F100- Automatiseret immunkemisk påvisning Søren Frank Jørgensen Lektor 19. april 01 Navn Navnesen Titel Afdelning 10 august 009 Side 1
Søren Frank Jørgensen
Søren Frank Jørgensen
Homogene immunoassays Kræver ikke separation af bundet og ubundet mærkning Udnytter at mærkningen ændrer sig når der dannes Ab-Agkompleks Bla. velegnet til analyse af små Ag (haptener, hormoner, farmeka), da disse alligevel skal konjugeres for at kunne måles
Homogene immunoassays Side 5 19. april 01
Homogene immunoassays Side 6 19. april 01
Homogene Immunoassays Amplification Excitation by energy 337 nm transfer XL 665 665 nm Time resolved detection bound acceptor µsec 337 nm XL 665 665 nm free acceptor 10 nsec 337 nm CrE 60 nm free donor µ
Heterogene Immunoassays Immunkomplekser bindes til overflade Muliggør separation af frie og bundne reagenser Flere typer af overflader: f.eks Mikrotititerbrønd, Latexpartikler, paramagnetiske partikler, mikrochip, strips Eksempel. Alm. ELISA Side 8 19. april 01
Heterogene immunoassays Paramagnetiske mikropartikler
Biotin-avidin/streptavidin Biotin-streptavidin komplex er et af de stærkeste non-kovalente komplekser i naturen Resistent overfor ph, temperatur, detergent, proteolyse Avidin (og streptavidin (fra streptomyces)) et en tetramer, hvor hver subunit kan binde en biotin (vitamin B7) Anvendes bredt til at mærke eller forankre proteiner eller oligonukleotider Side 10 19. april 01
Heterogene immunoassays Paramagnetisk mikropartikel Streptavidin Biotin Protein for binding
Heterogene immunoassays Antigen Antistof
Kompetitive vs. Non-kompetitive To grundlæggende varianter af heterogene immunassays: Non-kompetitive: Overskud af bindingspladser for analytten. Målingen er proprotional med koncentrationen af analyt. Kompetitive: Analytten konkurrerer (competes) med en tilsat mærket analyt om et underskud af bindingspladser. Jo mere analyt, jo mindre mærkning vil kunne bindes. Måleingen et omvendt proportional med koncentreationen af analytten Side 13 19. april 01
ARCHITECT One Step Assay Protocol Incubate analyte antibody coated paramagnetic microparticles acridinium derivative labeled tracer 5 min wash/aspirate (x3) remove unbound material pretrigger reagent releases label from solid phase trigger reagent magnetic separation of particles from label READ
ARCHITECT Two Step Assay Protocol incubate wash/aspirate (x3) remove unbound material analyte antibody coated paramagnetic microparticles Y Y Y Y acridinium derivative labeled conjugate or tracer incubate wash/aspirate (x3) remove unbound material pretrigger reagent releases label from solid phase magnetic separation of particles from label trigger reagent READ
Architect Undervisning F100- Automatiseret immunkemisk påvisning Chemiflex Two-Step Assay Sample + Microparticle WASH x 3 Incubation Conjugate Incubation Magnet WASH x 3 Pre-Trigger Trigger Light Magnet Magnet H:S Bispebjerg Hospital. Klinisk Biokemisk afdeling, Karina Rasmussen. April 006 Magnet
Architect Undervisning ARCHITECT Free T4/T3 Assay Design Step one Incubate (18 min.) Wash x 3 Remove Interferences and binding proteins Step two Wash x 3 Remove Excess Tracer Add Pre-Trigger Trigger Addition of Acridinium Labeled T3 Tracer Read H:S Bispebjerg Hospital. Klinisk Biokemisk afdeling, Karina Rasmussen. April 006
One Step Assay with Hook Effect incubate analyte antibody coated paramagnetic microparticles Y Y Y Y acridinium derivative labeled conjugate or tracer incubate Y Wash Removes unbound material Pretrigger reagent trigger reagent READ = Falsely Low Result!
