Syphilis Total Ab 1 plade - 96 72530 5 plader - 480 72531

Syphilis Total Ab 1 plade - 96 72530 5 plader - 480 72531 SÆT TIL KVALITATIV DETEKTERING AF ANTISTOFF MOD TREPONEMA PALLIDUM I HUMANT SERUM ELLER PLASMA VED HJÆLP AF EN ENZYMIMMUNANALYSETEKNIK 883679-2014/11

INDHOLDSFORTEGNELSE 1. PÅTÆNKT BRUG... 2 2. SAMMENDRAG OG FORKLARING AF TESTEN... 2 3. PRINCIPPER FOR PROCEDUREN... 2 4. REAGENSER... 3 5. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER... 4 6. PRØVEMATERIALER... 5 7. PROCEDURE... 6 8. TESTBEGRÆNSNING... 8 9. SPECIFIKATIONER FOR YDEEVNE... 9 10. BIBLIOGRAFISKE REFERENCER.... 12

1. PÅTÆNKT BRUG Disse sæt er beregnet til brug af uddannet og kvalificeret personale til kvalitativ detektering af antistoffer mod Treponema pallidum i humant serum og plasma. Produktet kan bruges til screening af bloddonorer og til hjælp ved diagnosticering af patienter, som mistænkes for at have en syfilisinfektion. 2. SAMMENDRAG OG FORKLARING AF TESTEN Syfilis er en kronisk infektion, som forløber gennem forskellige stadier: første, anden, tredje og fjerde. Disse stadier viser forskellige kliniske symptomer og giver typisk indledningsvis sår kendt som chankere, derefter syfilitisk udslæt, fuldt af lange hvileperioder. En ubehandlet infektion kan til sidst resultere i kardiovaskulære problemer og neurosyfilis. Infektionen forårsages af spirokæten Treponema pallidum og fås som regel ved seksuel kontakt, men sygdommen kan også overføres ved transfusion af inficeret blod. Intrauterin infektion forekommer også. Organismen har vist sig at være stort set umulig at dyrke i kunstige medier, og infektionsdiagnosen afhænger som regel af detektion af antistoffer i blodet, som viser sig lige efter den indledende infektion og kan vedblive i mange år. Tests for syfilis inddeles i fire kategorier: direkte mikroskopisk undersøgelse, test for treponemale antistoffer, tests for ikke-treponemale antistoffer og direkte antigentests. På grund af de lange hvileperioder og de ikke-treponale tests uspecifikke natur er metoder, som detekterer specifikke antitreponemale antistoffer i blodprøver, blevet mere og mere populære til screening. Syphilis Total Ab er en sådan test. 3. PRINCIPPER FOR PROCEDUREN Syphilis Total Ab bruger tre rekombinante antigener i en sandwich-analyse. Antigenerne detekterer T. pallidum-specifikke IgG, IgM og IgA, hvilket gør testen i stand til at detektere antistoffer i løbet af alle infektionens stadier. Brøndene er dækket med en blanding af 15Kd, 17Kd, og 47Kd T. pallidum-rekombinante antigener. Specifikke antistoffer i serum- eller plasmaprøver kombinerer med disse antigener og med de samme antigener konjugeret til peroxidase fra peberrod, når konjugatet tilsættes til en brønd, hvori prøven er blevet inkuberet. Når ureageret materiale er fjernet ved vask, påvises tilstedeværelsen af bundet enzym, der indikerer tilstedeværelsen af specifikke antistoffer i prøven, med en farveændring i substrat-/kromogenblandingen. Farvens intensitet sammenlignes med farven i kontrolbrønde for at bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af specifikke antistoffer. [DK] 2

