiode binde sig til M. pneumoniae antigenerne. Ubundne M. pneumoniae antigener fjernes efter anden inkubationsperiode ved gentagne vaskeprocedurer. Tilstedeværelsen af immunkomplexet synliggøres ved tilsætning af substrat i hver brønd. Den enzymatiske reaktion stoppes ved tilsætning af syre. Den optiske densitet, der opnås med af aflæsning ved 450/620 nm og ligger over en cut-off-værdi, angiver forekomsten eller fraværet af anti-m. pneumoniae IgM. 3. PRODUKTOPLYSNINGER Opbevaringsbetingelser og udløbsdato fremgår af kassen. Etiket Reagenser Mængde R1 Microplate Mikrotiterplade : 12 strimler med hver 8 aftagelige brønde, belagt med antistoffer mod humane IgM-gammakæder 1 R2 R3 Concentrated Washing Solution (20x) Negative control Koncentreret vaskeopløsning (20x) Tampon TRIS-NaCl (ph 7,4), 2 % Tween 20 Konserveringsmiddel: 0,04 % ProClin 300 Negativ kontrol: TRIS-NaCl-buffer (ph 8 ± 0,1), albumin fra kvægserum, glycerol, E102 og E122. Konserveringsmiddel: 0,2 % ProClin 300 1 x 70 ml 1 x 1 ml R4a Cut-off control Cut-off-kontrol: TRIS-NaCl-buffer (ph 8 ± 0,1), humant serum der er reaktive over for M. pneumoniae Ag, albumin fra kvægserum, glycerol, E102 og E122. Konserveringsmiddel: 0,2 % ProClin 300 1 x 1 ml R4b Positive control Positiv kontrol: TRIS-NaCl-buffer (ph 8 ± 0,1), humant serum der er reaktive over for M. pneumoniae Ag, albumin fra kvægserum, glycerol, E102 og E122. Konserveringsmiddel: 0,2% ProClin 300 1 x 1 ml R6 Conjugate Konjugat : M. pneumoniae Ag, der er bundet til peroxidase fra peberrod. Konserveringsmiddel : 0,15% ProClin 300 1 x 12 ml 1
R7 Sample diluent Prøvefortynder: TRIS-NaCl-buffer (ph 7,7 ± 0,1), albumin fra kvægserum, 0,1 % Tween 20 og fenolrød. Konserveringsmiddel : 0,15% ProClin 300 2 x 120 ml R9 Chromogen TMB Kromogen (brugsklar) 3.3.5.5 tetramethylbenzidin (< 0,1 %), H 2 O 2 (<1 %) 1 x 28 ml R10 Stopping Solution Stopopløsning (klar til brug): 1N-svovlsyreopløsning 1 x 28 ml 4. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Resultaternes pålidelighed afhænger af korrekt implementering af følgende regler for god laboratoriepraksis: Brug ikke reagenser efter udløbsdatoen. Undgå sammenblanding eller nogen form for forbindelse mellem reagenser fra forskellige partier i samme kørsel. BEMÆRK: Det gælder for vaskeopløsning (R2, etiketidentifikation: 20x, grøn), kromogen (R9, etiketidentifikation: TMB, turkisfarvet) og stopopløsning (R10, etiketidentifikation: 1N, rød), at det er muligt at anvende andre partier end dem i dette sæt under forudsætning af, at reagenserne er fuldstændig tilsvarende, og at samme parti anvendes i hele kørslen. BEMÆRK: Vaskeopløsningen (R2 etiketidentifikation* 20x, grøn) må ikke blandes med vaskeopløsningen (R2 etiketidentifikation* 10x, blå), der leveres i Bio-Rad-reagenssæt. * på flaskens etiket Vent 30 minutter før brug, så reagenserne kan stabilisere sig ved stuetemperatur (+18-30 C). Rekonstituér eller fortynd reagenserne forsigtigt for at undgå kontaminering. Undgå at udføre testen i nærheden af reaktive dampe (syre, alkaliske dampe og aldehyddampe) eller støv, der kan påvirke konjugatets enzymaktivitet. Benyt engangsmateriale, eller hvis dette ikke er muligt, udstyr af glas, som er vasket grundigt og skyllet med deioniseret vand. Grundig vask af mikropladen er et afgørende trin i proceduren: Udfør det anbefalede antal vaske, og sørg