Niveau: Udskrevet er dokumentet ikke dokumentstyret. Øvrigt NOAC (New Oral AntiCoagulantia) 3.14.2.1

Sygehus Lillebælt - Kl. Immunologi og Biokemi, VGS - 8 ANALYSEMETODER OG UDSTYR - 8. 3 Validering, afprøvning og ibrugtagning - 8. 3.14 N Kl. Immunologi og Biokemi, VGS Niveau: Udskrevet er dokumentet ikke dokumentstyret. Øvrigt NOAC (New Oral AntiCoagulantia) Dokumentbrugere: SLB/KIBA Læseadgang: KIBA Forfatter: REM2KI Dokumentansvarlig: DokumentID / Dokumentnr. Version: SLB/Biokemi/Vej/Specled 314398 / A. 8. 1.3 3.14.2.1 Godkendt af: S5USTE 06.01.2014 1) Analysefakta 2) Status på rapport 3) Rapport 3. 1) Problemformulering 3. 2) Udførelse 3. 3) Analysens kliniske anvendelse 3. 4) Krav 3. 4.a) Kvalitetskrav 3. 4.b) Serviceniveau 3. 5) Beskrivelse af analysemetoden 3. 6) Referenceinterval 4) Valideringsparametre 4. 1) Metrologisk sporbarhed 4. 1.a) Leverandørens oplysninger 4. 1.b) Egne undersøgelser 4. 1.c) Konklusion 4. 2) Pålidelighed til klinisk anvendelse 4. 2.1) Korrekthed 4. 2.1.a) Leverandørens oplysninger 4. 2.1.b) Egne undersøgelser 4. 2.1.c) Konklusion 4. 2.2) Ekstern kontrol 4. 2.2.a) Beskrivelse af programmet 4. 2.2.b) Egne undersøgelser 4. 2.2.c) Konklusion 4. 2.3) Metodesammenligning 4. 2.3.a) Leverandørens oplysninger 4. 2.3.b) Egne undersøgelser 4. 2.3.c) Konklusion 4. 3) Intermediær præcision 4. 3.a) Leverandørens oplysninger 4. 3.b) Egne undersøgelser 4. 3.c) Konklusion 4. 4) Måleusikkerhedsbudget 4. 4.a) Leverandørens oplysninger 4. 4.b) Egne undersøgelser 4. 4.c) Konklusion 4. 5) Detektionsgrænse / kvantificeringsgrænse 4. 5.a) Leverandørens oplysninger 4. 5.b) Egne undersøgelser 4. 5.c) Konklusion 4. 6) Linearitet 4. 6.a) Leverandørens oplysninger 4. 6.b) Egne undersøgelser 4. 6.c) Konklusion 4. 7) Måleinterval 4. 7.a) Leverandørens oplysninger 4. 7.b) Egne undersøgelser 4. 7.c) Konklusion 4. 8) Referenceinterval 4. 8.a) Leverandørens oplysninger Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 1 af 21

4. 8.b) Egne undersøgelser 4. 8.c) Konklusion 4. 9) Analytisk specificitet / interferens 4. 9.a) Leverandørens oplysninger 4. 9.b) Egne undersøgelser 4. 9.c) Konklusion 4.10) Afsmitning 4.10.a) Leverandørens oplysninger 4.10.b) Egne undersøgelser 4.10.c) Konklusion 4.11) Robusthed 4.11.a) Leverandørens oplysninger 4.11.b) Egne undersøgelser 4.11.c) Konklusion 4.12) Præanalytiske forhold 4.12.a) Leverandørens oplysninger 4.12.b) Egne undersøgelser 4.12.c) Konklusion 4.13) Vurdering af praktiske forhold 5) Konklusion 6) Referencer 1) Analysefakta IUPAC navn(e) Heparin,lav molmasse (anti-xa) enhed 10 3 NPU nr IU/l 28301 IUPAC navn(e) p-rivaroxaban enhed µg/l NPU nr 28689 IUPAC navn(e) p-koagulation trombin-induceret; tid ( 1 del pt + 2 dele n-pool) enhed sek. NPU nr 29358 Apparatur/leverandør STAR Reagenser/leverandør Stago Udførselssted Vejle/ Kolding Ansvarlig for validering Bjarne Falk Rangård, Tina Parkner Protokol sendt til godkendelse hos Ivan Brandslund, Jonna Skov Madsen dato 11/11-2013 2) Status på rapport Validering afsluttet Valideringsdata godkendt af Rapport sendt til godkendelse hos dato dato dato 3) Rapport 3. 1) Problemformulering De nye NOAC (New Oral Anticoagulants) medikamenter har skabt et nyt og specifik behov for koagulationsanalyserne: for dabigatran (Pradaxa ) fortyndet trombintid og for rivaraoxaban (Xarelto ) anti-faktor Xa, da der ved overdosering/overskridelse af toksisk grænse hos den enkelte patient kan forekomme alvorlig blødningskomplikation. De to nye koagulationsanalyser vil kunne bidrage til en vurdering af, om en sådan potentiel tilstand skønnes at være tilstede. 3. 2) Udførelse Anti-Faktor Xa analysen udføres som angivet af leverandøren. Der udføres kalibrering med såvel Fragmin som Rivaroxaban som kalibratorer for at vurdere om der kan anvendes en fælles kalibreringskurve for alle direkte Faktor-Xa inhibitorer med svar IU/l. Ved andre medikamenter Apixaban (Eliquis) vil dette blive gentaget. Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 2 af 21