4. REAGENSER 4.1. Beskrivelse Identifikation på etiketten R1 R2 R3 R4 R6 R8 R9 R10 Microplate Concentrated Washing Solution (20X) Negative control Positive control Conjugate Substrate buffer Chromogen: TMB solution (11X) Stopping solution Beskrivelse Mikroplade 12 teststrimler à 8 brønde hver dækket med T. pallidumrekombinante antigener (rag) Specifikt ID-nummer = 97 Koncentreret vaskeopløsning (20X) Tris-NaCl-buffer ph 7,4 Konserveringsmiddel: ProClin 300 (0,04 %) Negativ kontrol Tris-buffer indeholdende BSA (albumin fra kvægserum) Konserveringsmiddel: ProClin 300 (0,1 %) Positiv kontrol (human) Humant serum indeholdende antistoffer mod T.pallidum, negativt over for HIV1/2, HBs Ag og HCV, fortyndet i en Tris-buffer indeholdende BSA (albumin fra kvægserum) Konserveringsmiddel: ProClin 300 (0,1 %) Konjugat T.pallidum rag / peroxidase Konserveringsmiddel: ProClin 300 (0,05 %) Substratbuffer Citronsyre- og natriumacetatopløsning ph 4,0 indeholdende H 2 O 2 (0,015 %) og DMSO (4 %) Kromogen: TMB-opløsning (lyserød) Opløsning indeholdende 3,3',5,5'- tetrametylbenzidin (TMB) Stopopløsning Svovlsyreopløsning (H 2 SO 4 1N) Præsentation/ forberedelse 72530 1 plade 70 ml Skal fortyndes 2,1 ml 1,6 ml 8 ml 60 ml Skal rekonstitueres 5 ml Skal fortyndes 28 ml Præsentation / forberedelse 72531 5 plader 235 ml Skal fortyndes 2,1 ml 1,6 ml 30 ml 60 ml Skal rekonstitueres 5 ml Skal fortyndes 28 ml 4.2. Krav til opbevaring og håndtering Dette sæt skal opbevares ved +2-8 C. Alle sættets dele, som opbevares ved +2-8 C, kan bruges indtil den angivne udløbsdato på pakken (medmindre andet er angivet). Efter åbning, og hvis de ikke udsættes for kontaminering, kan R3-, R4-, R6-, R8-, R9- og R10- reagenserne, der opbevares ved +2-8 C, bruges indtil udløbsdatoen, der er vist på etiketten. [DK] 3

Identifikation R1 R2 Opbevaring Efter åbning af den vakuumforseglede pose kan mikropladestrimlerne, der opbevares ved +2-8 C, bruges i 1 måned ved opbevaring i den oprindelige pose, som er lukket tæt. Den fortyndede vaskeopløsning kan opbevares ved +2-30 C i 2 uger. Den koncentrerede vaskeopløsning (R2) kan opbevares ved +2-30 C. R8+R9 Efter rekonstituering kan reagenserne, når de opbevares i mørke, bruges i 6 timer ved stuetemperatur (18-30 C). 5. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Til in vitro-diagnose. Til professionel brug inden for sundhedssektoren. 5.1. Helbreds- og sikkerhedsforholdsregler: Dette testsæt må kun anvendes af kvalificeret personale, som er oplært i laboratorieteknikker, og som kender de potentielle farer. Bær det nødvendige beskyttelsestøj, handsker og øjen-/ansigtsbeskyttelse, og håndter materialet korrekt i henhold til god laboratoriepraksis. Testsættet indeholder humane blodkomponenter. Humane kildematerialer, der er brugt til fremstilling af reagenserne, er blevet testet og fundet ikke-reaktive for hepatitis B- overfladeantigen (HBs Ag), antistoffer mod human immundefekt virus (HIV-1 og HIV-2) og antistoffer mod hepatitis C-virus (HCV). Ingen kendt testmetode kan give fuld sikkerhed for, at der ikke forefindes smitstoffer. Derfor skal alle materialer fremstillet af humant blod, reagenser og humant prøvemateriale håndteres som om, de var i stand til at overføre smitsomme sygdomme, ved at følge forholdsregler for blodbårne patogener, som anbefales i lokale, regionale og nationale bestemmelser. Spild af biologisk materiale: Spild af materiale, der stammer fra humane kilder, skal behandles som potentielt smittefarligt. Spild, der ikke indeholder syre, skal omgående dekontamineres, herunder spildområdet, materialer og forurenede overflader eller udstyr, med et egnet kemisk desinfektionsmiddel, der er effektivt mod de potentielle biologiske farer i de involverede prøver (almindeligvis en 1:10-fortynding af husholdningsblegemiddel, 70-80 % ethanol eller isopropanol, en jodopløsning [f.eks. 0,5 % Wescodyne Plus osv.), og tørres tørt. Spild, der indeholder syre skal absorberes på passende vis (tørres op) eller neutraliseres, området skylles med vand og tørres tørt. Materialer, der anvendes til at absorbere det spildte materiale, kan kræve bortskaffelse som farligt affald. Derefter skal området dekontamineres med et af de kemiske desinfektionsmidler. BEMÆRK: Anbring ikke opløsninger, der indeholder blegemiddel, i autoklaven! Bortskaf alle prøver og materialer, der har været anvendt ved udførelsen af testen, som om de indeholdt smitstoffer. Kemisk, biologisk eller farligt laboratorieaffald skal håndteres og bortskaffes i henhold til alle lokale, regionale og nationale forskrifter. For anbefalinger i forhold til farer og forholdsregler relateret til visse kemiske komponenter i dette testsæt henvises der til piktogrammerne, som er vist på etiketterne, og oplysningerne sidst i brugsvejledningen. Sikkerhedsdatabladet findes på www.bio-rad.com. [DK] 4

