7. semester, Bachelor projekt Bioanalytikeruddannelsen København 111 In mærkning af anti-muc1-dtpa - og in vitro kontrol af affinitet til MUC1 antigen i forhold til 111 In-anti-TNP-DTPA Afleveret: Fredag den 08/01-2010 Projekt periode: Uge 44-2009 til uge 01-2010 Hovedvejleder: Inge Buch, Bioanalytikeruddannelsen København Bivejleder: Linda Mona Kragh, Rigshospitalet, Klinik for Klinisk Fysiologi, Nuklearmedicin & PET Afdeling: Klinik for Klinisk Fysiologi, Nuklearmedicin & PET Rigshospitalet Rapport udarbejdet af: Kim Ryder Jensen (200679) Praktisk arbejde i samarbejde med: Håkon S. Romme (110173)
Fra Bekendtgørelse om prøver og eksamen i erhvervsrettede uddannelser BEK nr 782 af 17/08/2009 19. En eksaminand, der under en prøve skaffer sig eller giver en anden eksaminand uretmæssig hjælp til besvarelse af en opgave eller benytter ikke tilladte hjælpemidler, skal af uddannelsesinstitutionen bortvises fra prøven. Stk. 2. Opstår der under eller efter en prøve formodning om, at en eksaminand uretmæssigt har skaffet sig eller ydet hjælp, har udgivet en andens arbejde for sit eget eller anvendt eget tidligere bedømt arbejde uden henvisning, indberettes dette til uddannelsesinstitutionen. Bliver formodningen bekræftet, og handlingen har fået eller ville kunne få betydning for bedømmelsen, bortviser uddannelsesinstitutionen eksaminanden fra prøven. Stk. 3. Udviser en eksaminand forstyrrende adfærd, kan uddannelsesinstitutionen bortvise eksaminanden fra prøven. I mindre alvorlige tilfælde giver uddannelsesinstitutionen først en advarsel. Stk. 4. Uddannelsesinstitutionen kan i de i stk. 1-3 nævnte tilfælde under skærpende omstændigheder beslutte, at eksaminanden skal bortvises fra institutionen i en kortere eller længere periode. I sådanne tilfælde gives en skriftlig advarsel om, at gentagelse kan medføre varig bortvisning. Stk. 5. En bortvisning efter stk.1-3 medfører, at en eventuel karakter for den pågældende prøve bortfalder, og at eksaminanden har brugt en prøveindstilling, jf. 6, stk. 3 og 4. Stk. 6. En eksaminand skal ved aflevering af en skriftlig besvarelse med sin underskrift bekræfte, at opgaven er udfærdiget uden uretmæssig hjælp, jf. stk. 1 og 2. Undertegnede bekræfter hermed, at denne projektrapport er udfærdiget af mig, uden at udgive andres arbejde for mit og uden uretmæssig hjælp jf. ovenstående uddrag af eksamensbekendtgørelsen. Dato: 08/01-2010 Underskrift 2
Forord Projektet er udarbejdet i slutningen af fjerde kvartal 2009 og starten af januar 2010. Det praktiske arbejde er udført i samarbejde med to laboratorier: Afdeling for Klinisk Fysiologi, Nuclearmedicin og PET på Rigshospitalet. Isotop laboratoriet på Panum Instituttet, under supervision af Amarnadh Nalla. I denne forbindelse skal det nævnes, at Amarnadh Nalla har forberedt de DTPA konjugerede antistoffer, som vi har anvendt til radioaktiv mærkning med indium i projektet. Under vores ophold i laboratoriet har Amarnadh Nalla sat kemikalier, utensiler og celler til rådighed. Jeg vil gerne sige tak til personalet på begge afdelinger, for samarbejdet og den hjælp vi har fået i forbindelse med det praktiske arbejde. En særlig tak skal rettes til overlæge Birger Hesse, Rigshospitalet, der har været behjælpelig med råd og vejledning i det praktiske arbejde på Rigshospitalet. Det er på sin rette plads, at rette en tak til vores kliniske vejleder Linda Mona Kragh, Righshospitalet, og vejleder Inge Buch, Bioanalytikeruddannelsen, der har været yderst behjælpelige med faglig, såvel som praktisk, støtte i projektperioden og har været til rådighed næsten 24 timer i døgnet. Ikke mindst en tak til Håkon S. Romme, som det praktiske arbejde i projektet er udført i samarbejde med. Tak. 3
Resumé I forbindelse med mammacancer ses der ofte metastaser i lymfesystemet. Cellerne i metastaserne har opreguleret MUC1 antigen på hele celleoverfladen. Det vil derfor være oplagt, at anvende en specifik metode til diagnosticering af metastaser i de lymfeknuder, der dræner vævet omkring tumoren. Vores mål med projektet er, at udføre en mærkningsprocedure af to antistoffer, anti-muc1 og anti-tnp, for at undersøge følgende forhold: Hvilken radiokemisk renhed kan opnås ved ITLC kromatografi, af radioaktivt mærket anti-muc1-dtpa og anti-tnp-dtpa, med 111 In målt på VCS-101 chromatogram scanner? Hvor stor del af henholdsvis 111 In-anti-MUC1-DTPA og 111 In-anti-TNP- DTPA kan bindes in vitro, til henholdsvis beads eller celler der udtrykker MUC1 antigen, målt i brøndtæller? Det viser sig, at vi kan opnå en radiokemisk renhed på over 90% ved radioaktiv mærkning af anti-muc1-dtpa og anti-tnp-dtpa med 111 In. Resultaterne fra vores forsøg viser, at der bindes op til 100% mere aktivitet til celler med anti-muc1-dtpa- 111 In end anti-tnp-dtpa- 111 In. 4
Forord... 3 Resumé... 4 Indledning... 7 Problembaggrund... 7 Formål... 8 Mål... 8 Begrænsninger... 9 Etiske overvejelser... 9 Problemformulering... 9 Begrebsdefinitioner... 9 Hypoteser... 9 Teori... 10 Indium... 10 DTPA... 10 MUC1... 11 Anti-TNP... 12 ITLC... 12 Oprensning PD-10 Kolonne... 13 Immunpræcipitation... 14 Dosiskalibrator... 15 VSC-101 chromatogram scanner... 16 Cobra II gammatæller... 16 Metodevalg og afgrænsning... 17 Materialer og Metode... 17 Mærkning... 17 Oprensning... 18 Beads... 18 Celle bindings analyse... 19 TCA kontrol til celle bindings analyse... 19 Resultater... 20 5
Mærkning og oprensning... 20 Beads... 22 Cellebindingsanalyse... 23 TCA... 25 Diskussion... 26 Mærkning... 26 Beads metoden... 31 Celle metoden... 34 Konklusion... 42 Perspektivering... 44 Litteraturliste... 45 Bilag 1... 47 Bilag 2... 50 Bilag 3... 53 Bilag 4... 55 6
