Screening af thrombocytter for HPA-1a antigener

Transkript

1 Resume 1.0 På klinisk immunologisk afdeling, Hillerød Hospital, ønskes der at opsætte en screening af donorer for HPA-1 antigener. Til dette formål, er der ved et tidligere 6. Semester projekt, afprøvet et ELISA kit til HPA-1 fænotypning fra firmaet DiaMed. Dette kit gav mange falsk positive resultater, og derfor går dette projekt ud på at finde en metode, til at forbedre kittet, med henblik på at mindske mængden af falsk positive resultater. I et forsøg på at forbedre metoden, er der over et antal opsætninger ændret på en række parametre som er: prøvemateriale, indførsel af stopreagens, manuel vask, indføring af en ekstra vask, ændret inkubationstemperatur, samt en ekstra blokering. Der blev anvendt i alt 17 prøver fra donorer, hvor 15 er HPA-1a negative og 2 er positive, som forud var HPA genotypebestemt på Rigshospitalet. Disse prøver er analyseret med dobbeltbestemmelser, men én ændret parameter per opsætning. Det blev til i alt 7 opsætninger, hvoraf den ene, er en opsætning ifølge producentens anbefalinger. Resultaterne for opsætningerne, blev vurderet ved hjælp af præcision, tolerance, differensplot, samt diagnostisk specificitet. Der blev ikke fundet frem til en ændring, som kunne mindske mængden af falsk positive resultater, og de falsk positive resultater fremkom gennem hele projektet ved de samme prøver. På baggrund af dette, menes det, at det konjugerede anti- HPA-1a ikke er specifikt nok og binder sig uspecifikt til en anden struktur i ELISA brøndene, og derved fører til falsk positive resultater. Forord 2.0 Dette projekt er udført på klinisk immunologisk afdeling på Hillerød Hospital, under vejledning af hovedvejleder Henriette Lorenzen og klinisk vejleder Karina Jensen. Da projektet kan have betydning for den videre metode til detektion af thrombocyt antigener, henvender det sig til bioanalytikere og læger på klinisk immunologiske afdelinger. Først og fremmest vil jeg takke personalet på klinisk immunologisk afdeling, Hillerød hospital, for god støtte og vejledning gennem projektet. Derudover vil jeg rette en tak til klinisk biokemisk afdeling, Hillerød hospital, for udlån af apparatur og en speciel tak til underviserne på afdelingen for god statistisk vejledning. Til sidst vil jeg ikke mindst takke mine to vejledere, for rigtig god støtte og vejledning, samt for jeres optimistiske opbakning, når der var brug for det. Bioanalytikerstuderende Side 1

2 Indhold Resume Forord Introduktion Problembaggrund Formål Mål Problemformulering Begrebsdefinitioner Teori Thrombocytten Transfusionsbehandling med thrombocytter IgG antistoffer HPA-1a Posttransfusion purpura Neonatal Alloimmun thrombocytopeni ELISA Platelet HPA-1a Typing Assay Metodevalg og afgrænsninger Metodevalg Afgrænsninger Etiske overvejelser Materialer og metoder Materialer Apparatur Kit fra DiaMed Kontroller Pipetter Prøvemateriale Metoder Resultater Cut-off værdier Præcision for opsætning med fuldblod Side 2

3 Opsætning med plasma Differensplot Præcision T-test Opsætning med stopreagens Differensplot Præcision Opsætning med manuel vask Differensplot Præcision Opsætning med ekstra vask Differensplot Præcision Opsætning med inkubering ved 37 grader Differensplot Præcision Opsætning med blokering Differensplot Præcision Diagnostisk specificitet Diskussion Cut-off værdier Fuldblod Plasma Stopreagens Manuel vask Ekstra vask Inkubering ved 37 grader Blokering Diagnostisk specificitet Samlet diskussion Konklusion Perspektivering Side 3

4 Litteraturliste Bilag 1: Pilotprojekter Bilag 2: PCR genotypebestemmelse Bilag 3: Analyseforskrifter Bilag 4: Data til resultatafsnit Bilag 5: Indlægsseddel fra DiaMed Bilag 6: Uddrag af forskrift til blodtypebestemmelse Bilag 7: Produkt specifikation: Thermo Multiskan reader Side 4

5 Introduktion 3.0 Screening af thrombocytter for HPA-1a antigener Problembaggrund 3.1 I forbindelse med transfusion af blodkomponenter, undersøges der for forligelighed mellem AB0 og RhD systemerne for donorblod og recipient. Dette er vigtigt, da det kan give voldsomme hæmolytiske transfusionskomplikationer, hvis der ikke er forligelighed mellem blodtyperne, og patienten i forvejen har A-, B- eller D- antistoffer. Det er nu blevet kendt, at også antigener repræsenteret på overfladen af thrombocytterne, specielt Human platelet antigen type 1a (HPA-1a), har klinisk relevans, når der transfunderes thrombocytter (10). Derfor er det praktisk, at have et panel med kendte HPA-1a negative donorer, så der kan gives blodkomponenter fra disse donorer, til HPA-1a negative patienter. Derudover kan uforligelighed (thrombocyt antigener) mellem mor og barn give komplikationer for barnet, som man i dag kender det med Rh D(9). Som følge deraf er det vigtigt, at HPA-1 fænotypen for thrombocytterne bestemmes på donorer, samt gravide kvinder. Mange steder, blandt andet på Rigshospitalet er kittet Platelet HPA-1a typing assay fra DiaMed, tidligere anvendt, til at bestemme thrombocyt-fænotypen på donorer. Men i forbindelse med et 6. semester projekt, hvor kittet blev afprøvet på klinisk immunologisk afdeling på Hillerød Hospital, blev det opdaget, at kittet gav mange falsk positive resultater. Dette er et problem, da Rigshospitalet kun anvender konfirmatorisk PCR på negative resultater. Derved kan man, hvis kittet giver falsk positive resultater, have donorer registreret elektronisk, som værende HPA-1a positive, hvor de i virkeligheden er negative. Jeg valgte at afdække dette problem, da afdelingen gav udtryk for, at de gerne vil have en screening af donorer for HPA-1a til at fungere hos dem. Derudover mener jeg, at det er vigtigt af få afgjort om dette kit giver falsk positive resultater, og om der eventuelt kan gøres noget for at undgå dette. Dette problem vil jeg afdække ved forsøg, hvor jeg vil ændre på forskellige parametre og derved se, om det kan forbedre metoden, med henblik på at undgå de falsk positive resultater. Formål 3.2 Formålet med dette projekt er at finde frem til en metode, hvorpå sandt positive resultater kan opnås, ved anvendelse af kit fra DiaMed. Ved at opnå dette, kan immunologisk afdeling på Hillerød Hospital, på længere sigt, rutinemæssigt udføre analysen. Derudover forbedres patientbehandlingen, ved at man udfører analysen på et mere sikkert grundlag, med en, forhåbentlig, mindsket risiko for falsk positive resultater. Udover at det vil gavne patienterne, vil det på længere sigt gavne personalet på afdelingen, da de vil føle sig mere sikker på selve analysen og dens usikkerhed. Hvis en patient har brug for blod og det er kendt at patienten er HPA-1a negativ, kan der med fordel gives blod fra en HPA-1a negativ donor. Her er det vigtigt at blodbanken er i besiddelse af et troværdigt panel af donorer, med en kendt negativ HPA- 1a type. Det kan siges, at når det kommer til selve patienten, har de falsk positive resultater ingen konsekvens, da der kun gives HPA-1a positivt blod til patienter, som ikke har risiko for udvikling af HPA-1a antistoffer. Men da der ikke er mange i befolkningen der er HPA-1a negative, kan det få betydning for antallet af donorer i panelet, hvis mange af disse negative donorer bliver testet som positive. Side 5

6 Mål 3.3 Målet med dette projekt er, at forbedre kittet Platelet HPA-1a typing assay fra DiaMed, med hensyn til at nedsætte mængden af falsk positive resultater. Jeg vil undersøge om der ved hjælp af ændringer, som fx andet prøvemateriale, tilsætning af stopreagens, anden inkubationstemperatur, manuel vask osv., kan opnås færre falsk positive resultater. Dette vil jeg finde frem til, ved hjælp af begreber som, diagnostisk specificitet, præcision og tolerance. Problemformulering 3.4 Kan man ved hjælp af ELISA kittet Platelet HPA-1a Typing Assay fra DiaMed, opnå sandt negative resultater, ved at ændre på parametre som prøvemateriale, vask, temperatur, inkubering, blokering og stopreagens? Begrebsdefinitioner 3.5 Sandt negative resultater HPA-1a ELISA CD41 GPIIIa Diagnostisk specificitet Negativt resultat fundet ved PCR Human platelet antigen type 1a Enzyme linked immunosorbent assay Kaldes også GPIIb Kaldes også CD61 En metodes evne til at finde prøver uden antigen. Side 6

7 Teori 3.6 Thrombocytten Screening af thrombocytter for HPA-1a antigener Thrombocytter dannes i knoglemarven af megakaryocytter, som afsnører thrombocytterne af dets cytoplasma. Thrombocytterne findes under normale omstændigheder i et stort antal i blodet ( x 10 9 /l) og de forlader aldrig blodbanen. Efter en levetid på ti dage, i inaktiv tilstand, destrueres thrombocytterne i milten og leveren, hvor de fagocyteres af makrofager (12, 20). Billede 1: Billede af en erytrocyt, til venstre og en thrombocyt til højre (22). Når thrombocytten aktiveres ved en karskade, binder den sig til det skadede væv, ved hjælp af von Willebrands faktor, hvor de svulmer op og udsender løbere. Derudover tømmer thrombocytten sine vesikler, der blandt andet indeholder adenosinfosfat (ADP), som gør overfladen på thrombocytterne klæbrig, hvilket gør, at flere og flere thrombocytter bindes til karskaden. Samtidig danner thrombocytterne også tromboxan A 2, som både stimulerer til frigørelsen af mere ADP, og direkte forstærker sammenklumpningen af thrombocytterne. Denne proces bliver ved indtil der er dannet en prop, som lukker karskaden. For at begrænse prop-dannelsen til det sted hvor karret er beskadiget, danner de raske endotelceller stoffet prostacyklin, der virker som en hæmmer på thrombocytternes klæbrighed. Billede 2: Oversigt over thrombocytternes evne til at fremme hinandens klæbelighed, samt hvordan intakt endotel undgår at der dannes koagler, hvor der ikke er behov for det (12). Kort tid efter at karskaden er sket, aktiveres koagulationssystemet, hvilket medfører at proppen ændres fra at være løst opbygget til at blive forstærket af fibrintråde. Noget tid efter begynder koaglet at trække sig sammen, da thrombocytterne trækker deres udløbere til sig. Derved lukker skaden sig mere og mere sammen, så såret ender med at lukke sig helt (12). Side 7

8 Transfusionsbehandling med thrombocytter Når der behandles med thrombocytkoncentrater ønsker man at standse eller mindske risikoen for en blødning hos patienten. De blødninger der primært bliver behandlet med thrombocytter, er blødninger forsaget af thrombocytdefekter (thrombocytopati) eller mangel på thrombocytter (thrombocytopeni)(19). Ud fra patientens thrombocytkoncentration bestemmes det hvorvidt patienten har behov for thrombocytter. Hvis koncentrationen er højere end 50 x 10 9 /l, har patienten en lille blødningstendens og behandling med thrombocytter er ikke påkrævet. Men hvis koncentrationen er lavere end 10 x 10 9 /l, har patienten en øget risiko for kraftig blødning og Billede 3: Thrombocytkoncentrater(21). thrombocyttransfusion kan blive nødvendig. Hvis der er en mistanke om, at patienten lider af thrombocytopati eller thrombocytopeni, kan det ses ved hjælp af thrombelastografi (TEG). TEG er en analyse der udføres på fuldblod, hvor styrken af et dannet koagel undersøges. Her kan der dannes et overblik over om patienten lider af thrombocytopeni, mangel på koagulationsfaktorer eller har en anden defekt i den hæmostatiske proces. Resultatet kommer frem ved hjælp af en graf, hvor patienten lider af thrombocytopeni eller thrombocytopati, hvis bredden af grafen (MA) er lav (29). I tilfælde hvor patientens thrombocytkoncentration ligger mellem 10 x 10 9 /l og 50 x 10 9 /l, vil man behandle med thrombocytter hvis der er tegn på blødningstendens (19). Når der skal behandles med thrombocytter, er det vigtigt at kende både HPA fænotypen på patienten og på det thrombocytkoncentrat der skal behandles med, da der ved uforligelighed, kan opstå transfusionskomplikationer i form af voldsom thrombocytopeni (PTP). Det er derfor vigtigt at kende HPA fænotypen på donerne, da det er ud fra donorblod, thrombocytkoncentraterne produceres. IgG antistoffer Antistoffer kan deles op i mindre klasser afhængigt af deres udseende, til IgG, IgM, IgE, IgA og IgD. IgG er det antistof som findes i størst koncentration i blodet (ca. 10g/l) og de er aktive i blod, såvel som i vævsvæsker, hvor de kan reagere mod virus, bakterier, og andre antigener som er fremmed for kroppen. Udover denne funktion, besidder IgG antistoffer evnen til, hos en gravid kvinde, at passere over placenta til fostret, som derved beskyttes i de første måneder, til fostrets immunsystem kan klare sig selv. Dannelsen af nye IgG antistoffer ses meget ofte i forbindelse med tidligere transfusionsbehandlinger eller graviditet. IgG antistoffer kaldes varme antistoffer, da de oftest reagerer bedst ved 37 grader, derudover kan IgG aktivere komplement systemet og derved lysere erytrocytter, virus og bakterier (14). Billede 4: Opbygningen af IgG antistof (13). Side 8