5.2. Forholdsregler vedrørende proceduren 5.2.1. Forberedelse Resultaternes pålidelighed afhænger af en korrekt implementering af følgende regler for god laboratoriepraksis: Brug ikke reagenser efter udløbsdatoen. Undgå sammenblanding eller nogen form for forbindelse mellem reagenser fra forskellige partier i samme testkørsel. Vent 30 minutter, før reagenserne tages i brug, så de kan stabilisere sig ved stuetemperatur (18-30 C). Testens navn og id-nummer skrives på hver mikroplades ramme. Dette specifikke id-nummer er ligeledes angivet på hver strimmel. Syphilis Total Ab: Specifikt ID-nummer = 97 Verificer det specifikke id-nummer før brug. Hvis der mangler et id-nummer, eller det ikke er det samme som det angivne id-nummer, som svarer til analysen, der skal testes, må strimlen ikke bruges. BEMÆRK! Det gælder for vaskeopløsning (R2, etiketidentifikation: 20X, farvet grøn), peroxidasesubstratbuffer (R8, etiketidentifikation: TMB-buffer, farvet blå), kromogen (R9, etiketidentifikation: TMB 11X, farvet lilla) og stopopløsning (R10, etiketidentifikation: 1N, farvet rød), at det er muligt at bruge andre partier end dem i dette sæt under forudsætning af, at samme parti anvendes i hele testforløbet. Disse reagenser kan anvendes sammen med en række andre produkter fra vores virksomhed. Kontakt vores tekniske serviceafdeling for at få yderligere oplysninger. Rekonstituer reagenserne med forsigtighed for at undgå kontamination. Benyt engangsmateriale eller, hvis dette ikke er muligt, udstyr af glas, som er vasket grundigt og skyllet med demineraliseret vand. Undgå, at mikropladen tørrer i perioden mellem vask og fordeling af reagens. Enzymreaktionen er meget følsom over for metalioner. Undgå derfor, at metalelementer kommer i berøring med de forskellige konjugat- eller substratopløsninger. Udviklingsopløsningen (substratbuffer + kromogen) skal være farvet lyserød. Hvis den lyserøde farvning ændrer sig inden for nogle få minutter efter rekonstitueringen, kan reagenset ikke anvendes og skal udskiftes. Forberedelsen af udviklingsopløsningen kan udføres i en ny engangsplastikbakke eller en glasbeholder, der først er vasket med 1N HCI og derefter skyllet grundigt med destilleret vand og tørret. Dette reagens skal opbevares i mørke. Brug aldrig den samme beholder til at fordele konjugat- og udviklingsopløsning. 5.2.2. Bearbejdning Analyseproceduren må ikke ændres. Undgå at udføre testen i nærheden af reaktive dampe (syre, alkaliske dampe og aldehyddampe) eller støv, der kan ændre konjugatets enzymaktivitet. Brug en ny fordelingsspids til hver prøve. Korrekt vask er et vigtigt trin i denne procedure: Overhold det anbefalede antal vaskecyklusser og sørg for, at alle brøndene fyldes helt og derefter tømmes helt. Forkert afvaskning kan medføre unøjagtige resultater. Følg de beskrevne vaskeprocedurer nøje for at opnå de bedst mulige testresultater. Ved anvendelse af nogle apparater kan det være nødvendigt at optimere vaskeproceduren (øge antallet af vaskecyklusser, trin og/eller mængden af vaskebuffer i hver cyklus) for at få et acceptabelt niveau for de negative prøvers OD-baggrund. Kontakt os vedrørende eventuelle spørgsmål til tilpasninger og særlige procedurer. 6. PRØVEMATERIALER Tag en blodprøve i overensstemmelse med gældende praksis. Testen skal udføres på ufortyndet serum eller plasma (indsamlet på EDTA, natriumcitrat, natriumheparin eller ACD) Prøver, der indeholder aggregater, skal renses ved centrifugering forud for testen. Prøverne skal opbevares ved +2-8 C, hvis testen skal udføres inden for 7 dage, eller dybfryses ved -20 C for en længere periode. Foretag ikke mere end 5 fryse-/optøningscyklusser. Prøver, som er blevet varmebehandlet ved 56 C i 1/2 time, kan bruges. [DK] 5