På grund af meget stor følsomhed overfor Dabigatran mht trombintid udføres denne i en opsætning, hvor patientplasma fortyndes 1+2 med normal pool. Kalibrering foretages i såvel Vejle som Kolding for at vurdere bias mellem de udførende laboratorier/udstyr. Der indsamles blodprøver fra patienter i behandling med: Fragmin, Xarelto og Pradaxa for at vurdere specificiteten af de anvendte analyser, samt analysernes kliniske anvendeliged i valgte opsætning. 3. 3) Analysens kliniske anvendelse Vurdering af toksicitet hos patient i behandling med et af de NOAC medikamenter, primært dabigatran og rivaroxaban, bilag 1 3. 4) Krav Underpunkter udfyldes 3. 4.a) Kvalitetskrav Der tilstræbes udelukkende en vurdering af om recipienten er overdoseret med den indgivne koagulationsinhibitor. Det er ikke meningen at vurdere compliance med hensyn til behandlingen. 1) Dabigatran: a) Krav til bias: Ud fra egne tilfældige målinger på 11 patienter i dabigatran behandling skønnes reference intervallet at være 22-149 sek., mens toksiske niveau er sat til 200 sek.: Tages udgangspunkt i det terapeutisk niveau med fortyndet trombintid på 22-149 sek. Referenceområdet 22-149 sek. svarer til 4 x SD på populationen, dvs. 1 SD = (149-22) : 4 = 32 sek. Standardkravet til bias er max. ½ af SD på populationen, dvs. Max. 32 :2 = 16 sek. Regnes dette i procent af den øvre ref. grænse bliver bias kravet på Max. 16 : 149 = 10,7 % ca. 10% Dvs. på den øverste ref. grænse på 149 kan det sande tal være ± 10% af 149 dvs. ca. 15 sek. uden forskellen er signifikant. b) Krav til CV: Vi vil kunne skelne mellem 149 sek. og 200 sek., dvs. fald fra 200 til 149?: Mean 200 - mean 149 > 1,96 x kvadr2 x SDkrav 51 > 2,8 x SDkrav SDkrav < 18 sek. CVkrav = SDkrav : diff.mean CVkrav = 18 : 174,5 CVkrav = 10,3 % ca. 10% MEN, da vi ud fra egne patient målinger finder CVanal på 4%, sætter vi den til 6% 1) Rivaroxaban: Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 3 af 21

a) Krav til bias: Ud fra egne tilfældige målinger på 6 patienter i rivaroxaban behandling skønnes reference intervallet at være 58-211 µg/l, mens toksiske niveau er sat til 400 µg/l: Tages udgangspunkt i det terapeutisk niveau med fortyndet trombintid på 58-211 µg/l. Referenceområdet 58-211 ng/ml svarer til 4 x SD på populationen, dvs. 1 SD = (211-58) : 4 = 38 µg/l. Standardkravet til bias er max. ½ af SD på populationen, dvs. Max. 38 :2 = 19 µg/l. Regnes dette i procent af den øvre ref. grænse bliver bias kravet på Max. 19 : 211 = 9,1 % 9% Dvs. på den øverste ref. grænse på 211 kan det sande tal være ± 9% af 211 dvs. ca. 19 µg/l uden forskellen er signifikant. b) Krav til CV: Vi vil kunne skelne mellem 211 µg/l og 400 µg/l, dvs. fald fra 400 til 211?: Mean 400 - mean 211 > 1,96 x kvadr2 x SDkrav 189 > 2,8 x SDkrav SDkrav < 67,5 µg/l CVkrav = SDkrav : diff.mean CVkrav = 67,5 : 305,5 CVkrav = 22,1 % ca. 22% MEN, da vi ud fra egne patient målinger finder CVanal på 3%, sætter vi den til 6% Analytisk CV < 6 % anses derfor tilfredsstillende i den kritiske del af måleområdet Der skal være et sikkert dosis respons for de 2 analyser til at kunne vurdere risiko for overdosering. Se endvidere den kliniske vurdering af analyseresultaterne. 3. 4.b) Serviceniveau Det skal være muligt også i vagten at udføre analyserne med henblik på at give de kliniske afdelinger en mulighed for at vurdere om recipienten er overdoseret med NOAC 3. 5) Beskrivelse af analysemetoden Der anvendes 2 forskellige måleprincipper, afhængig af hvilken koagulationsfaktor det pågældende antikoagulans er direkte rette imod. En fortyndet trombintid anvendes til direkte trombininhibitorer, som for eksempel Pradaxa (Dabigatran) En kromogen faktor Xa aktivitetsmåling anvendes til Direkte faktor Xa inhibitorer som for eksempel Xarelto (Rivaroxaban) Fortyndet trombintid: Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 4 af 21