9 HPA-1a Antigenerne på overfladen af thrombocytterne kaldes HPA (Human platelet antigen) og blev første gang beskrevet i Der er i alt blevet defineret 24 HPA antigener, hvor 12 af dem er inddelt i mindre grupper, der er nummeret efter hvornår de er blevet offentliggjort (HPA-1, -2, -3, -4, -5 og -15). Antigenerne i disse grupper er angivet i alfabetisk orden, efter hvor hyppigt de ses i befolkningen (fx HPA-5a) (10). I 1959 opserverede van Loghem og medarbejdere, at serum i visse tilfælde kunne agglutinere thrombocyt prøver. Da van der Weerdt senere ( ) opdagede et antigen med lignende egenskaber, valgte de, at kalde det først opdagede antigen for Zw a, og det nyligt fundne antigen for Zw b. I 1961, var der fundet et antistof ved navn anti-pl A1, dette antistof viste sig at være rettet mod det samme antigen som anti-zw a. Derfor blev det besluttet, at slå alle disse fundne antigener og antistoffer sammen i ét system. Dette system hedder i dag HPA-1 systemet og omfatter antigenerne HPA-1a og HPA-1b, samt deres tilhørende antistoffer (10). På overfladen af thrombocytmembranen findes der en masse glycoproteiner. Det er på disse proteiner at HPA antigenerne kommer til udtryk. Glycoproteinerne som udtrykker HPA antigener, sidder meget ofte i par, men de udtrykker stadig noget forskelligt. HPA-1 systemet kommer til udtryk på glycoproteinet GPIIIa (CD61), og personer uden dette glycoprotein er ikke i stand til at udtrykke disse antigener (9). På thrombocytter danner GPIIIa par med GPIIb, som udtrykker antigenerne tilhørende HPA-3 systemet, derfor omtales disse glycoproteiner ofte som GPIIbIIIa (10, 25). Nogle af de glycoproteiner der findes på overfladen af thrombocytter, findes også på overfladen af andre celler, og her er proteinerne ofte parret på en anden måde. GPIIIa findes også på overfladen endotel celler, fibroblaster og celler i glatmuskulaturen. Derfor er disse celler også i stand til at udtrykke antigener fra HPA-1 systemet, så udtrykket Human platelet antigen holder ikke helt (9). Ét glycoprotein er i stand til at udtrykke mange forskellige HPA systemer. Fx udtrykker GPIIIa antigener for systemerne HPA- 1, -4, -16 og nogle af antigenerne fra HPA-5 systemet(10). Antigenet HPA-1a er vidt udbredt blandt den kaukasiske race, hvor 72 % har genotypen HPA-1a1a, 26 % er heterozygote (HPA-1a1b) og 2 % homozygot for HPA-1b (HPA-1b1b) (2). Anti-HPA-1a er et IgG antistof og anses som værende det mest kliniske relevante af thrombocyt antistofferne. Derudover er anti-hpa-1a årsag til de fleste tilfælde af post transfusions purpura (PTP) og neonatal alloimmun thrombocytopeni (NAIT) (9, 10). Posttransfusion purpura PTP er en sjælden form for transfusionskomplikation der kan opstå ca. ½-1 uge efter blodtransfusion (erytrocytsuspension, thrombocytkoncentrat eller plasma), og medfører en alvorlig thrombocytopeni. PTP ses ofte hos kvinder efter postmenopausen som tidligere er blevet immuniseret ved graviditet eller blodtransfusion. I ca. 85 % af tilfældene kan der påvises HPA-1a antistoffer i patientens serum, og tilstanden fremkommer når en HPA-1b1b recipient modtager blodkomponenter indeholdende HPA-1a positive thrombocytter (24, 9). Side 9

10 Det som adskiller PTP fra andre transfusionskomplikationer er, at det ikke kun er de HPA-1a positive thrombocytter som destrueres, men også recipientens egne thrombocytter. Denne destruktion af både donor og patient thrombocytter medfører en voldsom thrombocytopeni, da mængden af thrombocytter falder drastisk. Der menes at være flere årsager til at både donor og patient thrombocytter destrueres: At der enten dannes komplekser mellem donor og patient thrombocytter. Eller at fragmenter fra donor thrombocytter sætter sig på recipientens thrombocytter, og til sidst, at de fremmede antigener stimulerer til dannelse af auto-antistoffer mod GPIIIa/IIb (7). Varigheden for denne tilstand vil i ubehandlet form være fra få dage til flere måneder. Til behandlingen af PTP foretrækkes intravenøst globulin, kortikosteroid og plasmaferese, da transfusion af thrombocytter ikke vil have en virkning i den akutte fase. Men hvis der opstår livstruende blødning, kan store doser trombocytkoncentrat hjælpe til at opretholde hæmostasen (24). Neonatal Alloimmun thrombocytopeni Ca. 10 % af kvinder med genotypen HPA-1b1b, vil danne anti-hpa-1a mod et HPA-1a positivt barn, under en graviditet. Ca. 2 % af børn født af en HPA-1a negativ mor, fødes med alvorlig NAIT (2, 3). Når en HPA-1b1b kvinde bliver gravid med et HPA-1a positive barn, vil mater begynde at danne IgG antistoffer (anti-hpa-1a), mod HPA-1a antigenerne på barnets thrombocytter. Da IgG antistoffer er små, kan de komme ind i fosterets blodbane gennem placenta, hvor Fc-receptorer transportere IgG antistoffer over placenta, og derved kan de binde sig til fosterets thrombocytter, hvorved de destrueres. Dette vil i % tilfældene føre til NAIT, hvor barnet fødes med et kritisk lavt thrombocyttal (< 50 x 10 9 pr. liter blod)(2, 3, 17). Denne form for immunisering, minder på mange måder om immuniseringen mellem mor og barn ved RhD uforligelighed. Men hvor komplikationer først opstår under 2. graviditet ved RhD, ses 50 % af NAIT tilfældene allerede under 1. Graviditet, da antigenet er meget immunogent. NAIT kan føre til at barnet fødes med intrakraniel blødning og i værste tilfælde kan barnet dø, enten post- eller prænatalt (2, 3). Der er mange forskellige måder at behandle NAIT på, og der er også mange delte meninger om hvilken én der er den foretrukne. Der kan tages blodprøver på fosteret, og fosteret kan få en thrombocyttransfusion med HPA-1a negative thrombocytter. Derudover kan man give mater intravenøst globulin (IVIG) eller steroider (2). Det er yderst vigtigt at bestemme HPA-1 fænotypen på mater og eventuelt på fosteret, så udviklingen af antistoffer hos moderen, løbende kan monitoreres og behandling gives, så tidligt som muligt, hvis det bliver nødvendigt (2). ELISA Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), er en form for enzyme immuno assay (EIA), hvor reaktionen er heterogen, dvs. foregår på en fast fase (titerplade). ELISA benyttes til detektion af antigener eller antistoffer, og anvendelsen er vidt udbredt på laboratorier og til levnedsmiddelanalyser (13). Der findes i dag rigtig mange former for ELISA, men overordnet deles det op i kompetitiv og non-kompetetiv ELISA. Den nonkompetitive ELISA, bliver også kaldt sandwich metoden og denne metode kan udføres som direkte og indirekte, alt afhængt af hvor enzymet er placeret i forhold til det stof man ønsker at detektere. Overordnet er princippet i ELISA, at reaktionen Side 10

11 foregår i plastik brønde som er coatede (immobiliseret) med antistoffer mod det søgte antigen. Når prøvematerialet tilsættes, vil antigenerne i prøven binde sig til antistofferne i brønden og ved vask fjernes alt ubundet materiale. Herefter tilsættes endnu et antistof (primært), som vil binde sig til antigenet fra prøven. Dette primære antistof vil, hvis der er tale om en direkte metode, være konjugeret med et enzym og ved at tilsætte et substrat, vil der ske en farveudvikling. Denne farveudvikling vil være proportional med mængden af antistof i prøven og kan måles fotometrisk (13). Billede 5: Princippet i en direkte ELISA, hvor det enzymkonjugerede antistof sidder direkte på det søgte antigen (13). Hvis der er tale om en indirekte metode, vil der blive tilsat et sekundært enzym konjugeret antistof, der er rettet mod det primære antistof. Den indirekte metode giver en forstærkende effekt, dvs. bliver mere følsom, i forhold til den direkte, idet der kan bindes flere sekundære antistoffer til det primære, end primære antistoffer til antigenet. Men denne metode er dog mere tidskrævende og der er større risiko for uspecifik binding. Her er det vigtigt at det immobiliserede antistof og det primære er fra to forskellige dyrearter, da det sekundære antistof ellers vil binde sig til begge antistoffer og ikke kun det primære. Billede 6: Princippet i en indirekte ELISA. Her ses det tydeligt at den indirekte metode har en forstærkende effekt i forhold til den direkte (13). Disse former for ELISA bliver kaldt non-kompetitive, da det primære antistof tilsættes i overskud i forhold til det søgte antigen og derved ikke skal konkurrer om antistoffet(13). Den kompetitive ELISA bygger på en konkurrence mellem antigener i prøven og et tilsat antigen. Dette fungerer ved at brøndene er coatet med antigener (immobiliserede) magen til dem der skal detekteres i prøven. Når der derefter tilsættes prøvemateriale, samtidig med det primære antistof, vil antigener fra prøven konkurrere med de immobiliserede antigener om at binde sig til antistoffet. Når det hele har inkuberet, fjernes komplekser mellem prøve-antigen og antistof, ved vask og et enzymkonjugeret sekundært antistof tilsættes. Efter vask tilsættes substratet hvilket fører til en farveudvikling som måles fotometrisk (13). Det vil sige, at der kun er komplekser mellem det immobiliserede antigen og antistof tilbage. Det betyder at jo mere antigen der er i prøven, jo flere primære antistoffer er bundet og skyllet væk og jo færre komplekser er der tilbage i brønden ved måling. Dette fører til at jo lavere absorbans der måles, jo mere antigen er der tilstede i prøven, dvs. at der her er tale om omvendt proportionalitet (13). Side 11

12 En vigtig del af ELISA er, at den faste fase der anvendes, skal have høj bindingsevne og ikke må medføre for mange ændringer af det immobiliserede antistof. Her kan der vælges mellem forskellige plastmaterialer, men de to mest anvendte er polystyren og polyvinylchlorid, som kan fås både som hele titerplader med 96 brønde eller i strips med 8 eller 16 brønde. Brøndene kan være flade eller u-formede i bunden, men hvis der anvendes u-formede, der dog er nemmere at vaske, skal der på grund af lysbrydning i bunden anvendes dobbelt målebølgelængde. Brøndene kan fås med forskelligt volumen og bindingsevne, alt efter hvor lav detektionsgrænse og størrelse af signal der ønskes (13). Inden brøndene kan anvendes til ELISA, skal de coates, plader kan dog fås coatede fra fabrikanten. Når der coates, er det vigtigt at der coates med en så lav koncentration af antistof som muligt, da brøndene ellers vil blive coatet med ustabile multi-lag af antistoffet. Tiden hvor brøndene ligger i coatings-væsken er vigtig, da for kort tid kan medføre uensartet coatning og hvis der sørges for, at alle brøndene har samme temperatur kan man stort set være sikker på at alle brøndene er coatet ens. Temperaturen og tiden hvor der coates ved er forskellig fra analyse til analyse, men en coatningstid på 3-4 timer ved 37 grader, eller natten over ved 4 grader er passende (13). Derudover skal den buffer der anvendes til at coate med, have den rigtige ph, da det ellers vil give en svag binding mellem antistoffet og plastikoverfladen. Alt dette efterfølges af en grundig vask, hvor coatning buffer og løst bundne molekyler fjernes for at undgå senere krydsreaktion (13). Efter coatning af brøndene, udføres der en blokering. En blokering vil sige at de stadig frie pladser som ikke blev bundet under coatningen, bliver blokeret. Dette gøres, da andre stoffer ellers kan binde sig til disse pladser under reaktionsforløbet. Der er en lang række stoffer som kan anvendes som blokeringsmiddel, herunder bovin serum albumin og Tween 20 og disse stoffer er som regel opløst i Phosphate buffered saline (PBS) eller trisbuffer. Her er det enormt vigtigt at ingen af stofferne i blokeringsbufferen er aktive reaktanter i resten af reaktionsforløbet, samt at brøndene fyldes helt, så hele brønden bliver blokeret. Blokeringstid og temperatur varierer meget fra analyse til analyse og må optimeres til hvert formål, så der ikke sker uspecifik binding. Hvis der anvendes Tween 20, kan dette også tilsættes vaskebufferen, så der blokeres hver gang der vaskes (13). Når antistof og antigen er tilsat i brøndene, vil der ske en reaktion hvor de danner komplekser med hinanden. Denne reaktion vil foregå langsommere end normalt, da antistoffet er immobiliseret, derfor kan inkubationstider på 2 3 timer anvendes hvis man ønsker at reaktionen når at løbe til ende. Men ofte anvendes reaktionstider ned til 10 minutter, da for lange inkubationstider vil øge risikoen for krydsreaktion og uspecifikke bindinger. Hvis der anvendes så korte reaktionstider, er det vigtigt at brøndene får den samme inkubationstid og her vil nøjagtigheden blive dårligere og detektionsgrænsen højere. Inkubationstemperaturen er som regel 37 grader eller stuetemperatur, alt afhængigt af hvilke antistoffer der arbejdes med, og det er optimalt hvis reagenserne er opvarmet til samme temperatur, inden de anvendes (13). Selve visualiseringen sker ved en enzym-substrat reaktion, hvor enzymet, som er konjugeret med det tilsatte antistof, omdanner substratet til et farvestof. Side 12

13 Der kan anvendes mange forskellige substrater, det mest anvendte substrat til ELISA er o-phenylendiamin (OPD). OPD kan dog være vanskeligt at arbejde med, da det for det første er meget lysfølsomt, hvilket gør at reaktionen skal foregå i mørke, derudover er OPD giftigt og mutagent. Desuden leveres det som tabletter der først skal opløses (13). Som erstatning for OPD kan der anvendes 3,3,5,5 -tetramethyl-benzidin (TMB), som før i tiden var anset som værende ufarligt at arbejde med. Men nu er der fundet ud af, at det kan give varig skade, hvis man kommer i kontakt med det. TMB anvendes dog stadig til mange analyser, formentlig da TMB giver større følsomhed end OPD og kan leveres som færdigt reagens. TMB udvikler en kraftig gul eller blå farve, henholdsvis med eller uden anvendelse af stopreagens, hvor ph en forskydes og farven ændres. Hvis der anvendes stopreagens foretrækkes svovlsyre og absorbansen måles ved 450 nm (13). Enzym-substrat reaktionen er afhængig af ph, som også skal fremme antigen-antistofreaktionen. Ofte anvendes en ph omkring kroppens egen ph, på 7,4 i form af en PBS eller tris-hcl buffer. Som regel afbrydes enzym-substrat reaktionen med et stopreagens, inden reaktionen når at løbe til ende og der skal tilsættes så meget substrat, at enzymet ikke når at løbe tør og derved påvirker farveudviklingen (13). Nogle substrater kan omdannes spontant af lys, derfor anbefales det, at der her anvendes en blindprøve som der trækkes fra absorbansen af de andre reaktioner. Derved tages der højde for den spontane omdannelse og resultaterne bliver mere pålidelige. Her er det også vigtigt at beskytte reaktionerne for lys og lade dem reagere i kort tid, men for korte reaktionstider kan også føre til unøjagtighed. Det anbefales at der anvendes tider mellem 10 og 30 minutter (13). Efter reaktion placeres titerpladen i en ELISA reader, der fungerer som et fotometer, der sender lys ned gennem brønden med den valgte bølgelængde. Her måles absorbansen som optical density værdier (OD), hvis maksimale værdi oftest er 2 eller 3 (13). Platelet HPA-1a Typing Assay Dette assay bliver leveret i ét samlet kit, til analyse af 192 prøver per kit og bliver produceret af firmaet DiaMed, der er leverandør af produkter til immunhæmatologi. Kittet indeholder alt der er nødvendigt for at kunne udføre analysen undtagen utensilier, blandt andet to HPA-1a microtiterplader i strips (8x1), som er coatet med anti-cd41 (monoklonalt RFGP56). CD41 eller GPIIb som det også bliver kaldt, er et protein der fungere som en overflademarkør for thrombocytter og forstadier hertil. Derudover indeholder kittet koncentreret anti-hpa-1a Horseradish peroxidase (HRP) konjugat, HPA-1a reaktionsbuffer, HPA-1a HRP substrat (TMB) og koncentreret HPA-1a vaskebuffer(1, 18). Selve analysen bygger på en direkte 1-trins sandwich ELISA til bestemmelse af HPA-1a antigener i fuldblod/plasma. En direkte sandwich ELISA er defineret ved at enzymet er placeret på det primære antistof (se figur 1), og at der er tale om en nonkompetitiv metode. Non-kompetitiv vil sige at antigenet detekteres ved hjælp af et overskud af antistof, hvorimod der ved den kompetitive tilsættes, ekstra af det søgte antigen, så patientens antigener skal konkurrer om pladserne på antistofferne (13). Som tidligere nævnt er det anvendte enzym HRP. HRP er et enzym der er isoleret fra peberrod og er det mest anvendte samt billigste enzym (13). Side 13