Prøver, der indeholder op til 120 g/l albumin, 200 mg/l bilirubin, 33 g/l triolein eller 2 g/l hæmoglobin, påvirker ikke resultaterne. Det frarådes dog at bruge hyperlipæmisk eller hyperhæmolyseret serum eller plasma. Prøverne skal optøs og blandes godt før test. Hvis prøvematerialet skal transporteres, skal det emballeres ifølge de gældende regler for transport af etiologiske stoffer og helst i nedfrosset tilstand. 7. PROCEDURE 7.1. Nødvendige materialer, der ikke medfølger Destilleret vand. Natriumhypochlorit (alm. blegemiddel) og natriumbicarbonat. Sugende papir. Engangshandsker. Sikkerhedsbriller. Engangsrør. Automatiske eller halvautomatiske, justerbare eller forudindstillede pipetter eller multipipetter til måling og fordeling af 50 μl, 1 ml og 10 ml. Måleglas med en kapacitet på 100 ml og 1 l. Automatisk, halvautomatisk eller manuelt vaskesystem til mikroplader (*). Mikropladeinkubator termostatindstillet til 37 C ±1 C (*). Beholder til biologisk farligt affald. Mikropladelæser med filtre på 450, 490 nm og 620-700 nm (*). (*) Kontakt os for nærmere oplysninger om det udstyr, der anbefales af vores tekniske afdeling. 7.2. Reagensforberedelse 7.2.1. Brugsklare reagenser Reagens 1 (R1): Mikroplade Hver støtteramme, der indeholder 12 teststrimler, er pakket i en forseglet foliepose. Åbn posen med en saks eller skalpel 0,5 til 1 cm over forseglingen. Åbn posen, og tag rammen ud. Læg de ubrugte strimler tilbage i posen. Luk posen omhyggeligt, og opbevar den ved +2-8 C. Reagens 3 (R3): Negativ kontrol Reagens 4 (R4): Positiv kontrol Reagens 6 (R6): Konjugat Skal homogeniseres ved at vende glasset op og ned før brug. Reagens 10 (R10): Stopopløsning 7.2.2. Reagenser, der skal rekonstitueres Reagens 2 (R2): Koncentreret vaskeopløsning (20x) Fortynd reagenset 1:20 i destilleret vand for at få en brugsklar vaskeopløsning. Forbered 800 ml til én plade med 12 teststrimler. Reagens 8 (R8) + reagens 9 (R9): Enzymudviklingsopløsning Fortynd kromogenet (R9) 1:11 i substratbufferen (R8) (f.eks. 1 ml reagens R9 + 10 ml reagens R8), hvis 10 ml er nødvendigt og tilstrækkeligt til behandling af 12 strimler. Homogeniser. 7.3. Analyseprocedure Følg den angivne procedure nøje. Brug negative og positive kontrolsera til hver test for at validere kvaliteten af testen. Følg nedenstående gode laboratoriepraksis: [DK] 6