Indledning Problembaggrund Diagnosen, mammacancer, stilles ofte ved at patienten eller patientens læge opdager en knude i mammavævet ved palpation, mammografi screening eller ultralydsscanning. Ofte tages en nålebiopsi af mammavævet, der sendes til analyse på en patologisk afdeling, som skal afgøre hvorvidt vævet er benignt eller malignt. I forbindelse med malignt væv har det vist sig, at der er overproduktion af forskellige proteiner fra cancer celler. Proteinerne kan komme til udtryk ved at blive indcoopereret i membranen på celleoverfladen. Der er specielt et protein der ofte bliver sat i forbindelse med forskellige typer cancer, MUC1. Såfremt, at der diagnosticeres malignt væv, vil mange patienter gennemgå en undersøgelse, kaldet sentinel node, på en klinisk fysiologisk og nuklearmedicinsk afdeling. Sentinel node kortlægger de lymfeknuder, der dræner vævet omkring tumoren i vævet. Undersøgelsen er vigtig, da der ofte ses metastaser i lymfeknuder, der dræner området med cancer i vævet. Patienten vil blive opereret for at fjerne tumor fra mammavævet. Under operationen vil det radioaktive sporstof fra sentinel node vise kirurgen hvor den første lymfeknude, der direkte drænerer vævet omkring tumor, er placeret. Den første lymfeknude, sentinel node, vil under operationen blive fjernet og undersøgt ved frysemikroskopi. Viser det sig, at der er metastaser i denne knude, vil kirurgen umiddelbart fjerne alle de andre lymfeknuder i regionen (axillen). Hvis der derimod ikke påvises malignitet ved frysemikroskopi, efterlader kirurgen resten af lymfeknuderne. De axillære lymfeknuder kan fjernes senere ved en sekundær operation, hvis man ved efterfølgende histologisk undersøgelse påviser malignitet i præparatet. (10) Da operationen er langvarig, vil patienten være udsat for narkose i lang tid. Patienten vil også have bivirkninger ved fjernelse af lymfekirtlerne, såsom hævelser, ødemer og smerter i armen. 7
Formål Det vil derfor være oplagt, at anvende en specifik metode til diagnosticering af metastaser i de lymfeknuder, der dræner vævet omkring tumoren. Formålet med projektet er at udføre forsøg in vitro, der skal vise om den nævnte metode vil kunne anvendes til diagnosticering af metastaser i lymfeknuder. På sigt vil formålet med in vitro forsøgene være at kunne nedbringe operationstiden og undgå at fjerne de lymfeknuder, der ikke indeholder metastaser. I en længere periode har man forsøgt at udvikle en metode til påvisning af metastaser i lymfeknuder. Forskning peger på, at antigenet MUC1 egner sig til at målrette et radioaktivt lægemiddel imod. (7) Metoden skal understøtte nålebiopsien og skal kunne udføres før patienten opereres, samtidig med at den skal være specifik for tumor celler. Metoden indebærer en fremstilling af et radioaktivt lægemiddel, som skal have en tilfredsstillende specificitet til diagnosticering af metastaser i lymfesystemet. Mål Vores mål med projektet er, at udføre en mærkningsprocedure af to antistoffer, anti-muc1 og anti-tnp, og at undersøge bindingen til MUC1 antigen in vitro. Dette indebærer at de mærkede antistoffer bliver anvendt til forsøg med beads bærende MUC1 antigen, og celler der udtrykker MUC1 antigen. Det vil forsøges at opnå en høj radiokemisk renhed af anti-muc1-dtpa og anti- TNP-DTPA med 111 In. Målet for den radiokemiske renhed sættes til højere end 90%. Det er vigtigt, at opnå en høj radiokemisk renhed, eftersom patienter der undersøges ved nuklearmedicinske metoder, ikke må udsættes for unødig stråling. Såfremt der forefindes frit indium i det færdige produkt, og dette anvendes til undersøgelse af patienter, vil det ikke give de optimale forhold. Strålingshygiejne loven, bekendtgørelse nr. 954 kap 5 85. angiver: Ved alle undersøgelser der ikke direkte kan gavne helbredstilstanden hos den person der undersøges, skal der lægges særlig vægt på at de ud føres med den mindst mulige indgivet aktivitet. For at opnå de bedste forhold, med hensyn til binding til antigen, er vigtigt med 8
en høj radiokemisk renhed således, at sporstoffet i første omgang kan anvendes til injektion i raske kaniner for at undersøge vandringen af anti-muc1- DTPA- 111 In i lymfesystemet. Begrænsninger Projektet omfatter ikke forsøg med mammacancer patienter, men udelukkende laboratorieforsøg. Etiske overvejelser Der er ingen etiske overvejelser i forbindelse med projektet, da det udelukkende er baseret på forsøg i laboratoriet. Problemformulering Hvilken mærkningsprocent kan vi opnå, ved ITLC kromatografi, af radioaktivt mærket anti-muc1-dtpa og anti-tnp-dtpa, med 111 In målt på VCS-101 chromatogram scanner? Hvor stor del af henholdsvis 111In-anti-MUC1-DTPA og 111 In-anti-TNP- DTPA kan bindes in vitro, til henholdsvis beads eller celler der udtrykker MUC1 antigen, målt i brøndtæller? Begrebsdefinitioner Mærkningsprocent: angiver hvor stor en del af den tilsatte aktivitet, der har bundet sig til hhv. anti-muc1-dtpa og anti-tnp-dtpa, i procent. Mærkningsprocenten måles som radiokemisk renhed. Hypoteser H1: Der kan opnås højere end 90% radiokemisk renhed for henholdsvis anti- MUC1-DTPA- 111 In og anti-tnp-dtpa- 111 In. H2: Ved oprensning af henholdsvis anti-muc1-dtpa- 111 In og anti-tnp-dtpa- 111 In er det muligt, at hæve den radiokemiske renhed til over 90%, hvis den direkte radiokemiske renhed er mindre end 90%. H3: Anti-MUC1-DTPA- 111 In bindes i højere grad til beads bærende MUC1 antigen end anti-tnp-dtpa- 111 In gør. 9
H4: Anti-MUC1-DTPA- 111 In bindes i højere grad til celler bærende MUC1 antigen end anti-tnp-dtpa- 111 In gør. Teori Indium Indium er et metal, og for at gøre det radioaktivt beskydes det med protoner. Derved opnås flere isotoper, her i blandt 111 In. Dette radionuklid anvendes i mange laboratorier til mærkning, f. eks. af hvide blodceller og monoklonale antistoffer. (KILDE) 111 In har en halveringstid på 67 timer, eller 2.83 dage, og henfalder ved elektron capture til stabil cadmium. 111 In udsender gamma stråling i to forskellige energiniveauer, henholdsvis 173 KeV og 247 KeV. Reaktionsskemaet kan skrives som: 111 49 In +e 111 48 Cd + γ. På figur 1 ses det fulde henfaldsskema. (3) Figur 1: Henfaldsskema for 111 In: Til venstre i figuren ses atomets energiniveau angivet i KeV. Pile angiver fald mellem energiniveauer. In (indium); Cd (cadmium); y (gamma stråling). DTPA DTPA, den kemiske betegnelse for diethylenetriaminepentaacetate, er en chelator, som er en organisk forbindelse med den evne at kunne binde 10