14 HRP virker ved at overføre hydrogen fra ét substrat (DH) til hydrogenperoxid (H 2 O 2 ): 2DH + H 2 O 2 2D ox + 2H 2 O DiaMed anvender TMB som substrat, der leveres i en mørk flaske klar til brug, under navnet HPA-1a HRP substrat. Til analysen har DiaMed valgt at der ikke skal anvendes stopreagens og derfor ender reaktionerne med at have en blå farve, som måles ved 630nm (25). DiaMed angiver ikke i indlægssedlen hvilken form for antistof der anvendes, men i en artikel der omhandler dette kit, skriver de at antistoffet er et monoklonalt HPA-1a antistof (1). Derudover nævnes der ikke hvad reaktions- og vaskebufferen indeholder, samt ph og derfor kan jeg ikke beskrive dette. Før analysen udføres, skal konjugatet fortyndes 1:100 med reaktionsbufferen og vaskebufferen fortyndes 1:10 med destilleret vand (25). Analysen startes ved, at fortyndet anti-hpa-1a HRP konjugat tilsættes brøndene, hvorefter prøvematerialet tilsættes og pladen rystes. Herefter inkuberes titerpladen ved stuetemperatur. Her vil thrombocytterne fra prøven binde sig til anti-cd 41 som brøndene var coatet med, og hvis thrombocytterne har HPA-1a antigener på overfladen, vil konjugatet binde sig til disse. Efter inkubering tømmes brøndene og der vaskes med fortyndet vaskebuffer, for at fjerne eventuelt ubundet materiale. Dernæst tilsættes substratet og der inkuberes ved stuetemperatur, hvor TMB bliver omdannet af HRP, hvis enzymet er til stede. Herefter aflæses brøndene i en ELISA reader (25). Til fortolkning af resultaterne anvender DiaMed et gråt område mellem sikker positiv og sikker negativ, denne gråzone strækker sig fra 0,3> OD < 0,5, det vil sige at værdier i dette interval skal genanalyseres. Værdier der falder udenfor gråzonen er enten positive (OD 0,5) eller negative (OD 0,3) for HPA-1a (25). Med dette kit vil DiaMed opnå en metode som er enkel og tidsbesparende i forhold til andre ELISA assay s (1). Billede 7: Analyseprincippet i kittet fra DiaMed (1). Side 14

15 Metodevalg og afgrænsninger 3.7 Metodevalg Det kit fra DiaMed som jeg ønsker at undersøge, er tidligere blevet afprøvet under et 6. semester projekt på Hillerød Hospital. Her gav kittet mange falsk positive resultater i forhold til konfirmatorisk PCR udført på Rigshospitalet. Derfor vil jeg prøve at ændre på forskellige parametre og statistik sammenligne disse resultater, med resultater fra et forsøg, som er udført ifølge indlægssedlen i kittet. Derved kan jeg finde frem til om mængden af falsk positive resultater kan mindskes ved at ændre på metoden. Jeg ønsker at ændre på følgende parametre: Blindprøve: Idet det mistænkes at substratet kan omdannes spontant af lys, vil jeg medtage en blindprøve for hver serie/ændring, da de anbefaler i litteraturen at der anvendes blindprøver i sådanne situationer (13). Jeg vil anvende blindprøver ved alle forsøgsopsætningerne og trække blindværdierne fra absorbansmålingerne. En blindprøve fungerer som et fastlagt nulpunkt, der er en fordel at medtage ved analytisk måling. En blindprøve skal følge analysegangen på samme niveau som prøverne, og de skal bearbejdes på samme måde som prøveopløsningerne, bortset fra at der ikke skal tilsættes prøvemateriale. Det vil sige at blindprøven indeholder alt andet end prøvematerialet. Når der anvendes en blindprøve tages der højde for at reagenser og andre tilsatte stoffer, eventuelt påvirker måleresultatet (15). Prøvemateriale: DiaMed beskriver, at der både kan anvendes fuldblod og plasma til deres analyse (25), da tidligere afprøvninger af kittet er foregået med fuldblod, ønsker jeg at afprøve med thrombocytrigt plasma. Derudover mener jeg at der kan være elementer i fuldblod som kan krydsreagere og derved give anledning til falsk positive resultater. Stopreagens: Jeg undre mig over at der ikke skal anvendes stopreagens, da reaktionen vil fortsætte inde i ELISA readeren, og derved vil der blive målt et højere signal, end hvis reaktionen blev stoppet efter inkuberingen i 10 minutter. I litteraturen omtaler de derudover det anvendte substrat i sammenhæng med anvendelsen af stopreagens, hvilket bestyrker min mistanke (13). Til at stoppe reaktionerne med, har jeg på baggrund af kilde 13, valgt at anvende 3 % svovlsyre, da de anbefaler at det benyttede substrat (TMB), stoppes med svovlsyre. Når der arbejdes med stopreagens, er det yderst vigtigt at analysen, ved store serier, udføres med stopur, så alle prøver får inkuberet lige lang tid. Ellers vil prøver som dryppes op først, få for stor absorbans. Manuel vask: Jeg ønsker at vaske manuelt, da jeg har tænkt at pladevaskeren måske ikke får vasket alt ubundet materiale væk. Desuden anbefaler DiaMed, at brøndene er helt tørre efter vask og dette mener jeg er nemmere at kontrollere hvis der vaskes manuelt (25). Derfor vil jeg prøve at vaske manuelt for at se om dette evt. kan optimere vasken. Side 15

16 Ekstra vask: Hvis forskriften fra DiaMed følges, tilsættes der først konjugat og lige efter tilsættes prøvematerialet. Da jeg synes at det er underligt at ubundet prøvemateriale ikke vaskes væk inden der tilsættes konjugat, vil jeg indføre sådan en vask. Derudover er der i kilde 13 angivet et bud på en ELISA til påvisning af antigen. I dette eksempel bliver prøvematerialet tilsat først, hvorefter der vaskes og til sidst tilsættes konjugatet. Jeg vil derfor først tilsætte prøvematerialet, derefter vaske for at fjerne eventuelt ubundet prøvemateriale, og efterfølgende vil jeg tilsætte konjugatet. Ved dette vil jeg opnå, at konjugatet ikke når at binde sig til andre komponenter i blodprøven og derved give risiko for øget absorbans. Inkubering: Ifølge DiaMed skal reaktionen inkubere ved stuetemperatur, men da anti-hpa-1a er et IgG antistof, vil jeg prøve at inkubere ved 37 grader, da IgG antistoffer er kendt som at reagere bedst ved 37 grader (14). Blokering: Denne ændring blev først tilføjet efter de andre opsætninger var udført, da kittet stadig gav mange falsk positive resultater, så jeg tænkte at brøndene måske ikke er coatet ordentligt fra fabrikanten. Derfor vil jeg blokere som det første i én af opsætningerne for at se om dette kan afhjælpe problemet. Jeg fandt frem til en analyseforskrift fra blodbanken på Glostrup hospital til blodtypebestemmelse (28). Denne forskrift beskriver en blokering med en 0,02 % Tween 20 opløsning, så denne metode ønsker jeg at anvende, til at blokere brøndene i håb om at det vil mindske mængden af falsk positive resultater. Konfirmatorisk test: For at kunne vurdere de resultater som ELISA en giver, skal jeg anvende en Konfirmatorisk test. Her vil jeg anvende den PCR metode, som i dag anvendes til bestemmelse af HPA-1a på vævstypelaboratoriet på Rigshospitalet. Jeg modtager prøver som på forhånd er HPA-genotypebestemt, så jeg derved kender den sande HPA-1a genotype på hver prøve. Kontroller: Til forsøget anvender jeg en negativ og en positiv kontrol fra DiaMed. Jeg anvender disse kontroller da det er dem som hører til kittet og DiaMed anbefaler at der anvendes både én positiv og én negativ kontrol per opsætning (25). Databehandling: Da hovedproblemet er de falsk positive resultater, vil jeg beregne en ny cut-off værdi for opsætningen med fuldblod, for at se om den ligger anderledes end i DiaMed s forskrift. Derudover vil jeg beregne en cut-off værdi for opsætningen med stopreagens, da disse prøver er målt ved en anden bølgelængde. Beregningen af cut-off værdierne, vil jeg foretage med de to negative kontroller der er i hver opsætning, i håb om at dette eventuelt kan nedsætte mængden at de falsk positive resultater. Side 16

17 Der findes forskellige måder hvorpå cut-off værdien kan beregnes, alt afhængigt om falsk positive, eller falsk negative resultater vil undgås. Jeg vil gerne undgå de falsk positive resultater, men samtidig skal huske, at det er de falsk negative der kan medføre de største komplikationer for patienten. Derfor har jeg valgt at anvende en beregning, hvor der er en lille risiko for falsk negative resultater og en smule højere risiko for falsk positive. Formlen lyder: middel neg. kontrol + 3SD (13). Da jeg også ønsker at bestemme en gråzone, har jeg valgt at tage min cut-off værdi plus 0,2 til at danne zonen, da DiaMed anvender en zone på 0,2 (25). Ved præcision, forstås metodens evne til at få nøjagtig samme værdi, ved gentagne målinger på samme prøve, dvs. at præcisionen er et udtryk for de tilfældige fejl (27). Da jeg antager at mine resultater er normalfordelte, kan præcisionen udtrykkes i middelværdi, SD og CV %. For at kunne vurdere de forskellige opsætningers reproducerbarhed (præcision), vil jeg ud fra kontrollerne beregne den inter-serielle præcision (dag til dag variation), som er udtrykt ved variationskoefficienten (CV %), både for det høje og det lave område (henholdsvis positiv og negativ kontrol). Derudover vil jeg beregne en tolerance på hvor meget dobbeltbestemmelserne afviger fra hinanden. Dette gør jeg ved hjælp af formlen: For at vurdere metodens evne til at adskille de HPA-1a negative patienter fra de positive, ønsker jeg at bestemme den diagnostiske specificitet. Jeg er interesseret i den diagnostiske specificitet, da metoden ved et tidligere 6. semester projekt gav mange falsk positive resultater. Specificiteten bestemmes ved hver opsætning, så jeg kan vurdere om metodens evne til at finde HPA-1a negative donorer/patienter forbedres. Den diagnostiske specificitet, fortæller noget om metodens evne til at udelukke patienter/ donorer, der er HPA-1a negative. Beregningen vil jeg foretage med formlen: og denne beregning vil jeg foretage for hver opsætning. Jeg vil derudover beregne differencerne, samt middelværdierne for de enkelte opsætninger, sammen med opsætningen med fuldblod. Disse sættes ind i et differensplot, hvor differencerne placeres på y-aksen, og da de to opsætninger anses som værende ligeværdige, placeres middelværdierne på x-aksen. Her jeg kan se hvordan resultaterne fra opsætningen med fuldblod, ligger i forhold til en anden given opsætning. Da DiaMed mener at der både kan bruges fuldblod og plasma til analysen, ønsker jeg at udføre en parret t-test, til at finde ud af, om der er signifikant forskel på de to opsætninger. Denne test undersøger om middeldifferencen for de to opsætninger er forskellig fra 0, dvs. om det gør en forskel at der anvendes plasma til analysen (27). Alt data opsættes og beregnes i Excel. Side 17

18 Afgrænsninger Da problemet med kittet fra DiaMed er de falsk positive resultater, vil jeg primært koncentrere mig om analysen af de HPA- 1a negative prøver. Derudover har jeg valgt at medtage to positive prøver, 1 homozygot og 1 heterozygot, for at bekræfte at analysen stadig ikke har problemer med at finde disse. Desuden vil man i rutinen, analysere positive og negative prøver sammen, så de positive prøver er også medtaget for at gøre analysen mere troværdig. Da der på nuværende tidspunkt kun er få donorer, der er HPA-genotype bestemt, er mængden af prøver begrænset. Da der derudover er færre negative donorer end positive, blev jeg nødt til at begrænse mængden af negative prøver til det der kunne anskaffes. Det blev til i alt 17 prøver, 15 HPA-1a negative og 2 positive. Jeg har valgt at begrænse mig til kun, at ændre på førnævnte parametre, da der var begrænset tid og ikke nok reagens til at ændre på flere. Derudover mener jeg at de parametre jeg har valgt at ændre, er de mest følsomme parametre i en ELISA og en ændring af disse, er et godt sted at starte. Da det skulle besluttes hvor mange bestemmelser analysen skulle udføres med, blev det bestemt at anvende dobbeltbestemmelser, da mængden af reagens var begrænset. På længere sigt ville det have været bedre hvis der blev anvendt trippelbestemmelser, da der derved ville være flere tal at arbejde med. På baggrund af et andet pilotprojekt, valgte jeg at der ikke skulle korrigeres for aborsbansen af thrombocytter, da en prøve med thrombocytrigt plasma, ikke gav en væsentlig absorbans. Mistanken om der skulle korrigeres for thrombocytter, kom da jeg tænkte, om de thrombocytter der sidder bundet til brønden, kunne være årsag til en højere absorbans og derved de falsk positive resultater. En detaljeret beskrivelse af pilotprojektet kan ses i bilag 1. Etiske overvejelser 3.8 Ifølge Transfusionsmedicinske standarder (24), kan donorblod efter generel tilladelse anvendes som kontrolmateriale, til fastsættelse af referenceområder for rutineanalyser og til udviklings- og forskningsformål. Dette gælder kun hvis et abnormt resultat ikke giver udtryk for sygdom, såfremt skal der indhentes skriftligt samtykke fra donor(24). Men da vores projekt går ud på at detektere HPA-1a antigener, er der ikke tale om påvisning af sygdom. Vores resultater vil ikke påvise en sygdom, men kun vise om donoren har det pågældende antigen eller ej. Når prøverne analyseres blændes de, så de ikke kan spores tilbage til donor. Materialer og metoder 4.0 Materialer 4.1 Apparatur ELISA reader: Thermo multiskan ascent Vasker: Thermo wellwash AC Inkubator: Organon telenika microwell system Incubator 500 Centrifuge: Hettich Rotixa 50 RS (radius = 20cm) Side 18

