Opformeringsmedie til identifikation af MRSA

Opformeringsmedie til identifikation af MRSA Contrast MRSA broth fra Oxoid versus ChromID MRSA fra Biomerieux Forfatter: Sofie Skov Frost (60080212) Fødselsdato: 24/7 1988 Periode for bachelorprojekt: uge 41 2012 til uge 4 2013 Uddannelse: Bioanalytiker på Professionshøjskolen Metropol i København Kliniskvejleder: Imran Khan og Lisbeth Kanstrup, Klinisk Mikrobiologisk Afdeling på Rigshospitalet Vejleder fra Professionshøjskolen Metropol: Kaj Nielsen Det praktiske projekt er udarbejdet i samarbejde med Parisa Hassanzadeh. Antal anslag i opgaven: 51.865

Forord Projektets praktiske del er udført på Mikrobiologisk Afdeling på Rigshospitalet. Målgruppen for projektet er bioanalytikerne på afdelingen, da det er disse der skal anvende medierne i praksis. Der skel specielt siges en tak til bioanalytikerne på afdelingen, da de alle har været en stor hjælp under dette projekt. Det har været muligt at overlade medier og agarplader til inkubation og følt medierne har været i trygge hænder og sikre på, at de angivende ønsker er blevet opfyldt. Personalet på afdelingen har hjulpet med at finde podepinde og lagt diverse isolater, der har været efterspurgt til dette projekt, til side. Abstrakt Formål På Klinisk Mikrobiologisk afdeling på Rigshospitalet, benyttes ChromID MRSA pladen fra Biomerieux til identifikation af Methicillin resistente Staphylococcus aureus. Afdelingen vil gerne have undersøgt, om en ny metode kan nedsætte analysetiden af negative MRSA prøver fra to til ét døgn. Projektets formål er dermed at undersøge om det både vil være tidsbesparende og rutinemæssigt fornuftigt at udskifte ChromID MRSA pladen med et nyt medie fra Oxoid; Contrast MRSA broth. Metode Til projektet er der anvendt 96 prøver, herunder 38 MRSA, 29 MSSA, 8 BORSA, 3 MRSA positive podepinde, 6 MRSA negative podepinde og 12 non S. aureus stammer. Contrast MRSA broth blev podet med kolonimateriale med en vatpind og på ChromID MRSA blev kolonimateriale udsået med en øjepodenål. Medierne blev inkuberet ved 37 ⁰C i 18-24 timer. Resultater Med dette undersøgelsesdesign har Contrast MRSA broth vist sig at have en sensitivitet på 100 % og en specificitet på 20 %. For ChromID MRSA pladen er sensitiviteten 100 % og specificiteten 63,6 %. Ud fra disse resultater blev de to medier vurderet overfor relevant litteratur. Konklusion Sensitivitet opnået i dette projekt konkludere at Contrast MRSA broth er et velegnet medie til identifikation af Methicillin resistente Staphylococcus aureus. Men ud fra dette projekts specificitet kan problemstillingen med at kunne detektere negative MRSA prøver hurtigt, være svær at opnå. Da specificiteten er så lav som den er (20 %), vil MRSA negative prøver ikke kunne detekteres inden for et døgn. Side 2 af 61

Indholdsfortegnelse Forord...2 Abstrakt...2 1.0 Introduktion...5 1.1 Problembaggrund...5 1.2 Formål...6 1.3 Problemformulering...6 1.4 Målformulering...6 1.5 Ordforklaringer...7 1.6 Metodevalg...7 1.7 Teori og analyseprincipper...8 1.7.1 β-laktamer...8 1.7.2 MRSA og meca genet...9 1.7.3 BORSA...9 1.7.4 ChromID MRSA fra Biomerieux... 10 1.7.5 Contrast MRSA broth fra Oxoid... 10 1.7.6 PCR... 10 1.7.7 Sensitivitet og specificitet... 11 2.0 Materialer...11 3.0 Metode...13 3.1 Golden standard... 13 3.2 Pilotforsøg... 13 3.2.1 Pilotforsøg: resistensbestemmelse af de opsamlede bakterier... 13 3.2.2 Podepinde... 15 3.2.3 Pilotforsøg: afprøvning af ChromID MRSA og Contrast MRSA broth... 15 3.2.4 MSSA-stammer fra rutinelaboratoriet... 17 3.3 Kontroller... 18 3.4 Fortyndningsrække... 18 3.5 Contrast MRSA broth podet med McFarland 0,3... 19 3.6 Forsøgsdesignet... 20 3.6.1 Forsøgsopstilling for det primære projekt... 21 3.6.2 Forsøgsopstilling for ChromID MRSA... 22 3.6.3 Forsøgsopstilling for Contrast MRSA broth (25)... 23 Side 3 af 61

4.0 Resultater...25 4.1 Graf over resultaterne... 25 4.2 Sensitivitet og specificitet... 26 4.3 Sand negative resultater og falsk positive resultater... 27 4.4 Fortyndingsrække... 29 4.5 BORSA resultater... 30 5.0 Diskussion...32 5.1 Diskussion af resultater... 32 5.1.1 Sensitivitet og specificitet for Contrast MRSA broth... 32 5.1.2 Sensitivitet og specificitet for ChromID MRSA og Brilliance MRSA 2 Agar... 33 5.1.3 Sand negative resultater og falsk positive resultater... 34 5.1.4 BORSA-stammerne... 35 5.2 Diskussion af brugervenligheden for Contrast MRSA broth... 36 5.3 Diskussion af forsøgsdesignet... 36 6.0 Konklusion...37 7.0 Perspektivering...37 8.0 Referenceliste...39 9.0 Bilag... 40-61 Side 4 af 61

1.0 Introduktion 1.1 Problembaggrund Staphylococcus species er små, ubevægelige, grampositive kokker i hobe. Staphylococcus species kan vokse både anaerobt og aerobt og der findes ca. 20 forskellige arter, hvoraf S. aureus og S. epidermidis er nogle af de vigtigste. De koagulase negative Staphylococcus (KNS), herunder S. epidermidis og S. sciuri, indgår sammen med andre bakterier i normalfloraen på huden og på slimhinderne i mund, næse og svælg (1). S. aureus er en patogen bakterie, men hos 50 % af befolkningen er S. aureus en del af den normale næse - og hudflora og af disse er ca. 20 % permanente bærere. I nogle tilfælde har S. aureus dannet genet meca, som gør denne resistent overfor visse antibiotika. Disse bakterier kaldes Methicillin resistente Staphylococcus aureus (MRSA) (2). I 1940 erne blev de første penicilliner udvundet og flittigt brugt. Der var nu fundet en kur mod de dødelige infektioner, som var meget hyppige blandt befolkningen. Da penicillin kom på banen var alle Staphylococcus species følsomme overfor dette. I 1960 erne og 1970 erne begyndte S. aureus at udvikle penicillinresistens, da S. aureus nu dannede enzymet penicillinase. S. aureus var igen en truende bakterie og specielt på hospitalerne var patienter og personale hårdt ramt (3). Methicillin resistent Staphylococcus aureus (MRSA) blev første gang påvist i 1961 i England og har siden bredt sig til hele verden. Danmark havde i mange år haft en lav forekomst af MRSA infektioner i forhold til andre lande, da MRSA stort set kun fandtes på de danske hospitaler (hospital-acquired MRSA). Der er dog siden slutningen af 1990 erne sket en stigning i MRSA infektioner. Nu ses MRSA infektioner også uden for hospitalet (community-acquired MRSA) (4). På Rigshospitalet er der ca. 50 tilfælde af MRSA infektioner om året (5). Ved mistanke om en infektion med MRSA, isoleres patienten og der podes fra næse, svælg, mellemkødet, sår samt kateterspidser ved intravenøs katetre og urinvejskatetre (6,7). Det er patienter, der har været i en risikosituation inden for de sidste 12 måneder, som screenes for MRSA. Dette kan fx være en udlandsrejse, hvor MRSA infektioner er hyppige (6). Patienten er isoleret indtil der, efter endt behandling for MRSA, foreligger tre negative screeningsprøver. Screeningsprøverne tages med en uges mellemrum på 7., 14., og 21. døgn efter endt behandling (6). Svar på en screeningsprøve kan ventes inden for 48 timer og en efterfølgende konfirmatorisk test på Statens Serum Institut kan tage yderligere 1-2 døgn (7). På Rigshospitalet isoleres patienten på en dobbeltstue, da de fleste stuer er dobbeltstuer. Derfor optager en isoleret patient to sengepladser under behandlingen. På Rigshospitalet koster en sygeseng Side 5 af 61