1) Fastlæg prøvefordelingen og identifikationsoversigten omhyggeligt. 2) Klargør den fortyndede vaskeopløsning R2. 3) Tag støtterammen og det nødvendige antal teststrimler (R1) ud af beskyttelsesposen. Læg de ubrugte strimler tilbage i posen. Luk posen, og opbevar den ved +2-8 C. 4) Fordel følgende i brøndene i den angivne rækkefølge (anbefalet pladefordeling): 50 µl negativ kontrol (R3) i A1, B1, C1 50 µl positiv kontrol (R4) i D1, E1 50 µl ufortyndet prøve i hver brønd, F1, G1, osv 50 µl konjugat (R6) i hver brønd Afhængig af det anvendte system er det muligt at ændre kontrollernes placering eller rækkefølgen af fordelingen. Homogeniser reaktionsblandingen med mindst 3 opsugninger eller med en mikropladeryster i 5 sekunder. BEMÆRK! Prøve- og kontrolfordelingen kan kontrolleres visuelt på dette trin af processen, der er forskel på farven i en tom brønd og en brønd med prøve. Fordel konjugatet i løbet af 5 minutter efter prøvefordelingen. Der er en tydelig farveforskel mellem en tom brønd og en brønd, der indeholder den røde konjugatopløsning (R6) (se 7.7) 5) Afdæk pladen med en ny selvklæbende film, hvis dette er muligt. 6) Inkubér mikropladen i 30 til 35 minutter ved 37 C ± 1 C. 7) Fjern den selvklæbende film ved behov. Sug indholdet i alle brønde op i en væskeaffaldsbeholder, og tilsæt mindst 370 µl vaskeopløsning til hver brønd. Sug igen, og gentag vasken mindst 4 gange (i alt 5 vaskecyklusser). Restmængden skal være mindre end 10 µl (hvis det er nødvendigt, kan teststrimlerne tørres ved at lægge dem med bagsiden op på sugende papir). Hvis et automatisk vaskesystem er til rådighed, følges samme arbejdscyklus. BEMÆRK! Gå til vasketrinet inden for 20 minutter. 8) Forbered udviklingsopløsningen (reagens R8 + R9). 9) Fordel hurtigt 50 µl nyforberedt udviklingsopløsning (R8 + R9) i hver brønd. Lad reaktionen foregå i mørke i 25 til 35 minutter ved stuetemperatur (18-30 C). Undgå at bruge selvklæbende film under inkubationen. BEMÆRK! Fordelingen af udviklingsopløsningen, der er lyserød, kan kontrolleres visuelt på dette trin af processen. Der er en tydelig farveforskel mellem en tom brønd og en brønd, der indeholder den lyserøde substratopløsning. (Se 7.7). 10) Tilsæt 50 µl stopopløsning (R10) i samme rækkefølge og med samme fordelingshastighed som for substratopløsningen. Homogeniser reaktionsblandingen. BEMÆRK! Fordeling af den farveløse stopopløsning kan kontrolleres visuelt på dette trin af processen. Substratfarven, lyserød (for negative prøver) eller blå (for positive prøver), svinder fra brøndene, som bliver farveløse (for negative prøver) eller gule (for positive prøver) efter tilsætning af stopopløsningen. 11) Tør undersiden af hver plade omhyggeligt af. Vent mindst 4 minutter efter tilsætningen af stopopløsningen og højst 30 minutter efter afbrydelsen af reaktionen, og aflæs den optiske densitet ved 450/620-690 nm ved hjælp af pladelæseren. 12) Kontroller, at de spektrofotometriske og visuelle aflæsninger stemmer overens, og sammenlign dem med plade- og prøvefordelingen og identifikationsoversigten. 7.4. Kvalitetskontrol Brug negative (R3) og positive (R4) kontroller til hver kørsel til validering af testresultaterne. (Se 7.5) [DK] 7