Why do not all manufacturers decide for -steps? Strenghts Weaknesses 1-step assay Easy to automate Potentially better precision Potentially faster assay Cheaper to develop (assay & instrument optimization) More risk for clinically significant interferences, especially for those by Thyroid Hormone Autoantibodies in Thyroid hormone tests Risk of High-Dose- Hook effect -step assay Suitable to almost all assays Excellent clinical performance: No High-Dose-Hook effect No interference by Thyroid Hormone Autoantibodies Less interferences by nonspecific binding More complex to automate Potentially slower assays Potentially poorer precision More expensive to develop (assay & instrumentation optimization)
Mærkning RU(bpy)3 bindes let til aminogrupper i proteiner, haptener og nucleinsyrer N N Ruthenium (bispyridyl) 3 + NHS ester N Ru N O N N O O N O + markør---------- spacer ------- linker
Analyseprincip: 1. Sandwich princip: AFP, CA15, NT-proBNP, PTH, Troponin T hs. Kompetitivt princip: Vitamin D3 (5-OH)
Sandwich princip: Elecsys NT-proBNP II Bi Biotinyleret NTproBNP-specifikt antistof (R1) NT-proBNP i prøve NT-proBNP-specifikt antistof mærket med ruthenium (R) -- Ru(bpy) 3 Bi -- Ru(bpy) 3 i Bi 9 min Bi
Sandwich princip: -- Ru(bpy) 3 i Bi Bi -- Ru(bpy) 3 + -- Ru(bpy) 3 Bi 9 min i
Sandwich princip: Bi Bi Bi Bi -- Ru(bpy) 3 Bi Bi -- Ru(bpy) 3 Bi Bi Bi Bi -- Ru(bpy) 3 --
Signal Sandwich princip: Detektion Koncentration
Kompetitivt princip: Elecsys Vitamin D3 (5- OH) Anti-5-OH vitamin D3-antistof mærket med ruthenium (R) 5-OH Vitamin D3 i prøve Biotinyleret 5-OH Vitamin D (R -- Ru(bpy) 3 Buffer (R1)
Kompetitivt princip: 9 min -- Ru(bpy) 3 9 min
Kompetitivt princip: Lav prøve koncentration = Høj signalværdi Høj prøve koncentration = Lav signalværdi
Signal Kompetitivt princip: Detektion Koncentration
Måleprincip Fotomultiplikator - Elektrode - Elektrode Reaktionsblandning + Elektrode Magnet
Måleprincip Fotomultiplikator - Elektrode - Elektreod Tripropylamin (TPA) Elektrode Magnet
Måleprincip Ru + TPA + Platinelektrode + Magnet
Måleprincip Foton (60 nm ) Ru + exciteret e - TPA. H + Ru + Ru 3+ TPA +. TPA e - e - + Platinaelektrode + Magnet
Måleprincip Forstærket signal F F F Foton Ru + TPA + Platinaelektrode Magnet +
Måleprincip Målecelle Fotomultiplikator - Elektrode - Elektreod CleanCell + Elektrode Magnet
Måleprincip Målecelle Fotomultiplikator - Elektrode - Elektreod Elektrode ropylamin (TPA) + Elektrode 10 400 Counts Magnet
ECL ~ ElektroChemiLuminescens Analyse fordele Forstærket signal betyder: Funktionelle Sensitivitet Optimeret Ab; høj bindingsaffinitet giver: Stort måleområde ECL = CL 0 Teknologien betyder også: Kort analysetid Løbende udvikling betyder: Bred testmenu
Tilgængelige analyser på cobas e 411 Thyreoideafunktion Anti-TG Anti-TPO Frit-T3 T3 Frit-T4 T4 Thyroglobulin TSH T-uptake Anti- TSH receptor Fertilitetshormoner DHEA-S Estradiol FSH HCG + β LH PAPP-A Progesteron Prolactin SHBG Testosteron Rheumatoid Arthritis Tumormarkører AFP CA 15-3 CA 19-9 CA 7-4 CA 15 CEA Cyfra 1-1 NSE PSA Frit PSA S100 Hjertemarkører CK-MB Digitoxin Digoxin Myoglobin NT-pro BNP Troponin T Troponin T hs Præ-eklampsi PlGF sflt Hepatitis Anti HAV Anti-HAV IgM HBsAg HBsAg Confirmatory Test Anti-HBs Anti-HBc Anti-HBc IgM HBeAg Anti-HBe Anti-HCV Retrovirus HIV Ag HIV Ag Confirmatory Test HIV Combi Torch Rubella IgG Rubella IgM Toxo IgG Toxo IgM CMV IgG CMV IgM Anæmi Ferritin Folat RBC folat Vitamin B1 Knoglemarkører β -crosslaps N-MID Osteocalcin PTH P1NP Vitamin D3 Diabetes C-Peptid Insulin Andre ACTH Cortisol IgE CCP Sepsis Elecsys Brahms PCT Anti CCP Il-6