3.000-5.000 kr. i døgnet, hvilket betyder at en patient kan koster op imod 10.000 kr. i døgnet alene for sengepladsen. Derudover kommer der diverse værnemidler så som handsker, mundbind, engangskitler, maske, briller og eventuelt visir (5). Det er dyrt at have patienter i isolation, så hver en dag der kan spares, vil være til fordel for hospitalet økonomisk og resursemæssigt. Identifikationen af MRSA på Rigshospitalet sker på nuværende tidspunkt ved at udså prøvemateriale fra podepinde på ChromID MRSA pladen fra Biomerieux og aflæse denne efter et døgns inkubation. Negative prøver inkuberes yderligere et døgn og aflæses. Der er nu kommet et nyt produkt på markedet, som kan reducere svartiden på negative prøver med et døgn. Dette medie er fra Oxoid og hedder Contrast MRSA broth. Ud fra produktbeskrivelsen kan negative prøver allerede aflæses efter ét døgns inkubation. 1.2 Formål På Klinisk Mikrobiologisk afdeling på Rigshospitalet benytter man sig af ChromID MRSA fra Biomerieux til identifikation af MRSA. Personalet på afdelingen vil gerne have undersøgt, om der findes en metode, der kan nedsætte analysetiden af negative MRSA prøver fra to til ét døgn. På dette grundlag er det valgt at undersøge om Contrast MRSA broth fra Oxoid kan opfylde dette krav. Formålet med projektet er at undersøge, om det både vil være tidsbesparende og rutinemæssigt fornuftigt at udskifte ChromID MRSA fra Biomerieux med opformeringsmediet Contrast MRSA broth fra Oxoid. 1.3 Problemformulering Er der forskel på bestemmelsen af Methicillin resistent Staphylococcus aureus ved brug af ChromID MRSA fra Biomerieux og Contrast MRSA broth fra Oxoid med hensyn til analysetiden og analysernes sensitivitet og specificitet? 1.4 Målformulering Undersøgelsen af Contrast MRSA broth fra Oxoid laves med henblik på eventuel implementering af analysemetoden på Klinisk Mikrobiologisk afdeling på Rigshospitalet. Det ønskes at afgøre hvilken analysemetode, Contrast MRSA broth fra Oxoid eller ChromID MRSA fra Biomerieux, der er bedst egnet til identifikation af MRSA med udgangspunkt i sensitiviteten og specificiteten. Side 6 af 61

Målet med projektet er at kunne detektere negative MRSA prøver og dermed få patienten hurtigere ud af isolationen, både for patientens skyld, men også rent økonomisk for hospitalet. På Klinisk Mikrobiologisk afdeling på Rigshospitalet har man erfaret at den chromogeneplade, ChromID MRSA fra Biomerieux, kan give falske positive resultater. Der er blevet observeret en positiv reaktion efter udsåning af Enterococcus species. Målet med projektet er derfor også at sammenligne falsk positive resultater fra Contrast MRSA broth og ChromID MRSA. 1.5 Ordforklaringer MRSA MSSA BORSA KNS ATCC Staphaurex SPA SCC meca Methicillin resistent Staphylococcus aureus Methicillin sensitiv Staphylococcus aureus Borderliner oxacillin Staphylococcus aureus Koagulase negative Staphylococcus. Disse bakterier er en del af den normale hudflora American Type Culture Collection. Stammerne herfra er godkendte derivater, der er sporbare til de originale stammer (8) Hurtig latex agglutinations test til identifikation af Staphylococcus aureus Protein A Staphylococcus (SPA). Dette er et gen, som findes hos Staphylococcus aureus Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) gen Gen der findes hos Methicillin resistent Staphylococcus aureus, som koder for penicillinbindende proteiner 1.6 Metodevalg Med Contrast MRSA broth kan man pode mediet direkte med podepinde. Der blev dog valgt at bruge bakterier fra kultur samling 1, da der ikke var mulighed for at skaffes 100 podepinde, hvor i hvert fald 40 af podepindene skulle være MRSA positive. Bakterierne blev udsået på 5 % blodagarplader og fra disse blev der taget en koloni med en vatpind til at pode Contrast MRSA broth med og en koloni med en øjepodenål til at udså på ChromID MRSA pladen. Der blev analyseret 96 prøver, da antallet af prøver skulle passe med muligheden for at lave prøver om ved eventuelle uoverensstemmelser. De fleste prøver var nedfrosne prøver, som er blevet MRSA, 1 Optøede bakterier fra Klinisk Mikrobiologisk afdelings frysere. Side 7 af 61

MSSA eller BORSA bestemt af enten Klinisk Mikrobiologisk afdeling på Rigshospitalet eller Statens Serum Institut. Derudover fik vi lagt MRSA positive podepinde til side fra rutinelaboratoriet. Da der bliver taget podninger fra anus, mellemkødet, munden og huden ville det være interessant at undersøge om Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis samt Non hæmolytisk Streptokokker kan påvirke analysen til at give et falsk positivt svar. Der blev derfor undersøgt om Contrast MRSA broth detekterer disse som værende negative prøver. Det endte med, at der blev undersøgt 38 MRSA-stammer, 29 MSSA-stammer, 8 BORSA-stammer, 9 podepinde fra rutinelaboratoriet og 12 non S. aureus stammer, herunder Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, S. epidermidis, S. sciuri og Non hæmolytisk Streptokokker, og 2 ATCC-stammer som kontroller. For at sikre troværdigheden af de opnåede resultater blev de anvendte bakterier undersøgt for resistensegenskaber inden forsøgets start. Ved at gøre dette kan man bedre stole på resultaterne efter det primære forsøg. Efter at have analyseret alle prøverne, blev der observeret en del falsk positive resultater, så det blev valgt at indføre en fortyndingsrække. Dette blev gjort for at vurdere om der var en øvre grænse for koncentrationen af kolonimateriale i opformeringsmediet Contrast MRSA broth. 1.7 Teori og analyseprincipper 1.7.1 β-laktamer β-laktamantibiotika er kendetegnet ved at have en β-laktamring, som dennes aktive struktur. β- laktamringen virker på den måde, at den binder sig med kovalente bindinger til penicillinbindende proteiner (PBP). PBP indgår i bakteriens cellevæg og er vigtig i bakteriens syntese af peptidoglycan, der er en polymer bestående af kulhydrater og aminosyrer. Pga. β-laktamringens binding til de penicillinbindende proteiner, vil der ske en nedsat syntese af peptidoglycan, som vil medfører en svækkelse af bakteriens cellevæg. Dette påvirker det osmotiske tryk i bakterien og dette vil til sidst bevirke at cellen dør. Nogle bakterier udskiller et enzym, som bryder β-laktamringen og derved deaktiverer antibiotikaets evne til at dræbe bakterien. Dette betyder at bakterien er blevet resistente overfor denne type antibiotika (9). Cefoxitin er et anden generations cefalosporin, som er et β-laktamantibiotikum. Cefoxitin hæmmer cellevægsdannelsen ved, at β-laktamringen binder sig til det penicillinbindende protein. Ved Methicillin resistente Staphylococcus aureus er det penicillinbindende protein ændret til PBP 2A, så cefoxitin ikke kan binde sig til bakterien og MRSA er dermed resistent overfor cefoxitin (10,9). Side 8 af 61

