: REF 080-035 Tilsigtet anvendelse MycAssay Pneumocystis er indiceret til brug af kvalificerede laboratoriemedarbejdere til kvalitativ påvisning af Pneumocystis jirovecii genomisk DNA ekstraheret fra respirationsprøver fra de nedre luftveje (f.eks. bronkiale prøver) som en hjælp for diagnosticering hos voksne patienter, som mistænkes at have P. jirovecii-lungebetændelse. MycAssay Pneumocystis er blevet godkendt til brug med Cepheid SmartCycler softwareversioner 1.7b og 3.0) (ved anvendelse af SDS Resumé og forklaring Pneumocystis jirovecii (tidligere carinii) lungebetændelse (PCP) er en almindelig opportunistisk lungebetændelse hos immunsvækkede patienter, især dem med fremskreden HIV-infektion og AIDS 1. Den erhverves typisk fra det omgivende samfund, og præsenterer sig som subakut, men fører til progressivt åndedrætssvigt og død 2, hvis den ikke behandles. Profylakse med trimethoprim-sulfamthoxazol (Bactrim eller Septrin) gives rutinemæssigt til mange risikopatienter, en praksis som væsentligt har reduceret forekomsten af PCP, men der sker gennembrud og de, der ikke ved at de er HIVpositive kan demonstrere AIDS med PCP 3. PCP forekommer også hos andre immunsvækkede patienter, inklusive modtagere af hele organtransplantater, hypogammaglobulinæmi, og kronisk leukæmi. Aktuelt er diagnosticeringen af PCP baseret på mikroskopi-metoder, da P. jirovecii ikke kan podes rutinemæssigt i mikrobiologilaboratorier. Bronkoalveolær lavage (BAL) er den foretrukne metode til indsamling af prøver. Almindelige metoder til diagnosticering omfatter immunofluorescens (IF) eller direkte fluorescens og histologisk farvning af prøver 4. er et molekylært diagnosesæt til påvisning af P. jirovecii baseret på Molecular Beacon 5 PCRteknologi. Hele testproceduren, inklusive udtrækning af DNA fra den kliniske prøve, kan gennemføres i løbet af 4 timer, eller kun 2 timer hvis ekstraheret DNA allerede er tilgængeligt.denne analyse giver direkte fordele i form af forbedret laboratorieeffektivitet kombineret med en hurtig test, der medfører sandsynlige kliniske fordele. Testens diagnostiske præcision afhænger i stor udstrækning af prøvens kvalitet. Procedurens principper Efter blanding af reagenserne i MycAssay Pneumocystis-sættet med en prøve, der indeholder den ønskede Pneumocystis DNA-sekvens (en del af den store Pneumocystis mitokondrial ribosomal underenhed), vil thermocycling resultere i DNA-amplifikation. Analysen indeholder også en Internal Amplification Control (IAC) sekvens, et DNA-fragment der ikke findes i Pneumocystis, andre fungale, bakterielle eller humane genomer, for at påvise PCR-hæmmende substancer og bekræfte funktionen af analysereagenserne. De amplificerede DNA-mål påvises ved hjælp af Molecular Beacons; enkeltstrengede oligonucleotid hybridiseringsprober, som danner en trin-og-spiral struktur. Spiralen indeholder en probesekvens, som er komplementær til en målsekvens, og trinnet dannes af adouceringen af komplementære armsekvenser, som er placeret på hver side af probesekvensen. En fluorofor, som fluorescerer når den exciteres med lys med den passende bølgelængde, er kovalent bundet til enden af én arm og en slukker, som undertrykker fluorescensen af fluoroforen ved tæt fysisk nærhed, er kovalent bundet til enden af den anden arm. Molecular beacons fluorescerer ikke, når de befinder sig frit i opløsningen. Imidlertid, når de hybridiserer til en nukleinsyrestreng, der indeholder en målsekvens, undergår de en konformationsændring, som gør dem i stand til at fluorescere. Mængden af fluorescens ved en hvilken som helst given cyklus, eller efter gennemført cyklus, afhænger af mængden af tilstedeværende specifikke amplicons på det pågældende tidspunkt. SmartCycler Real-Time PCR systemet monitorerer samtidigt fluorescensen, der udsendes af hver beacon. 1 Morris A, Lundgren JD, Masur H, Walzer PD, Hanson DL, Frederick T, Huang L, Beard CB, Kaplan JE. (2004). Current epidemiology of Pneumocystis pneumonia. Emerg Infect Dis: 10: 1713-20. 2 Miller RF, Allen E, Copas A, Singer M, Edwards SG. Improved survival for HIV infected patients with severe Pneumocystis jirovecii. pneumonia is independent of highly active antiretroviral therapy. Thorax 2006; 61:716-21. 3 Kovacs JA, Gill VJ, Meshnick S, Masur H. (2001). New insights into transmission, diagnosis, and drug treatment of Pneumocystis carinii pneumonia. JAMA: 286: 2450-60. 4 Huang L, Morris A, Limper AH, Beck JM; ATS Pneumocystis Workshop Participants. An Official ATS Workshop Summary: Recent advances and future directions in pneumocystis pneumonia (PCP). Proc Am Thorac Soc 2006;3:655-64. 5 Tyagi S, Kramer FR. (1996). Molecular beacons: Probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology: 14: 303-308. Dansk 1