19 Kit fra DiaMed Platelet HPA-1a typing assay kittet har et overordnet lot nummer: og et reference nummer: V. Reagens Lot/Batch nummer HPA-1a microtiterplader Anti-HPA-1a HRP konjugat HPA-1a reaktionsbuffer HPA-1a HRP substrat HPA-1a vaskebuffer Tween 20 Svovlsyre 3 % (Bie & Berntsen) Konjugatet blev fremstillet frisk hver dag og vaskebufferen blev fremstillet efter behov og opbevaret i køleskab og til analyserne anvendte jeg dobbeltbestemmelser. Kontroller Positiv HPA-1a kontrol: lot nummer: Negativ HPA-1a kontrol: lot nummer: Pipetter o Manuel Biohit finnpipette 2 20µl o Elektronisk Biohit proline finnpipette µl o Elektronisk Biohit proline multikanal finnpipette µl Prøvemateriale Her anvendes der EDTA stabiliseret blod fra donorer. Til nogle opsætninger anvendes fuldblod, og til andre anvendes thrombocytrigt plasma. De prøver der anvendes, indsendes til blodbanken i Hillerød, fra Rigshospitalet, hvor de er HPA genotypebestemt ved PCR, som værende HPA-1a negative. Derudover anvendes prøver som er genotypebestemt til at være HP-1a positive. Når prøverne modtages, bliver de opbevaret som fuldblod i EDTA glas i køleskab ved 4-5 grader. Der anvendes i alt 17 prøver hvor 15 er HPA-1a negative og 2 positive (1 homozygot og 1 heterozygot). Nogle af prøverne modtog jeg forud for vores forsøg, mens andre har stået i køleskab siden 6. Semester projektet i januar 2009 og disse prøver var kraftig hæmolyseret. Jeg valgte at anvende prøverne alligevel, da DiaMed ikke nævner noget og prøvematerialets holdbarhed i indlægssedlen (25). Da jeg blandt andet ønsker at udføre en opsætning med thrombocytrigt plasma, blev der forud for projektet udført et pilotforsøg. Her ville jeg finde frem til en passende centrifugering, som giver plasma med et thrombocyttal på omkring 250 x 10 9 /l, som DiaMed anbefaler det (25). Dette pilotprojekt er beskrevet i bilag 1. Tabel 1: Her ses en oversigt over hvor gamle prøverne var, da projektet blev påbegyndt den 14/ Prøverne blev opbevaret i køleskab ved 4 grader. Prøve nr. 7, 8 1, 14 3, 12 2, , 13 6, 11 4, Uger Side 19

20 Metoder 4.2 Til at starte med, udførte jeg en række pilotforsøg, blandt andet for at finde frem til om der skulle korrigeres for thrombocytterne, hvor mange bestemmelser der skulle anvendes, samt en afprøvning af stopreagenset. Disse forsøg vil jeg ikke komme nærmere ind på, men de er vedlagt i bilag 1. Opsætning som DiaMed foreskriver det (25): Forberedelse: 1. Opløs Anti-HPA-1a HRP konjugat 1:100 i HPA-1a reaktionsbuffer. 2. Før brug, skal vaskebufferen opløses i destilleret vand 1:9. Analysen: µl fortyndet Anti-HPA-1a HRP konjugat tilsættes i brøndene µl prøvemateriale tilsættes og pladen rystes i 10 sekunder. 3. Der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (18 25 grader). 4. Brøndene tømmes og der vaskes 7 gange med 300 µl fortyndet vaskebuffer. 5. Der tilsættes 100 µl HPA-1a HRP substrat og der inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur. 6. Brøndene aflæses i en ELISA reader ved 630nm. Derudover fandt jeg frem til at det fungerede bedst, hvis brøndene tømmes med en pipette i punkt 4. Dette er hoved-forskriften til projektet og alle følgende opsætninger følger denne forskrift, tilsat de ændringer jeg ønsker at foretage. Følgende punkter beskriver hvordan analysegangen ændres ved de forskellige opsætninger og der ændres kun én parameter per opsætning: Plasma: Til opsætningen med plasma er det kun prøvematerialet der ændres til thrombocytrigt plasma. Stopreagens: Til opsætningen med stopreagens tilsættes der 50 µl svovlsyre til alle brøndene efter punkt 5. Der aflæses ved 450nm. Der er også analyseret 10 negative kontroller med stopreagens for at kunne beregne en cut-off for opsætningen. Manuel vask: Ved anvendelse af manuel vask, blev trin 4 udført manuelt, hvor der blev tilsat 300µl vaskebuffer til hver brønd og når pladen var fyldt med vaskebuffer, ventede jeg 10 sekunder, før brøndene blev tømt med en multikanal pipette. Dette blev gentaget 7 gange. Ekstra vask: Til den opsætning hvor jeg vil indføre en ekstra vask, blev prøvematerialet først tilsat, pladen rystet i 10 sekunder og inkuberet i 30 minutter. Efter 5 gange vask, blev konjugatet tilsat og der inkuberes igen i 30 minutter. Herfra blev DiaMed s forskrift fulgt. 37 grader: Ved opsætningen med inkubering ved 37 grader, blev inkuberingen foretaget i en inkubator ved 37 grader. Blokering: Til opsætningen med en ekstra blokering, blokerede jeg i en 0,02 % Tween 20 opløsning (500µl Tween til 250ml destilleret vand). Først hældte jeg Tween opløsningen i en spand, hvorefter pladen kom ned i opløsningen og jeg sørgede for at der ikke var luftbobler i pladen. Efter ca. 20 minutter kom pladen i varmeskab ved 60 grader i 2 timer for at tørre. Resten af analysen fulgte DiaMed s forskrift. Specificerede analyseforskrifter kan findes i bilag 3. Side 20

21 Resultater 5.0 Forud for projektet blev der udført en række pilotforsøg, resultaterne af disse kan ses i bilag 1. Resultaterne for den konfirmatoriske PCR, har jeg skrevet ind i Excel og vedlagt som bilag 2. I mine beregninger har jeg ikke fratrukket blindprøverne, da disse ikke kunne anvendes. Hvorfor jeg har valgt at udelade blindprøverne, vil jeg komme nærmere ind på i min diskussion. Tabel 2: Oversigt over middelværdien på absorbansmålingerne for alle opsætninger. De resultater som er markeret med rød er positive (OD 0,5), de grønne er i gråzonen (0,3 < OD < 0,5) og de sorte er negative (OD 0,3). Opsætningen med stopreagens er bedømt ud fra grænserne nævnt i punkt 5.1. Prøve nummer 5 og 15 (markeret med fed skrift), er bestemt som værende positive ved PCR og resten er bestemt som værende HPA-1a negative. Blind er ikke trukket fra dataene. Fuldblod Plasma Stopreagens Manuel vask Ekstra vask 37 grader Blokering 1 0,211 0,237 0,500 0,203 0,233 0,232 0, ,564 0,531 1,469 0,620 1,495 0,658 0, ,222 0,221 0,500 0,126 0,401 0,191 0, ,739 0,647 1,737 0,474 1,150 0,542 0, ,781 2,228 5,368 1,516 1,876 3,008 1, ,938 1,993 6,000 2,484 2,421 2,584 2, ,118 0,117 0,542 0,072 0,140 0,093 0, ,219 0,152 0,195 0,160 0,212 0,165 0, ,070 0,065 0,316 0,053 0,102 0,067 0, ,372 1,972 3,269 1,090 1,977 1,502 0, ,129 0,471 1,064 0,055 0,099 0,085 0, ,986 2,614 5,640 2,824 2,671 3,022 2, ,487 0,349 1,257 0,386 0,794 0,513 0, ,092 1,173 1,545 0,050 0,085 0,112 0, ,562 2,109 4,991 1,156 2,047 2,484 1, ,238 1,604 4,929 1,828 2,033 2,073 1, ,251 0,212 0,485 0,121 0,200 0,115 0,226 Blind 0,082 1,429 0,086 0,089 0,154 0,272 Tabel 3: Her ses en oversigt over positive og negative resultater ved hver opsætning. Vurderingen af positive og negative prøver, er gjort på baggrund af middelværdierne for dobbeltbestemmelserne. I tabellen er også placeret resultaterne for den konfirmatoriske PCR, som anses som værende de sande værdier. Middelværdier samt resultater fra PCR kan ses i bilag 2 og 4. PCR Fuldblod Plasma Stopreagens Manuel vask Ekstra vask 37 grader Blokering HPA-1a pos HPA-1a neg Gråzone Side 21

22 Plasma - fuldblod Cut-off værdier 5.1 Screening af thrombocytter for HPA-1a antigener Her har jeg beregnet en cut-off værdi for opsætningen med fuldblod, samt for opsætningen med stopreagens. Cut-off værdien for fuldblod, vil jeg anvende til sammenligning med cut-off værdien som DiaMed anbefaler. Cut-off værdien for stopreagens, vil jeg benytte til at vurdere mine data fra opsætningen med stopreagens, da disse værdier er målt ved en anden bølgelængde. Data kan ses i bilag 4. Cut-off for fuldblod: OD 0,2 er HPA-1a negative OD > 0,2 - < 0,4 er i gråzonen OD 0,4 er HPA-1a positive Cut-off for stopreagens: OD 0,7 er HPA-1a negative OD > 0,7 - < 0,9 er i gråzonen OD 0,9 er HPA-1a positive Præcision for opsætning med fuldblod 5.2 Tabel 4: Beregning af præcisionen udtrykt ved CV % samt tolerance for den positive og negative kontrol. Positiv kontrol Negativ kontrol Middel 3,690 0,068 SD 0,053 0,007 CV % 1,4 10,4 Tolerance 2,0 14,7 Opsætning med plasma 5.3 Differensplot ,00 1,00-1,00 Differensplot - fuldblod vs. Plasma -3,00-0,50 0,50 1,50 2,50 3,50 Middelværdi af fuldblod og plasma Figur 1: Et differensplot der viser forskellen på de to opsætninger. På x-aksen er middelværdien for de to opsætninger, da de anses som værende ligeværdige. På y-aksen er differencen mellem de to opsætninger. Data kan ses i bilag 4. For at kunne vurdere de to metoder i forhold til hinanden, har jeg fremstillet et differensplot. Her kan det ses hvordan de to opsætninger ligger i forhold til hinanden, og om den ene evt. har tendens til at medføre højere værdier end den anden. Side 22

23 Stopreagens - fuldblod Screening af thrombocytter for HPA-1a antigener Præcision Tabel 5: Beregning af præcisionen udtrykt ved CV % for den positive og negative kontrol. Positiv kontrol Negativ kontrol Middel 3,417 0,071 SD 1,009 0,003 CV % 29,5 4,0 Tolerance 41,8 5,6 T-test Tabel 6: t-test; α=0,05. Se bilag 4 for data t-stat 0,952 P to-halet 0,355 Ud fra denne test kan det vurderes, om der er signifikant forskel på de to opsætninger. Er p-værdien under 0,05 er der påvist en signifikant forskel. Opsætning med stopreagens 5.4 Differensplot ,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00-0,50 Differendplot - fuldblod vs. stopreagens 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 Middelværdi af fuldblod og stopreagens Figur 2: Et differensplot der viser forskellen på de to opsætninger. På x-aksen er middelværdien for de to opsætninger, da de anses som værende ligeværdige. På y-aksen er differencen mellem de to opsætninger. Data kan ses i bilag 4. Præcision Tabel 7: Beregning af præcisionen udtrykt ved CV % og tolerancen for den positive og negative kontrol. Positiv kontrol Negativ kontrol Middel 4,558 0,114 SD 0,172 0,002 CV % 3,8 1,9 Tolerance 5,3 2,6 Side 23

24 Ekstra vask - fuldblod Manuel vask - fuldblod Screening af thrombocytter for HPA-1a antigener Opsætning med manuel vask 5.5 Differensplot ,50 0,00-0,50-1,00-1,50-2,00-2,50 Differensplot - fuldblod vs. Manuel vask 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 Middelværdi af fuldblod og manuel vask Figur 3: Et differensplot der viser forskellen på de to opsætninger. På x-aksen er middelværdien for de to opsætninger, da de anses som værende ligeværdige. På y-aksen er differencen mellem de to opsætninger. Data kan ses i bilag 4. Præcision Tabel 8: Beregning af præcisionen udtrykt ved CV % for den positive og negative kontrol. Positiv kontrol Negativ kontrol Middel 3,498 0,058 SD 0,066 0,005 CV % 1,9 8,6 Tolerance 2,7 12,2 Opsætning med ekstra vask 5.6 Differensplot Differensplot - fuldblod vs. ekstra vask 2,00 1,00 0,00-1,00-2,00-3,00 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 Middelværdi af fuldblod og ekstra vask Figur 4: Et differensplot der viser forskellen på de to opsætninger. På x-aksen er middelværdien for de to opsætninger, da de anses som værende ligeværdige. På y-aksen er differencen mellem de to opsætninger. Data kan ses i bilag 4. Side 24

25 37 grader - fuldblod Screening af thrombocytter for HPA-1a antigener Præcision Tabel 9: Beregning af præcisionen udtrykt ved CV % for den positive og negative kontrol. Positiv kontrol Negativ kontrol Middel 4,076 0,084 SD 0,009 0,006 CV % 0,2 7,6 Tolerance 0,3 10,8 Opsætning med inkubering ved 37 grader 5.7 Differensplot ,20 0,00-0,20-0,40-0,60-0,80 Differensplot - fuldblod vs. 37 grader 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 Middelværdi af fuldblod og 37 grader Figur 5: Et differensplot der viser forskellen på de to opsætninger. På x-aksen er middelværdien for de to opsætninger, da de anses som værende ligeværdige. På y-aksen er differencen mellem de to opsætninger. Data kan ses i bilag 4. Præcision Tabel 10: Beregning af præcisionen udtrykt ved CV % for den positive og negative kontrol. Positiv kontrol Negativ kontrol Middel 3,266 0,081 SD 0,190 0,006 CV % 5,8 7,0 Tolerance 8,2 9,9 Side 25

26 Blokering - fuldblod Opsætning med blokering 5.8 Screening af thrombocytter for HPA-1a antigener Differensplot ,50 0,00-0,50-1,00-1,50-2,00-2,50 Differensplot - fuldblod vs. Blokering 0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 Middelværdi for fuldblod og blokering Figur 6: Et differensplot der viser forskellen på de to opsætninger. På x-aksen er middelværdien for de to opsætninger, da de anses som værende ligeværdige. På y-aksen er differencen mellem de to opsætninger. Data kan ses i bilag 4. Præcision Tabel 11: Beregning af præcisionen udtrykt ved CV % samt tolerance for den positive og negative kontrol. Positiv kontrol Negativ kontrol Middel 1,361 0,075 SD 0,168 0,004 CV % 12,4 4,7 Tolerance 17,5 6,7 Diagnostisk specificitet 5.9 Tabel 12: Her ses en oversigt over den diagnostiske specificitet for hver opsætning. Fuldblod Plasma Stopreagens Manuel vask Ekstra vask 37 grader Blokering Specificitet 57,1 % 40,0 % 40,0 % 53,3 % 46,7 % 53,3 % 53,3 % Side 26