Colistin er en polymyxin, som ødelægger cytoplasmamembranens funktion. Polymyxiner består af et cyklisk peptid med en lang fedtopløselig hale og virker kun på gram negative bakterier(10,11). I forbindelse med identifikation af S. aureus og MRSA bruges Colistin, da S. aureus er en gram positiv bakterie og er derfor resistent overfor Colistin. Methicillin og oxacillin er begge tredje generations penicilliner og hører under β-laktamer. Methicillin og oxacillin har en hæmmende effekt på cellevægsdannelsen (10). Til identifikation af MRSA og MSSA benyttes der forskellige zonestørrelser ved vækst i tilstedeværelsen af Colistin og Cefoxitin. Prøvematerialet udsås på en resistensagarplade, hvor på der påsættes en Colistin150µg-tablet og en Cefoxitin30µg-tablet. Efter inkubation måles zonestørrelsen ved at kigge på bakteriens vækst i forhold til den påførte tablet. MRSA er resistent overfor Colistin150µg og har dermed har en følsomhed på 0 ( 15 mm) og er resistent overfor Cefoxitin30µg, som også har en følsomhed på 0 ( 29 mm). MSSA er resistent overfor Colistin150µg og har dermed en følsomhed på 0 ( 15 mm) og er følsom overfor Cefoxitin30µg, som dermed har en følsomhed på 3 ( 30 mm) (12). 1.7.2 MRSA og meca genet Methicillin resistent Staphylococcus aureus (MRSA) er en S. aureus bakterie med genet meca, som koder for det penicillinbindende protein PBP 2A. β-laktamantibiotika har en meget lav affinitet til dette protein, da det penicillinbindende protein er blevet ændret til PBP 2A. Det penicillinbindende protein 2A findes ikke i bakterier, som er følsomme overfor β-laktamantibiotika (1). PBP 2A menes at overtage cellevægssyntesen, hvor andre penicillinbindende proteiner hæmmes af β-laktamantibiotika (1). Mekanismen bag MRSA resistensudviklingen er, at bakterierne via plasmider overfører DNAmateriale indbyrdes, hvilket forandrer strukturen og funktionen af PBP (3). 1.7.3 BORSA Borderliner Oxacillin resistent Staphylococcus aureus (BORSA) er Staphylococcus aureus stammer med MIC 2 til oxacillin tæt på det National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) break point på 2 mg/l. BORSA-stammer kan ikke klassificeres som virkelig methicillin resistente, medmindre en meca gen test udføres (fx PCR). Borderliner Oxacillin resistent Staphylococcus aureus mangler meca genet (13). 2 Mindst hæmmende koncentration. Side 9 af 61

BORSA er defineret som meca negative S. aureus med nedsatte zoner /let forhøjet MIC til oxacillin (14). 1.7.4 ChromID MRSA fra Biomerieux Tilstedeværelsen af MRSA i en patient prøve identificeres ved, at grønne kolonier vokser frem på ChromID MRSA pladen efter 18-24 timers inkubation. Den chromogene plade indeholder cefoxitin, som virker på den måde, at det ødelægger bakteriens cellevægssyntese og dermed hæmmer bakterievækst. Da MRSA indeholder meca genet, som koder for det forandret penicillinbindende protein PBP 2A, kan cefoxitin ikke nedbryde bakterien. På denne måde vil MRSA vokse frem på den chromogene plade (15,16,9). 1.7.5 Contrast MRSA broth fra Oxoid Contrast MRSA broth er en bouillon til direkte identifikation af MRSA fra prøvematerialet. Bouillonen indeholder en blanding af forskellige antibiotika og inhibitorer, der hæmmer MSSA og non S. aureus stammer i at vokse. Ydermere indeholder bouillonen phenol rød, som en farveindikator samt kulhydraterne mannitol og trehalose (17). S. aureus kan fermentere mannitol og trehalose, hvorimod fx S. epidermidis ikke kan fermentere hverken mannitol og trehalose. E. faecalis og E. faecium kan begge fermentere mannitol og trehalose (18), men pga. inhibitorer i bouillonen hæmmes disse i at vokse i bouillonen. Fermenteringen resulterer i en stigning af ph i bouillonen, der observeres som en farveændring fra rød til orange/gul. Dette er en indikator for en positiv MRSA reaktion. Koncentrationen af nalidixic syre er nedsat i bouillonen i forhold til den chromogene plade Brilliance MRSA 2 Agar fra Oxoid. Syren påvirker både gram positive bakterier og gram negative bakterier. Koncentrationen af nalidixic syre er derfor valgt, så det minimere væksten af non S. aureus stammer, men samtidig ikke hæmme reaktionen af MRSA stammer (17). 1.7.6 PCR På Klinisk Mikrobiologisk afdeling på Rigshospitalet benytter man metoden Xpert MRSA/SA Blood Culture PCR analyse med apparaturet GeneXpert Dx fra Cepheid til identifikation af generne Staphylococcus Protein A (SPA), meca samt Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec). Disse gener bruges til identifikationen af MRSA ved hjælp af real-time PCR teknikken. Til GeneXpert Dx apparatet medfølger en kassette, som indeholder tre kamre mærket med 1, 2 og S. I kammer 1 tilsættes reagent 1, i kammer 2 tilsættes reagent 2 og i kammeret markeret med S, tilsættes prøvematerialet opslæmmet i sterilt vand og tilsat Elution Reagent (19,20). Polymerase Chain Reaction (PCR) bruges til at opformere DNA sekvenser til senere analysering. Ved en PCR analyse er der tre trin. Ved denaturering brydes hydrogenbindingerne i DNA ets dobbeltstreng og efterlader to enkeltstrenge. Dette sker ved en opvarmning til ca. 90 ⁰C. Ved annealing påsættes Side 10 af 61

primer stykkerne. Dette sker ved en hurtig temperatur sænkning til ca. 40 til 60 ⁰. Ved elongering forlænges primerne ved hjælp af en polymerase og enkelte nukleotider. Ved identifikationen af MRSA undersøger man for genet SPA, som koder for Protein A, der findes i cellevæggen hos S. aureus (21). meca genet koder for det penicillinbindende protein PBP 2A og ses kun hos Methicillin Resistente Staphylococcus aureus. Når en S. aureus bakterie erhverver sig genet Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) ændres denne til MRSA (22). 1.7.7 Sensitivitet og specificitet Sensitiviteten er et mål for andelen af positive reaktioner, der er korrekt identificeret. Sensitiviteten kan udregnes på følgende måde: (23). Specificiteten er et mål for andelen af negative reaktioner, der er korrekt identificeret. Specificiteten kan udregnes på følgende måde: (23). 2.0 Materialer Bakterie isolater: 38 MRSA-stammer 29 MSSA-stammer 8 BORSA-stammer 1 E. faecalis 2 E. faecium 2 E. coli 3 S. epidermidis 1 Non hæmolytisk streptokok 3 S. sciuri 6 MRSA negative podepinde 3 MRSA positive podepinde Kontroller: MRSA ATCC 33591. Dette er den samme ATCC-stamme, som producenten Oxoid har brugt til undersøgelsen af mediet Contrast MRSA broth (MRSA positiv kontrol). MSSA ATCC 29213 (MSSA positiv kontrol). Side 11 af 61