7.5. Testvalideringskriterier Denne test er valideret, hvis de efterfølgende betingelser er overholdt: 1) For den negative kontrol R3: OD R3 0,080 Hvis en af kontrolværdierne er over denne værdi, skal der ses bort fra denne, og beregningen skal udføres med de to tilbageblevne negative kontrolværdier. 2) For den positive kontrol R4: OD R4 0.700 7.6. Beregning / fortolkning af resultaterne Cut-off bestemmes med den negative kontrol R3: Beregn den gennemsnitlige målte absorbansværdi for den negative kontrol R3, og beregn cut-offværdien (COV) på følgende måde: COV = gennemsnitsværdi for OD R3 + 0.100 Prøver med OD under COV betragtes som værende negative af Syphilis Total Ab. Resultater, der ligger lige under cut-off-værdien (COV -10 % < OD < COV) bør imidlertid fortolkes med forsigtighed. Det tilrådes at genteste de tilsvarende prøver i en dobbelttest, når systemerne og laboratorieprocedurerne tillader dette. Prøver med OD over eller lig med COV betragtes som værende positive af Syphilis Total Ab og skal gentestes i dobbelttest før den endelige fortolkning. Gentestede prøver, som er over COV i mindst én dobbelttest, betragtes som værende positive og skal undersøges yderligere. Prøver, der er under cut-off i begge dobbelttests, betragtes som værende negative. I tilfælde af meget lav optisk densitet for testede prøver (negativ OD), og hvis både tilstedeværelsen af prøver og reagens er kontrolleret, kan resultaterne tolkes som værende negative. Det anbefales at bekræfte de positive prøver efter de aktuelt gældende nationale anbefalinger og algoritmer. 7.7. Spektrofotometrisk verificering af prøve- og konjugatpipettering (valgfri) Prøver og kontroller Det kan kontrolleres, om prøven og kontrollen findes i brønden, med en automatisk aflæsning ved 450/620 nm. En brønd med tilsat prøve har en OD mellem 0,050 og 1,100. Konjugat Konjugatet er farvet rødt. Det kan kontrolleres, om konjugatet findes i brøndene, med en automatisk læsning ved 450/620 nm. En brønd med prøve og konjugat har en OD 1,200. Verificering af pipettering af udviklingsopløsning Det er muligt at bekræfte tilstedeværelsen af lyserød udviklingsopløsning i brønden ved automatisk aflæsning ved 492 nm. En brønd med udviklingsopløsning skal have en optisk densitet over 0,100 (en lavere OD indikerer en utilstrækkelig fordeling af udviklingsopløsningen). 8. TESTBEGRÆNSNING Som ved alle serologiske tests for syfilis skal tolkningen af resultaterne, der opnås med Syphilis Total Ab EIA-analysen, bruges sammen med patientens kliniske symptomer, medicinske anamnese og andre laboratoriefund for at frembringe en overordnet klinisk diagnose. [DK] 8

Der findes ikke en enkelt test eller definitiv referencestandard til hver af denne sygdoms stadier. Syfilisdiagnosen baseres således fortrinsvis på serologisk testning, som kræver resultater fra både ikke-treponemale og treponemale metoder. Ingen diagnosetest giver absolut sikkerhed for, at en prøve ikke indeholder et lavt niveau af antistoffer mod T. Pallidum, såsom de, der forefindes i infektionens meget tidlige stadie. Derfor udelukker et negativt resultat ikke på noget tidspunkt muligheden for eksponering for infektion med syfilis. ELISA-teknikkerne kan give fejlagtige positive reaktioner. Det anbefales at kontrollere specificiteten for reaktionen for alle prøver, der testes gentaget positive, i henhold til fortolkningskriterierne for Syphilis Total Ab-sættet ved hjælp af en egnet metode: Treponema pallidum Hæmagglutinations-analyse. Alle treponemale testresultater har en tendens til at blive ved med at være reaktive efter en treponemal infektion, de må derfor ikke bruges til at evaluere reaktion på behandling. På grund af den vedvarende reaktivitet som regel i hele patientens levetid er de treponemale tests værdiløse til bestemmelse af tilbagefald eller reinfektion hos patienter med et reaktivt resultat. I dette tilfælde anbefales det at bruge andre analyser: Syphilis IgM EIA, RPR og TPHA. Den spektrofotometriske metode til verificering af fordeling af prøve, konjugat og udviklingsopløsning verificerer ikke nøjagtigheden af den fordelte mængde af prøvemateriale og konjugat. Denne metode viser kun forekomsten af prøvemateriale og konjugat. Fejlprocenten med denne metode er tæt forbundet med det anvendte systems nøjagtighed (en kumuleret variationskoefficient på mere end 10 % for fordeling og aflæsning vil i betydelig grad reducere kvaliteten af dette trin). 9. SPECIFIKATIONER FOR YDEEVNE 9.1. Præcisionsmåling Reproducerbarheden og den intermediære præcision er blevet bestemt ved hjælp af prøver med forskellige koncentrationer af syfilis-antistoffer. Prøverne blev testet 30 gange i de samme testserier for at bestemme reproducerbarheden. Prøverne blev også testet ved dobbelttests i 20 dage med en frekvens på 2 tests om dagen. Forholdsgennemsnit, standardafvigelser og variationskoefficienter (CV) blev beregnet. 9.1.1. Reproducerbarhed Prøver N Forholdsgennemsnit Standardafvigelse CV % Lav negativ 30 0,14 0,014 9,5 % Høj negativ 30 0,68 0,051 7,5 % Lav positiv syfilisab 30 1,90 0,070 3,7 % Positiv syfilis-ab 30 3,76 0,130 3,5 % De opnåede CVer for positive prøver er mindre end 10 %. [DK] 9