Forholdsregler Sættet er udelukkende beregnet til at blive anvendt af professionelle laboratoriemedarbejdere. Der kræves procedurer til non-aerosol manipulation af prøver. Standardforholdsregler og institutionsretningslinjer skal følges ved enhver håndtering af alle prøver. Et materialesikkerhedsdatablad kan fås hos Myconostica Ltd. Denne test er udelukkende beregnet til in vitro diagnostisk anvendelse. Denne test er udelukkende beregnet til brug med Cepheid SmartCycler systemet med Dx diagnosesoftwareversioner 1.7b og 3.0. Brug ikke reagenser eller kontroller, hvis de beskyttende poser er åbne eller gået i stykker ved modtagelsen. Reagenser og kontroller kan ikke ombyttes imellem sæt med forskellige partinumre. Hæld aldrig reagenser eller kontroller sammen fra forskellige glas, selvom de er fra samme parti. Anvend aldrig reagenser eller kontroller efter deres udløbsdato. Reagenser og kontroller må ikke genfryses eller genanvendes efter åbning. Bær beskyttelsesbeklædning og engangshandsker ved håndtering af sættets reagenser. Undgå mikrobiel- og deoxyribonuklease (DNase)-kontaminering af reagenser ved fjernelse af alikvoter fra glas. Det anbefales at bruge sterile, DNase-fri, lav-retentions engangs filter-tips eller positive displacement pipette tips. Brug en ny spids til hver prøve eller reagens. Bortskaf ubrugte reagenser og affald i overensstemmelse med gældende nationale og lokale love og forskrifter. For at undgå kontaminering med Pneumocystis eller internal amplification control (IAC) amplicons, må reaktionsglassene ikke åbnes efter amplifikation. Der kan eventuelt testes yderligere kontroller i overensstemmelse med vejledninger eller krav fra nationale, lokale eller akkrediterende organisationer. Det er forbudt at spise, drikke eller ryge i områder, hvor prøver eller sættets reagenser håndteres. Lave koncentrationer af DNA kan være ustabile ved ukorrekt opbevaring. Det anbefales, at udtrækninger af DNA fra kliniske prøver opbevares ved -80 o C for at bevare deres integritet. Desuden skal gentagne optøninger og genfrysninger altid undgås, når det er muligt. Sættets indhold Beskrivelse Sættet består af fem forseglede 3-rums folieposer, som hver kan anvendes separat. Hver pose indeholder tilstrækkelig reagens til 8 reaktioner. Volumen Glas 1 (orange hætte) Glas 2 (blå hætte) Glas 3 (klar kætte) Glas 4 (sort hætte) dntps MgCl 2 Bufferet opløsning af DNA polymerase complex <0,01% primere <0,01% Molecular Beacons <0,0001% Internal Amplification Control (IAC) Internal Amplification Control er et rekombinant DNA-plasmid, der indeholder en ikke-infektiøs sekvens uden relation til nogen af målsekvenserne (Pneumocystis) Tris-HCl buffer Negativ kontrol Vand Positiv kontrol <0,0001% positiv kontrol DNA Det positive kontrolmolekyle er et rekombinant plasmid, der indeholder Pneumocystismålsekvenserne Tris-HCl buffer 66 µl 66 µl 25 µl 25 µl Sættet indeholder desuden: MycAssay Pneumocystis Myconostica Protocol CD-ROM Brugsanvisning Analysecertifikat Opbevaring Sættet skal opbevares i frossen tilstand (-15 til -25 C) indtil udløbsdatoen, der er angivet på etiketten på sættets boks. Derefter skal det kasseres og bortskaffes ifølge lokale forskrifter. Dansk 2