Substrater: 5 % blodplader fra Statens Serum Institut Resistensplader fra Statens Serum Institut ChromID MRSA chromogene plader fra Biomerieux Brilliance MRSA 2 Agar chromogene plader fra Oxoid Contrast MRSA Broth fra Oxoid Saltvand 0,9 % NaCl fra Biomerieux Colistin150µg tabletter fra Rosco Cefoxitin30µg tabletter fra Rosco Oxacilin1µg tabletter fra Rosco Stuarts medie fra Statens Serum Institut Staphaurex fra Remel Apparaturer og utensilier: Bakterielt udstyr 37 ⁰C inkubator Densimat Mixer Finpipetter med pipettespidser (10-1000 µl) Maldi-tof PCR GeneXpert Dx fra Cepheid Lotnumre på anvendte medier: Producent Medie Dato Lotnummer Biomerieux ChromID MRSA 2012-11-13 100 160 9070 Oxoid Brilliance MRSA 2 Agar 2012-10-25 124 1949 Oxoid Contrast MRSA broth 2012-10-10 122 8689 Oxoid Contrast MRSA broth 2012-11-19 123 3257 Rosco Colistin 150µg 2016-03 1201-1 (Polymyxins) Rosco Oxacillin 1µg 2014-01 1001-2 Rosco Cefotaxime 30µg 2014-02 1001-2 (Cefoxitin) Biomerieux Saltvand, 0,85 % NaCl, Medium, 2 ml 2014-06-18 1001416000 Side 12 af 61

3.0 Metode 3.1 Golden standard Som golden standard blev der udført PCR, da denne metode kan detektere meca genet, som kun observeres ved MRSA. PCR resultatet bruges til at sammenligne resultater opnået fra hhv. Contrast MRSA broth og ChromID MRSA screeningerne. Før projektstart var der kørt PCR på alle de opsamlede prøver hos enten Klinisk Mikrobiologisk afdeling på Rigshospitalet eller Statens Serum Institut. Hvis der observeres uoverensstemmelser mellem de opnåede resultater fra Contrast MRSA broth og ChromID MRSA screeningerne og afdelingens PCR resultat, vil der efterfølgende blive kørt PCR på den pågældende prøve for at understøtte de opnåede resultater. 3.2 Pilotforsøg Inden opstart af det primære projekt blev alle de opsamlede bakterier undersøgt for at sikre, at disse stemte overens med tidligere identifikation. Til dette formål blev der lavet en resistensbestemmelse af de opsamlede bakterier. Derudover blev de to testmedier, Contrast MRSA broth og ChromID MRSA, afprøvet, for at blive komfortabel med brugen af medierne. 3.2.1 Pilotforsøg: resistensbestemmelse af de opsamlede bakterier For at kunne redegøre for hvilke bakterier, der er blevet testet i dette projekt, blev der lavet en resistensbestemmelse og Staphaurex test på alle de opsamlede bakterier, for på den måde at kunne identificere disse. Resultaterne af resistensbestemmelsen viste, at det var nødvendigt at lave en McFarland bestemmelse for at kunne standardisere og kvalitetssikre bestemmelsen. Dette blev gjort på det grundlag, at væksten på resistenspladerne var for tætte og en gendannelse af de enkelt resistensbestemmelser ville ikke være mulig. Ved at lave en McFarland, kan man opnå en bestemt kolonitæthed på alle pladerne. Udførelse af McFarland bestemmelse: Det blev valgt at forsøge med tre forskellige inoculum; McFarland 0,3; McFarland 0,5 og en bestemt suspension, der benyttes på Klinisk Mikrobiologisk afdeling på Rigshospitalet ved resistensbestemmelse af MRSA. Til McFarland 0,3 og McFarland 0,5 blev der brugt 2 ml 0,85 % NaCl, en mixer og en Densimat. Et par kolonier fra 5 % blodpladen blev opslæmmet med en vatpind i 2 ml 0,85 % NaCl, til der blev opnået en McFarland på 0,3 og en McFarland på 0,5. Efterfølgende blev opløsningen undersøgt ved at bruge en Densimat. Side 13 af 61

På afdelingen anvendes en bestemt McFarland for MRSA resistensbestemmelse (P-302-2), for at opnå semikonfluerende vækst. Hvis ikke denne procedure foretages, vil S. aureus vokser meget tæt på resistenspladen og følsomheden for antibiotika kan dermed ikke afmåles korrekt. Proceduren indeholder tre trin: 1) S. aureus fra en agarplade suspenderes i 0,85 % NaCl til McFarland 0,5. 2) 20 µl af suspensionen fortyndes yderligere i 2 ml 0,85 % NaCl. 3) 100 µl af ovenstående fortynding spredes jævnt på en resistensplade med glasspaltel. På resistenspladerne blev der påført en Colistin150µg-tablet og en Cefoxitin30µg -tablet. Der blev fremstillet resistensplader til hver af de tre McFarland, som anført i skemaet herunder: Tabel 1: Skema over McFarland bestemmelse: Navn McFarland Resistensbestemmelse Følsomhed overfor Colistin150µg Zonestørrelse ved Colistin150µg i mm Følsomhed overfor Cefoxitin 30µg Zonestørrelse ved Cefoxitin 30µg i mm MRSA P-302-2 0 15 0 25 ATCC 33591 MSSA P-302-2 0 15 3 32 ATCC 29213 MRSA 0,5 0 15 0 26 ATCC 33591 MSSA 0,5 0 15 0* 28 ATCC 29213 MRSA 0,3 0 15 0 27 ATCC 33591 MSSA ATCC 29213 0,3 0 15 3 33 Side 14 af 61