Ved tilstedeværelse af en standardiseret mængde trombin vil et normalt plasma koagulere indenfor et bestemt tidsrum. Er der tilstedeværelse af en trombin inhibitor vil koagulationstiden blive forlænget. Da trombintid er ekstremt følsomt overfor tilstedeværelse af Dabigatran fortyndes patientplasma 1 + 2 med normal plasma uden tilstedeværelse af dabigatran. Herved vil koagulationstiden være indenfor et rimeligt måleområde ved koncentration af Dabigatran i terapeutiske doser. Faktor Xa aktivitetsmåling, kromogen metode. Hovedfunktionen for Fakktor Xa er at spalte sit naturlige substrat protrombin til trombin. Alternativ reaktion er spaltningen af et specifikt kromogent substrat under frigørelse af paranitroanalin. Koncentrationen af paranitroanalin måles som OD ved 405 nm. Ved tilsætning af faktor Xa til plasma/substrat blandingen sker 2 reaktioner: 1 Substratet spaltes af faktor Xa, dannelse af paranitroanalin 2 Faktor Xa hæmmes af tilstedeværelse af inhibitorer, for eksempel Rivaroxaban Efter en given tid vil der opnås ligevægt mellem disse reaktioner. Koncentrationen af paranitroanalin er omvendt proportional med koncentrationen af faktor Xa inhibitor. 3. 6) Referenceinterval Patientprøver fra patienter der ikke er i behandling med pågældende medikamenter og som har normale aptt værdier undersøges for alle 3 analyser. 4) Valideringsparametre Underpunkter udfyldes 4. 1) Metrologisk sporbarhed Ingen oplysninger 4. 1.a) Leverandørens oplysninger 4. 1.b) Egne undersøgelser 4. 1.c) Konklusion 4. 2) Pålidelighed til klinisk anvendelse Det undersøges for analyserne p-rivaroxaban enhed µg/l og p-koagulation trombin-induceret; tid ( 1 del pt + 2 dele n-pool) enhed sek. Om der er et rimeligt dosis/respons for det pågælden medikament, ved hjælp af dosis respons kurver og ex vivo målinger på patienter i behandling. Patienter i behandling med Dabigatran undersøges for påvirkning af anti-faktor Xa målinger og standard koagulations målinger (aptt,kfnt.kftt) Patienter i behandling med Rivaroxaban undersøges for påvirkning af fortyndet trombintid og standard koagulations målinger (aptt,kfnt.kftt) 4. 2.1) Korrekthed Underpunkter udfyldes Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 5 af 21

4. 2.1.a) Leverandørens oplysninger 4. 2.1.b) Egne undersøgelser Dosis response Dabigatran. Fortyndet trombintid er målt for 2 koncentrationer af Dabigatran i såvel Vejle som Kolding Den ene koncentration 470 µg/l er lige over toksisk niveau Den anden koncentration 240 µg/l er ca. det halve af toksisk niveau. Resultater se Bilag 2 Patienter i behandling med Dabigatran er undersøgt i de valgte koagulationsundersøgelser. Der er opnået følgende resultater Desværre kender vi ikke tidsrum fra medicin indtag til prøvetagning. Fragmin Xarelto APTT KFNT KFTT Fort. Trombin anti-xa anti-xa Prøvenr: Dosis: (sek) (arb/l) (INR) (sek) IU/ml ng/ml 1/10 2013 1150 mg x 2 69,6 0,76 1,10 148,5 0,10 25,00 1/10 2013 2150 mg x 2 52,5 0,72 1,13 105,4 0,10 25,00 1/10 2013 3150 mg x 2 45,5 0,86 1,04 94,9 0,10 25,00 1/10 2013 4150 mg x 2 58,2 0,82 1,07 85,2 0,10 25,00 1/10 2013 5150 mg x 2 40,8 0,74 1,12 22,4 0,10 25,00 1/10 2013 6150 mg x 2 51,5 0,71 1,14 58,9 0,10 25,00 1/10 2013 7150 mg x 2 35,8 0,88 1,03 23,5 0,10 25,00 1/10 2013 8150 mg x 2 59,9 0,73 1,12 115,0 0,10 25,00 1/10 2013 9150 mg x 2 34,8 0,94 1,00 43,9 0,10 25,00 1/10 2013 10150 mg x 2 56,9 0,79 1,08 109,5 0,10 25,00 1/10 2013 11150 mg x 2 54,5 0,71 1,14 57,9 0,10 25,00 Ingen af de behandlede patienter giver anti-faktor Xa målinger over detektionsgrænsen (0,10 IU/ml eller 25 ng/ml rivaroxaban ) Hverken KFNT eller KFTT giver et dosis response. Der er sammenhæng mellem aptt og fortyndet trombintid Se bilag 2 Dosis response Rivaroxaban og Fragmin. Kalibrering af anti-xa analysen for såvel Rivaroxaban som Fragmin viser indledningsvis,at det ikke er muligt at anvende fælles kalibrering / enhed. Der måles derfor dosis response kurve specifikt for Rivaroxaban, se Bilag 2 Kalibrator over toksisk niveau på 400 µg/l er angivet til 457 µg/l. I Vejle måles en middelværdi på 445 µg/l og i Kolding på 448 µg/l. Afvigelse mellem laboratorier på < 1%. Bias Vejle ca. 2,6% og Kolding ca. 2% i forhold til den af leverandøren angivne kalibratorværdi. Patienter i behandling med Rivaroxaban APTT KFNT KFTT anti-xa anti-xa Fort. Trombin Fort. Trombin nummer Dosis: (sek) (arb/l) (INR) OD/min µg/l (ng/ml) (sek) 110 mg x 1,5 31,3 0,85 1,02 1,362 0,94 13,00 18,6 215 mg x 1 43,5 0,65 1,16 0,413 210,84 13,00 16,2 315 mg x1 35,3 0,93 0,98 0,956 63,20 13,00 15,2 415 mg x 1 32,2 0,77 1,07 0,972 60,28 13,00 15,1 515 mg x 2 47,2 0,93 0,98 0,456 193,41 13,00 13,2 Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 6 af 21