Når en pose er blevet åbnet, skal dens indhold anvendes straks og må ikke genfryses eller genanvendes. Nødvendigt udstyr/materiale (medfølger ikke) Cepheid SmartCycler Real Time PCR System (inklusive brugervejledning, tilsluttet computer og Dx Diagnostic software, version 1.7b eller 3.0d) Mini-centrifuge tilpasset specielt til SmartCycler reaktionsglas Mikrocentrifuge Vortex mixer SmartCycler reaktionsglas Stativ til SmartCycler reaktionsglas Mikropipetter (nødvendigt volumen 7,5 µl 20 µl) Sterile lav-retentions filterspidser Engangshandsker, uden pudder Mønsterbeskyttet DNA-dekontamineringsopløsning Permanent markeringspen DNA-isolationssæt (se nedenfor) Prøve Prøven til analysen er totalt DNA ekstraheret fra kliniske BAL-prøver. Det anbefales at anvende følgende DAN-isolationssæt og udstyr fra Myconostica Ltd., der også blev anvendt ved valideringen, til dette formål: - MycXtra Fungal DNA ekstraktionssæt (REF: 080-005, kan fås hos Myconostica) - Vortex-Genie 2 (Scientific Industries Inc., New York, USA) - Vortex Adapter Plate (REF: 080-015, kan fås hos Myconostica) Bemærkninger til proceduren Læs hele protokollen inden arbejdet påbegyndes Hele MycAssay Pneumocystis processen (eksklusive DNA-ekstraktion) tager ca. 2 timer, afhængigt af antallet af testede prøver. Opsætning af testen skal udføres i en PCR-arbejdsstation eller et pre-pcr laboratorium. Hvis en PCR-arbejdsstation ikke er tilgængelig, skal testen opsættes i et dertil beregnet område af laboratoriet 6, som regelmæssigt rengøres med DNA-dekontamineringsreagenser. Det skal imidlertid undgås at anvende DNA-dekontamineringsreagenser ved opsætning af Real-Time PCR, da de kan hæmme analysen. Brug mikropipetter til overføring af væsker. Mikropipetter, der kun er beregnet til dette formål, skal bruges til opsætning af disse reaktioner og de skal regelmæssigt dekontamineres. Det anbefales at anvende lav-retentions filterspidser for at sikre, at der ikke mistes noget DNA under opsætningsproceduren. Udvis forsigtighed ved håndtering af glas 4. Dette indeholder DNA-skabelonmateriale og kontaminering kan medføre forkerte positive testresultater. Bær altid handsker. Alle reagensglas skal forsynes med hætte efter brug og inden bortskaffelse. Vær forsigtig med at identificere SmartCycler reaktionsglassene korrekt, når der behandles flere patientprøver ad gangen. 6 For example see Mifflin, T. E. (2003). Setting up a PCR Laboratory. In PCR Primer, 2nd Ed. (eds. Dieffenbach and Dveksler). Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. USA. Dansk 3
Anvendelsesprocedure: 1. Opsætning af Real-Time PCR 1.1 Tænd først for SmartCycler Real-Time PCR systemet (instrument og tilhørende computer) og start den relevante software. Indtast brugernavn og password. 1.2 Kontrollér at arbejdsområdet er blevet rengjort med DNA-dekontamineringsreagenser og at det er helt tørt; undgå brugen under analyse-opsætning, da resterende rengøringsopløsning kan hæmme PCR-reaktionerne. 1.3 En pose indeholder én af hver af Glas 1, Glas 2, Glas 3 og Glas 4. Der er tilstrækkelig mængde reagenser i én pose til gennemføre 8 reaktioner. Der skal udføres mindst én positiv kontrol- og én negativ kontrol-reaktion pr. kørsel, hvor reagenserne er fra et enkelt sæt. Derfor kan én pose analysere 6 patientprøver. Hvis der skal testes mere end 6 prøver, kan der bruges mere end én pose, hvis de anvendte poser er fra samme sæt-parti. Der kan testes maskisimalt 38 patientprøver med de 5 poser i sættet. 1.4 Beregn antallet af nødvendige reaktioner med reference til nedenstående tabel: Antal af poser Maksimalt antal af patientprøver 1 6 2 14 3 22 4 30 5 38 1.5 Tag det passende antal poser ud af fryseren. Brug aldrig en pose, der ikke længere er forseglet, Tag også patientprøverne ud af fryseren, hvis de blev frosset efter ekstraktionen. 1.6 Åbn det nødvendige antal poser og tag glassene ud. Hvis der anvendes mere end én pose, men der kun gennemføres ét sæt positive og negative kontroller, er det kun nødvendigt at tage glas 3 og 4 ud af den ene pose. Udvis forsigtighed ved håndtering af glas 4. Dette indeholder DNA-materiale til positiv kontrol og kontaminering kan medføre forkerte positive testresultater. 1.7 Lad glassenes indhold tø op ved at anbringe dem på laboratoriebænken i 5-10 minutter og sikre, at indholdet af hvert glas er helt optøet inden der fortsættes. Bland glassenes indhold og patientprøverne med Vortex mixer; centrifugér dem derefter kort i en mikrocentrifuge for at sikre samling af alt indholdet i glassenes bund inden anvendelse. 1.8 Anbring det nødvendige antal SmartCycler reaktionsglas i deres stativ(er). Rør aldrig ved det diamantformede reaktionskammer på reaktionsglassene med hænderne. 