* Her er MSSA resistent for Cefoxitin, hvor den burde være følsom. Dette skyldes den for tætte vækst af kolonimateriale på resistenspladen. Zonestørrelse for Colistin150µg og Cefoxitin30µg ved MRSA og MSSA: MRSA er resistent overfor Colistin150µg og har dermed en følsomhed på 0 ( 15 mm) samt er resistent overfor Cefoxitin30µg med en følsomhed på 0 ( 29 mm). MSSA er resistent overfor Colistin150µg og har dermed en følsomhed på 0 ( 15 mm) samt er følsom overfor Cefoxitin30µg med en følsomhed på 3 ( 30 mm) (12). Ud fra resultater i Tabel 1 samt vurdering af væksten på de enkelte plader, blev det konkluderet, at det bedste resultat opnås ved brug af den samme procedure, der bliver brugt på afdelingen. Ved denne metode opnås en semikonfluerende vækst. 3.2.2 Podepinde Det blev valgt at medtage podepinde for at afprøve om Contrast MRSA broth kan bruges som rutine medie. 2 MRSA positive podepinde og 5 MRSA negative podepinde blev modtaget fra rutinelaboratoriet. Derudover blev der fremstillet to podepinde, ved at pode en kulpodepind med MRSA kolonimateriale fra en af de positive MRSA blodplader og overføre denne kulpodepind til Stuarts medium. Da Contrast MRSA broth og ChromID MRSA blev podet med podepindene, blev der observeret nogle uoverensstemmelser mellem resultaterne for de to undersøgte medier og afdelingens resultater. På dette grundlag blev der udført resistensbestemmelse på en af podepindene, da denne var blevet falsk negativ i Contrast MRSA broth og på ChromID MRSA pladen. Denne bakteries resistensmønster viste, at det ikke var en MRSA, da Colistin150µg havde en zonestørrelse på 25 mm og Cefoxitin30µg havde en zonestørrelse på 35 mm. Podepinden blev herefter medregnet som en MRSA negativ prøve. Der blev ikke lavet resistensbestemmelse på alle podepindene fra start af, da man kunne risikere at opbruge de bakterier, der eventuelt måtte være på podepindene. 3.2.3 Pilotforsøg: afprøvning af ChromID MRSA og Contrast MRSA broth Inden det praktiske forsøg med de chromogene medier, blev Contrast MRSA broth og ChromID MRSA medierne afprøvet. Formålet med denne afprøvning var at træne fremgangsmåden samt aflæsning af resultaterne. Fremgangsmåde Contrast MRSA broth: 1) 1 koloni opsamles med vatpind fra blodpladen. 2) Contrast MRSA broth podes med vatpinden. Vatpinden vendes og drejes grundigt, hvorefter væske afsættes i glassets kant inden vatpinden udtages. Side 15 af 61

3) Inkuberes i 18-24 timer ved 37 C og herefter 1. døgns aflæsning. 4) Negative prøver noteres, mens der laves konfirmatorisk test på positive prøver. Dette blev udført på den chromogene plade; Brilliance MRSA 2 Agar fra Oxoid. 5) Brilliance MRSA 2 Agar pladen aflæses efter 24 timers inkubation ved 37 C og resultat noteres. Fremgangsmåde ChromID MRSA: 1) 1 lille koloni opsamles med øjepodenål. 2) Der laves en 3-trins-spredning på ChromID MRSA. 3) Inkuberes i 18-24 timer ved 37 C og herefter 1. døgns aflæsning. 4) Negative prøver inkuberes yderligere i 18-24 timer ved 37 C og herefter 2. døgns aflæsning. Medierne blev til at starte med testet for en MRSA-stamme samt en MSSA-stamme, som kontrol for et positivt og negativt resultat. Tabel 2: Aflæsning af chromogene medier: Bakterie stamme 20. MSSA 3B 54. MRSA 3B ChromID MRSA Contrast MRSA broth Forventede resultat Resultat Forventede resultat Resultat NEGATIV NEGATIV POSITIV NEGATIV Ingen vækst/grønne Ingen Ingen farveændring, kolonier vækst/grønne fortsat rød kolonier POSITIV POSITIV POSITIV POSITIV Vækst af grønne Vækst af grønne Farveændring fra rød kolonier kolonier til gul Pilotforsøget med MSSA-stammen gik ikke som forventet for opformeringsmediet Contrast MRSA broth, da resultatet for denne stamme burde være negativt, men desværre blev positivt (Tabel 2). Der blev foretaget et nyt pilotforsøg med to nye stammer, en MSSA samt en MRSA, med samme fremgangsmåde. Endnu engang blev resultatet for MSSA-stammen positivt med Contrast MRSA broth. Da ChromID MRSA testen ved begge forsøg har givet forventede negative resultater for MSSA, er muligheden for at der er uoverensstemmelser med bakterien meget lille. Der blev nu valgt at teste Contrast MRSA broth en sidste gang. Denne gang både for MRSA, MSSA, Enterococcus faecalis samt Enterococcus faecium og en bouillon helt uden bakteriemateriale, for at se om der sker en Side 16 af 61

reaktion alene ved inkubationen. Derudover blev mediet testet ved podning med to MRSA positive podepinde. Tabel 3: Aflæsning af chromogene medier: Contrast MRSA broth Bakteriestamme Forventede resultat Resultat Intet bakteriemateriale NEGATIV NEGATIV Ingen farveændring, fortsat rød Rød Enterococcus faecium NEGATIV NEGATIV Ingen farveændring, fortsat rød Rød Enterococcus faecalis NEGATIV POSITIV Ingen farveændring, fortsat rød MSSA ATCC 29213 NEGATIV POSITIV Ingen farveændring, fortsat rød MRSA ATCC 33591 POSITIV POSITIV Farveændring fra rød til gul Podepind MRSA positiv POSITIV POSITIV Farveændring fra rød til gul Podepind MRSA positiv POSITIV POSITIV Farveændring fra rød til gul Tabel 3 viser, at der stadig fremkommer falsk positive resultater ved MSSA-stammen samt ved E. faecalis. E. faecium gav den forventede negative resultat og det samme gjorde alle de MRSA positive prøver. Derudover gav bouillonen uden kolonimateriale det forventede negative resultat, hvilket viser at der ikke sker en farveændring alene ved inkubationen. Det blev derefter besluttet at fortage en konfirmatorisk test på tre af stammerne på Brilliance MRSA 2 Agar; E. faecalis og de to ATCC-stammer; MSSA ATCC 29213 og MRSA ATCC 33591. Her blev MRSA ATCC 33591 positiv, som forventet og MSSA ATCC 29213 og Enterococcus faecalis blev begge negative, som forventet. 3.2.4 MSSA-stammer fra rutinelaboratoriet Til slut i dette pilotforsøg blev Contrast MRSA broth testet med tre MSSA-stammer direkte fra rutinelaboratoriet, hvor de har været udsået på 5 % blodplader. Der blev observeret to falsk positive resultater og et sandt negativt resultat. Disse resultater tyder på, at der er en uoverensstemmelse mellem de testede medier. Side 17 af 61

3.3 Kontroller Som MSSA positiv kontrol og MRSA positiv kontrol blev det valgt at benytte de to ATCC-stammer, som anført i Tabel 4. Der blev udført en PCR analyse for at sikre, at kontrollerne var henholdsvis MSSA og MRSA positive. Tabel 4: PCR resultater for kontrollerne: PCR Bakterie stamme SPA meca-gen SCC MSSA ATCC 29213 POSITIV NEGATIV NEGATIV MRSA ATCC 33591 POSITIV POSITIV POSITIV Ud fra resultaterne i Tabel 4 kan de to kontroller godkendes. MSSA ATCC 29213 blev testet positive for genet Staphylococcus Protein A (SPA), som koder for Protein A og som ses hos alle S. aureus samt testet negativ for meca genet og genet Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec), som er to gener der kun ses hos MRSA. Ligeledes kunne det observeres at MRSA ATCC 33591 er positiv for SPA genet, hvilket beviser, at det er en S. aureus, og derudover blev kontrollen testet positiv for meca genet og SCC genet, som kun ses hos MRSA-stammer. 3.4 Fortyndningsrække På baggrund af observationerne for Contrast MRSA broth efter det primære forsøg, blev det valgt at lave en fortyndingsrække. Dette blev gjort for at undersøge, om der eventuelt er en grænse for kolonimateriale i Contrast MRSA broth. Til dette blev ATCC-stammerne MRSA ATCC 33591 og MSSA ATCC 29213 brugt. Udførelse af 2-foldsfortynding: 1) Der opstilles 8 glas med 0,85 % NaCl i hver. I det første glas er der 2 ml 0,85 % NaCl og de resterende 7 glas indeholder 1 ml 0,85 % NaCl. 2) Der opnås en McFarland 1 i det første glas, 2 ml 0,85 % NaCl, for både MRSA ATCCstammen og MSSA ATCC-stammen. 3) Med en pipette overføres 1 ml fra det første glas (McFarland 1) til glas nummer to. Der blandes grundigt og dernæst overføres 1 ml fra glas to til glas tre osv. Den overskydende ml fra sidste glas kasseres (24). Side 18 af 61

