Instructions for use

Instructions for use Sanquin Reagents B.V. Plesmanlaan 125 1066 CX Amsterdam The Netherlands Phone: +31 20 5123599 Fax: +31 20 5123570 biologics@sanquin.nl www.sanquin.org/biologics MabTrack level infliximab M2920 96 308_v05 05/2018 (da) Kun til professionelt brug ELISA til kvantitativ måling af indholdet af lægemidlet infliximab Ab BUF CAL CONJ HRP Antistoffer mod Buffer Kalibrator Konjugat HRP HUM IFX MOU REK TNF Human Infliximab Mus Rekombinant TNF WELL Well - Interval Generel information MabTrack level infliximab er en enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) til hurtig, reproducerbar og specifik kvantitativ bestemmelse af infliximab-koncentrationer i humane plasma- og serumprøver. Det terapeutiske antistof infliximab påvirker tumornekrosefaktoren (TNF) og administreres hyppigt til patienter, der lider af reumatoid artritis, tarmsygdomme, hudsygdomme og cancer. TNF spiller en vigtig rolle ved inflammation og forårsager f.eks. smerter, hævede led og stivhed hos patienter med reumatoid artritis. Hæmning af TNF menes derfor at lindre nogle af disse symptomer og dermed forbedre patienternes livskvalitet. Plasma- og serumniveauer af TNF-hæmmere varierer kraftigt blandt patienterne og korrelerer tydeligt med patienternes kliniske symptomer. Hos ca. 8%-43% af patienter, der behandles med infliximab, dannes der antistoffer direkte mod infliximab. Dette kan delvist hindre TNF-hæmmerens funktion og kan forårsage en reduktion af plasmakoncentrationen af TNF-hæmmeren. Identifikation af lægemiddelindholdet kan være vigtig ved patientjusterede behandlingsplaner, da et lavt indhold ofte er indikation for dannelse af antistoffer mod infliximab. Derudover kan et lavt indhold være tegn på, at infliximab ikke virker effektivt inden rebound af kliniske symptomer. Som alternativ foreslås det, at doseringen af infliximab til patienter, der reagerer godt på infliximab, kan reduceres i overensstemmelse med serumkoncentrationerne. Test af lægemiddelindholdet kan derfor hjælpe med at tilpasse medicineringen eller skifte til en anden TNF-hæmmer. Denne infliximab level ELISA er blevet udviklet med henblik på hurtig, reproducerbar og specifik kvantitativ bestemmelse af infliximab-koncentrationer i plasma og serum. Dette ELISA-niveau er valideret for Remicade og de biosimilære midler Remsima og Inflectra. Klinisk optimale intervaller, f.eks. terapeutiske intervaller, blev bestemt hos Sanquin Diagnostic Services med infliximab ELISA for reumatoid artritis, der skal være mindst 3,0 µg/ml (Van de Bemt et al. 2013). For colitis ulcerosa er det optimale område 3-7 µg/ml (Vande Casteele et al.). Principper for testen MabTrack level infliximab ELISA er en "sandwichtype" enzym-immunoassay. TNF indfanges i mikrotiterpladerne af monoklonale antistoffer belagt i mikrotiterbrønde af polystyren. Infliximab i prøven, kalibrator eller kontrollerne binder sig til TNF i mikrotiterpladen. Ubundet materiale fjernes derefter ved vask. Derefter tilføjes et peberrod-peroxidasemærket monoklonalt antistof mod lægemidlet. Antistoffet binder sig til det infliximab/tnf/anti-tnf-kompleks, der er til stede i mikrotiterbrønden. Når ubundet HRP-konjugat er fjernet ved vask, tilsættes der substratopløsning til brøndene. Et farvet produkt dannes i proportion til den mængde infliximab, der er til stede i prøven, kalibratoren og kontrollerne. Når reaktionen afsluttes ved tilsætning af en stopopløsning, måles absorbansen i en mikrotiterpladelæser. Ud fra absorbansen i prøverne og kalibratorkurven kan koncentrationen af infliximab bestemmes ved interpolation med kalibratorkurven. Pakkens indhold Mouse-anti-TNF/recombinant TNF pre-coated microtiter plate 12 x 8 brønde - M2911 klar til brug Calibrator 1-6 6 x1 ml sorte hætter M2922 klar til brug Control 1 1 x 1 ml gennemsigtig hætte M2923 klar til brug, terapeutisk interval Control 2 1 x 1 ml gennemsigtig hætte M2924 klar til brug, terapeutisk interval Human anti-infliximab HRP-conjugate 1 x 12,5 ml brun flaske M2925 klar til brug Wash buffer stock solution 1 x 50 ml hvid flaske M1805 fortyndes 1:20 i destilleret vand HPE dilution buffer 1 x 50 ml hvid flaske M2940 klar til brug TMB substrate solution 1 x 12,5 ml brun flaske M1821 klar til brug Stop solution 0,18 M H2SO4 1 x 13,0 ml hvid flaske M1823 klar til brug Plate seals 10 x - - - 1 5