1.9 Opsæt altid først den negative kontrol og derefter patientprøverne. Den positive kontrol skal altid opsættes til sidst. 1.10 Reagens- og DNA-voluminer vises i nedenstående tabel: Reagens Glas 1 (orange hætte) Negativ kontrol Reaktion Patient prøve Positiv kontrol 7,5 µl 7,5 µl 7,5 µl Glas 2 (blå hætte) 7,5 µl 7,5 µl 7,5 µl Glas 3 (klar hætte) 10 µl - - Patientprøve - 10 µl - Glas 4 (sort hætte) - - 10 µl Totalt volumen 25 µl 25 µl 25 µl 1.11 Tilføj reagenser i den rækkefølge, der er vist i ovenstående tabel; glas 1, derefter glas 2, fulgt af skabelonen (negativ kontrol, patientprøve, eller positiv kontrol). Vær forsigtig ved udtagning af alikvoter fra glas 1; væsken er en smule viskøs og kan klæbe til glasset indvendige rand. Hvis dette sker, skal det køre igen i centrifugen for at samle den endelige indhold i bunden af glasset, inden det forsøges at fjerne de endelige alikvoter. Dansk 4
1.12 Brug en ny pipettespids til hver væskeoverføring. Sæt hætten på hvert reagensglas igen efter brug og kassér det straks sammen det resterende indhold i en lukket beholder til klinisk affald. Ubrugte reagenser kan ikke gemmes til senere brug. 1.13 Vær især forsigtig ved udtagning af væsken med pipette fra glas 4 (DNA til positiv kontrol) for at sikre, at den ikke kontaminerer andre reaktionsglas. Ved at lukke lågene på de andre reaktionsglas inden åbning af glas 4 reduceres risikoen for krydskontaminering. 1.14 Kontrollér at alle SmartCycler reaktionsglas-låg er fast lukket, sæt derefter etiket på hvert låg og skriv med en permanent markeringspen, f.eks. POS for positiv kontrol, NEG for negativ kontrol og patient-id for patientprøver. Lad reaktionsglassene centrifugere ned i 10 sekunder i den specielt tilpassede minicentrifuge. Kontrollér visuelt, at der ikke er bobler i reaktionsblandingerne. 1.15 Gå straks videre til afsnit 2. reaktioner er stabile på bænken i op til 60 minutter. 1.16 Efter PCR-opsætningen skal det sikres, at arbejdsområdet rengøres omhyggeligt med DNAdekontamineringsreagenser. 2. Gennemførelse af kørslen (run) Kontrollér, inden der fortsættes med det følgende afsnit, hvilken version af Dx softwaren der er installeret på computeren. Åbn softwaren, vælg Help fra værktøjslinjen og klik på About. For version 1.7b følges nedenstående vejledning i Afsnit 2.1 For version 3.0 følges nedenstående vejledning i Afsnit 2.2 Vær også opmærksom på, at der kræves visse brugerrettigheder i softwaren for at Retrieve Run(s) (modtage kørsel(ler) eller Import (importere) en analyse. Disse kan kun tildeles af administratoren af instrumentet. 2.1 SmartCycler Dx Diagnostic software version 1.7b 2.1.1 Åbn SmartCycler Dx Diagnostic software version 1.7b og indtast brugernavn og password. 2.1.2 Indsæt MycAssay Pneumocystis Myconostica Protocol CD-ROM'en og klik på fanen Define Assays. 2.1.3 Gå til Retrieve Run(s) via Tools-menuen på den øverste menubjælke og klik på Proceed: 2.1.4 Vælg filen MycAssay Pneumocystis Dx1_7 v3_1.dxa fra CD-ROM'en som vist nedenfor. Denne fil skulle være den enste, der registreres af programmet (et eksempel er vist nedenfor): Dansk 5
2.1.5 Fremhæv filnavnet Validation test 1 Myc Pne v3.1 på den næste skærm og klik på OK, klik derefter på Proceed og OK: 2.1.6 Luk programmet. Når det genåbnes vil MycAssay Pneumocystis Dx1.7b v3.1 analysen være tilgængelig til brug, når der oprettes en ny kørsel (run) 2.1.7 Klik på fanen Create Run. Indtast et passende Run Name (det anbefales, at dette som minimum omfatter datoen og brugerens initialer), eller lad feltet være blankt hvis du ønsker at programmet skal oprette navnet automatisk. 2.1.8 Vælg MycAssay Pneumocystis Dx1.7 v3.1 som den ønskede analyse. 2.1.9 Indtast sættets Lot Number og Expiration Date, som er trykt på sættets boks og på hver pose. Lotnummeret vil være i formen M-XXXXXXXX. 2.1.10 Indtast Number of specimens i boksen og klik på Apply. Sample ID for hver prøve vil automatisk blive navngivet SPEC af programmet. Omdøb derfor hvert sted med et passende navn til brug for identifikation; dvs. dobbeltklik på SPEC for at markere det og indtast prøve-id'en. 2.1.11 Programmet vil automatisk inkludere en negativ og positiv kontrol i Real-Time PCR kørslen. 2.1.12 Anbring omhyggeligt reaktionsglassene på de fastlagte steder i SmartCycler blokken og klik på Start Run. N.B. Vær opmærksom ved anbringelsen af reaktionsglassende på det fastlagte steder, da de eventuelt ikke anbringes i samme rækkefølge som i din opsætning. Notér navnet på kørslen (run name) og klik på OK. Nu vil kørslen starte og der fremkommer et rødt lys over hvert af de brugte steder på blokken Klim på fanen Check Status for at bestemme, hvor lang tid gennemførelse af kørslen vil tage. Kørslens navn (run name) og derefter kørselstiden (run time) vil blive angivet. Dansk 6