metalioner. Jo flere arme en chelator kan binde metalionen med, jo større stabilitet er der i det dannede metal kompleks. Det er relevant at benytte en chelator, da anti-muc1 ikke har egenskaben at kunne binde til metalioner. DTPA binder kovalent til makromolekyler som anti-muc1. Dette gør det muligt, at binde forskellige radioaktive nuklider, så som 111 In eller 131 I. Derved dannes et kompleks af antistof, DTPA og 111 In. Dermed kan man anvende DTPA komplekset til undersøgelse af forskellige biologiske funktioner, og disse kan visualiseres ved brug af radiofysiske målemetoder. Figur 2 viser et forslag til hvorledes DTPA danner chelat med en 111 In ion, og er bundet til et makromolekyle. (5) Figur 2: Den røde ring angiver bindingssted for metalioner til DTPA og den sorte kasse til venstre angiver bindingssted for makromolekyle/ protein. Modificeret (5). MUC1 MUC1 genet tilhører familien af gener, der koder for mucin glykoproteiner. De er karakteriseret ved at være højmolekylære. Mucin produceres af epitelceller og udskilles som en del af mucosa. (2) MUC1 er primært lokaliseret i mucus genereret i kirtel epitelceller, cytoplasma og på membranen af de fleste karcinomceller. (12) I mammacancer stimulerer steroidhormoner også MUC1 genets udtrykkelse. 11
MUC1 bliver generelt udtrykt på mammacellers apikale epiteloverflade, men i mamma-adenomcarcinomer, og andre epitelielletumorer, bliver MUC1 opreguleret over det normale niveau på hele celle overfladen. MUC1 findes i en stor del af epitelet i brystets kirtelvæv og er særdeles immunoreaktivt, hvilket gør MUC1 proteinet til en værdifuld markør for mammacancer og prognose af mammacancer. (6,7) Anti-MUC1 er et monoklonalt murin IgG2b antistof, som har den egenskab at kunne genkende mucin glykoproteinet MUC1. Anti-MUC1 reagerer kraftigt med de fleste karcinomer, og egner sig til forskellige analyser, her i blandt immunpræcipitation. (12) Anti-TNP I projektet anvender vi antistoffet, anti-tnp eller anti-trinitrophenyl, hvilket er et monoklonalt murin IgG1 antistof. Finsen laboratoriet 1 har produceret det anti- TNP, som vi anvender i vores projekt. I projektet anvender vi anti-tnp, som kontrol for specificiteten af anti-muc1. Da antistoffet ikke er produceret ud fra MUC1 antigen, har anti-tnp derfor ingen eller ringe affinitet til MUC1 antigen. Af denne grund egner anti-tnp sig som kontrol antistof i vores projekt. ITLC Ved at benytte ITLC, Instant Thin Layer Chromatografi, kan man bestemme en kemisk forbindelses renhed. I vores tilfælde bestemmes den radiokemiske renhed. Metoden egner sig til monitorering af kemiske eller biologiske processer, da metoden er hurtig at udføre. Metoden udnytter, at molekylerne har forskellige affinitet til hhv. den mobile fase og papiret. Derved kan molekyler separeres. I projektet anvender vi metoden til at monitorere radioaktivt mærkede antistofkomplekser (anti-muc1-dtpa- 111 In og anti-tnp-dtpa- 111 In). 1 Finsen Laboratoriet er en cancer forskningsenhed underlagt Rigshospitalet, København. 12
En mængde radioaktivt antistofkompleks påsættes ITLC papiret. Den mobile fase i ITLC tanken suges op i papiret, der er glasfiber coated med silica gel. Samtidigt med, at den mobile fase suges op i papiret, vil komponenterne fra den påsatte opløsning vandre opad. De molekyler der har den største affinitet til papiret vil vandre langsommere op, end molekyler med høj affinitet til den mobile fase. (14) Dermed får man en separation af radioaktivt antistofkompleks og frit 111 In i papiret. Forskellen i den frie og bundne aktivitet af 111 In kan bestemmes, ved anvendelse af skintillationsdetektor VCS-101 chromatogramscanner 2, som radiokemisk renhed / mærkningsprocent. Oprensning PD-10 Kolonne Målet med anvendelsen af denne kolonne er, at oprense det mærkede produkt, anti-muc1-dtpa- 111 In eller anti-tnp-dtpa- 111 In, for urenheder som f.eks. ubundet indium. Dette er vigtigt, da det ønskes at udføre cellebinding og beads forsøg alene med det rene produkt. Kolonnen benyttes også til skift af buffer, hvilket får en betydning når cellerne skal udsættes for produktet (mærkningen af antistofferne udføres med citratbuffer. Citraten kan få cellerne til at lysere). Princippet er gelfiltration og er en chromatografimetode, hvori størrelsen af molekylerne i en opløsning udgør grundlaget for separationen. Kolonnen indeholder et Sephadex G25 medium, der gør at små molekyler separeres effektivt fra molekyler med høj Figur 3 Viser princippet i PD-10 kolonne. Små molekyler har større affinitet til kolonnen, så disse vil blive tilbageholdt af huller i Sepadex gelen. Store molekyler elueres derved først. molekylevægt i en opløsning. Molekyler, der er større end hulerne i Sephadex mediets matrix, bliver elueret først, da de ikke tilbageholdes i gelen. Når en 2 Apparaturet beskrives senere. 13
reaktionsblanding elueres i PD-10 kolonnen, indeholdende radioaktivt antistof kompleks og frit 111 In, betyder det at 111 In vil blive tilbageholdt i kolonnen. Dermed vil det radioaktive antistof kompleks forlade kolonnen først. Figur 3 viser princippet i PD-10 kolonnen. (13) Immunpræcipitation Når et antigen kommer i kontakt med et antistof i en reaktionsblanding, vil disse reagere og danne binding med hinanden. Resultatet af reaktionen er kompleks dannelse. Komplekserne vil udfælde, som et præcipitat, i en vandig opløsning. For at danne antistof-antigen komplekser med vores radioaktivt mærkede antistof anti-muc1-dtpa- 111 In, anvender vi i projektet, beads og celler bærende MUC1 antigen på overfladen. Antistoffer kan overordnet inddeles i polyklonale, rettet mod flere forskellige bindingssteder på samme antigen, og monoklonale, rettet mod et enkelt bindingssted på et antigen. Eftersom anti- MUC1-DTPA- 111 In er et monoklonalt antistof, vil vi forvente, at der ikke dannes store komplekser. Hvis der er en større mængde antistof end antigen i en opløsning, så vil der være ubundet antistof i supernatanten. (4) For at undersøge om der findes ubundet antistof i supernatanten, kan man anvende TCA præcipitation. TCA, eller trichloracetic acid, er en tung syre på grund af sine tre chlorid grupper. Syren vil reagere med aminosyrerne i et protein eller antistof ved kovalent binding til H 2 N-R grupperne under fraspaltning af H 2 O. Når syren har bundet sig til antistofferne, kan man ved centrifugering separere antistofferne fra den væske de er i. Derved dannes der et overblik over supernatantens indhold efter inkubation med antigen. Hvis der tilsættes en relativ lille mængde antistof, kan man, ved at tilsætte human serum albumin (HSA) til supernatanten, danne en større pellet efter centrifugering. Metoden kan også vise hvor meget radioaktivt antistof, der kan forventes at udfælde før det reagerer med sit antigen. Dermed kan man også anvende TCA præcipitation til kontrol for cellebinding. 14