4) Der udsås 1 µl og 100 µl fra hver prøve på hver deres 5 % blodplade. CFU kan aflæses efter 24 timers inkubation ved 37 ⁰C. Derudover podes Contrast MRSA broth med en vatpind fra hver af de 16 prøver. Figur 1: Skitse af fortyndingsrækken: Fortyndingsrækken viste at alle fortyndingerne med MRSA blev positive, som forventet. Glas nummer et (McFarland 1) fortyndet med MSSA blev positiv (mørke orange), mens de resterende glas blev negative. 3.5 Contrast MRSA broth podet med McFarland 0,3 Efter at have set resultaterne for fortyndingsrækken og erfarede, at der muligvis er en grænse for koncentrationen af materiale i Contrast MRSA broth, blev der lavet en McFarland 0,3 på fire MRSAstammer, fire MSSA-stammer, en S. epidermidis og en Non hæmolytisk streptokok, hvorefter Contrast MRSA broth blev podet med hver af disse. Det blev valgt at benytte McFarland 0,3, da glas nummer 1 i fortyndingsrækken ~ til McFarland 1 blev positiv, og glas nummer 2 ~ til McFarland 0,5 blev negativ, og glas nummer 3 ~ til McFarland 0,25 blev negativ. Derfor er det forventeligt at McFarland 0,3 ligeledes vil blive negativ. Side 19 af 61

Tabel 5: Oversigt over resultaterne for test af Contrast MRSA broth podet med McFarland 0,3: Bakterie nr. Resultat Bakterie isolat Bakterie nr. Resultat Bakterie isolat 5 3 POSITIV MSSA 2C 11 POSITIV MRSA 1E 6 NEGATIV MSSA 2D 12 POSITIV MRSA 2A Rød 7 POSITIV MSSA 3D 13 POSITIV MRSA 2E Orange 21 POSITIV MSSA 2B 73 Negativ Rød Non hæmolytisk streptokok 10 POSITIV MRSA 1A 75 POSITIV S. epidermidis Tabel 5 viser, at der kun er én MSSA-stamme og én Non hæmolytisk streptokok, hvor det forventede negative resultat observeres, hvilket tyder på at der stadig er podet med for meget kolonimateriale. Det var intensionen at gentage fortyndingsrækken med en lavere McFarland og dernæst pode Contrast MRSA broth, men desværre var Contrast MRSA broth mediet udløbet og de opnåede resultater ville ikke være pålidelige. 3.6 Forsøgsdesignet Alle 96 stammer og 2 kontroller blev behandlet som værende MRSA mistænkte. Derfor blev alle 98 stammer udsået på afdelingens nuværende anvendte chromogene plade, ChromID MRSA, med en øjepodenål, og samtidig blev en koloni podet i opformeringsmediet Contrast MRSA broth med en vatpind. Contrast MRSA broth blev inkuberet i 18-24 timer ved 37 ⁰C, hvorefter prøverne blev aflæst. Positive prøver blev udsået på Brilliance MRSA 2 Agar fra Oxoid, som en konfirmatorisk test. Negative prøver blev noteret. Brilliance MRSA 2 Agar pladerne blev inkuberet i 18-24 timer ved 37 ⁰C, hvorefter positive og negative resultater blev noteret. ChromID MRSA pladerne blev inkuberet i 18-24 timer, hvorefter første aflæsning blev foretaget. Positive prøver blev noteret og negative prøver blev inkuberet i yderligere et døgn. Anden aflæsning 3 Tallene svarer til bakterienummeret fra resultatskemaet i bilag 2. Side 20 af 61

blev foretaget efter 18-24 timer, hvorefter de positive prøver blev noteret og negative prøver blev bekræftet. Oxoid anbefaler, at man inkuberer Contrast MRSA broth i 18 til 24 timer. Derfor blev det valgt at inkubere prøverne i forskellig tidsperioder. Prøve nummer 1 til 30 blev inkuberet i 18 til 20 timer, prøve nummer 31 til 60 blev inkuberet i 20 til 22 timer og prøve nummer 61 til 102 blev inkuberet i 22 til 24 timer. 3.6.1 Forsøgsopstilling for det primære projekt Figur 2 1. Alle bakterier blev udsået på 5 % blodplader. 2. Fra blodpladerne blev der lavet en Staphaurex test, resistensbestemmelse og en ny isolering. 3. Fra den nye isolering blev en koloni podet i Contrast MRSA broth med en vatpind og en koloni udsået på ChromID MRSA pladen med en øjepodenål. 4. Positive Contrast MRSA broth prøver blev konfirmeret på Brilliance MRSA 2 Agar pladen og negative ChromID MRSA plader blev inkuberet endnu et døgn. Side 21 af 61

3.6.2 Forsøgsopstilling for ChromID MRSA Figur 3: ChromID MRSA pladen blev udsået med kolonimateriale fra 5 % blodpladen med en øjepodenål. Billede af ChromID MRSA plade med beskrivelse af positivt resultat: Figur 4: Ved et positivt resultat observeres grønne kolonier på ChromID MRSA pladen fra Biomerieux.

3.6.3 Forsøgsopstilling for Contrast MRSA broth (25) Figur 5 1. Contrast MRSA broth blev podet med en vatpind. 2. Vatpinden snurres rundt et par gange nede i bouillonen og afdryppes på indersiden af glasset inden den fjernes fra mediet. 3. Den podede bouillon inkuberes i 18-24 timer ved 37 ⁰C. 4. Positive prøver blev konfirmeret ved at udså 1 µl af bouillonen på den chromogene plade fra Oxoid, Brilliance MRSA 2 Agar. Pladen aflæses efter et døgns inkubation ved 37 ⁰C.

Billede af Contrast MRSA broth med beskrivelse af de forskellige farveændringer: Figur 6: Eksempler på positive og negative resultater ved Contrast MRSA broth: 1: gul +, 2: gul +, 3: orange +, 4: mørke orange +, 5: rød 0 Billede af Brilliance MRSA 2 Agar plade med beskrivelse af positivt resultat: Figur 7: Ved et positivt resultat observeres blå kolonier på Brilliance MRSA 2 Agar pladen fra Oxoid.