- Den fladbundede mikrotiterplade består af 12 strimler med 8 brugsklare brønde. Alle brøndene er belagt med TNF-specifikt monoklonalt antistof fra mus og rekombinant TNF. Mikrotiterpladen er vakuumforseglet i en plastikpose indeholdende tørremiddel. Analysesættet giver mulighed for at bruge mikrotiterpladen flere gange. Afgør det antal strimler, der skal bruges til antallet af prøver, plus 8 brønde, der skal bruges til at køre kalibratorer og kontroller. Fjern strimler, der ikke skal anvendes, fra mikrotiterpladen, og pak dem ind igen i plastikposen med tørremiddel. - Efter åbning kan alle reagenser og mikrotiterpladestrimlerne bruges i 4 uger, hvis de opbevares ved 2-8 C. - Se vedlagte informationsseddel vedrørende specifikke infliximab-koncentrationer i kalibrator 1-6 og i kontrol 1 og kontrol 2. Yderligere materialer og/eller udstyr - Destilleret eller deioniseret vand. - Kalibrerede pipetter (5-1000 µl). - Multikanalspipette (30-300 µl). - Målebægre, kolber, cylinderflasker og væskebeholdere til forberedelse af reagenser. - Mikrotiterpladelæser (til læsning af OD ved 450 nm). Forholdsregler Kun til in-vitro-diagnose. Reagenserne bør opbevares ved 2 8 C. Utætte eller beskadigede flasker må ikke bruges. Reagenser (uåbnede eller åbnede) må ikke anvendes efter den udløbsdato, der er trykt på flaskens etiket. Det kan ikke antages, at reagenterne er fri for smittefarlige stoffer. Man skal være forsigtig ved brugen og bortskaffelsen af alle beholdere og deres indhold. Bortskaffelsen af spild efter fuldførelse af testen skal udføres i henhold til laboratoriets regulativer. Testprocedure Indsamling og forberedelse af prøver 1. Der skal anvendes prøver med dalværdier til at måle koncentrationen af infliximab. Derfor skal prøver tages senest 24 timer INDEN, at lægemidlet injiceres, for at sikre, at de angivne, forventede niveauer afspejler dalværdien for patienten. 2. Der må kun anvendes serum og EDTA plasma i analysen. 3. Separer plasma eller serum fra blodcellerne senest 4 timer efter prøvetagning og udfør analyserne med det samme. Hvis analyse af prøverne udsættes, kan de opbevares ved 2-8 C i 72 timer. Hvis prøverne ikke analyseres inden for 72 timer, skal de nedfryses. De kan opbevares nedfrosne ved -18 C i 12 måneder. 4. Opmål prøverne i portioner for at undgå, at de nedfryses og optøs flere gange. 5. Inden analyse skal frosne prøver optøs ved stuetemperatur. Der må ikke anvendes vandbad ved 37 C eller 56 C til optøning. 6. Prøverne skal blandes, inden der forberedes fortyndinger. Prøvefortynding 1. Hver patientprøve inkuberes i en brønd for sig. For at forbedre ELISA-testens pålidelighed anbefales det at udføre dobbeltbestemmelser for hver prøve. 2. Der kan anvendes en fortynding i forholdet 1:1500 i denne analyse til at måle infliximab-niveauet hos patienter. 3. Hvis prøvekoncentrationen er for høj til at opnå en præcis koncentration, skal testen gentages med en prøvefortynding i forholdet 1:2000 for at få et pålideligt resultat. 