620 mg x 1 45,0 0,71 1,11 0,986 57,76 13,00 14,1 715 mg x 1 54,4 0,610 1,20 0,228 315,34 13,00 18,7 815 mg x 1 69,0 0,830 1,02 0,678 123,64 13,00 19,6 915 mg x 1 35,3 0,980 0,95 1,264 14,07 13,00 17,8 1020 mg x 1 54,6 0,450 1,43 0,128 416,89 13,00 18,1 Der er ingen påvirkning af KFNT,KFTT og Fortyndet trombintid. Vi har en enkelt patient som har fået målt en værdi i toksisk niveau, og en på 75% af toksisk niveau. vi har ikke kendskab til hvor meget tid der er gået fra sidste indtag af medicin og prøvetagning. Der er kun marginal påvirkning af INR i toksisk niveau. 4. 2.1.c) Konklusion Dabigatran: Det er muligt at måle sikkert op til over toksisk niveau. Variation mellem Kolding og Vejle er mellem 3 og 4 % Patienter i Dabigatran behandling påvirker ikke måling af anti-faktor Xa, hvilket heller ikke er forventet, da Dabigatran er en specifik trombin inhbitor Forlænget aptt bør medføre mistanke om at patienten kan være i Dabigatran behandling. Rivaroxaban: Der skal anvendes specifik Rivaroxaban kalibrering Der er minimal afvigelse mellem Kolding og Vejle og Bias i toksisk område < 3-4 % Patienter i behandling med Rivaroxaban påvirker ikke måling af KFNT,KFTT og fortyndet trombintid. 4. 2.2) Ekstern kontrol Ikke undersøgt 4. 2.2.a) Beskrivelse af programmet 4. 2.2.b) Egne undersøgelser 4. 2.2.c) Konklusion 4. 2.3) Metodesammenligning Ikke foretaget 4. 2.3.a) Leverandørens oplysninger 4. 2.3.b) Egne undersøgelser 4. 2.3.c) Konklusion 4. 3) Intermediær præcision Underpunkter udfyldes 4. 3.a) Leverandørens oplysninger 4. 3.b) Egne undersøgelser Såvel Interseriel som Intraseriel præcisions målinger udføres Vejle resultater Rivaroxaban Kolding resultater Rivaroxaban Interassay 244 ng/ml Interassay 457 ng/ml Kolding resultater dato OD/min µg/l dato OD/min µg/l Enhed 244 µg/l 457 µg/l Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 7 af 21

middel 0,3117 260,4middel 0,1129 438,9middel 245,047 448,539 1s 0,008 4,381s 0,002 4,0671s 8,71 4,76 CV 2,6 1,7CV 2,3 0,9CV% 3,6 1,1 Vejle resultater Dabigatran Interassay 240 µg/l Interassay 470 µg/l sek sek middel 149,7middel 223,7 1s 3,71s 7,1 CV 2,5CV 3,2 Variationskoeficient Intraseriel for Kolding og Vejle Rivaroxaban 244 µg/l 457 µg/l Dabigatran (sek) 240 µg/l 470 µg/l middel 254 443middel 153,8 228,4 1s 11,0 11,21s 6,6 9,7 CV 4,3 2,5CV 4,3 4,2 4. 3.c) Konklusion Variationskoefficienterne er i alle de målte situationer under det krævede 6 % 4. 4) Måleusikkerhedsbudget Ikke relevant i forhold til kliniske anvendelse 4. 4.a) Leverandørens oplysninger 4. 4.b) Egne undersøgelser 4. 4.c) Konklusion 4. 5) Detektionsgrænse / kvantificeringsgrænse For hver analyse måles på patienter som ikke er i behandling, for at fastlægge relevant detektionsgrænse Der er foretaget målinger på en række patienter hvor der er rekvireret aptt og hvor det ikke formodes, at patienterne er i behandling. Målinger på "normale" aptt patienter, uden behandling med Dabigatran og med normal KFNT/KFTT PMBNR: KFNT INR APTT fort. Trombin (sek) sek µg/l 101350993450 1,25 0,86 31,6 16,3 13,00 101351073567 0,59 1,22 31,5 15,5 13,00 101351073354 0,89 1,00 32,5 15,6 13,00 101351033697 0,87 1,03 26,3 16,1 13,00 101351068113 0,94 0,97 33,9 16,2 13,00 101353178870 1,06 0,93 34,1 15,5 13,00 101351067745 0,96 0,96 34,5 16,2 13,00 101351059963 1,06 0,92 35,2 16,3 13,00 101351034480 1,18 0,88 31,1 16,4 13,00 101351060716 1,07 0,92 32,5 15,7 13,00 101351058177 0,83 1,03 31,6 16,1 13,00 101351057146 0,99 0,95 30,5 16,0 13,00 101351058991 0,89 0,99 30,9 16,4 13,00 101351001981 1,04 0,93 31,4 16,0 13,00 101351035843 0,89 0,99 34,3 16,5 13,00 101350989231 0,78 1,06 37,6 15,8 13,00 Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 8 af 21

101351050443 1,09 0,91 32,1 16,2 13,00 101351035185 0,97 0,96 34,1 16,0 13,00 101351047760 0,79 1,05 30,5 15,7 13,00 101351050753 0,87 1,01 36,3 15,5 13,00 101350992356 0,59 1,22 36,0 16,8 13,00 101333659482 1,15 0,89 30,6 16,4 13,00 101350998877 1,08 0,92 34,3 16,3 13,00 101350884359 0,91 0,98 34,6 16,0 13,00 101351029800 0,67 1,14 32,1 15,7 13,00 Middel 16,0 1s 0,4 2s 0,7 Laveste koncentration af Dabigatran vurderes omkring 13 µg/l Fortyndet trombintid på ubehandlede patienter vil ligge mellem 15 og 17 sekunder Målinger overfor Rivaroxaban kalibrering: Rivaroxaban kalibrering anvendt på aptt normale APTT KFNT KFTT anti-xa (sek) (arb/l) (INR) µg/l Prøvenr: 08/10 2013 1 28,0 1,30 0,86 25,00 08/10 2013 2 33,8 0,73 1,12 25,00 08/10 2013 3 37,2 0,88 1,03 25,00 08/10 2013 4 34,2 1,18 0,91 25,00 08/10 2013 5 30,1 0,76 1,10 25,00 08/10 2013 6 48,8 0,79 1,08 25,00 08/10 2013 7 36,1 0,86 1,04 25,00 08/10 2013 8 36,6 0,88 1,03 25,00 08/10 2013 9 33,4 1,36 0,87 25,00 08/10 2013 10 32,7 0,69 1,16 25,00 08/10 2013 11 30,1 1,26 0,89 25,00 08/10 2013 12 36,0 1,18 0,91 25,00 Der fås sammenlignelige resultater med patienter i Dabigatran behandling undtaget aptt. Laveste koncentration af Rivaroxaban vurderes omkring 25 µg/l 4. 5.a) Leverandørens oplysninger 4. 5.b) Egne undersøgelser 4. 5.c) Konklusion Normal område for fortyndet trombintid er 15-17 sekunder Detektionsgrænse for Rivaroxaban ca. 25 µg/l og for Dabigatran ca. 15 µg/l 4. 6) Linearitet Fastlægges ikke, da kun vurdering af toksicitet foretages 4. 6.a) Leverandørens oplysninger 4. 6.b) Egne undersøgelser 4. 6.c) Konklusion 4. 7) Måleinterval Der foretages kalibrering fra 0 til over toksisk niveau. Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 9 af 21