2.2 SmartCycler Dx Diagnostic software version 3.0 2.2.1 Åbn SmartCycler Dx Diagnostic software version 3.0 og indtast brugernavn og password. 2.2.2 Indsæt MycAssay Pneumocystis Myconostica Protocol CD-ROM'en og klik på fanen Define Assays, og Import (importér) filen MycAssay Pneumocystis v3_1.sca fra CD-ROM'en som vist nedenfor: 2.2.3 Klik på fanen Create Run. Indtast et passende Run Name (det anbefales, at dette som minimum omfatter datoen og brugerens initialer), eller lad feltet være blankt hvis du ønsker at programmet skal oprette navnet automatisk. 2.2.4 Vælg MycAssay Pneumocystis v3.1 som den ønskede analyse. 2.2.5 Indtast sættets Lot Number og Expiration Date, som er trykt på sættets boks og på hver pose. Lotnummeret vil være i formen M-XXXXXXXX. 2.2.6 Indtast Patient (Sample) ID og Number of specimens (formeringer) i de passende bokse og klik på Apply. Udfør dette for alle patientprøver, der testes. Programmet vil automatisk inkludere en negativ og positiv kontrol i Real-Time PCR kørslen. 2.2.7 Anbring omhyggeligt reaktionsglassene på de fastlagte steder i SmartCycler blokken og klik på Start Run. N.B. Vær opmærksom ved anbringelsen af reaktionsglassende på det fastlagte steder, da de eventuelt ikke anbringes i samme rækkefølge som i din opsætning. Notér navnet på kørslen (run name) og klik på OK. Nu vil kørslen starte og der fremkommer et rødt lys over hvert af de brugte steder på blokken Klim på fanen Check Status for at bestemme, hvor lang tid gennemførelse af kørslen vil tage. Kørslens navn (run name) og derefter kørselstiden (run time) vil blive angivet. 3. Dataanalyse og fortolkning 3.1 Resultaterne kan ses i Dx softwaren ved at vælge fanen View Results. 3.2 Klik på knappen View Another Run nederst på siden, vælg den kørsel du ønsker at se og klik på OK. 3.3 Patient Results skal allerede være valgt i Views-listen. Patient (prøve) ID'en og det efterfølgende analyseresultat vil blive klart angivet. Resultaterne kan fortolkes ved hjælp af nedenstående tabel: Resu ltat Patient resultat Farve Fortolkning Yderligere handling 1 Negative Grøn Negativ for Pneumocystis Rapporter resultat 2 Positive Rød Positiv for Pneumocystis Rapporter resultat 3 Invalid Lys grå* IAC fejl i prøve Gentag prøve 4 Invalid Lys grå* Fejl i positiv eller negativ kontrol Gentag hele kørslen *Hvis resultater rapporteres som ND, i lys grå, svarer dette til fejlkode 3079, resultatet af høj fluorescens i en eller flere kanaler. Hvis der registreres en Ct-værdi 39,0 i Pneumocystis-kanalen, skal dette rapporteres som positiv. 3.4 For at se individuelle prøveresultater (Ct-værdier) for enten Pneumocystis eller IAC separat, skal man vælge Sample Results fra listen Views og klikke på de individuelle faner for hvert målobjekt (dvs. <Pne> eller <IAC>). Resultaterne vil blive vist i det samme format som Patient Results, men for hvert individuelt målobjekt. 3.5 Hvis der for en patientprøve rapporteres et ugyldigt resultat, skyldes dette et mislykket IAC-resultat (indikeret som Unresolved (ikke løst) i fanen Sample Results); gentag reaktionen (plus positive og negative kontroller). Hvis Dansk 7