Dosiskalibrator Apparaturet anvendes til at bestemme den aktivitet, som en radioaktiv kilde har. Det kunne f.eks. være aktiviteten af 111 InCl 3, før der tilsættes anti-muc1-dtpa og anti-tnp-dtpa. Dosiskalibratoren kan måle hvor mange kerneomdannelser der sker pr. sekund målt i bequarel, Bq (1 Bq = 1 henfald pr. sek.). Dosiskalibratoren kan indstilles til, at måle forskellige radioaktive isotoper, såsom molybdæn, technetium, iod, indium mfl. Dosiskalibratoren (Figur 4 3 ) kan også udregne en bestemt dosis til en bestemt tid ud fra henfalds-loven, angivet i Bq. Den radioaktive kilde nedsænkes i brønden, og der registreres radioaktivitet ved vekselvirkning mellem den udsendte stråling og gassen i røret. Den elektriske ladning vil ændres og kan registreres som en hændelse. Jo flere hændelser, jo højere aktivitet. Figur 4: Opbygning af dosiskalibrator. Der kan tilkobles printer til udskrift af målinger på etiketter. 3 Kilde modificeret fra: http://upload.wikimedia.org/wikipedia.commons/thumb/a/a5/dose_calibrator/sc hematic-de.svg/400px-dose_calibrator/schematic/de.svg.png og http://www.klimonitors.com/nukmed/dateien/crc15w.gif 15
VSC-101 chromatogram scanner Apparaturet er en scintilations detektor. Princippet i denne type detektor er, at gamma stråling vekselvirker med en krystal, så der dannes lys fotoner. Fotonerne omdannes til elektroner i en fotokatode. Elektronerne forstærkes i fotomultiplikatoren, der giver et elektrisk signal til en computer/tælleenhed, der registrerer antallet af lys fotoner fra krystallen. En slæde fører prøven forbi detektoren. Figur 5: Skematisk opbygning af VCS-101 Chromatogram scanner. Bly kappen har en sprække, der tillader gammastrålingen at passere (3). Figur 5 viser opbygningen af VCS-101 Chromatogram scanneren. Cobra II gammatæller Apparaturet er en brøndtæller. Det er opbygget af en krystal (NaI). Krystallen er hul, således at der er plads til, at sætte et reagensglas ind i den. Når krystallen omgiver hele kilden, betyder det at detektoren bliver mere sensitiv. Tæt på krystallen sidder fotokatoden og fotomultiplikatoren, der forstærker lysglimtet fra krystallen og videregiver elektriske impulser til en tælleenhed (3) efter samme princip, som beskrevet oven for. Figur 6 viser opbygningen af gammatælleren. Figur 6: Skematisk opbygning af Cobra II brøndtæller. 16
Metodevalg og afgrænsning Projektet tager udgangspunkt i en eksisterende metode til radioaktiv mærkning af protein konjugeret til DTPA med indium - ligeledes for binding af antistof til beads og celler. Vi har valgt at udføre 12 mærkninger af hhv. anti-muc1-dtpa og anti-tnp- DTPA, 5 forsøg med beads og cellebindings forsøg. Overnævnte giver ikke et tilstrækkeligt datagrundlag for at behandle resultaterne med statistiske beregninger, hvorfor dette er fravalgt. Under forsøgenes udførsel fandt vi det relevant at udføre yderligere 2 mærkninger af anti-muc1-dtpa, se diskussion. Det skal nævnes, at vi vælger at udføre mærknings proceduren, på trods af, at udløbsdatoen for anti-muc1 er overskredet. Det skyldes, at antistoffet er anvendt og fundet brugbart efter udløbsdatoen (11) og det er det eneste anti- MUC1 vi har adgang til. Det har ikke været muligt at udføre flere forsøg, da der ikke har været ressourcer, antallet af rør med beads og plader med celler, til rådighed. Materialer og Metode Materialeliste: Se Bilag 1. Mærkning 1. 100 µl 0,5 M citratbuffer med saltvand ph 5,5 blandes med ca. 10 MBq 111 InCl 3 (ca. 10 µl) i eppendorf rør, lad stå i 5 min. (Mix A) 2. Der overføres 50 µl Mix A til et nyt eppendorf rør. (Mix B) 3. Afpipetter 17 µl anti-muc1-dtpa til Mix A, bland med pipetten. 4. Afpipetter 13 µl anti-tnp-dtpa til Mix B, bland med pipetten. 5. Inkubation ved stuetemperatur i 30 minutter. 6. 2 tørre ITLC- strimler påsættes nu 1 dråbe 5uL, af henholdsvis Mix A og MIx B. 7. Strimlerne udvikles i ITLC kar. 8. ITLC- strimlerne scannes på VCS-101 Chromatogram scanner. 17
Oprensning 1. PD-10 kolonne elueres med DPBS buffer med 0,1% BSA (25 ml). 2. 111 In-anti-MUC1-DTPA eller 111 In-anti-MUC1-DTPA, påføres PD-10 Kolonnen. 3. Eluer PD-10 kolonnen med 500 µl DPBS buffer, der opsamles i et eppendorf rør. 4. Gentag punkt 3 til der haves 12-15 fraktioner på hver 500 µl. 5. Bestem aktiviteten af fraktionerne i dosiskalibrator og PD-10 kolonnen. Den første højeste aktivitet, testes på ITLC for renhed. Beads 1. Afpipetter 200 µl af den højeste 500 µl fraktion, fra oprensningen, over i 1 ml eppendorf rør og tilsæt 800 µl DPBS buffer (rør 1). 2. Udtag 500 µl fra rør 1, til et nyt 1 ml eppendorf rør (rør 2). 3. Et rør med beads og DPBS buffer centrifugeres. 4. Overfør 500 µl fra rør 2, til beads (rør 3). Bland på bordmixerer og inkuber i 1 time ved stuetemperatur under konstant bevægelse. 5. Centrifuger beads og opsaml supernatanten (rør 4). 6. Vask beads med 3 x 500 µl DPBS buffer (rør 5). 7. Tæl aktiviteten af rør 1, 3, 4 og 5. Punkt 1: Punkt 7: Hvis oprensning ikke udføres, tilsættes det mærkede produkt, DPBS buffer ad 1000 µl. Aktiviteten af (rør 1), er kontrol. Aktiviteten af (rør 3 + rør 4), giver ubundet supernatant. Aktiviteten af beads, er den bundne aktivitet. 18
Celle bindings analyse 1. Plader med 12 brønde, præpareret med celler bærende MUC1 antigen og vækstmedie, udtages fra varmeskab. 2. Vækstmediet fjernes med pipette, og der tilsættes i stedet DPBS buffer. 3. Herefter tilsættes den ønskede mængde- antistof /- aktivitet til hver brønd. 4. Pladen inkuberes i varmeskab ved 37C i 30 minutter. 5. Nu afpipetteres supernatanten, og cellerne skylles ud vha. EDTA, der løsner cellerne fra brønden. 6. Opløsningen centrifugeres v 14.000 o/min i 5 minutter. 7. Afpipetter supernatanten. 8. Mål Pellet og supernatant. Kontrol til cellebindings analyse: Billedeoptagelse af cellepladerne med gammakamera, skal vise om cellerne med bundet aktivitet, er vasket ud. TCA kontrol til celle bindings analyse 1. Der tilsættes TCA til supernatanten eller til det mærkede produkt. 2. Der tilsættes 1 ml HSA 0,1%. 3. Inkubation i 15 min v. 4 C. 4. Centrifugering i 5 min v. 14.000 o/min 5. Supernatant og pellet tælles i gamma tæller. 6. Det antal CPM der er i pellet, svarer til den mængde ubundet radioaktivt mærket antistof der er i supernatanten. Eller det maksimale antal CPM der kan bindes til cellerne. 19