4.0 Resultater Målet med projektet var at kunne detektere negative prøver hurtigt og sikkert, derfor er resultaterne evalueret i forhold til sandt negative resultater ved de tre forskellige medier. Desuden blev de falsk positive resultater vurderet, da man på Klinisk Mikrobiologisk afdeling på Rigshospitalet har erfarede at Enterococcus species kan resultere i falsk positive resultater på ChromID MRSA pladen. Derfor sammenlignes resultaterne for de analyserede non S. aureus prøver. Resultaterne for fortyndingsrækken og resultaterne for BORSA-stammerne vil også blive vurderet. Resultaterne fra Brilliance MRSA 2 Agar er taget med som separate resultater, da det kunne være interessant at vurdere dette medies egenskaber i forhold til identifikationen af MRSA. Følgende stammer blev analyseret: 38 MRSA, 29 MSSA, 8 BORSA, 3 MRSA positive podepinde, 6 MRSA negative podepinde og 12 non S. aureus, herunder E. faecalis, E. faecium, E. coli, S. epidermidis, Non hæmolytisk streptokok samt S. sciuri. Det blev til 41 MRSA positive prøver og 55 MRSA negative prøver, i alt 96 prøver. 4.1 Graf over resultaterne Graf 1: samlede resultater: 50 45 40 35 Antal prøver 30 25 20 15 Contrast MRSA broth ChromID Brilliance MRSA 2 Agar 10 5 0 Sand positiv Sand negativ Falsk positiv Falsk negativ Graf 1 giver et overblik over resultaterne. Sand positive resultater svarer til alle de testede MRSA positive prøver, der blev positive som forventet. Sand negative resultater svarer til alle de testede MRSA negative prøver, der blev negative som forventet. Falsk positive resultater svarer til alle de

testede MRSA negative prøver, der mod forventning blev positive. Falsk negative prøver svarer til alle de testede MRSA positive prøver, der mod forventning blev negative. 4.2 Sensitivitet og specificitet Tabel 6: Sensitivitet og specificitet for Contrast MRSA broth analysen: Contrast MRSA broth Sande positive Sande negative Prøver i alt resultater resultater Diagnostisk positive 41 (sand positiv) 44 (falsk positiv) 85 resultater Diagnostisk negative 0 (falsk negativ) 11 (sand negativ) 11 resultater Prøver i alt 41 55 96 Sensitivitet: Specificitet: Tabel 7: Sensitivitet og specificitet for ChromID MRSA testen: ChromID MRSA Sande positive Sande negative Prøver i alt resultater resultater Diagnostisk positive 41 (sand positiv) 20 (falsk positiv) 61 resultater Diagnostisk negative 0 (falsk negativ) 35 (sand negativ) 35 resultater Prøver i alt 41 55 96 Sensitivitet: Specificitet: Side 26 af 61

Tabel 8: Sensitivitet og specificitet for Brilliance MRSA 2 Agar testen: Brilliance MRSA 2 Sande positive Sande negative Prøver i alt Agar resultater resultater Diagnostisk positive 41 (sand positiv) 14 (falsk positiv) 55 resultater Diagnostisk negative 0 (falsk negativ) 30 (sand negativ) 30 resultater Prøver i alt 41 44 85* * Der blev kun udsået på 85 Brilliance MRSA 2 Agar plader, da testen blev brugt som konfirmatorisk test for positive resultater observeret ved Contrast MRSA broth og er dermed ikke brugt på de 11 negative prøver. Sensitivitet: Specificitet: 30 30 14 4.3 Sand negative resultater og falsk positive resultater Da en stor del af projektet gik ud på at kunne finde negative prøver og få patienten hurtigt ud af isolation, var det relevant at kigge på de sandt negative resultater og falsk positive resultater for alle tre medier: Contrast MRSA broth, ChromID MRSA og Brilliance MRSA 2 Agar. Tabel 9: Sand negative resultater for Contrast MRSA broth testen: For Contrast MRSA broth testen blev 11 prøver ud af 55 negative prøver detekteret som værende sand negative, hvilket svarer til 20 % af de MRSA negative prøver. De negative MRSA bakterie isolater, der ikke blev påvist med Contrast MRSA broth testen var MSSA-stammerne, S. sciuri, BORSAstammerne, S. epidermidis og E. faecalis. Det vil sige at 44 prøver ud af 55 MRSA negative prøver, blev testet falsk positive, hvilket svarer til 80 % af de MRSA negative prøver. Side 27 af 61

Bakterie Contrast MRSA nr. broth 1. døgn 73 4 Negativ rød 76 Negativ rød 88 Negativ rød 90 Negativ rød 91 Negativ rød 94 Negativ rød Bakterie isolat Bakterie nr. Contrast MRSA broth 1. døgn Non 98 Negativ hæmolytisk Rød streptokok (Dermabacter hominis) E. faecium 99 Negativ Rød E. coli 100 Negativ Rød E. coli 101 Negativ Rød E. faecium 102 Negativ Rød MRSA negativ Bakterie isolat MRSA negativ MRSA negativ MRSA negativ MRSA negativ MRSA negativ Tabel 10: Falsk positive resultater for ChromID MRSA For ChromID MRSA pladen blev der detekteret 35 prøver ud af 55 negative prøver som værende sand negative, hvilket svarer til 63,6 % af de MRSA negative prøver. Der blev derfor detekteret 20 falsk positive resultater med ChromID MRSA testen, det vil sige 36,3 % af de MRSA negative prøver. Bakterie nr. Bakterie isolat Bakterie nr. Bakterie isolat Bakterie nr. Bakterie isolat 4 5 MSSA 1G 41 MSSA 5B 72 BORSA 8A 9 MSSA 4E 51 MSSA 3C 77 E. faecalis 17 MSSA 1A 52 MSSA 3H 86 BORSA 86 18 MSSA 1B 53 MSSA 3I 87 BORSA 8B 19 MSSA 1C 54 MSSA 4C 89 BORSA 8F 36 MSSA 2G 56 MSSA 4I 100 Podepind 38 MSSA 3F 57 MSSA 5C 4 Tallene svarer til bakterienummeret fra resultatskemaet i bilag 2. 5 Tallene svarer til bakterienummeret fra resultatskemaet i bilag 2 Side 28 af 61

Tabel 11: Falsk positive resultater for Brilliance MRSA 2 Agar For Brilliance MRSA 2 Agar pladen blev 30 prøver ud af 44 MRSA negative prøver sandt negative, det vil sige at 68,2 % af de MRSA negative prøver blev detekteret. Der blev derfor detekteret 14 falsk positive resultater med Brilliance MRSA 2 Agar, det vil sige 31,8 % af de MRSA negative prøver. Bakterie nr. Bakterieisolat Bakterie nr. Bakterieisolat 8 6 MSSA 3E 70 BORSA 8C 9 MSSA 4E 71 BORSA 8G 20 MSSA 2A 72 BORSA 8A 34 MSSA 1H 85 BORSA 8D 38 MSSA 38 86 BORSA 8H 51 MSSA 3C 87 BORSA 8B 57 MSSA 5C 89 BORSA 8F Ved Brilliance MRSA 2 Agar var det kun 44 MRSA negative prøver, som blev testet, da Brilliance MRSA 2 Agar blev brugt som en konfirmatorisk test. Derfor blev testen ikke udført på de 11 prøver, som blev detekteret negative i Contrast MRSA broth testen. Disse 11 prøver blev også detekteret negative på ChromID MRSA pladen. 4.4 Fortyndingsrække Til udførelse af Contrast MRSA broth testen skal man bruge podepinde. Da det ikke var muligt at skaffe 100 podepinde til forsøget, blev der brugt kolonimateriale fra de opsamlede bakterier. For at retfærdiggøre at der ikke var for meget materiale i en koloni i forhold til bakterie materialet på en podepind, blev det valgt at lave en 2-foldsfortyndingsrække med de to ATCC-stammer; MRSA ATCC 33591 og MSSA ATCC 29213. Tabel 12: Resultatskema for 2-foldsfortyndingsrækkeforsøget: Som forventet blev der observeret positive resultater ved alle fortyndingerne med MRSA ATCC 33591. Hvorimod ved MSSA ATCC 29213 observeres der kun et positive resultat, nemlig ved fortynding nummer et, som havde en McFarland på 1,0. For resten af fortyndingerne blev der kun observeret negative resultater, hvilket viser at prøven er sand negativ. 6 Tallene svarer til bakterienummeret fra resultatskemaet i bilag 2 Side 29 af 61