27 Diskussion 6.0 Screening af thrombocytter for HPA-1a antigener Til dette projekt har jeg anvendt prøver fra HPA-1 genotype bestemte donorer, hvor 15 er HPA-1a negative, og 2 er positive. Disse prøver er blevet analyseret med kittet Platelet HPA-1a Typing Assay fra DiaMed, hvor jeg har prøvet at ændre én parameter per opsætning. Dette førte til en lang række resultater, i form af dobbeltbestemmelser for hver prøve, som er omregnet til middelværdier og anvendt til opsætning af et differensplot. Derudover er resultaterne for kontrollerne, anvendt til at beregne præcisionen for hver opsætning, både i det lave og høje område. Før projektets start mistænkte jeg, at substratet kunne omdannes spontant af lys, derfor valgte jeg at medtage blindprøver til alle opsætninger, undtagen den med fuldblod, da DiaMed ikke nævner at der skal anvendes blindprøve til kittet. At substratet omdannes spontant, kan føre til falsk positive værdier, da farveudviklingen ikke kun sker på grund af enzymet, men også på grund af lyset i omgivelserne. Til blindprøverne blev alle reagenser tilsat, undtagen prøve/kontrol, i håb om at dette kunne afhjælpe de falsk positive resultater. Der blev inddraget to blindprøver i hver serie, hvor min tanke var at trække middelværdien af blindprøverne fra absorbansen af de enkelte prøver, for derved kun, at få absorbansen for farveændringen forsaget af enzymet tilbage. Men i løbet af analyseprocessen, så jeg at blindprøverne gav forholdsvis høje absorbanser og til tider højere absorbanser end prøverne (tabel 13). Da blindprøverne blev så høje, valgte jeg at de ikke skulle trækkes fra prøveværdierne, da jeg ville få mange negative absorbanser, som ville være svære at regne videre på. Som det kan ses i tabel 13, er blindværdierne til tider meget høje og varierer meget fra blind a til blind b. Umeldbart mener jeg, at der kan være flere årsager til disse høje værdier, det kan være at der er sket kontaminering af brøndene med blindprøverne, men dette mener jeg er usandsynligt, da der forekommer høje værdier ved næsten alle blindprøverne. Det kan også være at substratet er meget følsomt overfor lys, og omdannes spontant på ingen tid. Hvis dette er tilfældet, kunne det godt være svar på de falsk positive resultater, men så burde alle negative prøver blive positive og ikke kun del af prøverne. Jeg mener dog stadig at substratet, TMB, til en vis grad er følsom overfor lys, da DiaMed i indlægssedlen skriver, at pladen skal beskyttes mod lys, hvis den ikke kan aflæses efter inkubering med TMB (25). Derudover bliver substratet leveret i en brun lystæt flaske og et dansk firma ved navn Kem-En-Tec Diagnost ics A/S skriver i et sikkerhedsdatablad for TMB, at det skal opbevares beskyttet mod lys (23). Tabel 13: Blindværdier. Plasma Stopreagens Manuel Ekstra 37 Blokering vask vask grader Blind a 0,085 0,197 0,121 0,091 0,129 0,247 Blind b 0,078 2,661 0,050 0,086 0,178 0,296 Da der ved et tidligere 6. semesterprojekt i blodbanken på Hillerød hospital, blev fundet mange falsk positive resultater, vil jeg ud fra mine resultater analysere og vurdere dataene med henblik på mængden af falsk positive værdier. Derudover vil jeg senere diskutere præcisionen for de forskellige opsætninger, samt ved hjælp af differensplottet, diskutere hvordan en given opsætning bliver målt i forhold til metoden med fuldblod. Da metoden med fuldblod, er den metode som DiaMed anbefaler(25), vil jeg gennem hele min diskussion sammenligne resultaterne fra fuldblods metoden, med hver enkelt ændring/opsætning. Side 27

28 Cut-off værdier 6.1 Da problemstillingen i denne opgave handler om de falsk positive resultater, synes jeg at det ville være relevant at kigge på cut-off værdien, da det er denne værdi der bestemmer grænsen mellem positive og negative prøver. I indlægssedlen til DiaMed s kit skriver de at cut-off værdien er 0,3 og gråzonen går fra 0,3 til 0,5 (25). I mine beregninger hvor jeg har anvendt 10 negative kontroller, som er analyseret efter forskriften fra DiaMed (25), får jeg cut-off værdien til at være 0,2 og jeg har bestemt at gråzonen skal være lige så stor som den DiaMed anvender, dvs. fra 0,2 til 0,4. Jeg har kun valgt at beregne en cut-off værdi for opsætningen med fuldblod og stopreagens (se senere), og cut-off værdien for fuldblod vil jeg anvende til alle opsætningerne, undtagen den med stopreagens. Det kan diskuteres om det ikke ville være mere hensigtsmæssigt, at bestemme en cut-off for alle opsætningerne, da grænsen muligvis ville rykke sig ved en ændret parameter. Dette mener jeg ville være en fordel, da hver opsætning derved kan bedømmes, med en cut-off værdi der er tilpasset de ændringer jeg har fortaget. Men disse tanker kom først efter at forsøget var færdiggjort, og derfor er der kun beregnet de førnævnte værdier. Cut-off værdien på 0,2 kan ikke mindske mængden af falsk positive resultater, da grænsen er lavere end før. Der vil derimod opnås flere falsk positive resultater, hvis denne cut-off værdi anvendes. Til at beregne førnævnte cut-off værdi har jeg anvendt en metode, hvor der undgås færre falsk negative resultater, da det stadig et de falsk negative man helst vil undgå. Der er to andre måder hvorpå en cut-off kan beregnes, men disse har jeg valget fra, da den ene øgede risikoen for falsk negative resultater og den anden ville give flere falsk positive, disse to beregningsmetoder er angivet i kilde 13. Hvis min beregnede cut-off værdi blev større end den fra DiaMed, ville dette havde været en fordel, da grænsen mellem positiv og negativ ville være højere og derved ville nogle af de falsk positive resultater blive negative eller komme til at ligge i gråzonen. Hvis der kigges på resultaterne i tabel 2, kan det ses, at værdierne for de falsk positive resultater ligger højt, så jeg tvivler på at en højere cut-off værdi ville have haft en indvirkning her. Der står ikke i indlægssedlen hvordan DiaMed har beregnes deres cut-off værdi, så derfor kan jeg ikke vurdere deres cut-off overfor min. I en artikel som blandt andet er skrevet af to ansatte fra DiaMed (1), skriver de at, de under udviklingen af dette assay har bestemt hvordan resultaterne for kittet skal fortolkes. Her har de fundet frem til en cut-off værdi på 0,2 og en gråzone mellem 0,2 og 0,3, og at prøver over 0,3 er positive. I denne artikel er cut-off værdien beregnet med samme formel som jeg har anvendt (middel + 3SD), og deres cut-off værdi passer til den jeg har beregnet. Men hvorfor den er forskellig fra den i indlægssedlen, skal jeg ikke kunne sige, da jeg, som sagt, ikke kender beregningsmetoden der er anvendt i det ene tilfælde. I et andet studie (4), hvor de anvender en metode magen til den der anvendes i dette projekt, har de også beregnet cut-off med formlen middel + 3SD, og har fundet en nedre cut-off til at være 0,266, hvilket igen passer nogenlunde med den jeg har beregnet. De skriver derudover at alle absorbanserne for de positive prøver, lå over 0,8 og at denne værdi har hjulpet dem med at definere den øvre cut-off til at være 0,6 (4). Hvordan de har beregnet denne øvre grænse, skriver de desværre ikke noget om. Derfor bliver jeg nødt til at fastholde min, lidt usikre, øvre grænse til 0,4, da jeg ikke ved hvordan den øvre cut-off værdi beregnes. Da prøverne i opsætningen hvor jeg anvender stopreagens, er målt ved 450nm i stedet for 630nm, mener jeg at det er nødvendigt at vurdere om prøverne er negative eller positive, ud fra en anden grænse end de andre opsætninger. Derfor har Side 28

29 jeg ved hjælp af 10 negative kontroller, beregnet en ny cut-off værdi for opsætningen. Jeg bestemte grænsen til at være 0,7 og en gråzone fra 0,7 til 0,9, dvs. at prøver over 0,9 er positive og prøver under 0,7 er negative. Denne grænse ligger lidt højere end de andre cut-off værdier, og da det i tabel 2 kan ses, at resultaterne for opsætningen med stopreagens, ligger lidt højere end de andre opsætninger, stemmer dette meget godt overens. Fuldblod 6.2 Opsætningen er udført som DiaMed anbefaler og er opstillet med henblik på at sammenligne denne opsætning med de serier hvor der er foretaget ændringer. Som det kan ses i tabel 3, medfører denne analyse 6 falsk positive resultater, som alle gav absorbanser langt over cut-off på 0,5, samt 1 resultat i gråzonen som ligger tæt på den øvre cut-off. Dette giver et godt grundlag for at sammenligne med de andre serier, i håb om, at disse vil mindske mængden af falsk positive resultater. Plasma 6.3 Analysen ved denne opsætning blev udført ifølge forskriften fra DiaMed (25), det eneste der er ændret er prøvematerialet, som her er thrombocytrigt plasma. Denne ændring har jeg valgt at foretage, da DiaMed skriver, at der til denne analyse både kan anvendes fuldblod og plasma. Derfor har jeg valgt at undersøge om det gør en forskel for analyseresultatet, og ikke mindst de falsk positive resultater, at jeg anvender plasma. Hvis der kigges i tabel 3, kan det ses, at der ved denne opsætning er 9 HPA-1a positive, 6 negative og 2 prøver i gråzonen. Dette giver, at der her er 7 falsk positive prøver, hvilket er flere end i opsætningen med fuldblod. Forud for denne opsætning, mente jeg at anvendelse af plasma i stedet for fuldblod, ville minimere risikoen for falsk positive resultater, da jeg havde en formodning om at antistoffet kunne binde sig til andre komponenter i blodet end thrombocytter. Ifølge dette projekt er dette dog ikke tilfældet, da der er flere falsk positive, end ved anvendelse af fuldblod som prøvemateriale. I figur 1 har jeg fremstillet et differensplot, hvor det kan ses om den ene opsætning eventuelt medfører højere absorbanser end den anden. I differensplottet har jeg valgt at placere middelværdien for plasma og fuldblod på x-aksen, da jeg anser dem som værende ligeværdige. Når et differensplot skal vurderes, ses der hvor punkterne ligger i forhold til 0-linjen. Hvis punkterne samler sig omkring 0- linjen, medfører de to opsætninger ens resultat. I figur 2 kan det ses at punkterne tilnærmelsesvis samler sig omkring 0 i det lave område, men kommer længere og længere væk fra linjen, jo højere absorbansen bliver. Værdierne i det højere område ligger under linjen og ud fra dette, kan det ses at metoden med fuldblod generelt medfører højere absorbanser end den med plasma. Dette mener jeg primært kan skyldes, at der i fuldblod er en højere koncentration af thrombocytter end i plasma. Til dette projekt er der anvendt thrombocytrigt plasma, som er fremkommet ved skånsom centrifugering. Selvom thrombocytrigt plasma indeholder en højere koncentration af thrombocytter end almindeligt plasma, vil koncentrationen ikke være så høj som i fuldblod, da en del thrombocytter, trods den skånsomme centrifugering, vil blive presset ned mod erytrocytterne. Så derfor mener jeg at absorbansen er højere for fuldblod, da der er flere thrombocytter til stede i brøndene, end ved opsætningen med plasma. Side 29

30 Derudover var der en tendens til at der kunne samle sig rester af størknet blod i og omkring brønden, og at dette muligvis kunne føre til en højere absorbans. En anden årsag kan være, at der i fuldblod er flere muligheder for at antistoffet kan binde sig uspecifikt til andre celler end thrombocytter og nogen af disse celler kan sidde i det størknede blod i brønden. Derved vil HRP omdanne både substratet på thrombocytterne og substratet tilhørende de uspecifikke bindinger og derved give en højere absorbans end opsætningen med plasma. I tabel 5 kan der ses en oversigt over resultaterne fra beregningen af den inter-serielle præcision. Denne præcision fortæller hvor god kittet er til at til at få den samme værdi, ved analyse af den samme prøve, når der anvendes plasma som prøvemateriale. Præcisionen er udtrykt ved CV % og er bestemt ud fra de to kontroller som er analyseret i serien. Normal beregnes præcisionen på baggrund mange målinger på den samme prøve. Men her er præcisionen beregnet ud fra to målinger, på henholdsvis den positive og negative kontrol. Derfor skal disse præcisioner tages med forbehold, da der kun ligger to værdier til grund for beregningen. I tabel 5 kan det ses at CV % i det høje område (positiv kontrol) er 29,5 og i det lave område er 4,0. Dette viser at analysen, hvor der anvendes plasma, er mest præcis ved måling i det lave område. I tabel 4 er resultaterne for beregning af præcisionen ved opsætning med fuldblod opstillet. Her kan det ses at præcisionen er bedst i det høje område med en CV % på 1,4, og CV % for det lave område er 10,4. Jeg kan ud fra dette vurdere at præcisionen forbedres i det lave område, hvis der anvendes plasma frem for fuldblod. Men som sagt skal disse beregninger tages med forbehold, da der ikke er anvendt nok værdier til grundlag for beregningen. Desværre kan jeg ikke vurdere præcisionen yderligere, da DiaMed i indlægssedlen ikke skriver noget om præcisionskrav til analysen. Men de skriver at dobbeltbestemmelser ikke må variere mere end 20 % fra hinanden (tolerance på 20 %), ellers skal prøven analyseres igen (25). Hvis der kigges på tolerancen for opsætningen med plasma, kan det ses at det kun er tolerancen for den negative kontrol der holder sig under de 20 %. Derfor vil det vælges at forkaste resultaterne for den positive kontrol og genanalysere. Til sidst har jeg valgt at udføre en parret t-test, da DiaMed mener at det ikke gør en forskel om der anvendes plasma eller fuldblod til analysen. En t-test anvendes til at undersøge om middel differencen for de to metoder er forskellig fra nul, dvs. om der er signifikant forskel på resultaterne mellem de to opsætninger. I tabel 6 kan det ses, at testen giver en p-værdi på 0,355 og da p-værdien er højere end signifikansniveauet på 0,05, er der ikke påvist en signifikant forskel på de to opsætninger. Det vil sige at det ikke har betydning for måleresultatet, om der anvendes fuldblod eller thrombocytrigt plasma. Dette mener jeg er en stor fordel for analysen, da hele processen med centrifugering kan udelades og arbejdsganges derved lettes. I et studie som er foretaget af Garner et al. i 1999 (4), anvendes der en ELISA metode som har identisk analyseforskrift med den DiaMed metode der anvendes i dette projekt. Her analyserer de både på fuldblod og thrombocytrigt plasma, som på forhånd er HPA-1 genotypebestemt ved SSP-PCR. I dette studie konkluderer de at metoden både kan anvendes med fuldblod og plasma, da den kan skelne mellem positive og negative resultater ved thrombocytkoncentrationer helt ned til 25 x 10 9 /l (4). Dette resultat stemmer overens med resultatet af dette studie, da t-testen viste at der ikke var en forskel på om der blev anvendt plasma eller fuldblod. Side 30