Resultater Mærkning og oprensning Oversigtsskema: Dag: 1 2 3 3 4 5 6 7 7 7 7 8 9 13 14 Mærkning nr.: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 14 Antistof:MUC1 (M) TNP (T) M T M T M T M T M T M T 0,5 M Citrat Buffer µl Frossen; ph 5,5 100 100 200 100 100 Frisk; ph 5,5 250 Frisk; ph 5,5 150 150 100 50 100 Frisk; ph 5,5 200 Frisk; ph 6,0 400 100 111-In i MBq: 11 11 22,8 9,2 9 9,9 11 8,3 9,8 22 MUC1 5,9 5,8 9,5 2,3 5,2 5,2 10 4,5 4,9 5,6 4,2 6,1 12 52 TNP 5,2 4,8 8,2 2,4 3,7 3,8 4 5,6 4,2 3,7 9,5 5,3 Volumen antistof: MUC1 (ul) 17 20 17 17 17 17 20 17 17 17 17 17 35 170 TNP (ul) 13 20 13 13 13 13 15 13 13 13 27 13 Inkubering: 30 minutter (30) 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 75 minutter (75) 75 75 75 75 75 75 75 Mærkningsprocent MUC1 30 min (%) 89 92 75 76 26 65 91 78 87 92 89 61 91 96 MUC1 75 min (%) 93 92 83 55 90 87 95 TNP 30 min (%) 93 94 94 93 77 85 52 66 87 65 91 55 TNP 75 min (%) 93 93 88 74 75 75 Oprensning MUC1 (%) 18 63 45 89 84 TNP (%) 38 42 83 75 ITLC, mobil fase: Sterilt vand (SV) SV SV SV SV SV SV 0,05 M Citratbuffer (CB) CB CB CB CB CB CB CB CB CB Mærknings procenterne, som er angivet i skemaet, er afrundet til nærmeste hele tal. Diagrammer over mærkningsprocent: se næste side. M M T M M T M T M T M T M T 20
Diagram for mærkning og oprensning af anti-muc1-dtpa- 111 In MUC1 Mærkninger 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Mærkning MUC1 30 MUC1 75 (e oprens) MUC1 30: MUC1 75: e oprens: 30 minutters inkubation 75 minutters inkubation Efter oprensning Diagram for mærkning og oprensning af anti-tnp-dtpa- 111 In TNP Mærkninger 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Mærkning TNP 30 TNP 75 (e oprens) TNP 30: TNP 75: e oprens: 30 minutters inkubation 75 minutters inkubation Efter oprensning (Eksempel på resultat af chromatogramscanning kan ses i billag 3). 21
Beads Mærket antistof: Udført på mærkning: Supernatant Ubundet antistof Beads Bundet antistof Ubundet + bundet antistof Kontrol MUC1 5 0,795 MBq 0,046 MBq 0,841 MBq 1.316 MBq TNP 5 0,585 MBq 0,046 MBq 0,631 MBq 1,085 MBq MUC1 8 1,190 MBq 0,055 MBq 1,245 MBq 1,509 MBq TNP 8 1,064 MBq 0,131 MBq 1,195 MBq 1,520 MBq MUC1 9 1,377 MBq 0,129 MBq 1,506 MBq 1,669 MBq TNP Ikke udført MUC1 12 1,380 MBq 0,054 MBq 1,424 MBq 1,722 MBq TNP 12 0,851 MBq 0,059 MBq 0,910 MBq 1,069 MBq 22
Cellebindingsanalyse Dag 9, Celle 1 Dag 9, Celle 1 CPM 300.000 250.000 200.000 150.000 100.000 50.000 0 0 5 10 15 20 25 30 35 ul antistof tilsat 2mL MUC1celler TNPceller Mængden af mærket antistof er tilsat direkte fra mærkning nummer 13. De enkelte punkter på kurven er henfaldskorrigeret til den 3/11-2009 kl. 12.00. Dag 10, Celle 2 og 3 Dag 10, Celle 2 200.000 150.000 CPM 100.000 50.000 0 0 5 10 15 20 25 ul antistoff tilsat 2 ml amuc1celler bmuc1celler atnpceller btnpceller Mængden af radioaktivt antistof er tilsat fra en fortynding af den oprindelige mærkning 13 (50uL + 950uL PBS buffer.). Der er udført dobbeltbestemmelse således, at 1. bestemmelse er amuc1celler og atnpceller, 2. bestemmelse er bmuc1celler og btnpceller. De enkelte punkter på kurven er henfaldskorrigeret til den 3/11-2009 kl. 12.00. Resultater fra Dag 10, Celle 3, er ikke medtaget. 23
Dag 12, Celle 4 Dag 12, Celle 4 CPM 600.000 500.000 400.000 300.000 200.000 100.000 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 ul antistof ad 2 ml MUC 1celler TNPceller Aktiviteten af mærket antistof er justeret til samme aktivitet for henholdsvis Anti- MUC1-DTP- 111 In og anti-tnp-dtpa- 111 In. Mængden af radioaktivt antistof er tilsat fra en fortynding af den oprindelige mærkning 13 (50uL + 950uL PBS buffer.), og herefter ad 1000uL PBS buffer. De enkelte punkter på kurven er henfaldskorrigeret til den 3/11-2009 kl. 12.00. Dag 14, Celle 5 Dag 14, Celle 5 CPM 3.000 2.500 2.000 1.500 1.000 500 0 0 5 10 15 20 25 ul antistoff tilsat ad 2 ml amuc1celler bmuc1celler atnpceller btnpceller Aktiviteten af mærket antistof er justeret til samme aktivitet for henholdsvis Anti- MUC1-DTP- 111 In og anti-tnp-dtpa- 111 In og stammer fra mærkning 14. Mængden af radioaktivt antistof er tilsat fra en fortynding (50uL + 950uL PBS buffer) af denne justering. Der er udført dobbeltbestemmelse således at 1. bestemmelse er amuc1celler og atnpceller, 2. bestemmelse er bmuc1celler og btnpceller. De enkelte punkter på kurven er henfaldskorrigeret til den 3/12-2009 kl. 16.57. 24
TCA Dag 12, TCA analyse TCA Kontrol Dag 12, Celle 4 CPM 600.000 500.000 400.000 300.000 200.000 100.000 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 Aktivitet i 2 ml supernatant TNPpp MUCpp Resultaterne afspejler analysering af supernatanten fra Dag 12, Celle 4. Henholdsvis MUC pp og TNP pp beskriver at, det er den målte aktivitet i protein pellet vist i diagrammet. De enkelte punkter på kurven er henfaldskorrigeret til den 3/11-2009 kl. 12.00. Dag 14, TCA Kontrol Dag 14, TCA Kontrol 200.000 150.000 CPM 100.000 50.000 0 0 5 10 15 20 25 ul antistof tilsat ad 2 ml MUC1pellet TNPpellet Prøvematerialet til kontrollen er den samme, som er tilsat cellerne for Dag 14, Celle 5. Derved er aktiviteten af mærket antistof også her justeret til samme aktivitet for henholdsvis Anti-MUC1-DTP- 111 In og anti-tnp-dtpa- 111 In., og stammer ligeledes fra mærkning 14. Mængden af radioaktivt antistof er tilsat fra en fortynding (50uL + 950uL PBS buffer) af denne justering. De enkelte punkter på kurven er henfaldskorrigeret til den 3/12-2009 kl. 16.57. 25