for, at alle brønde bliver helt fyldt og derefter helt tømt. Ukorrekt vask kan føre til unøjagtige resultater. Undgå, at mikropladen bliver tør mellem vaskene og fordelingen af reagenserne. Benyt aldrig den samme beholder til at fordele konjugatet og enzymsubstratet. Enzymreaktionen er meget følsom over for metaller eller metalioner. Undgå derfor, at metalelementer kommer i berøring med de forskellige opløsninger med konjugat eller kromogen. Kromogenopløsningen (R9) bør være farveløs. Hvis farven bliver blå, kan reagenset ikke anvendes og skal udskiftes. Anvend en ny pipettespids til hver prøve. Kontrollér, at pipetterne og andet udstyr er i orden og fungerer korrekt. SUNDHEDS- OG SIKKERHEDSMÆSSIGE FORHOLDSREGLER Brug engangshandsker ved håndtering af reagenser. Undgå at pipettere med munden. Det humane kildemateriale, der er brugt til fremstilling af reagenser, er blevet testet og fundet ikke-reaktivt for hepatitis B- overfladeantigen (HBs Ag), antistoffer til hepatitis C og antistoffer til HIV 1 og HIV 2 (Human Immunodeficiency Virus). Eftersom ingen metode kan give fuld garanti for fravær af smittekim, skal reagenser af human oprindelse og patientprøverne håndteres som potentielt smittefarlige. Ethvert materiale, herunder vaskeopløsninger, der kommer i direkte kontakt med prøver og reagenser, som indeholder humant kildemateriale, skal betragtes som potentielt smittefarligt. Undgå at spilde. Spildt syre skal neutraliseres med natriumbikarbonat og derefter rengøres med 12 % natriumhypoklorit, der er fortyndet i forholdet 1:10. Tør efter med sugende papir. Det materiale, der anvendes til rengøringen, skal kasseres og placeres i en affaldsbeholder til farligt affald. Patientprøver, reagenser med humant kildemateriale samt kontamineret materiale og produkter må først bortskaffes efter desinficering. Se piktogrammet(merne), som er angivet på mærkaterne, og informationerne sidst i brugsanvisningen i forbindelse med farer og forholdsregler for kemiske komponenter i dette testsæt. Sikkerhedsdatabladet kan findes på www.bio-rad.com. 2
5. PRØVEMATERIALE 1) Den anbefalede prøvetype er serum, der er indsamlet i tørglas. 2) Følg nedenstående anbefalinger for håndtering, behandling og opbevaring af serumprøver: - Indsaml alle serumprøver under overholdelse af de generelle forholdsregler. - Lad prøverne koagulere helt, før de centrifugeres. - Sørg for, at glassene altid er lukkede. - Efter centrifugeringen dekanters serummet og opbevares i tæt tillukkede opbevaringsrør. - Prøverne kan opbevares ved 2 8 C, hvis screeningen udføres inden for 24 timer. Hvis analysen ikke udføres inden for 24 timer, eller prøverne skal sendes, skal de nedfryses til mindst -20 C. - Undgå at prøverne optøs mere end en enkelt gang. Tidligere nedfrosne prøver skal blandes grundigt efter optøning, før testen udføres. 3) Der er ikke påvist interferens på grund af høje mængder albumin eller bilirubin. Undgå at anvende lipemiske eller hæmolyserede prøver. 4) Undgå at opvarme prøverne. 