4. 7.a) Leverandørens oplysninger 4. 7.b) Egne undersøgelser 4. 7.c) Konklusion 4. 8) Referenceinterval Fastlægges udfra måling af patientprøver uden indgift af relevant medikament 4. 8.a) Leverandørens oplysninger 4. 8.b) Egne undersøgelser 4. 8.c) Konklusion Normal område for fortyndet trombintid er 15-17 sekunder Detektionsgrænse for Rivaroxaban ca. 25 µg/l og for Dabigatran ca. 15 µg/l Data se punkt 4.5 4. 9) Analytisk specificitet / interferens Patienter i behandling med Dabigatran undersøges for påvirkning af anti-faktor Xa målinger og standard koagulations målinger (aptt,kfnt.kftt) Patienter i behandling med Rivaroxaban undersøges for påvirkning af fortyndet trombintid og standard koagulations målinger (aptt,kfnt.kftt) 4. 9.a) Leverandørens oplysninger 4. 9.b) Egne undersøgelser Data se punkt 4.2.1.b 4. 9.c) Konklusion 1) Dabigatran: Vi ser kun ensidigt opad, og da det er en differens vi ser på så kvsdr 2, samt da for et givet tidspunkt medtages ikke CVbiol., så for differensen 200-149, dvs. 25,5%: 25,5% > 1,96 x kvadr2 x kvadrcvanal. 2 25,5% > 2,8 x kvadr6 2 25,5% > 16,8 Dvs. hvis tallet i sek. har ændret sig mere end ca. 17%, så et statistisk signifikant fald og forskel på 1. og 2. måling. 2) Rivaroxaban: Vi ser kun ensidigt opad, og da det er en differens vi ser på så kvsdr2, samt da for et givet tidspunkt medtages ikke CVbiol., så for differensen 400-211: 52,8% > 1,96 x kvadr2 x kvadrcvanal. 2 52,8% > 2,8 x kvadr6 2 52,8% > 16,8 Dvs. hvis tallet i µg/l har ændret sig mere end ca. 17%, så et statistisk signifikant fald og forskel på 1. og 2. måling. 4.10) Afsmitning Ikke relevant Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 10 af 21

4.10.a) Leverandørens oplysninger 4.10.b) Egne undersøgelser 4.10.c) Konklusion 4.11) Robusthed Vurderes udfra Intraseriel præcision 4.11.a) Leverandørens oplysninger 4.11.b) Egne undersøgelser Data se punkt 4.3.b 4.11.c) Konklusion Udfra de foreliggende data vurderes analyserne som robuste. CV er selv mellem laboratorier mindre end det ønskede. 4.12) Præanalytiske forhold Prøvetagning og prøvepræparation følger leverandørens anvisninger. Ved resultatvurdering skal prøvetagningstidspunkt fastlægges i forhold til sidste indtagelse af medikament. 4.12.a) Leverandørens oplysninger 4.12.b) Egne undersøgelser 4.12.c) Konklusion Som det fremgår af Bilag 1 angående dosering af de forskellige medikamenter afhænger plasma koncentrationen meget af den tid der går fra indtagelse af medicin til blodprøvetagning. Peakværdi for Dabigatran 2-3 timer efter indtag. Peakværdi for Rivaroxaban 2-4 timer efter indtag. Throug værdi umiddelbart før næste indtag for begge. 4.13) Vurdering af praktiske forhold 5) Konklusion Fortyndet trombintid er velegnet til at vurdere om der er tale om toxicitet for Dabigatran. Den anvendte målemetode for bestemmelse af anti-faktor Xa er velegnet til at vurdere om der er tale om toxicitet for Rivaroxaban. De valgte metoder differentierer sikkert mellem indtag af henholdsvis Faktor Xa specifikke inhibitorer og trombin specifikke inhibitorer. Der er påvirkning af aptt for begge medikament grupper, men ingen sikker påvirkning af KFNT/KFTT 6) Referencer Bilag: 1, NOAC Klinik 2, Analyseresultater Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 11 af 21

Dosis respons Dabigatran Vejle Kolding Vejle Kolding 240 ng/ml 470 ng/ml sek sekunder sek sekunder 143 137,4 210 215,7 143 146,5 211 214,4 153 149,4 228 217,1 153 148,1 229 218,5 150 158 229 234 151 160,6 228 234,3 151 159,6 224 233,9 150 160,6 225 238,2 151 169,5 226 256,5 152 164,1 227 257,5 151 162,2 224 235,2 151 230 234,2 143 157,3 210 236,4 143 157,3 211 236 153 155,4 228 235,2 153 157,6 229 238,6 150 166,4 229 151 166,3 228 151 153,4 224 227,7 150 154,3 225 229 151 156,6 226 228,9 152 156,5 227 229,9 157 232 160 231 157 233 160 233 middel 151,2 157,0 225,3 232,6 1s 4,5 7,4 6,9 11,3 CV 3,0 4,7 3,1 4,9 Variation Kolding versus Vejle mellem 3 og 4 % Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 12 af 21