reaktionen fortsat mislykkes, kan der eventuelt være en hæmmende substans til stede i skabelonen og der kan ikke stoles på et negativt resultat. 3.6 Jo lavere Ct-værdi desto højere sandsynlighed for sygdom. Ved Ct-værdier tæt på cut-off-værdien på 39,00 er der større sandsynlighed for, at de repræsenter kolonisering end infektion, men nogle patienter kan have sygdom med meget lidt tilstedeværende P. jirovecii, repræsenterende en ringe prøve, tidligere behandling eller typen af fungal belastning i den specifikke patient. 3.7 For at eksportere kørselsdata, så de kan overføres til en anden computer, skal du gå til menuen Tools øverst på skærmen og vælge Data Management, efterfulgt af Archive Run(s) fra rullemenuen. Der fremkommer en meddelelsesskærm, klik på Proceed. Vælg den kørsel (run), der skal arkiveres ved at markere feltet til venstre og klik på OK. Der fremkommer en advarselsmeddelelse med angivelse af, hvor mange kørsler der skal arkiveres; klik på Proceed, hvis dette antal er korrekt. Vælg destination til lagring af kørselsfilen, f.eks. USB-stik. Klik på Save og notér filnavnet. Der fremkommer en meddelelsesskærm med angivelse af, hvor mange kørsler der skal arkiveres; klik på Proceed, hvis dette antal er korrekt. 3.8 For at importere kørselsdata skal du gå til menuen Tools øverst på skærmen og vælge Data Management, efterfulgt af Retrieve Run(s) fra rullemenuen. Der fremkommer en meddelelsesskærm, klik på Proceed. Gå til Look In: og vælg den lagerenhed, der bruges til at arkivere kørselsdataen (se afsnit 3.4 ovenfor). Vælg den kørselsfil (run file), der skal hentes, og klik på Open. Der fremkommer en anden skærm, der beder dig om at vælge den kørsel, du ønsker at hente. Vælg den kørsel, der skal hentes, og klik på OK. Der fremkommer en meddelelsesskærm med angivelse af, hvor mange kørsler der skal hentes; klik på Proceed, hvis dette antal er korrekt. 3.9 Når en kørsel er gennemført, vil dens kørseldatafil automatisk blive downloadet og kan findes i mappen SmartCycler Dx Folder på computeren. Denne kan om nødvendigt kopieres til en hvilken som helst mappe og gemmes elektronisk. 3.10 Hvis der er brug for en udskrift af resultaterne, så klik på Report og derfter på Print. Dette omfatter både det generelle Patient result (Positive, Negative eller Invalid) og Ct-værdien for hvert Sample Result. Dansk 8
4. Fejlfinding 4.1 Den negative kontrol har genereret et positivt signal i FAM-kanalen: Der opstod kontaminering under opsætningen. Resultater fra hele kørslen er ikke pålidelige og kan ikke betragtes som nøjagtige. Gentag hele kørslen og vær meget omhyggelig ved tilføjelse af skabelonerne, især den positive kontrol (glas 4), for at sikre, at der ikke sker krydskontaminering. Kontrollér at arbejdsområdet og instrumenterne bliver korrekt dekontamineret før og efter brug. Den negative kontrol var ukorrekt placeret i instrumentet. Sørg omhyggeligt for, at reaktionsglassene anbringes på de tildelte steder og forsynes korrekt med noter i programmet. 4.2 Den negative kontrol IAC Ct-værdi ligger ikke inden for det acceptable område: PCR er blevet hæmmet. Kontrollér, at arbejdsområdet og instrumenterne er helt tørre efter brug af dekontamineringsmidler inden PCRopsætning. Opbevaringsbetingelserne for sættet var ikke i overensstemmelse med instruktionerne i afsnittet om opbevaring i denne brugsanvisning, eller sættet har overskredet udløbsdatoen. Kontrollér, at de korrekte opbevaringsbetingelser for sættet er blevet overholdt. Kontrollér udløbsdatoen for reagenserne (se etiketten på sættets boks / poser) og gentag om nødvendigt med et ikke-udløbet sæt. Reagens fra enten glas 1 eller 2 blev ikke tilsat til PCR-reaktionen, eller der blev tilsat den dobbelte mængde fra glas 2. Gentag kørslen idet der udvises forsigtighed i opsætningsfasen. Sådanne fejl kan registreres, hvis væskeniveauet er højere eller lavere i ét reaktionsglas i forhold til andre. 4.3 Den positive kontrol er negativ: Opbevaringsbetingelserne for sættet var ikke i overensstemmelse med instruktionerne i afsnittet om opbevaring i denne brugsanvisning, eller sættet har overskredet udløbsdatoen. Kontrollér, at de korrekte opbevaringsbetingelser for sættet er blevet overholdt. Kontrollér udløbsdatoen for reagenserne (se etiketten på sættets boks / poser) og gentag om nødvendigt med et ikke-udløbet sæt. Der opstod en fejl under trin 1.12 og den positive kontrolskabelon (glas 4) blev anbragt i det forkerte reaktionsglas. Gentag kørslen idet der udvises stor forsigtighed i opsætningsfasen. Sådanne fejl kan registreres, hvis der er højere væskeniveau i et reaktionsglas og et lavere niveau i et andet, i forhold til normalt niveau. Reagensen fra enten glas 1 eller 2 blev ikke tilsat til reaktionen. Gentag kørslen idet der udvises forsigtighed i opsætningsfasen. Sådanne fejl kan registreres, hvis der er lavere væskeniveau i denne reaktion sammenlignet med andre. Den positive kontrol var ukorrekt placeret i instrumentet. Sørg omhyggeligt for, at reaktionsglassene anbringes på de tildelte steder. 