Diskussion Mærkning For at lette arbejdet i laboratoriet forberedte vi ca. 20 portioner á 2 ml frisk 0,5 M citratbuffer. Portionerne blev opbevaret ved 20ºC. I de seks første mærkninger er denne citratbuffer anvendt. Til de øvrige mærkninger blev der fremstillet frisk 0,5 M citratbuffer. Anti-MUC1-DTPA, inkubation 30 minutter De to første mærkninger gav en radiokemisk renhed tæt på 90%, hvorved resultatet opfylder målbeskrivelsen. I den tredje og fjerde mærkning blev den radiokemiske renhed bestemt til 75%. Det kunne skyldes, at når indium henfalder skal man anvende et større volumen af 111 InCl 3 for at opnå den samme aktivitet. Derved øges koncentrationen af Cl - I opløsningen med ph ændring til følge. Hvis ph ændres, kan chelatoren eller 111 -In bryde sin binding. Da vil man bestemme en lav radiokemisk renhed. I den femte mærkning bestemte vi den radiokemiske renhed til 26% og den sjette til 65%. Dette er en stor forskel som gør, at vi igen overvejer førnævnte eller, om citratbufferen ikke kan anvendes fra frost. Det overvejes også om den mobile fase i ITLC tanken kan have haft indflydelse på affiniteten til papiret. Indtil nu har vi anvendt sterilt vand, som mobil fase. Det skal dertil nævnes, at vi har opnået en radiokemisk renhed på over 90% ved brug af sterilt vand, som mobil fase. Derved kan det tænkes, at de radioaktivt mærkede antistoffers affinitet ændres ved brug af forskellige mobile faser. I vores projektet har vi ikke undersøgt nærmere hvilke mobile faser, der egner sig bedst til formålet. Vi har i projektet valgt, at skifte fra sterilt vand til den citratbuffer der anvendes til den radioaktive mærkning af antistofferne. Da citratbufferen tilsættes i et bestemt forhold til mængden af 111 InCl 3, vil det være oplagt at lave en fortynding af citratbufferen. For ikke at interferere med 26
dette forhold, valgte vi at anvende 0,05 M citratbuffer som mobil fase. Efter skiftet af den mobile fase ser vi ikke radiokemiske renheder under 60%. Vi valgte også at udskifte den frosne citratbuffer med frisk fremstillet 0,5 M citratbuffer. På grund af disse ændringer, valgte vi kun at udføre den syvende mærkning med anti-muc1-dtpa. Den radiokemiske renhed blev bestemt til 90% med de nye parametre, og vi valgte derfor at anvende frisk 0,5 M citratbuffer og 0,05 M citratbuffer til de efterfølgende mærkninger og de radiokemiske renheds bestemmelser. Forholdet mellem citratbuffer og 111 InCl 3 er ca. 10 MBq til 100uL 0,5 M citratbuffer. Eftersom den radiokemiske renhed svinger fra 90% ned til 26%, tænker vi at mængden af tilsat citratbuffer også har en indflydelse. Derfor valgte vi, at udføre mærkning 8, 9, 10 og 11 med forskellig mængde citratbuffer. Mærkning 8 og 9 er tilsat 150uL citratbuffer (til mærkning 9 er fremstillet en dagsfrisk citratbuffer), mærkning 10 er tilsat 100uL citratbuffer og mærkning 11 er tilsat 50uL citratbuffer. Det viser sig, at den radiokemiske renhed for mærkning 8 bliver 78%. Mærkning 9 bliver 86%, mærkning 10 bliver 91% og mærkning 11 bliver 89%. Det tyder på, at den radiokemiske renhed ændres med voluminet af citratbufferen. Der bestemmes en lavere radiokemisk renhed ved tilsætning af mere citrat buffer. Det er svært at konkludere noget på baggrund af disse resultater, men det giver stadigt en ide om, at tilsætning af 100uL citratbuffer til 10 MBq 111 InCl 3, er at foretrække med hensyn til mærkning af anti-muc1-dtpa. Et studie af Schuhmacher et al. (8) beskriver anvendelsen af citratbuffer i en mindre koncentration (0,1 M citratbuffer) end vi har anvendt (0,5M citratbuffer) til radioaktiv mærkning af antistof. I studiet bestemmes den radiokemiske renhed til at være mellem 55% og 95%. Der er overensstemmelse mellem dette studie og vores resultater, da vi finder resultaterne af vore mærkninger indenfor det samme interval, selvom vi ændrer på mængden, og dermed forholdet af tilsat citrat buffer. Da begge intervaller for radioaktiv mærkning af antistoffer 27
netop er i overensstemmelse med resultaterne fra Schuhmacher et al. (8), kan det ikke påvises, at have en effekt på den radiokemiske renhed, når vi ændrer på koncentrationen fra 0,5 M til 0,1 M citratbuffer. Vi fortsatte til den tolvte mærkning af anti-muc1-dtpa. Her benyttede vi igen 100uL citratbuffer til ca. 10 MBq 111 InCl 3, hvilket giver en radiokemisk renhed på 60%. I mærkning 13 er der anvendt 20 MBq 111 InCl 3 og 200 ul citratbuffer, og i mærkning 14 er der anvendt 50 MBq 111 InCl 3 og 500 ul citratbuffer for at holde forholdet. Det giver os en radiokemisk renhed på henholdsvis 90% og 95%. 95% er den højeste radiokemiske renhed, der er opnået ved inkuberingstiden 30 minutter. Mærkning af anti-muc1-dtpa inkubation 75 minutter Lige fra de første forsøg har vi tænkt, at inkuberingstiden vil have en indflydelse på den radioaktive mærkning af antistoffer, i retning af en højere radiokemisk renhed. Ved mærkning 1 og 2 blev det besluttet, at inkubere ITLC af to forskellige varigheder, en på 30 minutter og en udvidet på 75 minutter. Ved mærkning 1 stiger den radiokemiske renhed med ca. 3% til 92%, og ved mærkning 2 sker der ingen forbedring, da den forbliver stabil. Dette får os til at revurdere påstanden om, at en forlænget inkuberingstid vil fremme den radiokemiske renhed. Som tidligere beskrevet, opnår vi en ringe radiokemisk renhed på 26% i den femte mærkning. Af denne grund valgte vi, at fortsætte med at udføre ITLC efter 30 og 75 minutter, såfremt at den radiokemiske renhed bestemmes til under 90% efter 30 minutters inkubation. Resultatet blev i høj grad påvirket, idet den radiokemiske renhed blev forbedret til 82%. I de to følgende mærkninger, 7 og 8, bestemmes den radiokemiske renhed til henholdsvis 90% og 77%. Dette giver også en ændring ved den forlængede inkubering. Mærkning 7 forbliver 90%, hvorimod mærkning 8 stiger til 87%. Da de efterfølgende mærkninger ligger tæt på 90%, blev det fravalgt at udføre ITLC efter 75 minutter. 28
Det viser sig, at den radiokemiske renhed ikke forbedres mere end ca. 3%, når den radiokemiske renhed er tæt på 90% efter 30 minutters inkubation. Resultaterne, som fremkommer ved en inkuberingstid på 75 minutter, peger dermed i retning af, at når den radiokemiske renhed bestemmes til 90%, eller under, efter 30 minutters inkubation, vil den radiokemiske renhed stige. Der bindes altså mere 111 In til anti-muc1-dtpa ved en inkubationstid på 75 minutter. Dette kan også skyldes, at reagenserne ikke er blandet godt nok. I følge forskriften skal antistofferne optøs ved stuetemperatur, herefter skal det blandes på en bord mikser og efterfølgende med pipette. Hvis dette ikke er udført på en ordentlig måde, kan det tænkes, at antistofferne klumper sammen og ikke vil binde nær så meget 111 -In. Schuhmacher et al. (8) udfører ligeledes radioaktiv mærkning af murin antistof med 111 -In og DTPA som chelator. 