9.1.2. Intermediær præcision Prøver N Forholdsgennems nit Lav negativ Høj negativ Lav positiv syfilis-ab Positiv syfilis-ab 8 0 8 0 8 0 8 0 0,15 0,74 2,30 4,13 Intern analyse Krydskontroller et analyse / laborant Krydskontrol dag Reproducerbarh ed i alt SD CV % SD CV % SD CV % SD CV % 0,03 5 0,03 8 0,11 2 0,18 0 22,5 % 0,023 14,7 % 5,1 % 0,074 10,0 % 4,9 % 0,312 13,5 % 4,3 % 0,543 13,1 % 0,01 7 0,00 6 0,09 9 0,19 5 10,9 % 0,045 29,0 % 0,8 % 0,084 11,2 % 4,3 % 0,346 15,0 % 4,7 % 0,604 14,6 % De opnåede CVer for positive prøver er mindre end eller lig med 15 %. 9.2. Klinisk ydeevne Den kliniske ydeevne for Syphilis Total Ab-analysen er beregnet ved test af prøver fra prospektive og retrospektive undersøgelser: Prospektiv undersøgelse: - 5195 prøver fra tilfældige bloddonorer; - 460 prøver fra patienter, som var under mistanke for syfilis. Retrospektiv undersøgelse: - 350 positive fra STD-patienter. Undersøgelserne blev udført på 2 bloddonorklinikker, på et STD-center (seksuelt overførte sygdomme) og hos Bio-Rad. 9.2.1. Diagnostisk specificitet Undersøgelsen blev udført på serum og EDTA-plasmaprøver, der var indsamlet på 2 blodbanker fra tilfældige donorer i Frankrig. Der blev også udført en specificitetsundersøgelse på prøver fra patienter. Alle resultaterne blev sammenlignet med dem, der var opnået med andre CE-mærkede syfilistests. Tabel 1: Specificitetstest (IR = reaktiv i starten; RR = gentaget reaktiv) Population Sted Prøvetype Bloddonor er nr. 1 + nr. 2 Totalt antal prøver Reaktive i starten (IR) Gentaget reaktive (RR) RR specificitet (%) Serum SST 3127 2 2* 3125/3125 Plasma EDTA K2 2068 2 2* 2066/2066 Total 5195 4 4* Patienter nr. 3 Serum 351 1 1 100 % 5191/5191 99,72 % 350/351 95 % CI (%) 99,93 % - 100 % 98,42 100 % *Gentaget reaktive prøver testet positive med anden CE-mærket EIA-syfilisanalyse blev udelukket fra diagnosespecificitetsberegningen [DK] 10