4.4 Patientprøve(r) giver Resultat 3 - Invalid (ugyldig): Det er sandsynligt, at den/de ekstraherede kliniske prøve(r) indeholder PCR-hæmmere. Vi anbefaler, at DNA fra kliniske prøver ekstraheres ved hjælp af MycXtra Fungal DNA ekstraktionssæt. 4.5 Der findes ingen resultater for nogen kanal med nogen prøver eller kontroller: Opbevaringsbetingelserne for sættet var ikke i overensstemmelse med instruktionerne i afsnittet om opbevaring i denne brugsanvisning, eller sættet har overskredet udløbsdatoen. Kontrollér, at de korrekte opbevaringsbetingelser for sættet er blevet overholdt. Kontrollér udløbsdatoen for reagenserne (se etiketten på sættets boks / poser) og gentag om nødvendigt med et ikke-udløbet sæt. Det anvendte udstyr fungerer ikke optimalt. Dansk 9
Kontrollér, at dit Real-Time PCR-instrument er blevet serviceret korrekt og er up-to-date, samt at det er blevet fuldt kalibreret som beskrevet i denne installations- og vedligeholdelsesvejledning. Der blev brugt en ukorrekt protokolfil under opsætning af softwaren. Referér venligst til afsnit 2 og vælg den korrekte protokolfil, som specificeret for hver softwaretype/-version, fra Myconostica Protocol CD-ROM'en. Det er kun muligt at finde den fil, der passer til softwaren. Gentag kørslen ved hjælp af den korrekte protokolfil. Hvis du har yderligere spørgsmål, eller hvis du erfarer problemer, bedes du kontakte vores Technical Support (productsupport@lab21.com) Dansk 10
Præstationskarakteristika og -begrænsninger Ananlytisk sensitivitet Ved hjælp af den ovenfor beskrevne protokol og et rekombinant Pneumocystis DNA molekyle genereret hos Myconostica blev Limit of Detection (LoD) for Pneumocystis bestemt til at være < 35 kopier. Denne værdi blev bestemt ved hjælp af et rekombinant DNA-plasmid, der indeholdt målsekvensen. Pneumocystis-målsekvensen er mitokondrial, derfor vil der være talrige kopier pr. celle, men det vides ikke hvor mange. Analytisk selektivitet Analytisk selektivitet blev testet ved hjælp af DNA ekstraheret fra flere forskellige fungale og ikke-fungale arter. Der blev ikke rapporteret positivt resultat med følgende arter: Alternaria alternata, Aspergillus flavus, A. fumigatus, A. niger, A. terreus, Blastomyces capitatus, Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, Cladosporium spp., Cryptococcus neoformans, Doratomyces microsporus, Fusarium solani, Rhizomucor pusillus, Rhodotonila rubra, Saccharomyces cerevisiae, Scedosporium apiospermum, S. prolificans, Sporothrix schenkii, Trichosporon capitatum. Der blev ikke rapporteret positivt resultat med følgende bakteriearter; Bordetella pertussis, Corynebacterium diphtheriae, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Lactobacillus plantarum, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes, S. salivarius. Humant genomisk DNA giver ikke et positive resultat med denne analyse. Påvirkende substanser (kontraindikationer for brug) Følgende forbindelser blev testet i klinisk relevante koncentrationer og det blev konstateret, at de ikke hæmmede analysen: acteylcysteine, amphotericin, beclometasondipropionat, budesonid, colistimethatnatrium, fluticasonpropionat, formoterolfumaratdihydrat, ipratropiumbromid, lidocain, mannitol, salbutamolsulfat, salmerterol, Septrin (trimethoprimsulphamethoxazole), natriumklorid, natriumcromoglicat, terbutalin og tobramycin. Præstationsevaluering Den kliniske cut-off-værdi ved en Ct-værdi på 39,0 blev fastslået efter en analyse af et set kliniske prøver hentet fra forskellige patientpopulationer. Kliniske prøver indsamlet ved Bronkoalveolær lavage (BAL), der var blevet indsamlet fra 2 hospitaler, ekstraheret ved hjælp af MycXtra sættet og opbevaret, blev brugt til at evaluere præstationen af sættet. Resultaterne fra PCR-metoden blev sammenlignet med immunofluorescent mikroskopi. PCR