111 -In blev inkuberet med antistoffet bundet til DTPA i 60 minutter ved stuetemperatur. Antistof-DTPA komplekset var i en opløsning med 0,1 M citrat buffer ph 6. Ubundet 111 -In blev bundet ved tilsætning af 0,01 M EDTA. Herefter blev den radiokemiske renhed bestemt ved brug af papirchromatografi. I vores forsøg valgte vi, at måle radiokemisk renhed ved to forskellige inkuberingstider, 30 minutter og 75 minutter. Da artiklen anvender en anden inkubationslængde end vi gør, vil det være interessant at sammenligne resultaterne, for at se om inkubationstiden har indflydelse på den radiokemiske renhed. Resultaterne fra studiet af Schuhmacher et al. (8) angiver, at i alle de 26 mærkninger, som er udført i studiet, var den radiokemiske renhed bestemt til mellem 55% og 95%. Til sammenligning ligger vores resultater for anti-muc1- DTPA- 111 In ved en inkubationstid på 30 minutter mellem 26% og 95%, og ved en inkubationstid på 75 minutter mellem 55% og 95%. Der kan ikke påvises den store forskel i radiokemisk renhed mellem artiklens resultater og vores resultater for inkuberingstiden på 75 minutter. Det ser derfor ikke umiddelbart ud som om, at den forlængede inkubationstid på 15 minutter har nogen betydning for den målte radiokemiske renhed. Der ses en forskel mellem vores 29
resultater for inkubationstiden 30 minutter, og resultaterne af Schuhmacher et al. (8) for 60 minutters inkubation. Heri ligger en forbedring på 29%, fra vores forsøg til Schuhmacher et al., af den nederste grænse i intervallet ved 60 minutters inkubation. Det skal dog nævnes, at det kun er den femte mærkning i vores forsøg, der giver en radiokemisk renhed mindre end 60%. Da det kun er en ud af fjorten mærkninger, der er så lav, må der være tilknyttet en eller flere fejlkilder til forsøget, som for eksempel problemer med afpippetering eller blanding af reagenser. Til forskel fra både vores resultater, og studiet af Schuhmacher et al. (8), benyttes der en citratbuffer af endnu lavere koncentration. Der er derved ingen forskel på, om man benytter 0,1 M citratbuffer (8) eller 0,5 M citratbuffer. Anti-TNP-DTPA inkubation 30 minutter og 75 minutter Vi ønsker at anvende anti-tnp-dtpa som kontrol, da anti-tnp ikke er specifik for MUC1 antigen. Anti-TNP har dog samme molekylevægt som anti-muc1. Mærkningen af anti-tnp-dtpa med 111 In, blev udført samtidigt med mærkningen af anti-muc1-dtpa. Dog er der to undtagelser. Der er ikke udført anti-tnp-dtpa mærkning på mærkning 7, på baggrund af de forudgående mærkninger af anti-muc1-dtpa. Vi valgte derfor, kun at udføre mærkning på anti-muc1-dtpa. Formålet med mærkning 9 var, at teste anti-muc1-dtpa- 111 In over for en anden type beads end de tidligere anvendte (Se afsnit Beads senere i diskussionen). De første fire mærkninger af anti-tnp-dtpa, for inkubationstiden på 30 minutter, ligger stabilt og adskiller sig fra de resterende mærkninger af anti- MUC1-DTPA, der alle er lavere. Sammenlignes inkubationstiderne 30 minutter og 75 minutter, for anti-tnp- DTPA- 111 In, ses en ændring i positiv retning. Det er kun den sjette mærkning der skiller sig ud, her falder renheden fra 85% til 74%. 30
Oprensning af anti-muc1-dtpa-111in og anti-tnp-dtpa-111in Vi har udført oprensning af de respektive radioaktivt mærkede antistoffer ved brug af PD-10 kolonne. For anti-muc1-dtpa- 111 In er dette udført 5 gange og for anti-tnp-dtpa- 111 In 4 gange. Resultaterne er entydige, idet den radiokemiske renhed bestemt efter oprensning bliver lavere end før oprensning. Den første oprensning er udført på mærkning to. Her falder den radiokemiske renhed fra 92% til 18%, hvilket er et stort spring. PD-10 kolonnen må ikke tørre ud under eluering (13), hvilket er sket. Det kan forklare det store fald i den radiokemiske renhed. Målet med oprensningen var, foruden skift af buffer, at hæve den radiokemiske renhed til over 90% for mærkninger med en radiokemisk renhed på under 90%. Dette er ikke lykkedes. mærkning 13 er det resultat, der er tættest på 90% efter oprensning, hele 89%, med hensyn til anti-muc1-dtpa- 111 In. Dertil skal siges, at den radiokemiske renhed blev bestemt til 91% før oprensning. Beads metoden Ved at benytte små kugler coatede med MUC1 antigen kan man, in vitro, bestemme, hvor meget antistof der kan bindes hertil. I projektet har vi udført fire forsøg med beads. Det skyldes, at vi har haft et lavt antal af rør med beads til rådighed, og at resultaterne tyder på, at beads ene ikke kan anvendes. Resultaterne er fremkommet på baggrund af aktiviteten og ikke mængden af tilsat antistof, som blev målt i dosiskalibrator. Metoden er derfor ikke kvantitativ, men giver en ide om anti-muc1-dtpa- 111 In kan bindes til antigenet på beads ene. Ved at sammenholde aktiviteterne målt i dosiskalibratoren, fra henholdsvis anti- MUC1-DTPA- 111 In og anti-tnp-dtpa- 111 In, vil man se hvorvidt MUC1 er specifik for antigenet på beads ene. Det forventes at anti-tnp-dtpa 111 -In vil binde mindre aktivitet end anti-muc1-dtpa- 111 In. Forsøgene er udført ved anvendelse af anti-muc1-dtpa- 111 In og anti-tnp- DTPA- 111 In fra de respektive mærkninger: 5, 8, 9 og 12. 31
Det viser sig, imod forventning, at der ikke er bundet betydeligt mere anti- MUC1-DTPA- 111 In end anti-tnp-dtpa- 111 In til disse beads. Resultaterne viser, at af den samlede aktivitet, for både anti-muc1-dtpa- 111 In og anti-tnp-dtpa- 111 In, kun bindes med mellem 5% og 10% af den samlede målte aktivitet til beads ene. Resultaterne fra det andet forsøg, udført på mærkning 8, skiller sig ud fra de tre andre. Det viser sig, at der bliver bundet 50% mere anti-tnp-dtpa- 111 In end anti-muc1-dtpa- 111 In, hvilket svarer til 10% af den samlede aktivitet. Resultatet af de øvrige forsøg viser, at der bindes den samme aktivitet til beads ene. Type af beads På baggrund af den lave mængde aktivitet af anti-muc1-dtpa- 111 In bundet til beads udført på mærkning 5 og 8 valgte vi, til det tredje forsøg, at anvende beads af nyere dato end de to første. Da vi kun fik udleveret et rør med disse beads, var det ikke muligt, at udføre kontrolbinding til beads med anti-tnp-dtpa- 111 In. Det konstateres, at der er mere aktivitet der bindes til disse beads end tidligere, 8,5% imod 5,5%, af den målte aktivitet bundet til beads ene. Inkubation Beads ene blev inkuberet en time ved stuetemperatur. I projektet har vi ikke forsøgt at ændre på inkubationstiden for disse beads. Derfor kan det anbefales at udføre forsøg, hvor inkubationstiden ændres. Under inkubationen er det vigtigt, at beads ene er under konstant bevægelse, da de er meget koncentrerede i røret. Således bliver antistoffet fordelt i røret med beads. Det er muligt, at bevægelsen ikke har været kraftig nok, og dermed fører til en ringe fordeling af antistof til alle beads ene i røret. Resultatet bliver en ringe binding til beads ene. Den omvendte situation kunne også tænkes, idet bevægelsen også kan have været så kraftig, at antistofferne er blevet rystet fra antigenet, for dermed også at give en ringe binding til beads ene. 32