31 Stopreagens 6.4 Denne ændring blev fortaget da jeg havde en formodning om at reaktionen vil fortsætte efter inkubering med substratet, og derved medføre en højere absorbans end hvis reaktionen blev stoppet efter 10 minutter. Selve analysen er udført ifølge forskriften fra DiaMed, men hvor stopreagenset er tilsat efter inkubering med substratet og aflæsningen er foretaget ved 450nm. I tabel 3 kan det ses at der ved opsætningen med stopreagens er fundet 9 falsk positive resultater, hvilket er en forringelse i forhold til opsætningen med plasma. I figur 2 kan der ses et differensplot hvor opsætningerne med fuldblod og stopreagens er sat overfor hinanden. Her har jeg igen valgt at de to opsætninger skal anses som ligeværdige, da jeg ikke ser en sikkerhed i analysen med fuldblod som prøvemateriale. I plottet kan det ses, at alle værdierne ligger over 0-linjen, hvilket vil sige at anvendelse af stopreagens, medfører en højere absorbans end opsætningen med fuldblod. Årsagen til dette er, at reaktionen skiftede farve ved tilsætning af stopreagens, fra blå til en kraftig gul farve. Denne gule farve, er årsagen til at målingerne er foretaget ved 450nm og ikke 630nm som der står i analyseforskriften. I princippet kan målingerne godt bruges, selvom de ligger meget højere end dem for fuldblod. Her er det bare yderst vigtigt at bestemme nye cut-off værdier, så resultaterne bliver vurderet i forhold til niveauet i målingerne. Derfor har jeg beregnet en nedre cut-off værdi (beskrevet tidligere) til at være 0,7 og den øvre har jeg sat til at være 0,9 og det er disse værdier som resultaterne for denne opsætning er vurderet ud fra. Når der skal vælges et stopreagens, kan alle stærke syrer og baser anvendes, så længe ph en i reaktionen forskydes nok, til at enzymreaktionen stoppes. Jeg valgte at anvende 3 % svovlsyre, da det var tilgængeligt på hospitalet og derudover nævnes det i litteraturen at reaktioner mellem HRP og TMB stoppes med svovlsyre (13). I tabel 7 er resultaterne for beregningerne af præcision og tolerance. Præcisionerne for den positive og negative kontrol, henholdsvis CV % på 3,8 og 1,9, viser at der ved denne opsætning er opnået god præcision i det lave, såvel som i det høje område. Dette er en fordel, da man er sikker på at metoden ikke laver tilfældige fejl, dvs. at analyseusikkerheden er lav. Som nævnt tidligere, skriver DiaMed at tolerancen på dobbeltbestemmelserne er 20 %. Ifølge resultaterne i tabel 7, er tolerancen 5,3 % i det høje område og 2,6 i det lave. Disse værdier ligger under 20 % og derfor kan dobbeltbestemmelserne anses som værende troværdige, da de overholder tolerancen. Efter at have kigget på de beregnede resultater for opsætningen med stopreagens, mener jeg at denne opsætning fungere lige så godt som den med fuldblod. Men da det overordnede problem er de falsk positive resultater, vil jeg i den samlede diskussion, komme ind på de falsk positive resultater som er opstået i denne opsætning, samt vurdere den beregnede diagnostiske specificitet. Side 31

32 Manuel vask 6.5 Da jeg skulle planlægge hvilke ændringer jeg ville foretage, valgte jeg blandt andet, at prøve at vaske manuelt i stedet for maskinelt. I indlægssedlen til kittet skriver DiaMed at det er vigtigt at brøndene er helt tørre efter vask, inden substratet tilsættes. Derfor ville jeg prøve at vaske manuelt 7 gange med 300µl vaskebuffer ved hjælp af en multikanalpipette. Til projektets andre opsætninger er vasken foregået maskinelt i en pladevasker fra Thermo, og allerede ved pilotforsøgene lagde jeg mærke til at vaskeren efterlod en meget lille dråbe vaskebuffer midt i bunden i brønden. Da DiaMed som sagt anbefaler at brøndene er helt tørre, prøvede jeg om det sidste væske kunne bankes ud af brøndene, men dette kunne ikke lade sig gøre. Så derfor mistænkte jeg, at dette er årsagen til da falsk positive resultater og specielt efter en repræsentant fra DiaMed lage det samme til grund for problemet. På oversigten i tabel 3, kan det ses at opsætningen med manuel vask har ført til 5 falsk positive resultater, hvilket er det færreste antal indtil videre. I differensplottet (figur 3), ligger næsten alle punkterne under 0-linjen, hvilket betyder at metoden med fuldblod medfører højere absorbanser end med manuel vask. Dette kan kobles sammen med det mindre antal falsk positive resultater, da en mindre absorbans kan medfører at nogle værdier vil komme under cut-off og derved gå fra positiv til negativ. I dette tilfælde drejer det sig om prøve nummer 4 der ved fuldblod er målt til 0,739 og ved manuel vask fik en absorbans på 0,474 (tabel 2). Det vil sige at prøven er kommet ned under den øvre cut-off på 0,5 og er gået fra at være positiv til at været i gråzonen. Om dette på længere sigt vil gøre en forskel, kan jeg ikke sige, da jeg ikke havde muligheden for at genanalysere prøver i gråzonen. Jeg fandt frem til, at det stort set er umuligt at efterlade brøndene helt tørre. Lige meget hvor meget jeg koncentrerede mig om at få suget enhver dråbe op af brøndene, blev der altid en lille dråbe tilbage, ligesom ved den maskinelle vask. Hvorfor brøndene skal være helt tørre, kan måske være fordi, at der i vaskebufferen er en smule blokeringsmiddel. Ifølge kilde 13 må blokeringsmiddel ikke blandes med substratet, da jeg kan forestille mig at det kan have en forstyrrende effekt for enzymsubstrat reaktionen. Men om der er blokeringsmiddel i vaskebufferen kan jeg ikke udtale mig om, da DiaMed har været meget sparsomme med oplysninger om hvad deres reagenser indeholder. Efter pilotforsøget forsøgte jeg at ændre vaskerne, så den sugede brøndene tørre ved en cirklende bevægelse, men dette hjalp ikke og efterlod stadig en dråbe tilbage. Med hensyn til præcisionen, kan det ses i tabel 8, at den er bedst i det høje område, men at begge CV % ligger i det lave område. Men igen skal disse værdier tages med forbehold, da hver CV % kun er beregnet af to værdier. I forhold til tolerancen, overholder begge tolerancer, grænsen på 20 %, hvilket viser er variationen mellem dobbeltbestemmelserne er i orden og kan anvendes. I en artikel, skrevet af H. Bessos et al (8)., hvor en fuldblods HPA-1 fænotypning til screening evalueres. I dette assay til fænotypning, vaskes der op til 10 gange efter inkubering med primært antistof. Derudover skriver de, at de vasker blodet inden analyse, for at forbedre testens evne til at skelne positive og negative resultater. Denne vask foregår ved at 5ml blod fortyndes 1:10 og slynges ved 750g i 10min og det vaskede blod, resuspenderes i 1ml vaskebuffer (8). Det mener jeg er noget som kan anvendes til at forbedre kittet i dette projekt, da en vask af fuldblodet inden anvendelse, muligvis vil fjerne Side 32

33 komponenter, som antistoffet eventuelt vil binde uspecifikt til. Derudover kunne det være en fordel at vaske ELISA pladen flere gange, da en repræsentant fra DiaMed har udtrykt at vasken i dette assay er af stor betydning. Jeg mener at der skal arbejdes videre med vasken, så der først og fremmest, findes frem til en metode hvor brøndene kan suges helt tørre, da det er et kriterium som DiaMed stiller til analysen. Ekstra vask 6.6 Jeg valgte at foretage denne ændring, da jeg fandt det mest passende at tilsætte prøvematerialet først og derefter vaske ubundet prøve væk, inden konjugatet tilsættes. Denne tanke bakkes op af kilde 13 som giver et eksempel på en ELISA til detektion af antigen, hvor konjugat og prøve tilsættes i førnævnte rækkefølge. Jeg mener at hvis DiaMed s rækkefølge anvendes, vil konjugatet have mulighed for at binde uspecifikt til andre komponenter i blodprøven og danne komplekser, som på én eller anden måde kan binde sig til brønden, så det ikke vaskes ud. Hvis dette er tilfældet vil det give anledning til mange falsk positive resultater. I tabel 3 kan det ses at denne opsætning har medført 7 falsk positive resultater, som er forringelse i forhold til de 6 falsk positive som blev fundet ved opsætningen med fuldblod. I differensplottet (figur 4), ligger punkterne over 0-linjen i det lave område og under linjen ved de højere absorbanser. Dette tyder på at opsætningen med den ekstra vask, medfører en smule højere værdier en med fuldblod. Men hvis der kigges i tabel 2 kan det ses, at det varierer meget mellem om det er den ene eller anden opsætning der måler højest og derfor mener jeg at forskellen er opstået ved tilfældigheder. Derfor mener jeg at det ikke har gjort en betydelig forskel at tilføje en ekstra vask, og at rækkefølgen hvormed prøve og konjugat tilsættes, ikke har en indflydelse på de falsk positive resultater. Jeg mener desuden at dette modbeviser min påstand om, at konjugatet binder sig til andre blodkomponenter, og derved medfører falsk positive resultater. Da konjugatet, i denne opsætning, kun har mulighed for at binde sig til thrombocytterne hvilket stadig medfører falsk positive resultater. Med hensyn til præcisionen for denne opsætning (tabel 9), kan det ses at CV % i det høje område er meget lav, hvilket tyder på at målinger i dette område er foretaget med god præcision. Derudover bliver tolerancen overholdt for begge dobbeltbestemmelser. Dette fortæller kun at præcisionen er i orden, men da selve problemet ligger i de falsk positive resultater, er det primært det, som opsætningen skal vurderes på, og på dette punkt fungerer opsætningen ikke. Inkubering ved 37 grader 6.7 Ifølge DiaMed skal reaktionen inkubere ved stuetemperatur (18 25 grader) (25). Da anti-hpa-1a er et IgG antistof, ville jeg prøve at inkubere ved 37 grader, da IgG antistoffer er kendt for at reagere bedst ved denne temperatur (14, 5). Men i tabel 3, kan det ses at en ændring af inkuberingstemperaturen ikke afhjælper problemet med de falsk positive resultater. Dette kan der være flere årsager til, blandt andet at der findes 4 IgG subklasser, hvor anti-hpa-1a tilhører IgG subklasse 1 (5), og det kunne tænkes at disse subklasser reagerer bedst ved forskellige temperaturer. Så mit primære bud på hvorfor der ikke sker en forbedring, er at IgG klasse 1 reagere bedst ved stuetemperatur. Derudover ville det ikke mindske mængden af falsk positive resultater, hvis antistoffet reagerede bedre ved 37 grader. Da temperaturen primært anvendes til at regulere reaktionstiden, hvor reaktionen foregår hurtigst ved en temperatur tæt på antistoffets temperaturoptimum. Derudover spiller temperaturen en rolle i enzym reaktionen, da enzymer også har en temperatur hvor de fungere bedst, dvs. får omdannet mest substrat per tidsenhed. Jeg har desværre ikke kunnet finde en pålidelig kilde om temperaturoptimum for Side 33

34 HRP, men jeg ved at mange enzymer har optimum omkring 37 grader, og fungere ved temperaturer i et stort interval omkring optimum. Så jeg går ud fra at inkuberingstemperaturen ved stuetemperatur, er fundet til at være den mest passende med hensyn til både enzym og antistof. I differensplottet i figur 5 kan det ses at opsætningen med fuldblod har tendens til at give de højeste værdier, men forskellen i værdierne er ikke så stor, at jeg vil sige at det har gjort en forskel at inkubere ved en anden temperatur. Jeg vil nok mene at den lille forskel ligger i at reaktionen nok foregår bedst ved stuetemperatur, men dette er kun en formodning, da forskellen er så lille. Hvis reaktionen foregik bedre ved de 37 grader, ville dette medføre højere absorbanser, hvilket jeg ikke er interesseret i, da dette ville medføre flere falsk positive resultater. I de tilgængelige artikler, er der kun inkuberet ved stuetemperatur (5, 8), hvilket bestyrker min mistanke om at antistof-antigen reaktionen foregår bedst ved denne temperatur. Med hensyn til præcision og tolerance, kan det i tabel 10, at disse overholdes ligesom ved de andre opsætninger. Som nævnt tidligere, så er problemet ved denne opsætning stadig de falsk positive resultater, så det er det der primært skal kigges på. Jeg vil vurdere opsætningens tendens til falsk positive resultater i den samlede diskussion. Blokering 6.8 Jeg valgte at prøve med en blokering, da jeg mistænkte at brøndene ikke er blokeret ordentligt fra fabrikanten, så plastoverfladen binder andre komponenter i reaktionsforløbet, der derved føre til falsk positive resultater. Blokeringen blev fortaget med en 0,02 % Tween 20 opløsning, som jeg selv fremstillede ud fra en analyseforskrift til blodtypebestemmelse (28). Der findes andre midler at blokere med, blandt andet bovin serum albumin, men da Tween 20 var tilgængeligt på hospitalet og er det som Bioanalytikeruddannelsen anvender, valgte jeg at anvende dette. Denne ændring førte til 5 falsk positive resultater, hvilket sammen med den manuelle vask, er det laveste antal i projektet. Dette anser jeg dog ikke som en betydelig ændring, da det også kan skyldes tilfældigheder. Jeg mener at hvis problemet med de falske resultater lå i blokeringen, ville der kunne ses en betydelig forbedring af resultaterne, da de frie bindingssteder i brøndene ikke længere vil være tilgængelige, og derved ville den målte absorbans falde drastisk. Det kan også diskuteres om den anvendte blokeringsopløsning er korrekt, da opløsningen kan fremstilles med forskellige koncentrationer af Tween 20. Så jeg mener at blokeringen eventuelt kan udføres igen, med en kraftigere koncentration af Tween 20, for at se om det muligvis ville have en virkning på mængden af de falsk positive resultater. I differensplottet (figur 6), kan det ses at alle punkterne ligger under 0-linjen, hvilket viser at metoden med fuldblod, medfører de højeste absorbanser. Dette kan skyldes at frie pladser i brøndene er blevet blokeret, men at blokeringsopløsningen muligvis ikke har indeholdt en tilpas høj koncentration af Tween 20. I en artikel skrevet af Michael Steinitz, der arbejder på Hebrew University-Hadassah Medical School i Israel (6), undersøges det blandt andet hvor lav koncentrationen af en Tween 20 opløsning kan være, for at der stadig sker en succesfuld blokering. Her anvendes der ELISA MaxiSorp plader fra Nunc (Danmark), hvilket er de samme plader der anvendes til dette projekt. Han tilsætter 200µl Tween 20 opløsning i faldende koncentration til brøndene og inkubere pladerne natten over ved 4 grader. Efter vask tilsætter han basisk phosphatase sammen med substratet, og måler absorbansen ved 405nm. Han vurdere graden af blokering, ved at kigge på de målte absorbanser, jo lavere responset er, jo bedre er der blokeret. Han konkludere at der kan opnås succesfuld blokering med Tween 20 opløsninger, helt ned til en koncentration på 0,00024 % (6). Side 34