Dabigatran patienter og aptt versus fortyndet trombintid Dabigatran patienter 160,0 140,0 Fortyndet trombintid sekunder 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 aptt sekunder

Dosis response Rivaroxaban Vejle Kolding Vejle Kolding 244ng/ml 457 ng/ml OD/min ng/ml ng/ml OD/Min OD/min ng/ml ng/ml OD/Min 0,311 261 238,12 0,116 434 444,19 0,306 264 241,08 0,113 439 444,19 0,325 253 239,89 0,113 439 442,49 0,312 260 241,67 0,114 437 447,62 0,310 261 239,3 0,116 434 456,47 0,305 264 233,47 0,114 437 447,62 0,320 256 261,17 0,113 439 447,62 0,322 255 254,67 0,107 448 449,36 0,303 265 250,86 0,111 442 449,36 0,303 265 250,24 0,112 440 456,47 0,321 273 252,12 0,112 476 451,11 0,326 271 248,37 0,113 474 442,49 0,314 277 240,48 0,326 0,109 480 454,67 0,108 0,314 279 255,31 0,302 0,112 476 451,11 0,11 0,311 261 246,52 0,116 434 460,13 0,306 264 248,37 0,113 439 451,11 0,325 253 255,31 0,113 439 452,88 0,312 260 249,61 0,114 437 463,86 0,310 261 236,95 0,116 434 427,89 0,305 264 237,53 0,114 437 439,15 0,320 256 242,87 0,322 0,113 439 444,19 0,114 0,322 255 252,12 0,307 0,107 448 439,15 0,117 0,303 265 236,95 0,111 442 449,36 0,303 265 243,48 0,112 440 435,86 0,298 268 245,91 0,317 0,109 445 447,62 0,112 0,315 258 240,48 0,326 0,109 445 442,49 0,115 0,314 259 0,109 447 0,311 261 0,111 442 middel 0,312 262,6 245,5 0,317 0,112 445,1 447,6 0,113 1s 0,008 6,561 7,127 0,010 0,003 13,666 7,708 0,003 CV 2,510 2,498 2,903 3,193 2,267 3,070 1,722 2,953 Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 14 af 21

Interseriel Vejle Interseriel Kolding Vejle resultater Rivaroxaban Kolding resultater Rivaroxaban Interassay 244 ng/ml Interassay 457 ng/ml Kolding resultater dato OD/min ng/ml dato OD/min ng/ml Enhed 244 ng/ml 457 ng/ml 6/8 2013 0,311 261 6/8 2013 0,116 434 Dato 238,12 444,19 6/8 2013 0,306 264 6/8 2013 0,113 439 12.8.2013 241,08 444,19 6/8 2013 0,325 253 6/8 2013 0,113 439 239,89 442,49 6/8 2013 0,312 260 6/8 2013 0,114 437 241,67 447,62 6/8 2013 0,310 261 6/8 2013 0,116 434 239,3 456,47 6/8 2013 0,305 264 6/8 2013 0,114 437 233,47 447,62 6/8 2013 0,320 256 6/8 2013 0,113 439 261,17 447,62 6/8 2013 0,322 255 6/8 2013 0,107 448 254,67 449,36 6/8 2013 0,303 265 6/8 2013 0,111 442 250,86 449,36 6/8 2013 0,303 265 6/8 2013 0,112 440 250,24 456,47 middel 0,3117 260,4 middel 0,1129 438,9 middel 245,047 448,539 1s 0,008056 4,376706 1s 0,002601 4,067486 1s 8,70559 4,762134 CV 2,6 1,7 CV 2,3 0,9 CV% 3,6 1,1 Vejle resultater Dabigatran Interassay 240 ng/ml Interassay 470 ng/ml dato sek sek 6/8 2013 143 210 6/8 2013 143 211 6/8 2013 153 228 6/8 2013 153 229 6/8 2013 150 229 6/8 2013 151 228 6/8 2013 151 224 6/8 2013 150 225 6/8 2013 151 226 6/8 2013 152 227 middel 149,7 middel 223,7 1s 3,683296 1s 7,149981 CV 2,5 CV 3,2 Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 15 af 21

Rivaroxaban μg/l Dabigatran CV beregnet i sekunder 244 µg/l 470 μg/l 240 µg/l 457 µg/l 261 434 143 210 264 439 143 211 253 439 153 228 260 437 153 229 261 434 150 229 264 437 151 228 256 439 151 224 255 448 150 225 265 442 151 226 265 440 152 227 273 476 151 224 271 474 151 230 277 480 143 210 279 476 143 211 261 434 153 228 264 439 153 229 253 439 150 229 260 437 151 228 261 434 151 224 264 437 150 225 256 439 151 226 255 448 152 227 265 442 157 232 265 440 160 231 268 445 157 233 258 445 160 233 259 447 137,4 215,7 261 442 146,5 214,4 238 444 149,4 217,1 241 444 148,1 218,5 240 442 158 234 242 448 160,6 234,3 239 456 159,6 233,9 233 448 160,6 238,2 261 448 169,5 256,5 255 449 164,1 257,5 251 449 162,2 235,2 250 456 157,3 234,2 252 451 157,3 236,4 248 442 155,4 236 240 455 157,6 235,2 255 451 166,4 238,6 247 460 166,3 227,7 248 451 153,4 229 255 453 154,3 228,9 250 464 156,6 229,9 Intraseriel 237 428 156,5 Middel 238 439 153,8 228,4 1s 243 444 6,6 9,7 CV % 252 439 4,3 4,2 237 449 243 436 246 448 240 442 254 446 Intraseriel 11,0 11,2 Middel 4,3 2,5 1s CV % Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 16 af 21