v mikroskopi-diagnose Mikroskopi positiv Mikroskopi negativ PCR positiv 45 8 0.85 PPV (positiv prædiktiv værdi ) PCR 2 33 0.94 NPV (negativ prædiktiv værdi ) negativ 0.96 0.80 Følsomhed Specificitet Tabel 1: Diagnostisk følsomhed og specificitet af sættet sammenlignet med immunofluorescent mikroskopi. Tabel 1 repræsenterer data indhentet fra patienter med diagnosticeret HIV, patienter der ikke er inficeret med HIV og patienter med ubestemt HIV-status. Patienter med Pneumocystis-lungebetændelse har meget varierende mængder af påviselige organismer; jo lavere Ct-værdi desto højere sandsynlighed for sygdom. Patienter med HIV og Pneumocystislungebetændelse har tendens til at have større antal af påviselige organismer end patienter, der ikke er inficeret med virussen, men der er en betydelig overlapning. Spredningsdiagrammet i Figur 1 viser denne overlapning. For fuldkommenhedens skyld, da datasættet i Tabel 1 omfattede patienter, hvis HIV-status var ukendt, er spredningsdiagrammet for denne gruppe inkluderet i Figur 1 (søjle 3): Dansk 11
Ct-værdi Kategori 1 = HIV+ / mikroskopi+ ; 2 = HIV- / mikroskopi+ ; 3 = HIV ukendt / mikroskopi+ ; 4 = Alle mikroskopi- Figur 1: Spredningsdiagram med Ct-værdier fra DNA ekstraheret fra patientrespirationsprøver. Der er beskrevet fire grupper. Klinisk rapportering MycAssay Pneumocystis sættet er beregnet til at fungere som en hjælp for diagnosticering af Pneumocystislungebetændelse. Resultaterne skal vurderes i sammenhæng med patientens kliniske tilstand og andre diagnostiske testresultater. I det følgende er angivet anbefalede rapporter, hver afhængig af fortolkningen af analyseresultatet. Resultat nr. 1 Pneumocystis jirovecii ikke påvist. Resultat nr. 2 Pneumocystis jirovecii påvist. Positivt resultat Angiv Ct-værdi Resultat nr. 3 Test mislykket; hæmmere eller andre ukendte substanser tilstede. Jo lavere Ct-værdi desto højere sandsynlighed for sygdom. Ved Ct-værdier tæt på cut-off-værdien på 39,00 er der større sandsynlighed for, at de repræsenter kolonisering end infektion, men nogle patienter kan have sygdom med meget lidt tilstedeværende P. jirovecii, repræsenterende en ringe prøve, tidligere behandling eller typen af fungal belastning i den specifikke patient. Dansk 12
Procedurens begrænsninger Den grundlæggende begrænsning af denne procedure relaterer til kvaliteten af den primære prøve: - Hvis prøven er meget lille eller ikke er hentet fra det påvirkede område af lungen, vil testen være mindre følsom og kan være fejlagtigt negativ. - BAL-prøver skal centrifugeres inden DNA-ekstraktion fra tabletten. - Data har også vist, at en reduktion af voluminet af supernatant, der buges i ekstraktionsprocessen, opnået ved centrifugeringen, reducerer andelen af hæmmere, der trænger ind i systemet. Selvom MycXtra Fungal DNA ekstraktionsproceduren er beregnet til at fjerne PCR-hæmmere, er der ikke foretaget evaluering af alle lægemidler eller patientpopulationer. Proceduren er ikke blevet fuldt vurderet med spyt og er heller ikke blevet vurderet med inducerede saltvandsprøver eller på prøver fra børn. Falske positive resultater kan være forårsaget af ekstern kontaminering af den originale prøve eller test. En sådan kontaminering kan forårsages af P. jirovecii-kontamineret luft, ringe eksperimentalteknik med hensyn til positiv kontrol eller ekstern (især via pipette) kontaminering med P. jirovecii DNA. Da et sandt positivt resultat kan opnås fra patienter, som forbigående eller vedvarende er koloniseret af P. jirovecii, kræves der klinisk vurdering ved fortolkning af testresultaterne. LICENSER TopTaq TM Hot Start leveres af QIAGEN. QIAGEN er et registreret varemærke tilhørende Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland. Dette produkt sælges under licens fra Public Health Research Institute, Newark, New Jersey, USA og må kun bruges under PHRI-patentrettigheder til human in vitro-diagnose. SmartCycler er et registreret varemærke tilhørende Cepheid, 904 Caribbean Drive, Sunnyvale, CA, 94089, USA. Lab21,184 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 0GA, United Kingdom. Telephone: +44 (0) 1638 552 882 Facsimile: +44 (0) 1638 552 375 Email: productsupport@lab21.com Dansk 13