35 Dette viser at min 0,02 % Tween 20 opløsning, burde give en fuldstændig blokering. Steinitz anvender dog en anden blokeringsmetode, ved at lade pladerne inkubere natten over ved 4 grader, hvor jeg har inkuberet ved 60 grader 2 timer. Dette burde dog ikke gøre en forskel, da den metode jeg har fulgt, har fungeret til blodtypebestemmelse (28), og inkuberingen ved en højere temperatur medfører bare at pladen tørrer hurtigere. Derfor tyder det på at problemet med de falsk positive resultater ligger et andet sted end i blokeringen. Tolerance og CV % ligger højt i det høje måleområde, men da tolerancen holder sig under de 20 %, ser jeg ikke noget forkert i dette. Diagnostisk specificitet 6.9 Den diagnostiske specificitet er en yderst velegnet parameter til at vurdere en metodes evne til at undgå falsk positive resultater. Hvis en metode har en høj diagnostisk specificitet, vil det sige at metoden er god til at finde alle prøver der er negative for antigenet. Den diagnostiske specificitet for fuldblod er 57,1 %, hvilket vil sige, at sandsynligheden for at der opnås et negativt resultat ved fravær af antigenet, er 57,1 %. Eller med andre ord, at der er 57,1 procents sandsynlighed for at en negativ prøve, vil blive fundet negativ ved opsætningen med fuldblod. I den nedenstående tabel kan det ses at alle specificiteter ligger under, eller omkring 50 %, hvilket jeg vil sige er meget lavt. Disse lave specificiteter, viser at ingen af opsætningerne er gode til at finde frem til alle de negative prøver. Ud fra tabellen kan jeg tydeligt se at det ikke har lykkedes mig at forbedre specificiteten, ved at foretage en række ændringer ved kittet, da den højeste specificitet ses under opsætningen med fuldblod. Diagnostisk specificitet for hver opsætning. Fuldblod Plasma Stopreagens Manuel vask Ekstra vask 37 grader Blokering Specificitet 57,1 % 40,0 % 40,0 % 53,3 % 46,7 % 53,3 % 53,3 % Samlet diskussion 6.10 I tabel 3 kan der ses en overordnet oversigt over fordelingen mellem HPA-1a positive, negative og resultater i gråzonen, samt resultaterne for den konfirmatoriske PCR. Her ses det tydeligt at ingen af opsætningerne definerer alle sandt negative prøver som værende negative og at mængden af falsk positive resultater varierer fra opsætning til opsætning. Hvis der kigges nærmere på tabel 2, vil der kunne ses at de falsk positive resultater fremkommer ved de samme prøver. Fx er prøve nummer 12 bestemt som værende HPA-1a negativ ved PCR, men ved denne ELISA fra DiaMed bliver prøven ved alle opsætninger bestemt som værende HPA-1a positiv. Udover prøve nummer 12, gælder dette også prøverne 2, 4, 6, 10, 13 og 16. Blandt disse prøver, er der nogle der bliver bestemt til at være i gråzonen og disse prøver skal, under normale omstændigheder, analyseres igen. Men da jeg var bange for at løbe tør for reagens, valgte jeg at lade disse resultater være i gråzonen. Disse prøver kan i princippet hverken vurderes til at være positive eller negative, men de vil i dette projekt bedømmes som værende positive. I bilag 4 under rådata, kan det ses at mange absorbanser er høje. Gennem mit studie har jeg lært, at absorbanser ikke må overstige 2, da der ved absorbanser over 2 er større måleusikkerhed. Dette har jeg desværre ikke kunnet finde en kilde på, men i en laboratorievejledning er det nævnt at absorbanser ikke må overstige 2 (30). Ifølge en folder fra Thermo, omkring Side 35

36 den ELISA reader der er anvendt i dette projekt, skrives der at readeren er pålidelig til en absorbans på 3,5 (31). Derfor må jeg antage at de prøver med absorbanser under 3,5 er pålideligt målt, men at der er forbundet en vis usikkerhed ved målinger over 3,5. Da jeg i løbet af projektet kunne se at det var de samme prøver som ved alle opsætningerne gav et falsk positive resultat, begyndte jeg at tænke, om de falsk positive resultater kunne have noget med selve prøven at gøre. Derfor valgte jeg at undersøge den fulde HPA genotype, som var tilgængelig i blodbankens database (bilag 2), da jeg tænkte at det anvendte antistof i kittet ikke er specifikt nok og kan binde til andre HPA antigener i prøven. Som det fremgår i tabellen i bilag 2 er der ikke en sammenhæng mellem falsk positive resultater og genotypen for de pågældende prøver. De falsk positive prøver indeholder overordnet de samme antigener som de negative prøver og derfor kan jeg ikke lægge dette til grund for problemet. Men da det er de samme prøver som bliver falsk positive, mener jeg stadig at der kunne være en biologisk variation i form af proteiner på overfladen af thrombocytten, som antistoffet fra kittet kunne binde sig til. Det målte respons på disse prøver er lige så højt som responset på de sandt positive prøver (prøve 5 og 15) og derfor kunne det tyde på at antistoffet sidder bundet til noget på thrombocytterne. Men på den anden side kunne der også være tale om en komponent, enten på selve brønden eller det immobiliserede CD41, som ligner strukturen for HPA-1a antigenet og at antistoffet binder uspecifikt til denne struktur. Men jeg hælder dog mest til at det er noget på overfladen af thrombocytten der binder antistoffet uspecifikt, da de falsk positive resultater ikke opstår ved alle de negative prøver. Problemet ved denne metode, mener jeg derved ligger i selve antistoffet, der er uspecifikt og derved binder til en komponent, som kun findes hos nogle patienter og ikke andre, og derfor vil HPA-1a negative prøver med denne komponent falde ud som falsk positive. I en artikel (1), der omhandler kittet fra DiaMed, skriver de at antistoffet er monoklonalt, og er fremstillet ved at isolere V fragmentet specifikt for HPA-1a antigenet (V fragment er vist i billede 2). Et monoklonalt antistof er defineret ved et molekylært homogent/monospecifikt antistof (16), hvilket vil sige et antistof der er specifikt overfor ét antigen. Selv om det monoklonale HPA-1a antistof burde være specifikt for HPA-1a antigener, mener jeg at der i processen med at producere antistoffet muligvis kan være gået noget galt. Her mener jeg at fejlen kan ligge i, at de isolerede V fragmenter muligvis ikke er isoleret ordentligt, så der derved bliver produceret et uspecifikt antistof. I kilde 13 står der, at der ikke er store krav til renheden af immunogener til fremstilling af monoklonale antistoffer, da en enkelt klon, der producere antistoffet rent, senere udvælges (13). Her mener jeg at den valgte klon, måske ikke producerer antistoffet helt rent, så antistoffet derved ikke er helt specifikt for HPA-1a antigenet. Udover fejl på det anvendte antistof, kan problemet også ligge i prøvernes holdbarhed ved analysen. DiaMed skriver i indlægssedlen (25), hverken noget om hvor gamle prøverne må være, samt om hæmolyse har betydning for analyseresultatet, men en repræsentant fra DiaMed har sagt, at bare der ét fragment af en thrombocytmembran i prøven, burde være nok. Som det kan ses nedenstående skema, så var mange af prøverne forholdsvis gamle, da jeg startede projektet. Efter min egen overbevisning mener jeg, at der til næsten alle analyser er en holdbarhed for prøverne, da blodet henfalder med tiden. Dette kunne også ses på prøverne anvendt i dette projekt, hvor mange var så kraftigt hæmolyseret, at der efter centrifugering ikke Side 36

37 kunne ses forskel på plasma og erytrocytter. Jeg mener ikke at prøver i sådan en tilstand kan anvendes, men da DiaMed ikke nævner noget om begrænset holdbarhed, må jeg rette mig efter det. I litteraturen er der delte meninger om hvor længe prøverne kan opbevares før HPA-1 fænotypebestemmelse. I en artikel som beskriver en ELISA metode til HPA-1 fænotypning, nævnes der at prøverne kan holde op til 10 uger ved 4 grader (3). I en anden artikel (8), skriver de at prøverne kun kan holde i 23 dage og i en tredje artikel (4), anvender de 3 måneder gamle prøver som kontroller, uden problemer. Med så mange delte meninger, er det svært at forholde sig til hvor længe prøverne må opbevares, så derfor mener jeg at det specifikt skal testes, med kittet fra DiaMed. Specielt da en anden artikel som blandt andet er skrevet at to ansatte i DiaMed, der omhandler det anvendte kit står, at hverken prøvens tilstand eller alder har indflydelse på metoden (1). Da den førstnævnte artikel, ikke omhandler præcis det kit jeg har arbejdet med, vælger jeg at lægge min tillid til artiklen i kilde 1, da den trods alt er skrevet af ansatte hos det firma der forhandler kittet. Tabel over prøvernes alder ved projektets start. Prøve nr. 7, 8 1, 14 3, 12 2, , 13 6, 11 4, Uger Den analytiske del af dette projekt er udført i samarbejde med min medstuderende Charlotte Kjærsgaard, så derfor er de forskellige trin i analysen ikke altid udført af den samme person. Derfor kan der opstå variationer, da flere personer ikke altid udfører tingene ens. Her tænker jeg primært på afpippetering og opdrypning af reagens og prøve i brøndene, som følge deraf vil der altid ligge en lille variation i resultaterne, men om den har haft en betydning for resultaterne i dette projekt, skal jeg ikke kunne sige. Men jeg mener at denne metode skal kunne holde til variationen mellem personale, da de ikke anbefaler en automatisering af opdrypning. Hvis dette kit en dag kommer til at fungere ordentligt, er der på Hillerød hospital planer om at en opdrypnings maskine skal anvendes, og så er dette problem ikke længere relevant. Side 37

38 Konklusion 7.0 Da resultaterne i dette projekt, ikke viste en nedsat mængde af falsk positive resultater, kan jeg konkludere, at der kun til en vis grad kan opnås sandt negative resultater, ved at ændre på parametre som prøvemateriale, vask, temperatur, inkubering, blokering og stopreagens. Der er ved hjælp af den diagnostiske specificitet påvist, at der ikke sker en forbedring i metodernes evne til at give et negativt resultat ved fravær af HPA-1a antigenet, i forhold fuldblodsmetoden som anbefales af producenten DiaMed. Resultaterne tyder derfor på, at problemet ikke ligger i selve ELISA metoden, men at det anvendte HPA-1a antistof ikke er specifikt nok, og derved kan binde til en anden struktur der ligner HPA-1a antigenet. Perspektivering 8.0 Dette projekt førte ikke til en løsning på hvordan mængden af falsk positive resultater kan mindskes. Men det har bragt bud på hvad der muligvis kunne være årsagen til problemet. For at komme nærmere en løsning, kræves der yderligere undersøgelser af kittet og muligvis undervisning, fra DiaMed, af personalet på afdelingen, i hvordan analysen skal udføres. Jeg mener at undervisning er nødvendig, da producenten eventuelt kan vise, om der gøres forkert i forhold til metoden. Ved yderligere undersøgelser menes der i forhold til antistoffet, hvor der undersøges om antistoffet er uspecifikt. Fx ved at udføre et stort antal analyser, hvor der ikke tilsættes prøvemateriale, og binder antistoffet sig uspecifikt, vil der kunne måles et respons. Det kunne også være en fordel at rekvirere nye prøver fra de donorer der er anvendt, så det kan testes, om holdbarheden og tilstanden af prøvematerialet, har betydning for analyseresultatet. Til sidst ville det være en mulighed at afprøve om det kunne forbedre metoden, hvis fuldblodet vaskes inden analyse, som omtalt i diskussionen. På nuværende tidspunkt kan denne analyse ikke indføres i laboratoriet, da der stadig er problemer med troværdigheden af et negativt resultat. Side 38

39 Litteraturliste Artikler: Bøger: 1. Aeby C, Garner S, Smethurst P, Ouwehand W, Mérieux Y, Introduction: Schawaller M. A Simple, Fast, One-stage HPA- 1a Phenotyping ELISA. 2. Bessos H, Perez S, Armstrong-Fisher S, Urbaniak S, Turner M. The development of a quantitative ELISA for antibodies against human platelet antigen type 1a. Transfusion Mar; 43: Bessos H, Hofner M, Salamat A, Wilson D, Urbaniak S, Turner M. An international trial demonstrates suitability of a newly developed whole-blood ELISA kit for multicentre platelet HPA-1 phenotyping. Vox Sanguinis. 1999; 77: Garner S, Smethurst P, Merieux Y, Aeby C, Smith G, Armour K, et al. A rapid one-stage whole-blood HPA-1a phenotyping assay using a recombinant monoclonal IgG1 anti-hpa-1a. British Journal of Haematology. 2000; 108: Watkins N, Armour K, Smethurst P, Metcalfe P, Scott M, Hughes D, et al. Rapid Phenotyping of HPA-1a using either diabody-based hemagglutination or recombinant IgG1-based assays. Transfusion juli; 39: Steinitz M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 2000; 282: Loren A, Abrams C. Efficacy of HPA-1a (PI A1 )-negative platelets in a patient with post-transfusion purpura. American Journal of Hematology. 2004; 76: Bessos H, Mirza S, McGill A, Williamson L. Hadfield R. Murphy W. A whole blood assay for platelet HPA1 (PLA1) Phenotyping applicable to large-scale screening. British Journal of Haematology. 1996; 92: Combs M, Denomme G, Grossman B, Haley R, Harris T, Jett B, et. al. Technical manual Advancing transfusion and cellular therapies worldwide. 15. Udgave Klein H. Anstee D. Blood transfusion in clinical medicine. 11. Udgave. Blackwell publishing; Hall R, Malia R, Medical laboratory. 2. Udgave. Bullerworth-Heinemann Ltd; Sand O, Sjaastad Ø, Haug E. Fysiologi en grundbog. København: Munksgaard Danmark; Andersen H, Sørensen U, Thomsen E. Immunkemiske metoder teori og praksis. Århus: Nucleus; Jersild C, Sloth H, Dragsted L. Transfusionsmedicin og intravenøs væsketerapi. 2. Udgave. København: Nyt Nordisk Forlag Arnold Busck; Simonsen F. Analyseteknik Instrumentering og metoder. København: Ingeniøren bøger; Nørgaard J. Medicinske fagudtryk en klinisk ordbog med kommentarer. 2. Udgave. Nyt Nordisk Forlag Arnold Busck; Side 39

40 Internet: 17. Odense Universitetshospital Svendborg Sygehus, Trombocytopeni: Set d. 12. Februar Dako, Products, CD41, platelet glycoprotein IIb: Set d. 8. Juni Rigshospitalet, Afdelinger, Blodbank, Vejledning i behandling med blodkomponenter til ikke akut blødende patienter: DEGUID=%7BCC9678D6-959E-4A7A-8CDF EAF99%7D&NRORIGINALURL=%2Fmenu%2FAFDELINGER%2FDiagnostisk%2Bcenter%2FKlinisk%2BImmunol ogisk%2bafdeling%2b- %2BBlodbank%2FVejledning%2Bi%2BTransfusionsbehandling%2FVejledning%2Bi%2Bbehandling%2Bmed%2Bblodko mponenter%2btil%2bikke%2bakut%2bbl%25c3%25b8dende%2bpatienter.htm%3fwbcmode%3daut&nrcachehi NT=Guest&WBCMODE=Aut Set d. 8. Juni Sunhed.dk, B- Thrombocytter, antalk.: Set d. 8. Juni Leeds & Bradford Pathology Partnership, Blood transfusion products, Platelets: usionproducts/platelets/tabid/201/default.aspx Set d. 8. Juni Blood physiology: Set d. 8. Juni Kem-En-Tec Diagnost ics A/S, Material safety data sheet, TMB: Set d. 7. Maj Andet: 24. Dansk selskab for klinisk immunologi. Transfusionsmedicinske standarder. Version 3.0, Er vedlagt som bilag Indlægsseddel: Platelet HPA-1a Typing Assay. (B ). DiaMed. 26. Noter til generelle analyseprincipper 1. og 2. semester. Version F06. Bioanalytikeruddannelsen København. 27. Kock A. Statistik undervisning Klinisk biokemisk afdeling, Hillerød Hospital: LT, BB. Procedurer: Inverness blood grouping system og vejledning til blodtypebestemmelse. Klinisk immunologisk afdeling, Amtssygehuset i Glostrup. 22. Okt Er vedlagt som bilag Johansson P, Bochsen L, Stensballe J. Thrombelastografi (TEG) Introduktion til koagulation, hæmostase og TEG. Blodbanken, Rigshospitalet. 30. Øvelseskatalog Andet semester. Semester E06. Bioanalytikeruddannelsen København. 31. Product specifications, Thermo Scientific Multiskan EX. Thermo Scientific, Er vedlagt som bilag 7. Side 40