Analysens kliniske anvendelse: Vurdering af toksicitet hos patient i behandling med NOAC medikamenter, primært dabigatran og rivaroxaban. Effekt Dabigatran (Pradaxa ) Direkte trombin(faktor IIa)- hæmmer Rivaroxaban (Xarelto ) Direkte faktor Xa-hæmmer Målemetode Fortyndet Trombin tid i sek. Anti-Faktor Xa i µg/l (µg/l = ng/ml) Dosis Højeste niveau v. steady state Laveste niveau v. steady state Eks. AFLI: Kaps. 150 mg x 2 dgl. Kaps. 220 mg x 1dgl./110 mg x 2dgl. 2-3 timer efter po indtag: 184 (64-443) ng/ml a (2) 183 (62-447) ng/ml b (2) 12-24 timer efter po indtag: 90 (31-225) ng/ml c 37 (10-96) ng/ml d Eks. DVT og lungeemboli: Tbl. 20 mg x 1 dgl. Tbl. 15 mg x 1 dgl. Tbl. 10 mg x 1 dgl. 2-4 timer efter po u. mad: 222,6 (159,6-359,8) ng/ml e (3) 124,6 (91,4-195,5) ng/ml f (3) 16-24 timer efter po indtag: 22,3 (4,3-95,7) ng/ml e d 9,1 (1,3-37,6) ng/ml f d Halveringstid 12-14 timer 7-10 timer hos yngre 11-13 timer hos ældre PT (v. overdosis) APTT (v. overdosis) Fortyndet trombintid : (6) Øget risiko for blødning: > 2 x øvre referenceinterval c-d : Øget risiko for blødning: Et bud evt. > 400 ng/ml, svarende til ca. 200 sek. : (6-7) Evt. let : (6-7) LMW heparin (Fragmin ) Direkte faktor Xa-hæmmer Anti-Faktor Xa i IU/L (IU/L = 10-3 IU/ml) Eks. DVT: Inj. sc. 200 IE/kg pr. døgn, dog højest 18.000 IE pr. døgn 3-4(-6) timer efter sc. inj. 3-4 timer efter sc. inj. Anti-Faktor Xa Pradaxa 150 mg x 2 højeste normal værdi ca.150 sek.* 1 Øget risiko for blødning: Et bud evt. > 400 ng/ml. Xarelto 15 mg x 1-2 højeste normal værdi ca. 315 ng/ml* 3 : (5) Evt. øget risiko for blødning: Ved dosis x 2 dgl (100 IE/kg x 2 dgl) og patient med forøge blødningsrisiko: > 1,0 anti-xa IE/ml 1 Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 17 af 21

Elimination Specialist behan dling ved overdosering/ li vstruendeblødni ng? Ca. 85% udskilles gennem nyrerne og ca. 6% med fæces Seponer Dabigatran Evt. aktiveret kul Evt. dialyse hos nyresyge (7) Evt. (lav evidens) protrombin kompleks og rekombinant aktiveret faktor VII ved livstruende blødning (7-8) (En patient på Xarelto 20 mg x 1 havde værdi på 417 ng/ml) 2/3 metaboliseres i leveren, hvoraf 50% udskilles med urine n og 50% med fæces. 1/3 udskilles uomdannet med urinen Seponer Rivaroxaban Evt. aktiveret kul Evt. (lav evidens) protrombin kompleks og rekombinant aktiveret faktor VII ved livstruende blødning (7-8) Fragmin 15.000 IE x 1 højste normal værdi ca. 0,8 IU/ml *2 Hovedsagligt renalt Seponer Fragmin Protaminsulfat Interaktioner 1) Inhibitorer af P- glykoprotein øger effekten, f.eks. ketoconazol, itraconazol, tracrolimus, cyclosporin, verapamil, amiodaron, clarithromycin 2) Induktorer af P- glykoprotein hæmmer effekte n, f.eks. rifampicin, carbamazepin, phenytoin 3) Antacida hæmmer effekten 1) Inhibitorer af P-glykoprotein og CYP3A4 øger effekten, f.eks. ketoconazol, itraconazol, voriconazol, posacinazol, tracrolimus, cyclosporin, clarithromycin 2) HIV-proteasehæmmere øger effekten, f.eks. ritonavir 3) Mad øger optag 4) Induktorer af P-glykoprotein og CYP3A4 hæmmer effekten, f.eks. rifampicin, carbamazepin, phenytoin, phenobarbital Generelt for alle AK medikamenter: Farmaka med hæmmende virkning på hæmostasen øgere kten, f.eks. acetylsalicylsyre o andre NSAID, Vitamin K- antagonister og dextran a Median (5% og 95% percentiler) med median creatinin clearence på 75 ml/min. For dosis 150 mg x 2 dgl. b Median (5% og 95% percentiler) med median creatinin clearence på 75 ml/min. For dosis 220 mg x 1 dgl. c Målt 12 timer efter indtag. d Målt 24 timer efter indtag. e For dosis 20 mg x 1 dgl f For dosis 10 mg x 1 dgl *1: Ud fra tilfældige målinger på 11 patienter i Pradaxa behandling 150 mg x 2 dgl. *2: Ud fra tilfældige målinger på 10 patienter i Fragmin behandling 2.500-15.000 IE x 1 dgl. *3: Ud fra tilfældige målinger på 10 patienter i Xarelto behandling 15 mg x 1 dgl. til 15 mg x 2 dgl. Interferens for NOAC: NOAC interferer med rutine koagulations assays, hvorfor ved behandling med NOAC anbefales, at ved prøvetagning for koagulations parametre, at sidste indtag af NOAC skal foregå min. 24 timer før dette. For lupus antikoagulans prøver måske endda min. 48 timer før (1). 2 Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 18 af 21