4. Hvis koncentrationen af prøven er for lav til at opnå en præcis koncentration, skal testen gentages med en prøvefortynding i forholdet 1:200 for at få et pålideligt resultat. Fortynding Prøvetype HPE-volumen 1:50 5 µl ufortyndet patientprøve 245 µl 1:200 50 µl 1:50 for-fortyndet patientprøve 150 µl 1:1500 10 µl 1:50 for-fortyndet patientprøve 290 µl 1:2000 5 µl 1:50 for-fortyndet patientprøve 195 µl Forberedelse af brugsklar vaskebufferopløsning Forbered en brugsklar opløsning ved at tilsætte 50 ml stamopløsning af vaskebufferen (hele indholdet af en flaske) til 950 ml destilleret vand. Den brugsklare opløsning kan opbevares i op til 2 måneder ved 2-8 C. Forberedelse af ELISA-testproceduren 1. Lad alle reagenser få stuetemperatur (18-25 C). 2. Hele analysen skal udføres ved stuetemperatur (18-25 C), uden at prøverne omrystes. 3. Brøndene må ikke stå utildækkede eller udtørrede i længere tid mellem inkubationstrinene. 4. Fjern forsigtigt alle luftbobler fra brøndene inden inkubation. 5. Undgå krydskontaminering ved at bruge engangspipettespidser ved hver overførsel og nye pladeforseglinger ved hvert inkubations- /fikseringstrin i ELISA-eksperimentet. 6. Bland alle reagenser grundigt, men forsigtigt inden brug (uden dannelse af skum). 2 5

Udførelse af ELISA-testproceduren 1. Tag mikrotiterpladen med det påkrævede antal mikrotiterpladestrimler ud af posen. De ubrugte strimler kan opbevares i plastikposen med tørremiddel. 2. Klargør vaskebufferen og prøverne ifølge protokollen. 3. Tilsæt 100 µl pr. brønd af kalibratorer, kontroller eller fortyndede patientprøver i overensstemmelse med det foreslåede layout for mikrotiterpladen eller dit eget layout.luk hætteglassene med kalibratorer og kontroller efter brug for at forhindre fordampning. 4. Dæk mikrotiterpladen til med klæbeforsegling, og inkuber i 1 time. 5. Aspirer supernatanter fra brønde, fyld hver brønd med 250 µl fortyndet vaskebuffer. Lad vaskebufferen i hver brønd stå i 30-60 sekunder pr. vaskecyklus, og tøm derefter brøndene. Efter (manuel og automatisk) vask skal al væske tømmes af mikrotiterpladen ved at banke den let mod sugepapir med åbningerne nedad for at fjerne alle rester af vaskebuffer. Gentag dette fire gange. Efter den sidste vask skal brøndene være tørre! 6. Tilsæt 100 µl anti-infliximab HRP-konjugat i hver brønd. 7. Dæk mikrotiterpladen til med klæbeforsegling, og inkuber i 1 time. 8. Aspirer supernatanter fra brønde, fyld hver brønd med 250 µl fortyndet vaskebuffer. Lad vaskebufferen i hver brønd stå i 30-60 sekunder pr. vaskecyklus, og tøm derefter brøndene. Efter (manuel og automatisk) vask skal al væske tømmes af mikrotiterpladen ved at banke den let mod sugepapir med åbningerne nedad for at fjerne alle rester af vaskebuffer. Gentag dette fire gange. Efter den sidste vask skal brøndene være tørre! 9. Gentag dette fire gange. Efter den sidste vask skal brøndene værre tørre! 10. Tilsæt 100 µl TMB-substratopløsning i hver brønd. 11. Inkuber mikrotiterpladen i mørke. Den må ikke rystes. Kontroller farvedannelsen hvert 5. minut. Når den blå farve er dannet i de positive brønde, og de blinde stadig er farveløse, skal reaktionen stoppes. Den gennemsnitlige inkubationstid er 10 ± 1 minut. 12. Stop reaktionen ved at tilsætte 100 µlstopopløsning i hver brønd. 13. Mål mikrotiterpladen i en ELISA-læser ved A450 nm. Læs pladen inden for 30 minutter efter tilsætning af stopopløsningen. Der må anvendes en anden bølgelængde på 540-620 nm som reference under målingen. Foreslået layout af mikrotiterpladen Kalibreringskurven og kontrollerne skal inkluderes i hver kvantitativ analysekørsel. De kan udføres på en enkelt række. De medfølgende reagenser giver brugeren mulighed for at bruge mikrotiterpladen i en til maks. fire kørsler. Det foreslåede mikrotiterplade-layout er til en enkelt kørsel. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A CAL1 prøve 1 prøve 5 prøve 9 prøve 13 prøve 17 prøve 21 prøve 25 prøve 29 prøve 33 prøve 37 prøve 41 B CAL2 prøve 1 prøve 5 prøve 9 prøve 13 prøve 17 prøve 21 prøve 25 prøve 29 prøve 33 prøve 37 prøve 41 C CAL3 prøve 2 prøve 6 prøve 10 prøve 14 prøve 18 prøve 22 prøve 26 prøve 30 prøve 34 prøve 38 prøve 42 D CAL4 prøve 2 prøve 6 prøve 10 prøve 14 prøve 18 prøve 22 prøve 26 prøve 30 prøve 34 prøve 38 prøve 42 E CAL5 prøve 3 prøve 7 prøve 11 prøve 15 prøve 19 prøve 23 prøve 27 prøve 31 prøve 35 prøve 39 prøve 43 F CAL6= prøve 3 prøve 7 prøve 11 prøve 15 prøve 19 prøve 23 prøve 27 prøve 31 prøve 35 prøve 39 prøve 43 blank G CTRL 1 prøve 4 prøve 8 prøve 12 prøve 16 prøve 20 prøve 24 prøve 28 prøve 32 prøve 36 prøve 40 prøve 44 H CTRL 2 prøve 4 prøve 8 prøve 12 prøve 16 prøve 20 prøve 24 prøve 28 prøve 32 prøve 36 prøve 40 prøve 44 Resultater 1. Enhver intern eller online tilgængelig softwaremetode kan anvendes til beregning af koncentrationer. Brug en ikke-lineær regressionsanalyse til kurvetilpasning. Det anbefales at anvende en logistisk regressionsanalyse med fire parametre (4PL), men en logistisk regressionsanalyse med fem parametre (5PL) eller kurvetilpasning vha. tredjegradspolynomium kan også anvendes. Der gives en generel metode til beregning i hånden. 2. Noter absorbansen ved 450 nm for hver brønd indeholdende en kalibrator. 3. Plot absorbansen på Y-aksen på en lineær skala, og plot infliximab-koncentrationen i kalibratorprøven på X-aksen på en logaritmisk skala, og indtegn den kurve, der passer bedst. 4. Noter absorbansen ved 450 nm for hver brønd indeholdende en specifik prøve. 5. Lokaliser den gennemsnitlige nettoabsorbansværdi, der findes for hver prøve på den lodrette akse og følg en vandret linje, til den skærer kalibratorkurven. 6. Tegn en vertikal linje fra skæringspunktet på kalibratorkurven mod X-aksen. 7. Ved skæringspunktet med X-aksen aflæses infliximab-koncentrationen på den vandrette akse. 8. Gang den opnåede infliximab-koncentration med fortyndingsforholdet for prøven. Dette er den faktiske koncentration af infliximab i prøven. Der skal anvendes et fortyndingsforhold på 1:1500 for kontrol 1 og kontrol 2. 9. Beregn gennemsnittet af begge duplikatværdier for prøven. 3 5

Eksempel på standardkurve efter 10 minutters farvedannelse: Fortolkning Den optimale terapeutiske koncentration af infliximab afhænger af sygdommen i kombination med patientens specifikke karakteristika. Hvis Level-testen udføres til diagnostiske formål og/eller for at fastlægge patientens behandlingsplan, må den fundne koncentration aldrig udgøre en definitiv diagnose, men skal anses som indikation for den kliniske situation, der muligvis vil kræve yderligere diagnostisk undersøgelse. De kliniske parametre skal bruges sammen med infliximab-koncentrationen i beslutningsprocessen. Derudover skal der måles antistoffer mod infliximab, anti-infliximab for patienter med en lav koncentration af disse, hvilket skal tilføjes til resultaterne af immunogenicitetstesten og de kliniske parametre i beslutningsprocessen. Indikation for terapeutiske niveauer for patienter, der behandles med infliximab* Raske donorer og patienter, der ikke behandles med infliximab Subterapeutiske niveauer af infliximab Normale terapeutiske niveauer af infliximab Forhøjede niveauer af infliximab negativ < 3,0 µg/ml 3-7 µg/ml** > 7,0 µg/ml * Der gives kun indikationer for terapeutiske værdier, og hvert laboratorium må definere egne cutoff-værdier til diagnostiske formål. ** Det normale, terapeutiske niveau er den koncentration, hvor en patient har større sandsynlighed for et godt til moderat klinisk respons. Det normale, terapeutiske niveau er ikke nødvendigvis lig med det optimale terapeutiske niveau. Det optimale, terapeutiske niveau er relateret til sygdommen og patientens individuelle parametre. Specifikationer De citerede værdier for testens specifikke ydeevne repræsenterer typisk resultater og må ikke ses som specifikationer for dette analysesæt. Vedlagte informationsseddel indeholder det specifikke analyseinterval for sættet og for infliximab-koncentrationen i kalibratorerne. Genfinding : 94% ved 2 µg/ml (1:1500) Kvantificeringsgrænse