41 Bilag 1: Pilotprojekter Skal der korrigeres for thrombocytter? Pilotprojektet er udført med dobbeltbestemmelser af 3 hæmoglobin prøver fra tapperummet. Fremgangsmåde: 1. 20µl plasma tilsættes til brøndene fra DiaMed s kit. 2. Pladen rystes i 10 sekunder. 3. Der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. 4. Der vaskes 7 gange i destilleret vand. 5. Der tilsættes 300µl destilleret vand til brøndene. 6. Aflæsning ved 630nm. Ved aflæsning kunne det ses, at absorbansen lå omkring 0,04. Dette mener jeg ikke har nogen væsentlig betydning og derfor vil jeg ikke korrigere for thrombocytter i resten af projektet. Hvordan skal der centrifugeres for at få thrombocytrigt plasma? DiaMed skriver at analysen også kan udføres med plasma med en thrombocytkoncentration omkring 250 x 10 9 /l (interval x 10 9 /l) (25). I en bog stod der, at thrombocytrigt plasma fremkommer ved centrifugering ved 170g i 10 minutter (11). Herfra anvendte jeg formlen n=(g/a r) 0,5 til at beregne hvor mange rpm der skulle anvendes (26): Jeg startede med at indstille centrifugen til 1740rpm og to andre hastigheder (1650 og 1830rpm) i 10 min. Derudover satte jeg centrifugen til at bremse så blidt som muligt. Efter centrifugering, fik jeg lov til at måle thrombocyttallene på sysmex apparatet på klinisk biokemisk afdeling. Alle tre programmer gav thrombocyttal på omkring 200 x 10 9 /l og derfor valgte jeg at prøve med nogle blidere centrifugeringer for at få koncentrationen højere op. Jeg programmerede tre nye hastigheder: 1650, 1600 og 1550rpm i 5 minutter. 1550rpm viste de bedste resultater med thrombocyttal omkring 500 x 10 9 /l, derfor er det denne centrifugering jeg vil anvende til projektet. Forskyder stopreagenset ph, så der sker et farveskift i brøndene? Dette pilotprojekt gik ud på, at se hvilken indflydelse det vil have på reaktions farven, når jeg tilsætter stopreagenset. Da et farveskift vil føre til, at der skal måles ved en anden bølgelængde. Jeg anvendte én prøve, som analyseres med trippelbestemmelse og som stopreagens anvendte jeg 3 % svovlsyre. Analysen blev udført efter DiaMed s forskrift, hvor jeg tilsatte 50µl svovlsyre inden aflæsning. Da svovlsyren blev tilsat, skiftede reaktionen farve fra blå til gul, hvilket gør at jeg ikke længere kan aflæse ved 630nm. Derfor aflæste jeg pladen ved alle de bølgelængder der var tilgængelige på ELISA readeren, og fik følgende resultater: 340nm 405nm 450nm 492nm 630nm 1a 0,248 1,551 4,086 0,699 0,087 1b 0,249 1,502 4,057 0,680 0,082 1c 0,233 1,159 3,222 0,548 0,078 Side 41

42 Som det kan ses af resultaterne absorbere de gule brønde mest ved 450 nm. For at være sikker på at denne bølgelængde er den bedste at måle ved, fremstillede jeg et spektrum på et fotometer som jeg fik lov til at låne på biokemisk afdeling. Jeg fremstillede spektret med bølgelængder fra 350 til 600nm og det viste også at der absorberes mest ved 450nm. Dette stemmer overens med litteraturen som anbefaler at ved anvendelse TMB, hvor reaktionen er stoppet med svovlsyre, måles ved 450nm (13) og derfor måler jeg ved 450nm. Side 42

43 Bilag 2: PCR genotypebestemmelse Prøve HPA-1a HPA-1b HPA-2a HPA-2b HPA-3a HPA-3b HPA-4a HPA-4b HPA-5a HPA-5b Side 43

44 Bilag 3: Analyseforskrifter Opsætning med plasma: µl fortyndet Anti-HPA-1a HRP konjugat tilsættes i brøndene µl prøvemateriale (plasma) tilsættes og pladen rystes i 10 sekunder. 3. Der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (18 25 grader). 4. Brøndene tømmes og der vaskes 7 gange med 300 µl fortyndet vaskebuffer. 5. Der tilsættes 100 µl HPA-1a HRP substrat og der inkuberes I 10 minutter ved stuetemperatur. 6. Brøndene aflæses i en ELISA reader ved 630nm. Opsætning med stopreagens µl fortyndet Anti-HPA-1a HRP konjugat tilsættes i brøndene µl prøvemateriale tilsættes og pladen rystes i 10 sekunder. 3. Der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (18 25 grader). 4. Brøndene tømmes og der vaskes 7 gange med 300 µl fortyndet vaskebuffer. 5. Der tilsættes 100 µl HPA-1a HRP substrat og der inkuberes I 10 minutter ved stuetemperatur. 6. Der tilsættes 50µl svovlsyre. 7. Brøndene aflæses i en ELISA reader ved 630nm. Opsætning med manuel vask µl fortyndet Anti-HPA-1a HRP konjugat tilsættes i brøndene µl prøvemateriale tilsættes og pladen rystes i 10 sekunder. 3. Der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (18 25 grader). 4. Brøndene tømmes og der vaskes manuelt med 8 kanals pipette 7 gange med 300 µl fortyndet vaskebuffer. 5. Der tilsættes 100 µl HPA-1a HRP substrat og der inkuberes I 10 minutter ved stuetemperatur. 6. Brøndene aflæses i en ELISA reader ved 630nm. Opsætning med ekstra vask µl prøvemateriale tilsættes pladen som rystes i 10 sekunder. 2. Der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (18 25 grader). 3. Vask brøndene ved pladevasker, 5x med 300 µl fortyndet HPA-1a vaskebuffer. 4. Tilsæt 80 µl fortyndet HPA-1a HRP Konjugat til brøndene. 5. Der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (18 25 grader). 6. Brøndene tømmes og der vaskes 7 gange med 300 µl fortyndet vaskebuffer. 7. Der tilsættes 100 µl HPA-1a HRP substrat og der inkuberes I 10 minutter ved stuetemperatur. 8. Brøndene aflæses i en ELISA reader ved 630nm. Side 44

45 Opsætning med inkubering ved 37 grader µl fortyndet Anti-HPA-1a HRP konjugat tilsættes i brøndene µl prøvemateriale tilsættes og pladen rystes i 10 sekunder. 3. Der inkuberes i 30 minutter ved 37 grader. 4. Brøndene tømmes og der vaskes 7 gange med 300 µl fortyndet vaskebuffer. 5. Der tilsættes 100 µl HPA-1a HRP substrat og der inkuberes I 10 minutter ved 37 grader. 6. Brøndene aflæses i en ELISA reader ved 630nm. Opsætning med blokering µl Tween 20 blandes med 250ml destilleret vand. 2. Mikrotitterpladen kommes i Tween opløsningen, og alle luftbobler fjernes fra pladen. 3. Efter ca. 20 minutter tages pladen op af opløsningen og tørres i varmeskab ved 60 grader i 2 timer µl fortyndet Anti-HPA-1a HRP konjugat tilsættes i brøndene µl prøvemateriale (plasma) tilsættes og pladen rystes i 10 sekunder. 6. Der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur (18 25 grader). 7. Brøndene tømmes og der vaskes 7 gange med 300 µl fortyndet vaskebuffer. 8. Der tilsættes 100 µl HPA-1a HRP substrat og der inkuberes I 10 minutter ved stuetemperatur. 9. Brøndene aflæses i en ELISA reader ved 630nm. Side 45

46 Bilag 4: Data til resultatafsnit Rådata: Screening af thrombocytter for HPA-1a antigener Fuldblod Plasma Stopreagens Manuel vask Ekstra vask 37 grader Blokering Pos a 3,727 4,130 4,679 3,545 4,069 3,400 1,242 Pos b 3,652 2,703 4,436 3,451 4,082 3,131 1,480 Neg a 0,073 0,073 0,115 0,054 0,079 0,085 0,077 Neg b 0,063 0,069 0,112 0,061 0,088 0,077 0,072 1a 0,242 0,208 0,585 0,230 0,217 0,252 0,205 1b 0,179 0,265 0,415 0,176 0,249 0,212 0,210 2a 0,540 0,549 1,399 0,696 1,729 0,666 0,389 2b 0,587 0,513 1,538 0,544 1,260 0,650 0,388 3a 0,218 0,223 0,546 0,133 0,553 0,177 0,246 3b 0,226 0,218 0,454 0,119 0,248 0,204 0,232 4a 0,788 0,781 1,778 0,360 1,139 0,569 0,555 4b 0,689 0,513 1,696 0,588 1,160 0,514 0,465 5a 3,641 2,333 4,736 1,737 1,682 3,092 1,413 5b 3,921 2,122 6,000 1,294 2,070 2,924 1,673 6a 3,222 2,065 6,000 2,739 2,408 2,571 2,221 6b 2,653 1,921 6,000 2,229 2,434 2,597 1,999 7a 0,134 0,141 0,676 0,071 0,147 0,099 0,123 7b 0,101 0,092 0,408 0,072 0,133 0,087 0,148 8a 0,185 0,178 0,181 0,185 0,206 0,132 0,243 8b 0,253 0,125 0,209 0,134 0,217 0,197 0,281 9a 0,070 0,069 0,389 0,050 0,106 0,068 0,101 9b 0,069 0,060 0,242 0,056 0,097 0,065 0,077 10a 1,362 1,606 3,320 1,160 2,049 1,720 0,952 10b 1,381 2,337 3,217 1,020 1,904 1,284 0,860 11a 0,100 0,857 1,529 0,054 0,096 0,076 0,129 11b 0,157 0,084 0,599 0,056 0,102 0,093 0,087 12a 2,995 2,415 6,000 2,804 2,629 2,734 2,094 12b 2,976 2,812 5,279 2,843 2,712 3,310 2,729 13a 0,551 0,311 1,140 0,394 0,765 0,448 0,302 13b 0,423 0,386 1,374 0,378 0,823 0,577 0,438 14a 0,101 0,051 0,287 0,049 0,075 0,108 0,099 14b 0,083 2,294 2,802 0,051 0,094 0,115 0,129 15a 2,319 2,123 4,880 1,250 1,879 2,884 1,545 15b 2,804 2,094 5,102 1,061 2,215 2,084 1,079 16a 1,969 1,878 4,579 1,750 2,173 2,077 1,694 16b 2,507 1,330 5,278 1,906 1,893 2,069 1,998 17a 0,274 0,188 0,615 0,137 0,243 0,098 0,237 17b 0,228 0,235 0,355 0,105 0,157 0,131 0,214 Blind a 0,085 0,197 0,121 0,091 0,129 0,247 Blind b 0,078 2,661 0,050 0,086 0,178 0,296 De røde tal indikere et positivt resultat, grøn er i gråzonen og de sorte tal er negative. Side 46

47 Beregning af cut-off værdier Fuldblod Stopreagens Neg. Kontrol Neg. Kontrol 1 0,071 0,24 2 0,100 0, ,054 0, ,066 0, ,140 0, ,052 0, ,048 0, ,052 0,22 9 0,066 0, ,175 0,509 Middel 0,082 0,2875 SD 0,043 0,138 3SD 0,129 0,413 Cut-off 0,212 0,701 Data til differensplot Fuldblod vs. stopreagens Middelværdi Difference 0,356 0,289 1,017 0,905 0,361 0,278 1,238 0,998 4,575 1,587 4,469 3,062 0,330 0,424 0,207-0,024 0,193 0,246 2,321 1,897 0,597 0,935 4,313 2,654 0,872 0,770 0,819 1,453 3,777 2,429 3,584 2,691 0,368 0,234 Fuldblod vs. plasma Middelværdi Difference 0,224 0,026 0,548-0,033 0,222-0,001 0,693-0,092 3,005-1,553 2,466-0,945 0,118-0,001 0,186-0,067 0,068-0,005 1,672 0,600 0,300 0,342 2,800-0,372 0,418-0,138 0,633 1,081 2,336-0,453 1,921-0,634 0,232-0,039 Side 47

48 Fuldblod vs. ekstra vask Middelværdi Difference 0,222 0,022 1,029 0,931 0,311 0,179 0,944 0,411 2,829-1,905 2,680-0,517 0,129 0,022 0,215-0,008 0,086 0,032 1,674 0,605 0,114-0,030 2,828-0,316 0,641 0,307 0,088-0,007 2,305-0,515 2,136-0,205 0,226-0,051 Fuldblod vs. manuel vask Middelværdi Difference 0,207-0,008 0,592 0,056 0,174-0,096 0,607-0,265 2,648-2,266 2,711-0,454 0,095-0,047 0,189-0,060 0,062-0,017 1,231-0,282 0,092-0,074 2,905-0,163 0,437-0,101 0,071-0,042 1,859-1,407 2,033-0,410 0,186-0,130 Fuldblod vs. blokering Middelværdi Difference 0,209-0,004 0,476-0,176 0,231 0,017 0,625-0,229 2,662-2,238 2,524-0,828 0,127 0,018 0,241 0,043 0,080 0,019 1,139-0,466 0,119-0,021 2,699-0,575 0,429-0,117 0,103 0,022 1,937-1,250 2,042-0,392 0,238-0,026 Fuldblod vs. 37 grader Middelværdi Difference 0,222 0,021 0,611 0,094 0,206-0,032 0,640-0,198 3,395-0,773 2,761-0,354 0,106-0,025 0,192-0,054 0,068-0,004 1,437 0,130 0,107-0,045 3,004 0,036 0,500 0,026 0,102 0,020 2,523-0,078 2,156-0,165 0,183-0,137 Side 48

49 Side 49

50 T-test for plasma vs. fuldblod t-test: Parvis dobbelt stikprøve for middelværdi Variabel 1 Variabel 2 Middelværdi 1, , Varians 1, , Observationer Pearson-korrelation 0, Hypotese for forskel i middelværdi 0 fg 16 t-stat 0, P(T<=t) en-halet 0, t-kritisk en-halet 1, P(T<=t) to-halet 0, t-kritisk to-halet 2, Side 50

51 Bilag 5: Indlægsseddel fra DiaMed Side 51

52 Side 52

53 Bilag 6: Uddrag af forskrift til blodtypebestemmelse Side 53

54 Side 54

55 Bilag 7: Produkt specif Screening af thrombocytter for HPA-1a antigener ikation: Thermo Multiskan reader Side 55

56 Side 56

57 Side 57