Reference: (1) Heidbuchel H et al. European Heart Rhytm Association Practical Guide on the use of new oral anticoagulants in patients with non-valvular atrial fibrillation; Europace; 15:625-51, 2013. (2) van Ryn et al. Dabigatran etexilate a novel, reversible, oral direct thrombin inhibitor: Interpretation of coagulation assays and reversal of anticoagulationt activity; Thrombosis and Haemostasis; 103:1116-27, 2010. (3) Dempfle C-E. Pharmakologie der neuen oralen Antikoagulanzien; Herz; 37:362-7, 2012. (4) Pro.medicin.dk (for dapigatran, rivaraxaban og apixaban), juli 2013 (5) Produktresumé.dk (for Fragmin), juli 2013 (6) Baglin T. Clinical use of new oral anticoagulant drugs: dabigatran and rivaroxaban; doi: 10.1111/bjh.12502, 2013 (7) Rodgers R et al. Correlating protrombin time with plasma rivaroxaban level; doi: 10.1111/bjh.12566, 2013 (8) Drager W.E. Developing a management plan for oral anticoagulant reversel; Am. J. Health- Syst Pharm, vol 70, Suppl 1, S21-31, 2013. Kvalitetskrav for analysesvar: 1) Dabigatran: a) Krav til bias: Ud fra egne tilfældige målinger på 11 patienter i dabigatran behandling skønnes reference intervallet at være 22-149 sek., mens toksiske niveau er sat til 200 sek.: 3 Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 19 af 21

Tages udgangspunkt i det terapeutisk niveau med fortyndet trombintid på 22-149 sek. Referenceområdet 22-149 sek. svarer til 4 x SD på populationen, dvs. 1 SD = (149-22) : 4 = 32 sek. Standardkravet til bias er max. ½ af SD på populationen, dvs. Max. 32 :2 = 16 sek. Regnes dette i procent af den øvre ref. grænse bliver bias kravet på Max. 16 : 149 = 10,7 % ca. 10% Dvs. på den øverste ref. grænse på 149 kan det sande tal være ± 10% af 149 dvs. ca. 15 sek. uden forskellen er signifikant. b) Krav til CV: Vi vil kunne skelne mellem 149 sek. og 200 sek., dvs. fald fra 200 til 149?: Mean 200 - mean 149 > 1,96 x kvadr2 x SDkrav 51 > 2,8 x SDkrav SDkrav < 18 sek. CVkrav = SDkrav : diff.mean CVkrav = 18 : 174,5 CVkrav = 10,3 % ca. 10% MEN, da vi ud fra egne patient målinger finder CVanal på 4%, sætter vi den til 6% Vi ser kun ensidigt opad, og da det er en differens vi ser på så kvsdr 2, samt da for et givet tidspunkt medtages ikke CVbiol., så for differensen 200-149, dvs. 25,5%: 25,5% > 1,96 x kvadr2 x kvadrcvanal. 2 25,5% > 2,8 x kvadr6 2 25,5% > 16,8 Dvs. hvis tallet i sek. har ændret sig mere end ca. 17%, så et statistisk signifikant fald og forskel på 1. og 2. måling. 2) Rivaroxaban: a) Krav til bias: Ud fra egne tilfældige målinger på 10 patienter i rivaroxaban behandling skønnes reference intervallet at være 58-315 ng/ml, mens toksiske niveau er sat til 400 ng/ml: Tages udgangspunkt i det terapeutisk niveau med fortyndet trombintid på 58-315 ng/ml. 4 Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 20 af 21

Referenceområdet 58-315 ng/ml svarer til 4 x SD på populationen, dvs. 1 SD = (315-58) : 4 = 64,3 ng/ml. Standardkravet til bias er max. ½ af SD på populationen, dvs. Max. 64,3 :2 = 32,1 ng/ml. Regnes dette i procent af den øvre ref. grænse bliver bias kravet på Max. 32,1 : 315 = 10,2 % 10% Dvs. på den øverste ref. grænse på 315 kan det sande tal være ± 10% af 315 dvs. ca. 32 ng/ml uden forskellen er signifikant. b) Krav til CV: Vi vil kunne skelne mellem 315 ng/ml og 400 ng/ml, dvs. fald fra 400 til 315?: Mean 400 - mean 315 > 1,96 x kvadr2 x SDkrav 85 > 2,8 x SDkrav SDkrav < 30,4 ng/ml CVkrav = SDkrav : diff.mean CVkrav = 30,4 : 357,5 CVkrav = 8,5 % ca. 9% MEN, da vi ud fra egne patient målinger finder CVanal på 3%, sætter vi den til 6% Vi ser kun ensidigt opad, og da det er en differens vi ser på så kvsdr2, samt da for et givet tidspunkt medtages ikke CVbiol., så for differensen 400-315: 21,3% > 1,96 x kvadr2 x kvadrcvanal. 2 21,3% > 2,8 x kvadr6 2 21,3% > 16,8 Dvs. hvis tallet i ng/ml har ændret sig mere end ca. 17%, så et statistisk signifikant fald og forskel på 1. og 2. måling. 5 Kl. Immunologi og Biokemi, VGS NOAC (New Oral AntiCoagulantia),ver.1.3, DokID: 314398 Side 21 af 21