6. ANALYSEPROCEDURE 6.1 - NØDVENDIGT MATERIALER, DER IKKE MEDFØLGER - Vortex-mixer. - Mikrotiterpladelæser med filtre på 450 nm og 620 nm *. - Manuel, halvautomatisk eller automatisk mikrotiterpladevasker *. - Beholder til farligt biologisk affald. - Natriumhypochlorit og natriumbikarbonat. - Bakteriefrit, destilleret eller demineraliseret vand. - Graduerede cylindere med kapaciteter på hhv. 25, 50, 100 og 1000 ml. - Engangslatexhandsker. - Beskyttelsesbriller. - Sugende papir. - Automatiske eller halvautomatiske, justerbare eller forudindstillede pipetter eller multipipetter til måling og fordeling af 10 1000 µl og 1, 2 og 10 ml. - Engangsglas. * Kontakt vores tekniske afdeling for at få detaljerede oplysninger om det anbefalede udstyr. 6.2 - REKONSTITUERING AF REAGENSER R2: Fortynd vaskeopløsningen R2 i destilleret vand i forholdet 1:20, fx 50 ml R2 og 950 ml destilleret vand, for at få den brugsklare vaskeopløsning. Klargør 350 ml fortyndet vaskeopløsning til én plade med 12 strimler, hvis der foretages manuel vask. 6.3 - OPBEVARING AF ÅBNE OG/ELLER REKONSTITUEREDE REAGENSER R1: Efter åbning af de vacuumforseglede poser, er teststrimlerne holdbare i otte uger, ved opbevaring ved 2-8 C i den samme, omhyggeligt lukkede pose. R2: Efter fortynding kan vaskeopløsningen gemmes i 2 uger ved +2-30 C. Når den koncentrerede vaskeopløsning opbevares ved +2-30 C, er den stabil indtil udløbsdatoen på etiketten, forudsat at der ikke forekommer kontamination. R9: Efter åbning og uden kontamination er reagenset stabilt i op til 8 uger ved opbevaring ved +2-8 C. R3, R4a, R4b, R6, R7 og R10: Ved opbevaring ved 2-8 C uden kontaminering er reagenserne R8 og R10 holdbare indtil den udløbsdato der er angivet på etiketten. 6.4 - PROCEDURE Følg analyseproceduren nøje. Brug kalibratorerne ved hver kørsel for at validere analyseresultaterne. Lad reagenserne stabilisere sig ved stuetemperatur (18-30 C), før de anvendes. 1) Opret en nøje fordelings- og identifikationsplan for kontrol- og testprøverne. 2) Forbered den fortyndede vaskeopløsning (R2). (Se afsnit 6.2). 3) Tag bakken og teststrimlerne (R1) ud af beskyttelsesposen. 4) Vask mikrotiterpladestrimlerne en enkelt gang med fortyndet R2. Vend mikrotiterpladen, og dup den forsigtigt med sugende papir for at fjerne resterende væske. 5) Fortynd kalibratorerne R3, R4a, og R4b og testprøven i R7, så der opnås en fortynding på 1/201 (10 µl prøvemateriale + 2 ml R7). Bland de fortyndede prøver i Vortex-mixeren. 6) Ved manuel udførelse af analysen, tilsættes 100 µl fortyndede kontrolprøver og fortyndede testprøver i brøndene som foreslået nedenfor: 3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 E5 B R4a E6 C R4a E7 D R4b E8 E E1 E9 F E2 E10 G E3 E11 H E4 E12 7) Afdæk mikrotiterpladen med selvklæbende pladeforsegling, og pres den ned mod pladen, så den slutter helt til overalt. Inkuber mikrotiterpladen i et termostatstyret vandbad eller et varmeskab til mikrotiterplader ved stuetemperatur (18-30 C) i 1 time. 8) Fjern den selvklæbende pladeforsegling i slutningen af første inkubationsperiode. Sug indholdet af alle brønde op i en beholder til biologisk farligt affald (en beholder med natriumhypochlorit). Vask mikrotiterpladen tre gange. Vend mikrotiterpladen, og dup den forsigtigt med sugende papir for at fjerne resterende væske. 9) Tilsæt 100 µl konjugatopløsning (R6) til alle brønde. Opløsningen skal rystes forsigtigt før brug. 10) Afdæk mikrotiterpladen med selvklæbende pladeforsegling, og pres den ned mod pladen, så den slutter helt til overalt. Inkuber mikrotiterpladen i et termostatstyret vandbad eller et varmeskab til mikrotiterplader ved stuetemperatur (18-30 C) i 1 time. 11) Fjern den selvklæbende pladeforsegling efter anden inkubationsperiode. Sug indholdet af alle brønde op i en beholder til biologisk farligt affald (en beholder med natriumhypoklorit). Vask mikropladen 4 gange med 350 µl vaskeopløsning (R2). Vend mikropladen på hovedet, og dup den forsigtigt mod sugepapiret for at fjerne resterende væske. 