nedre : 0,08 µg/ml (1:200) øvre (overflødigt antigen) : intet overflødigt antigen observeret (47 µg/ml ved 1:2000) Præcision Total præcision præcision mellem kørsler 0,30 µg/ml (1:200) : 11,0% 9,5% 2,14 µg/ml (1:1500) : 8,8% 5,8% 17,3 µg/ml (1:2000) : 7,4% 6,5% Lineært interval : 0.22-39.7 µg/ml Ingen krydsreaktivitet med : TNF-hæmmerne infliximab, etanercept og golimumab Interferensfaktorer : Interferens<20% med: hæmoglobin - 5 og 40 mg/ml konjugeret bilirubin - 0,02 og 0,5 mg/ml ukonjugeret bilirubin - 0,1 og 1,5 mg/ml triglycerider - 15 og 50 mg/ml humant serumalbumin - 60 og 80 mg/ml reumatoid faktor (RA) - 1600 U/mL Metodesammenligning assay : 70 patientprøver blev sammenlignet med Sanquin Diagnostic Services' egen, validerede metode analyse : Passing and Bablock: y = 0,91x + 0,04 Spearman correlation: 0,99 Begrænsninger - Analysesættet er alene fremstillet til professionel brug, og brugeren skal være uddannet i og bekendt med ELISA-testprocedurer. - ELISA fungerer optimalt, hvis alle pipetter og systemer bliver kontrolleret og fuldt vedligeholdt i overensstemmelse med fremgangsmåden beskrevet af producenten. - Kun manuel analyse af dette sæt, som beskrevet i denne brugsanvisning, er valideret af Sanquin. Alle krav i denne brugsanvisning er valideret med den manuelle analysemetode. Hvis sættet anvendes på en ELISA-automat, skal testen valideres af brugeren inden brug. Kravene i denne brugsanvisning er ikke gyldige for sættets ydeevne på en ELISA-maskine. - Hvis kontrollerne ikke ligger inden for det angivne interval, er resultaterne ikke gyldige, og testen skal gentages. - Da kontrollerne er fortyndet på forhånd, kan de ikke bruges til at kontrollere prøve- og reagenspræparater af brugeren. - Prøver, der har en optisk tæthed ved OD450 nm uden for kalibratorkurven, er ikke gyldige og kan ikke bruges til beregninger. Ekstrapolering af resultaterne er ikke acceptabelt. Sådanne prøver skal måles i mindre eller større fortyndingsforhold. 4 5

- Der kan fås falskt positive eller negative resultater, hvis prøverne anvendes med interferensfaktorer, der er højere end angivet i specifikationerne. - Kun de reagenser, der er med i sættet, må bruges. Brug ikke reagenser fra forskellige batcher eller lot de kan ikke erstatte hinanden. Dog kan HPE-, TMB-, stop- og vaskebuffer fra andre Sanquin-kits anvendes til biologi, forudsat at materialerne ikke har overskredet deres udløbstid, og at de har været opbevaret i lukkede flasker ved 2-8 C. - Reagenser eller reagensrester (f.eks. dødvolumen) må ikke blandes med indholdet i nyåbnede hætteglas. - Hætter og hætteglas må ikke byttes rundt, hætterne skal sættes på de tilhørende hætteglas. - Der må ikke tilsættes NaN3 til reagenserne, da det påvirker testens ydeevne. - Der må ikke anvendes aluminiumsfolie under inkubationstrinene. -. - Den koncentrerede buffer kan indeholde saltkrystaller. Opvarm den koncentrerede buffer KORT til 37 C til at opløse krystallerne, før De tilbereder arbejdsbufferen. Referencer 1. van den Bemt B.J.F.; Annals of the Rheumatic Diseases. 2008;67:1697-1701. 2. Aarden L.; Current Opinion in Immunology. 2008;20(4):431-435. 3. de Vries M.K.; Annals of the Rheumatic Diseases. 2007;66(9):1252-1254. 4. Wolbink G.J.; Arthritis & Rheumatology. 2006;54(3):711-715. 5. Van der Bemt B.J.F.; British Journal of Clinical Pharmacology. 2013;76(6):939-945. 6. Vande Casteele N.; Gastroenterology. 2015;148:1320-1329. En komplet liste over alle referencer, der er publiceret af Sanquin om infliximab, findes på www.sanquin.org/biologics Det garanteres, at produkter fra Sanquin virker som beskrevet i producentens originale brugsanvisning. Det er af afgørende betydning, at procedurerne, testlayouts samt anbefalede reagenser og udstyr overholdes nøje. Sanquin fraskriver sig ethvert ansvar, som opstår som følge af nogen afvigelse heraf. 5 5