Nr. Contrast MRSA broth podet med MRSA ATCC 33591 1 Positiv 2 Positiv 3 Positiv 4 Positiv 5 Positiv 6 Positiv 7 Positiv 8 Positiv Blodplade med MRSA 1µl CFU/ml Blodplade med MRSA 100µl CFU/ml Contrast MRSA broth podet med MSSA ATCC 29213 300 x 10 6 For tæt Positiv Mørke orange 150 x 10 6 For tæt Negativ Rød 75 x 10 6 For tæt Negativ Rød 375 x 10 5 For tæt Negativ Rød 188 x 10 5 For tæt Negativ Rød 94 x 10 5 For tæt Negativ Rød 47 x 10 5 For tæt Negativ Rød 23 x 10 5 For tæt Negativ Rød Blodplade med MSSA 1µl CFU/ml Blodplade med MSSA 100µl CFU/ml 300 x 10 6 For tæt 150 x 10 6 For tæt 75 x 10 6 For tæt 375 x 10 5 For tæt 188 x 10 5 For tæt 94 x 10 5 For tæt 47 x 10 5 For tæt 23 x 10 5 For tæt 4.5 BORSA resultater Borderliner Oxacillin Resistent Staphylococcus aureus (BORSA) er udover at være resistent overfor Cefoxitin30µg og Colistin150µg, ligeledes resistent overfor Oxacilin1µg. Derfor blev det valgt at påføre en Oxacilin1µg-tablet på BORSA-stammernes resistensplade. Ved BORSA-stammerne skal Oxacilin1µg zonestørrelsen være 15 mm for at være resistent (26,13). Tabel 16 viser at nogle af de testede BORSA-stammer giver en zonestørrelse over 15 mm og er dermed følsom overfor Oxacilin1µg. Det blev valgt at bruge alle 8 BORSA-stammer til projektet trods uoverensstemmelser i følsomheden. Tabel 13: Samlede resultater for BORSA-stammerne: Tabellen giver et samlet overblik over resultaterne for de testede BORSA-stammer. Alle 8 stammer er blevet testet positive i Contrast MRSA broth. Af de 8 stammer var der kun én (nr. 74), som blev Side 30 af 61

detekteret negativ ved Brilliance MRSA 2 Agar pladen. Ved ChromID MRSA var der fire af de otte BORSA-stammer som blev detekteret negative; nr. 70, nr. 71, nr. 74 og nr. 85. Der var fire af stammerne, der viste sig at være resistent overfor Oxacillin1µg; nr. 70, nr. 71, nr. 72 og nr. 87. Der blev udført PCR analyse på fire af BORSA-stammerne, de fire stammer, der var blevet detekteret positive ved ChromID MRSA testen. Alle fire stammer viste sig ikke at indeholde meca genet og var dermed MRSA negative. Plade Contrast -nr. MRSA broth 1. døgn 70 7 Positiv 71 Positiv 72 Positiv 74 Positiv 85 Positiv 86 Positiv 87 Positiv 89 Positiv Konfirmatorisk 1. døgn ChromID 1. døgn ChromID 2. døgn Oxacilli n PCR resultat Brilliance MRSA 2 Agar 1µg Zonestørrelse Følsomhed ++ Ingen vækst Ingen vækst 15 0 (3 hvide kolonier) + Ingen vækst Ingen vækst 15 0 +++ +++ 14 0 meca negativ Ingen vækst Ingen vækst Ingen vækst. 21 3 Grønfarvet agar, mik: kokker i hobe + Ingen vækst Ingen vækst 22 3 +++ +++ 17 3 meca negativ +++ +++ 15 0 meca negativ +++ +++ 20 3 meca negativ 7 Tallene svarer til bakterienummeret fra resultatskemaet i bilag 2. Side 31 af 61

5.0 Diskussion 5.1 Diskussion af resultater I dette afsnit vil de opnåede resultater blive sammenholdt med relevant litteratur og de resultater som Oxoid har offentliggjort for Contrast MRSA broth. Diskussionsafsnittet er opdelt efter punkterne i problemformuleringen tilsvarende opdelingen af resultatafsnittet. 5.1.1 Sensitivitet og specificitet for Contrast MRSA broth Ved brug af kolonimateriale fra 5 % blodplader podet i Contrast MRSA broth blev der vist en meget høj sensitivitet (100 %), da der ingen falske negative resultater blev observeret. Derimod er specificiteten for Contrast MRSA broth testen kun på 20 %, hvilket skyldes de mange falsk positive resultater. Contrast MRSA broth testen er ikke specifik overfor MRSA positive prøver og mediet kan ikke detektere ikke-mrsa stammer til at være negative. I artiklen Contrast MRSA broth (Oxoid) as a screening tool for MRSA colonization af Schäfer, P. et al. (27) har de analyseret 100 podepinde ved brug af Contrast MRSA broth testen. Schäfer, P. et al. har for Contrast MRSA broth testen opnået en sensitivitet på 100 % og en specificitet på 87 %. Sammenlignet med sensitiviteten og specificiteten opnået i dette projekt, ses det at sensitiviteten for Contrast MRSA broth i begge forsøg er på 100 %. Den opnåede specificitet er derimod meget forskellig. Schäfer, P. et al. fik en specificitet på 87 %, hvorimod i dette projekt blev der bestemt en specificitet på 20 %. Den store forskel kan skyldes forskel i prøvematerialet. Da der i dette projekt blev brugt kolonimateriale direkte fra blodpladen, har inoculumet i bouillonen muligvis været alt for høj. Denne påstand blev yderligere bekræftet, da resultaterne opnået ved fortyndingsrækkeforsøget blev undersøgt. Fortyndingsrækkeforsøget viste, at alle glassene podet med MRSA ATCC 33591 giver det forventede positive resultat. Og at der i glassene podet med MSSA ATCC 29213 opnås negative resultater (Tabel 12). Da der kun har været opnået falsk positive resultater for MSSA i det primære forsøg i dette projekt, kan man undres over at resultaterne for fortyndingsrækkeforsøget blev detekteret negative. Disse observationer indikerer, at der højst sandsynligt er en øvre grænse for mængden af bakterie materiale af non S. aureus til podning af Contrast MRSA broth for at undgå falsk positive resultater. Til sammenligning har Oxoid selv testet Contrast MRSA broth. I artiklen Evaluation of Oxoid Contrast MRSA broth af Crabtree, D. (28) blev der analyseret 99 MRSA positive prøver og 97 MRSA negative prøver samt 119 podepinde. Kolonimateriale fra blodplader med henholdsvis et inoculum på 10 7 CFU/ml og et inoculum svarende til, hvad der ca. er på en podepind, på 10 2 til 10 3 CFU/ml blev podet i Contrast MRSA broth. De 119 podepinde blev opslæmmet i 1 ml saltvand hvoraf 250 µl af suspensionen blev brugt til at pode Contrast MRSA broth. Ved inoculum 10 2 til 10 3 CFU/ml Side 32 af 61