12) Fordel hurtigt og i mørke 200 µl kromogenopløsning (R9) i hver brønd. Lad reaktionen foregå i mørke i 30 ± 5 minutter ved stuetemperatur (+18-30 C). Benyt ikke selvklæbende pladeforsegling til denne inkubation. 13) Stands enzymreaktionen ved at tilsætte 100 µl stopopløsning (R10) i hver brønd. Benyt samme rækkefølge og fordelingshastighed som for enzymsubstratet. 14) Tør undersiden af pladen omhyggeligt af. Aflæs den optiske densitet ved 450/620 nm ved hjælp af en mikropladelæser inden for 30 minutter efter standsning af reaktionen. Strimlerne skal opbevares i mørke før aflæsning. 15) Kontrollér, at der er overensstemmelse mellem aflæsningen, fordelingsplanen for pladen og prøverne, før resultaterne rapporteres. 7. FORTOLKNING AF RESULTATER 7.1. KVALITETSKONTROL Medtag alle kalibratorerne til hver testkørsel. Følgende kriterier skal overholdes, hvis analysen skal betragtes som gyldig. Værdier for optisk densitet: - OD R4b > 0,500 -Forhold: - OD R4a / OD R3 > 2,0 - OD R4b / OD R4a > 1,5 Hvis kriterierne for kvalitetskontrollen ikke opfyldes, skal testkørslen gentages. 7.2. BEREGNING AF CUT-OFF-VÆRDI (COV) COV = gennemsnitlig OD R4a 7.3. FORTOLKNING AF RESULTATERNE Forekomsten eller fraværet af IgM-antistoffer, der retter sig mod M. pneumoniae, i det testede prøvemateriale bestemmes ved at sammenligne serummets optiske densitet med en cut-off-værdi. Prøves optiske densitet Resultat Fortolkning og Anbefaling OD A < OD R4a x 0,80 OD A OD R4a x 0,80 DO A < OD R4a OD A OD R4a Negativt Usikkert Positivt Sandsynligvis ingen nylig infektion med af M. pneumoniae Resultatet skal bekræftes 10 20 dage efter den første kontrol Der kræves en kvantitativ undersøgelse af IgG-antistoffer til M. pneumoniae. Resultaterne skal bekræftes 10 20 dage senere (IgG/IgM). 4
7.4. HJÆLP TIL FEJLFINDING Reaktioner, der ikke godkendes eller bekræftes ved gentagelse, skyldes ofte: Utilstrækkelig vask af mikrotiterplader. Kontamination af negative prøver med serum eller plasma med høj antistoftiter. Kontamination af farveudviklingsopløsningen med iltningsmiddel (natriumhypoklorit, metalioner o.lign.). Kontamination af stopopløsningen. 8. PROCEDURENS BEGRÆNSNINGER Diagnosticering af en nylig infektion kan kun fastlægges på baggrund af en kombination af kliniske observationer og serologiske data. Resultatet af en enkelt serumprøve leverer ikke tilstrækkeligt bevis til en diagnosticering af en nylig infektion. 9. YDEEVNE 9.1 SENSITIVITET OG SPECIFICITET Resultaterne af korrelationsundersøgelserne med Platelia M. pneumoniae IgM (72781) bekræfter, at ændringerne i dette sæt ikke påvirker resultaterne med testen Platelia M. pneumoniae IgM OPD(72777), der nævnes herunder. Specificitet Udbredelsen af Platelia M. pneumoniae IgM blev bestemt til 1 % ud fra 300 prøver fra bloddonerer. Specificiteten blev evalueret til 100 % (31/31) ifølge 31 prøver franyfødte. Sensitivitet 1) Sammenlignende undersøgelser Sensitiviteten for Platelia M. pneumoniae IgM ved IgM-konstatering blev evalueret til 100 % (61/61) ifølge to uafhængige evalueringer. 