Positionen af beads under inkubationen I et enkelt forsøg har rørene med beads været i lodret position. Det blev observeret at et volumen fra beads ene, tilsat anti-muc1-dtpa- 111 In og anti- TNP-DTPA- 111 In, er dryppet fra røret med beads ned i ependorffrøret til opsamling af supernatanten. Derved har den tilsatte volumen radioaktivt mærket antistof haft mulighed for at løbe igennem røret med beads, før end der er dannet binding til antigenerne på beads ene. Resultatet af dette kan medføre en lavere aktivitet bundet til beads ene. Kontrol Vi har medtaget en kontrol, da vi ønsker at skabe et overblik over i hvilken grad antistofferne binder sig til beads ene. Vi ønsker, ved hjælp af kontrollen, at gøre rede for aktiviteten. Kontrollen er en bestemmelse af aktiviteten i den tilsatte opløsning af radioaktivt mærkede antistoffer. Aktiviteten af anti-muc1-dtpa- 111 In og anti-tnp-dtpa- 111 In er målt inden de respektive radioaktive antistof komplekser er tilsat til beads ene. Det viser sig, at der går en del aktivitet tabt under proceduren. Den størst svundne aktivitet er 0,475 MBq. Dette billede gentager sig i alle forsøgene. Det kan skyldes, at de radioaktivt mærkede antistoffer var i et ependorffrør, og med pipette blev udtaget og tilsat til beads ene. Der vil være en del aktivitet, der sidder tilbage i pipettespidsen og en del aktivitet, der er tilbage i ependorffrøret. Vi forventede derfor at måle en lavere aktivitet, end den vi har tilført. Før de respektive radioaktivt mærkede antistoffer er sat til beads ene, har vi udført ITLC, med efterfølgende chromatogram scanning, for at bestemme den radiokemiske renhed. Det havde været en værdifuld oplysning, også at udføre radiokemisk renheds bestemmelse på supernatanten fra beads ene. Dermed havde vi kunne se, om det var de radioaktivt mærkede antistofkomplekser der skyldtes den ringe binding til beads ene. De beads vi har anvendt er forberedt af Amarnadh Nalla (11). Oprindeligt skulle beads ene være testet inden forsøgene blev udført. Under et projektmøde blev 33
det diskuteret, at beads ene ikke er kontrolleret for om anti-muc1 har bundet sig til beads ene. Det blev belyst i samme diskussion, at det har været svært at finde et MUC1 antigen til indkøb til brug i projektet. Der fandtes på det tidspunkt kun en variant af antigenet. Af denne grund var det forventet, at det radioaktivt mærkede antistof, anti-muc1, ikke ville binde sig til beads ene. Vi må konstatere, at forsøgene ikke er udført under optimale forhold, da vi ikke ved om der er antigen på de beads vi har anvendt. Da det er vigtigt at få afklaret, om anti-muc1-dtpa- 111 In kan binde til MUC1 antigenet in vitro, overvejede vi at finde en anden metode til påvisning af dette. Dette ledte os i retning af, at afprøve anti-muc1-dtpa- 111 In og anti-tnp- DTPA- 111 In over for mamma-cancerceller bærende MUC1 antigen. Celle metoden Til alle cellebindings analyserne har vi anvendt både anti-muc1-dtpa- 111 In og anti-tnp-dtpa- 111 In. Fra dag 9 til dag 12 har vi udført forskellige cellebindingsforsøg, hvori vi har varieret den tilsatte aktivitet til cellerne. Cellebindingsanalysen fra Dag 14, Celle 5 er en gentagelse af forsøget Dag 10, Celle 2. Vi har i det praktiske arbejde med celler anvendt to mærkninger af hhv. anti- MUC1-DTPA- 111 In og anti-tnp-dtpa- 111 In. Til cellebindingsanalyse dag 9 til 12, har vi anvendt mærkning 13 med en radiokemisk renhed efter oprensning på 89% for anti-muc1-dtpa- 111 In og 83% for anti-tnp-dtpa- 111 In. Dag 14 har vi anvendt mærkning 14 til cellebindingsanalyse. Forud for cellebindingen blev den radiokemiske renhed efter oprensning bestemt til 84% for anti-muc1-dtpa- 111 In og 75% for anti-tnp-dtpa- 111 In. Da vi anvender samme mærkning til cellebindingsanalyse dag 9 til 12, har vi ved ITLC og efterfølgende kromatogramscanning, kontrolleret den radiokemiske renhed af anti-muc1-dtpa- 111 In og anti-tnp-dtpa- 111 In, efter udførelsen af cellebindings analysen dag 12. Her blev den radiokemiske renhed af begge radioaktivt mærkede antistoffer bestemt til 82%. 34
Resultaterne fra cellebindingsanalysen er forholdsvis entydige. Det viser sig, at anti-muc1-dtpa- 111 In bindes i højere grad til cellerne end anti-tnp-dtpa- 111 In. På baggrund af resultaterne fra Dag 9, Celle 1 valgte vi, at fortsætte forsøgene med en fortynding af mærkning 13 (1:20). Herefter tilsatte vi 5uL, 10uL og 20uL af henholdsvis anti-muc1-dtpa- 111 In og anti-tnp-dtpa- 111 In til cellerne, og der blev udført dobbelt bestemmelse. Ser vi på forskellen imellem anti-muc1-dtpa- 111 In og anti-tnp-dtpa- 111 In, tælles der over hele linien op imod 100% flere cpm for anti-muc1-dtpa- 111 In. Aktivitet Ved at variere på den aktivitet, der blev tilsat cellerne, forventede vi at finde et volumen antistof, der svarer til den højeste aktivitet, der kan bindes til cellerne. Dette blev udført ved at tilsætte fra 5uL til 30uL antistof til cellerne med 5uL interval for Dag 9, Celle 1 af både anti-muc1-dtpa- 111 In og anti-tnp-dtpa- 111 In. Det viser sig at den højeste aktivitet, der bindes til cellerne, fremkommer ved henholdsvis 25uL og 30uL for anti-muc1-dtpa- 111 In. På grafen Dag 9, Celle 1, for anti-tnp-dtpa- 111 In er der et udsving ved 25uL, der indeholder et større antal cpm end de øvrige resultater på grafen. Der er bestemt samme aktivitet i supernatanten for dette punkt, som ved tilsætning af 10uL antistof. Ligeledes måles den samme aktivitet i supernatanten ved tilsætning af 30uL i supernatanten. Ved 30 ul findes punktet på kurven på linie med de øvrige. Det kan skyldes, at der er afpipetteret forkerte voluminer af anti-tnp- 111 In. Der ses derfor bort fra disse punkter. På baggrund af resultaterne Dag 9, Celle 1 valgte vi, at fortsætte med tre forskellige voluminer, henholdsvis 5uL, 10uL og 20uL. Da der er 12 brønde i en plade med celler, er det muligt at udføre dobbelt bestemmelse af begge radioaktive antistoffer på cellebindingerne. 35