9.2.2. Diagnostisk sensitivitet Retrospektiv undersøgelse: Undersøgelsen blev udført på 350 frosne prøver, hvoraf 2 prøver blev erklæret negative og 348 bekræftet positive med CE-mærkede syfilis-analyser. Blandt disse 348 positive prøver var 7 prøver fra patienter på et tidligt stadie af infektionen. Alle 348 prøver blev testet positive med Bio-Rad Syphilis Total Ab-analysen. Prospektiv undersøgelse: I alt 460 friske prøver blev evalueret med Bio-Rad Syphilis Total Ab-analysen og sammenlignet med CE-mærkede syfilis-tests. 348 blev testet negative med både Bio-Rad og referencetests (med to prøver testet falsk positive med reference EIA-test) 109 blev testet positive med begge analysetests. 3 prøver viste afvigende resultater (efter gentest med Bio-Rad-analysen): 1 prøve testet positiv med Bio-Rad-analysen og meget negativ med referencetestene. Denne prøve med lav syfilisfrekvens var på grænse-cut-off-værdien for begge EIA-tests 1 prøve testet positiv med referencetestene, negativ med Bio-Rad-analysen (fra 1 patient uden symptomer) 1 prøve testet positiv med referencetestene, negativ IR og positiv i den gentagne test med Bio-Rad-analysen. Retrospektive og prospektive undersøgelser: Den samlede diagnosesensitivitet var 99,56 % (457/459) med et konfidensinterval ved 95 % på [98,44 % - 99,95 %]. Klinisk sensitivitet Den kliniske sensitivitet blev også undersøgt på 3 kommercielle paneler og 1 serokonversionspanel. Bio-Rad Syphilis Total Ab-analysen blev sammenlignet med en CE-mærket syfilisanalyse. Detektionen for hver prøve i panelerne er ens for Bio-Rad-analysen og syfilis-referenceanalysen. 9.3. Analytisk sensitivitet Den analytiske sensitivitet er blevet evalueret på 2 NIBSC-standarder og beregnet ved cut-off-værdien ved hjælp af en regression. 1. Grænsen for detektion af IgG / IgM blev evalueret på 3 partier Syphilis Total Ab-analyse og beregnet til 0,53 mie/ml med CI 95 % [0,10 mie/ml 1,30 mie/ml] ved hjælp af WHOstandarden IgM/IgG (NIBSC-kode: 05/132). 2. Grænsen for detektion af IgG blev evalueret på 1 parti Syphilis Total Ab-analyse og beregnet til 0,11 mie/ml med CI 95 % [0,02 mie/ml 0,27 mie/ml] ved hjælp af WHO-standarden IgM/IgG (NIBSC-kode: 05/122). 9.4. Analytisk specificitet / krydsreaktivitetsundersøgelse I alt 125 potentielt interfererende prøver indeholdende antistoffer mod patogener, som kan føre til infektionssygdomme (Lyme, toksoplasmose, EBV, leptospirose, SLE (lupus), hepatitis A-antistof, hepatitis B-antistof, hepatitis C-antistof, HTLV I/II og HIV), prøver fra patienter i risikogruppen (gravide kvinder og multipara-kvinder) eller prøver fra patienter med immunsystemforstyrrelser (reumatoide faktorer) blev testet med Syphilis Total Ab-analysen. Blandt 125 testede prøver blev 1 prøve testet positiv flere gange med Syphilis Total Ab-analysen. Denne prøve blev verificeret sand positiv med andre CE Syphilis EIS-analyser og bekræftende analyser. Den fundne specificitet for denne målgruppe er lig med 100 % (124/124) med et 95 % konfidensinterval på [97,1 % - 100,0 %]. [DK] 11

9.5. Hook-effekt Forekomsten af en mulig hook-effekt er undersøgt ved test af 6 syfilis-positive prøver med høje titre ved forskellige fortyndinger. Ækvivalensen for observerede resultater mellem ikke-fortyndede og fortyndede prøver viser manglende hook-effekt på de testede prøver. 10. BIBLIOGRAFISKE REFERENCER. 1. Levinson SS. The Nature of Heterophilic Antibodies and Their Role in Immunoassay Interference. J. Clin. Immunoassay 15: 108-115,1992. 2. Norris S.J. Plypeptides of Treponema pallidum: Progress toward understanding their structural, functional and immunological role. Microbiological Reviews, Setpt. 1993 Vol 57. 3. Larsen SA, Steiner BM, and Rudolph AH. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis. Clin Microbiol Rev. 1995 Jan; 8(1):1 21. 4. Zrein M, Maure I, Boursier F, Soufflet L. Recombinant antigen-based enzyme immunoassay for screening of Treponema pallidum antibodies in blood bank routine. J Clin Microbol. 1995 Mar; 33(3):525 7. 5. Singh AE and Romanowski. Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiological, and some biologic features. Clin Microbiol Rev. 1999 Apr; 12(2):187 209. 6. Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin Chem Lab Med. 2009. 47:596-606. 7. International Journal of STD & AIDS 2009; 20: 300 309. 8. Screening donated Blood for Transfusion-Transmissible infections. World Health Organization. 2009 9. M. J. Loeffelholz, and M. J. Binnicker, It Is Time to Use Treponema-Specific Antibody Screening Tests for Diagnosis of Syphilis, J Clin Microbiol, 50 (2012), 2-6. [DK] 12

[DK] 13

[DK] 14

[DK] 15

[DK] 16

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tlf.: +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax: +33 (0) 1 47 41 91 33 2014/11 www.bio-rad.com 883679 [DK] 17