2) Serokonvertering På begge evalueringssteder blev der konstateret 38 serokonverteringer med Platelia M. pneumoniae IgM. I 11 tilfælde viste Platelia M. pneumoniae IgM konstatering af serokonversion 1 eller 2 prøvetagninger før serokonversion kunne konstateres med CFR-test (Complement Fixation Reaction) eller indirekte immunofluorescenstest. 9.2 - PRÆCISION Der blev undersøgt 4 prøver: en negativ prøve og tre positive prøver (Lidt Middel, Meget). Variationskoefficienter (CV) blev beregnet ud fra undersøgelser af samme analyseserie (på 30 ens prøver) og mellem analyseserier (på 20 dage, med 2 analyseserier pr. dag) og bekræftede et tilfredsstillende resultat med hensyn til gentagelsesnøjagtighed for Platelia M. pneumoniae IgM for positive prøver: - CV (i samme analyseserie) < 6 % - CV (mellem analyseserier) < 10 % 9.3 - KRYDSREAKTIVITET Der blev testet 149 prøver med kendt serologi for forskellige markører for luftvejsinfektioner og prøver, der var positive for rheumatoide faktorer og autoantistoffer. Blandt de 6 prøver, der blev fundet positive med Platelia M. pneumoniae IgM OPD (72777), blev 4 også bekræftet som positive i CFR-testen (titer 8). 2 prøver (mæslinger) kunne ikke testes anden gang. 10. PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL Alle producerede og kommercialiserede reagenser er underlagt et komplet kvalitetssystem lige fra modtagelsen af råmaterialet til den endelige kommercialisering af produktet. Hvert parti sendes til kvalitetskontrol og frigives kun på markedet, når det overholder kravene for godkendelse. Dokumentation vedrørende produktion og kontrol af hvert parti opbevares inden for virksomheden. 5
11. REFERENCER 1) ABRAMOVITZ, P., SCHVARTZMAN, P., HAREL, D., LIS, I., and NAOT, Y. Direct invasion of the central nervous System by Mycoplasma pneumoniae: a report of two cases The Journal of Infectious diseases, Vol. 1545, N 3 March 1987. 2) BUSOLO, F., MELONI, G.A Serodiagnosis of M. pneumoniae infections by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) The Yale Journal of Biology and Medicine 56 (1983), 517-521. 3) CLYDE, W.A., Jr Mycoplasma pneumoniae infections of man The Mycoplasmas, Vol II, 1979 by Academic Press, Inc ; 275-302. 4) HIRSCHBERG L., KROOK A., PETTERSSON C.A., VIKERFORS T. Enzyme linked immunosorbent Assay for Detection of Mycoplasma pneumoniae specific Immunoglobulin M. Eur. J. Clin Microbiol. Infect. Dis. Vol. 7, 1988, 420-423. 5) KENNY, G.E., GRAYZO, J.T. Eaton pleuropneumoniae-like organism (Mycoplasma pneumoniae) complement-fixing antigen : extraction with organic solvents. The Journal of Immunology, Vol. 95, N 1 (1965). 6) MOULE J.H., CAUL E.O. The specific IgM response to Mycoplasma pneumoniae infection : interpretation and application to early diagnosis. Epidem. Inf. (1987), 99, 685-692. 7) RAISANEN, S.M., SUNI, J.I., LEINIKKI, P.O. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. J. Clin. Pathol. 1980 ; 33 : 836-840 8) VIKERFORS T., BRODIN G., GRANDIEN M., HIRSCHBERG L., KROOK A., PETTERSSON C.A. Detection of specific IgM antibodies for the diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection : a clinical evaluation Scand. J. Infec. Dis. 20 : 610-620, 1988 6
7
Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 2013/11 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 881132 www.bio-rad.com 8